Cromatografia su strato sottile - TLC - Progetto Lauree Scientifiche.

CromatograCromatografia su strato fia su strato

sottilesottile

- TLC -- TLC -

Progetto “Lauree Scientifiche”

http://www.unife.it/

CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA


Nella cromatografia, le separazioni possono avvenire su colonna (colonna cromatografica)

o su un supporto planare (TLC)


CROMATOGRAFIA SU STRATO CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC)SOTTILE (TLC)

La La cromatografia su strato cromatografia su strato sottilesottile o o TLCTLC, è una tecnica , è una tecnica cromatografica di semplice cromatografica di semplice preparazione; questo la rende preparazione; questo la rende particolarmente adatta per particolarmente adatta per l'esecuzione di valutazioni l'esecuzione di valutazioni qualitative o semi-quantitative.qualitative o semi-quantitative.

Come tutte le cromatografie, si Come tutte le cromatografie, si basa sulla diversa separazione basa sulla diversa separazione di diverse sostanze tra una di diverse sostanze tra una fase stazionaria ed una ed una fase mobile, in funzione , in funzione dell'affinità di ogni sostanza con dell'affinità di ogni sostanza con esseesse..


http://it.wikipedia.org/wiki/Immagine:TLC_schema_esplicativo.PNG


PRINCIPIO DI PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTOFUNZIONAMENTO

Tutti i componenti della miscela sono depositati Tutti i componenti della miscela sono depositati sulla lastra (fase stazionaria) e sono trasportati sulla lastra (fase stazionaria) e sono trasportati (eluiti) da un solvente (fase mobile) che si muove.(eluiti) da un solvente (fase mobile) che si muove.Nella TLC l’eluente si muove dal basso verso l’alto Nella TLC l’eluente si muove dal basso verso l’alto attraverso un strato sottile per capillarità.attraverso un strato sottile per capillarità.I composti si muovono con diversa velocità, in I composti si muovono con diversa velocità, in base alla diversa affinità della sostanza base alla diversa affinità della sostanza analizzata, verso un eluente e verso la fase analizzata, verso un eluente e verso la fase stazionaria.stazionaria.Si ha separazione poiché i composti più affini Si ha separazione poiché i composti più affini all’eluente si muovono di più sulla lastra.all’eluente si muovono di più sulla lastra.



FASE STAZIONARIAFASE STAZIONARIALa fase stazionaria è generalmente uno strato La fase stazionaria è generalmente uno strato dallo spessore uniforme di circa 1 mm di dallo spessore uniforme di circa 1 mm di materiale adsorbente, depositato su una lastra di materiale adsorbente, depositato su una lastra di vetro o plastica. Il materiale adsorbente può vetro o plastica. Il materiale adsorbente può essere gel di silice, allumina, cellulosa in polvere essere gel di silice, allumina, cellulosa in polvere o polvere di diatomee, tutti materiali polario polvere di diatomee, tutti materiali polari



AlCl

OAl

Cl

Al

OAl

O

AlO

OAl

O

Na

Na

acida (pH circa 4)

per acidi carbossilici eaminoacidi

neutra

per composti neutri

basica (pH circa 10)

per amine

Allumina: è ottenuta dall’idrossido di alluminio mediante opportuni trattamenti e disidratazione a 400-500°. Si può ottenere in tre forme:

Silice: la superficie dei granuli di silice è caratterizzata dalla presenza di gruppi silanolici (Si-OH) e di gruppi silossanici (Si-O-Si):

SiO

OH

O

O

SiO

SiO

OHO

OHO

Si Si Si

Sistema tetraedrico di SiO4

Fasi stazionarie (per TLC):


FASE MOBILEFASE MOBILE

La fase mobile è un solvente opportunamente La fase mobile è un solvente opportunamente scelto (od una miscela di solventi), capace di scelto (od una miscela di solventi), capace di separare i componenti della miscela da analizzare separare i componenti della miscela da analizzare e poco affine per polarità alla fase stazionaria e poco affine per polarità alla fase stazionaria scelta.scelta.



Esempio di serie di eluenti Con forza eluente crescenteSu fase fissa polare

n-pentanoisoottanocicloesanodi carbonioxilenetoluenebenzenecloroformiometilene clorurotetraidrofuranoacetoneacetato di metileanilinan-propanoloetanolometanoloacido acetico

La TLC utilizza un’ampia varietà di solventi, con diverso grado di polarità: potere eluotropo: forza con cui il solvente è in grado di trascinare l’analita lungo la lastrina; solventi apolari (idrocarburi alifatici quali esano o eptano) per soluti con polarità molto bassa; idrocarburi clorurati (CHCl3, CH2Cl2), tetraidrofurano, etere etilico, acetonitrile, alcool isopropilico: in ordine di polarità crescente

Fasi mobili (per TLC):



I vantaggi della tecnica TLCI vantaggi della tecnica TLCvisibilità delle sostanze che rimangono sul punto di visibilità delle sostanze che rimangono sul punto di

deposizionedeposizione

preparazione del campione spesso non necessariapreparazione del campione spesso non necessaria

utilizzo fasi mobili che assorbono in UVutilizzo fasi mobili che assorbono in UV

vasta scelta di reagenti chimici coloranti selettivivasta scelta di reagenti chimici coloranti selettivi

grande numero di campioni trattabili grande numero di campioni trattabili

simultaneamentesimultaneamente

velocità di condizionamentovelocità di condizionamento

TECNICA CROMATOGRAFICATECNICA CROMATOGRAFICALa traccia rossa è la sostanza più affine con l’eluente in quanto ha percorso un tragitto più lungo.

La traccia gialla rappresenta una sostanza meno affine all’eluente,infatti ha percorso una distanza minore.


