Microscopía De FluorescenciaEDUAR DAVID CARABALLO

Microscopía de Fluorescencia

Fluorescencia: propiedad que poseen determinadas sustancias ( fluorescentes )de emitir, bajo la acción de radiaciones de onda corta, otras radiaciones de longitud de onda más larga.

0.1 1 180 340 750 400 . 103

Espectro Electromagnético

Rayos Gamma RayosX

Ultravioleta

Visible

Infrarrojo

Microondas

Longitud de onda

Microscopio de fluorescencia• La fluorescencia es un fenómeno de luminiscencia que fue observado inicialmente por Sir George Stokes en el año 1852, para luego ser explicada físicamente en el año 1935 por Alexander Jablonski (107). Es la propiedad que tienen ciertos elementos químicos denominados fluoróforos o fluorocromos de emitir luz visible cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de una mayor longitud de onda (de un determinado color, verde, rojo, amarillo) (fig. 6-21). Es un fenómeno de luminiscencia de vida corta, emitida simultáneamente con la excitación.

La imagen muestra el principio de la fluorescencia. Arriba se observa el rayo incidente (color azul claro) de una determinada longitud de onda, el cual es absorbido por las partículas fluorescentes (esferas naranja) que responden emitiendo otra luz, en este caso de color verde que exhibe una longitud de onda mayor que la de la luz incidente. 

Los términos de fluorocromo y fluoróforo definen los siguientes conceptos: 

• Fluorocromo: Marcador colorante fluorescente empleado en investigación para crear contraste en zonas determinadas de los especímenes.

• Fluoróforo: Parte de una molécula (fluorocromo, proteína) que le imparte la propiedad de fluorescencia.

Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y de emisión específico que depende de la composición y estructura de la molécula fluorescente.

Algunos de los principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia y sus respectivos espectros de absorción y emisión en valores aproximados. 

La microscopía de fluorescencia es muy útil porque la molécula fluorescente, aún cuando sea muy pequeña, puede ser observada debido a la luz que emite. Los fluorocromos actúan como fuentes de luz de un color determinado que pueden ser localizadas en áreas específicas de la muestra que se estudia. El marcaje selectivo de moléculas y otros compuestos celulares se realiza mediante la técnica de inmunofluorescencia.

Requerimientos para el microscopio de fluorescencia

• Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el espectro específico de cada fluorocromo. Hay que tomar en cuenta que la fluorescencia es pasajera y la iluminación produce un efecto de fotoblanqueo en el fluorocromo; además, las células vivas pueden ser dañadas por la intensa radiación. La luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lámparas de mercurio a alta presión que funcionan de un modo diferente a las lámparas de filamentos incandescentes.

• Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, la del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no deseadas.

• Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numérica.

Esquema básico de la iluminación en el microscopio de fluorescencia. La luz blanca emitida por la fuente de luz es filtrada dejando pasar por ejemplo, solo la luz azul. El espejo dicroico refleja la luz de cierta longitud de onda (en este caso azul) pero deja pasar otras. Filtra la luz azul que excita al fluorocromo (fluoresceína) pero por el contrario, deja pasar la luz verde emitida. 

Aplicaciones del microscopio de fluorescenciaSon numerosas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, notablemente en biología y medicina:

• Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.

• Estudio de células normales y patológicas.

• Estudios inmunológicos.

• Mineralogía.

 

 

Microscopía de Fluorescencia

Colorantes Fluorescentes: cuando se exponen a la luz ultravioleta, se perciben como un cuerpo brillante sobre fondo oscuro. El color y la intensidad de luz que emiten es una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada.

Los colorantes fluorescentes utilizados en la tinción de muestras clínicas, son detectados con ayuda del

Microscopio de Fluorescencia.

Microscopio de Fluorescencia-Contraste

de Fases

Tipos de Microscopía de Fluorescencia

Primaria. La propia muestra posee fluorescencia.

Secundaria: muestra marcada con colorantes fluorescentes.

Inmunofluorescencia: la fijación del colorante fluorescente se realiza con un anticuerpo marcado.

Inmunofluorescencia

La base de una prueba inmunológica es la reacción Antígeno-Anticuerpo.

Antígeno: también llamados inmunógenos, son cualquier material que estimula la formación de un anticuerpo. En su mayoría son sustancias proteicas

Determinante Antigénico: la parte por la que un antígeno se une al anticuerpo.

Hapteno: pequeñas moléculas que no son capaces por sí solas de estimular la formación de anticuerpos, pero que unidas a otras moléculas más grandes, sí lo hacen.

Inmunoglobulinas: proteínas cuya característica definitoria es que

en ellas reside la actividad de anticuerpo.

Inmunofluorescencia:

Anticuerpos: Estructura.

Anticuerpos

Funciones: Reconocer un determinado antígeno y combinarse con

él. Esta característica depende del idiotipo ó región variable.

Desencadenar una serie de consecuencias tras la unión con el antígeno, lo cual depende de la región constante. Según el tipo de inmunoglobulina, existen distintas posibilidades como capacidad de atravesar la placenta ó no, distribución por el organismo, capacidad de fijarse a la superficie de determinadas células, capacidad de activar el complemento, etc.

Inmunofluorescencia

Inmunofluorescencia Directa:

Son ensayos que están limitados a la detección de antígeno, y que permiten el diagnóstico de enfermedades bacterianas, fúngicas, parasitarias y virales.

Consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante reacción directa con un un anticuerpo específico, marcado con colorante fluorescente.

El anticuerpo es obtenido a través de la inoculación del microscopio productor del antígeno en un modelo animal

Es un método simple y rápido de realizar, con pocas reacciones inespecíficas, sin embargo es menos sensible.

Inmunofluorescencia Directa

InmunofluorescenciaInmunofluorescencia Indirecta.

Se puede usar tanto para la detección de antígenos como de anticuerpos.

Es una técnica de doble capa en donde se aplica el anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato que puede ser un antígeno u otro anticuerpo, y se visualiza por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo.( por ejemplo : hepatocitos ó células Hep-2 si buscamos anticuerpos antinucleares, ó leishmanias si buscamos anticuerpos antileishmania, células que contienen virus, Toxoplasma gondii, ó Treponema pallidum si buscamos anticuerpos contra estos agentes infecciosos )

Este método es más sensible y produce una fluorescencia de mayor brillo, sin embargo es menos específico y puede dar lugar a mayor reactividad cruzada.

Inmunofluorescencia Indirecta

Inmunofluorescencia Indirecta: detección de Antígeno.

Fluorocromos. Son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud

de onda determinada cuando captan ( son excitados por ) un fotón incidente de una longitu de onda característica.

Ejemplos: Isotiocianato de fluoresceína: verde manzana. Rodamina: Naranja brillante.Características: Forman uniones con las proteínas pero sin afectar los grupos de combinación

específica del anticuerpo. La fluorescencia se ve afectada por el pH El fenómeno de “ fijación “ disminuye la fluorescencia en 15% a 30% con

respecto al colorante libre Las grandes intensidades de luz empleada, provocan también el

desvanecimiento de la fluorescencia.

Imágenes Teñidas con Fluorocromos

Mycobacterium

Neisseria

Treponema Borrelia

Servicio Microscopía de fluorescencia en Colombia

• UDEA (Universidad de Antioquia – Grupo de Neurociencias de Antioquia).

•Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá.

•Universidad de Los Andes.

GRACIAS