Separazione TLC di estratto di Separazione TLC di estratto di pomodoropomodoro

Analizzare un concentrato di pomodoroAnalizzare un concentrato di pomodoro

Estrarre sostanze principali:Estrarre sostanze principali: licopene e licopene e ββ-carotene-carotene

Eseguire la tecnica cromatografica TLCEseguire la tecnica cromatografica TLC

Separare ed identificare componentiSeparare ed identificare componenti


Pigmenti nel concentrato di pomodoro:Pigmenti nel concentrato di pomodoro:

LICOPENELICOPENE: sostanza appartenente alla classe dei : sostanza appartenente alla classe dei carotenoidi, è il principale responsabile del colore rosso del carotenoidi, è il principale responsabile del colore rosso del pomodoro e di altri pigmenti gialli e rossi caratteristici di pomodoro e di altri pigmenti gialli e rossi caratteristici di alcuni frutti e verdure (albicocca, pompelmo, cocomero, alcuni frutti e verdure (albicocca, pompelmo, cocomero, uva). E’ presente nel sangue e in natura si trova sottoforma uva). E’ presente nel sangue e in natura si trova sottoforma di isomeri strutturali di tipo trans e in particolare nella frutta di isomeri strutturali di tipo trans e in particolare nella frutta e nella verdura fresca la percentuale risulta essere di e nella verdura fresca la percentuale risulta essere di 30mg/kg. Possiede un’altissima capacità antiossidante e 30mg/kg. Possiede un’altissima capacità antiossidante e antiradicali liberi, per questo viene utilizzato in molteplici antiradicali liberi, per questo viene utilizzato in molteplici applicazioni terapeutiche. Attualmente viene studiato per applicazioni terapeutiche. Attualmente viene studiato per curare le malattie degenerative delle cellule.curare le malattie degenerative delle cellule.


ββ-Carotene: -Carotene: sostanza appartenente allasostanza appartenente alla classe dei classe dei carotenoidi, determina il pigmento giallo-arancio di prodotti carotenoidi, determina il pigmento giallo-arancio di prodotti naturali, ad esempio della carota.naturali, ad esempio della carota.


Descrizione dell’esperienza:Descrizione dell’esperienza:Materiale utilizzato:Materiale utilizzato:

Bilancia tecnicaBilancia tecnica

Pipette graduatePipette graduate

2 becker, beuta, matraccio2 becker, beuta, matraccio

Cotone idrofiloCotone idrofilo

Sostanze utilizzate:Sostanze utilizzate:50g pomodoro concentrato50g pomodoro concentrato

DiclorometanoDiclorometano

N-esanoN-esano

Alcool etilico 95%Alcool etilico 95%

Sodio solfato anidroSodio solfato anidro


Procedimento:Procedimento:

Pesare nel becker 50g di concentrato di pomodoro e Pesare nel becker 50g di concentrato di pomodoro e aggiungere 70ml di etanolo al 95% e agitare bene con la aggiungere 70ml di etanolo al 95% e agitare bene con la spatola;spatola;Mettere un po’ di cotone sul fondo di un imbuto e filtrare la Mettere un po’ di cotone sul fondo di un imbuto e filtrare la miscela pressando leggermentemiscela pressando leggermenteTrasferire in becker la componente solida rimasta sul filtro;Trasferire in becker la componente solida rimasta sul filtro;Trattare con 50ml di Diclorometano ed agitare per 5minuti;Trattare con 50ml di Diclorometano ed agitare per 5minuti;Filtrare in un imbuto munito di cotone e raccogliere il Filtrare in un imbuto munito di cotone e raccogliere il filtrato in una beuta.filtrato in una beuta.Si anidrifica con sodio solfato anidro. Portare a piccolo Si anidrifica con sodio solfato anidro. Portare a piccolo volume in pallone da 100ml in rotavapor e portare a secco.volume in pallone da 100ml in rotavapor e portare a secco.


SEMINASEMINALa semina viene

effettuatacon il nostro campione da

analizzare,tramite un apparecchio chiamato microsiringa o con un semplice capillare per

punto di fusione; questo procedimento deve

essere fatto accuratamente


OSSERVAZIONIOSSERVAZIONIIl Il ββ-carotene è la -carotene è la componente che sale componente che sale con maggiore velocità con maggiore velocità sulla lastra a causa sulla lastra a causa della maggiore affinità della maggiore affinità con l’eluente.con l’eluente.Il licopene invece Il licopene invece viene rallentato viene rallentato perché instaura dei perché instaura dei legami con la fase legami con la fase stazionaria che è il gel stazionaria che è il gel di silice.di silice.

LicopeneCampioneββ-carotene-carotene


ANALISI DATIANALISI DATIL’analisi dei dati si L’analisi dei dati si basa su un fattore basa su un fattore chiamato: Rf chiamato: Rf

RfRf== corsa della macchiacorsa della macchia / /corsacorsa dell’eluentedell’eluente

Ogni sostanza ha un Rf Ogni sostanza ha un Rf diverso.diverso.


ANALISI A UVANALISI A UVQualora non sia possibile osservare direttamente le macchie di campione sulla superficie della lastrina - caso molto frequente - si può ricorrere all'osservazione sotto luce ultravioletta o alla reazione con reagenti che sviluppano composti colorati


CONCLUSIONICONCLUSIONI

La tecnica TLC permette di separare i La tecnica TLC permette di separare i componenti principali di una miscela;componenti principali di una miscela;

le sostanze estratte sono pure, cioè le sostanze estratte sono pure, cioè molto simili agli standard. molto simili agli standard.

E’ possibile estrarre i componenti dal E’ possibile estrarre i componenti dal pomodoro.pomodoro.


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