Comparison of indirect immunofluorescence and ID Screen ® Toxoplasmosis indirect ELISA for the detection of antibodies against Toxoplamsagondii in cat and dog sera.

Philippe Pourquier2, Gladia Macrì1, Manuela Scarpulla1, Laura Salvato1

(1) Instituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana (IZS LT), Rome, Italy (2) ID VET - Montpellier, Frankreich

Toxoplasmosis

� Toxoplasmosis is a zoonotic disease caused by a coccidian protozoan parasite, Toxoplasma gondii, that can infect warm-blooded animals, including man.

� Members of the cat family (Felidae) are the definitive hosts. They play an important role in toxoplasmosis spread because they excrete resistant Toxoplasma gondii oocysts into the environment.

� Many mammals and birds serve as intermediate hosts. Infection is contracted by ingesting either oocysts from the environment or meat containing live organismes.

� In dogs, infection may be asymptomatic. Abortion and central nervous system damage (in young dogs) may occur.

Lifecycle

Figure 1 : Life cycle of Toxoplasma gondii (from Dubey JP, Toxoplasmosis. J Am Vet Med Assoc 189:166, 1986 to Dubey)

Fig. 3 : Electron microscopie photo of an intracellulartachyzoite

Fig. 2 : Tissue cystfreed frommouse brain

Fig. 4 : Electron microscopie photo of a sporulated

oocyst

Toxoplasmosis serology� Toxplasmosis serology is performed

during human pregnancy, and thus is a question which has been studied extensively.

� ELISA, microagglutination and IFAT are the main tests used for Toxoplasmosis diagnosis

� In the veterinary field, commercial ELISAsare currently available for ruminants, but not for other species.

Toxoplasmosis serology� In Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle

Regioni Lazio e Toscana For dogs, microagglutination or IFAT is used. Agglutination, however, is difficult to interpret and therefore only IFAT is used.

� IFAT is difficult to implement for large sample numbers.

Aim

� ID VET has developed a multispecies kit that can be used on a large spectrum of mammals.

� This study compares IFAT and ID Screen ELISA

Method: ID Screen® Toxoplasmosis indirect ELISA

+ Sample *

Wash Wash

+ Conjugate + Substrate

P30 coatedmicroplates

Multi-species-PO conjugate

* Sample = serum, plasma or meat juice

Interpretation

� Read the optical densities at 450 nm

� Results are expressed as S/P%

STRONG POSITIVE

S/P ≥ 200%

POSITIVE50% ≤ S/P < 200%

DOUBTFUL40% < S/P < 50%

NEGATIVES/P ≤ 40%

StatusResult

OD(PC) – OD (NC)OD (Serum) – OD (NC)S/P% = 100 x

The P30 antigen

� Major surface antigen in the externalsurface of the plasma membrane.

� Reference antigen in human diagnostics.

Multi-species conjugate

� Proprietary conjugate recognizing a wide spectrum of mammalian antibodies

� Also used in other ID Screen kits (Toxoplasmosis, Neosporosis, Q Fever, Chlamydia, Trichinellosis)

External ValidationsSVILUPPO E VALUTAZIONE DELLE PERFORMANCE DI UNA ELISA HOME MADE DA UTILIZZARE PER LA DIAGNOSI INDIRETTA DI TOXOPLASMOSI OVINA

P.M. Mangili 1, G. Vesco 2, F. Feliziani 1, A. Paoloni 1, M. Menichelli 1, M. Cagiola 1, C. Marini 1, P. Pourquier 3, P. Papa1

1 : Istituto Zooprofilattico dell’Umbria e delle Marche2 : Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Sicilie3 : ID-Vet - Innovative Diagnostics Montpellier France

SVILUPPO E VALUTAZIONE DELLE PERFORMANCE DI UNA ELI SA HOME MADE DA UTILIZZARE PER LA DIAGNOSI INDIRETTA DI TOXOPLASMOSI OVINA

P.M. Mangili 1, G. Vesco 2, F. Feliziani 1, A. Paoloni 1, M. Menichelli 1, M. Cagiola 1, C. Marini 1, P. Pourquier 3, P. Papa1

1Istituto Zooprofilattico dell’Umbria e delle Marche ; 2Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Sicilie ; 3 ID-Vet - Innovative Diagnostics Montpellier France

Key Words: Toxoplasma gondii , Elisa indiretta, IFAT

SUMMARY

The performance characteristics of an ELISA test for toxoplasmosis was assessed using 416 samples collected from sheep located in endemic areas of Italy. Indirect immunofluorescence (IFAT) was used as the reference method. The diagnostic accuracy of the home made method and that one of a commercial Kit was considered to be high. In this study the ROC analysis was used as a tool for selecting cut-off points. Sensitivity, specificity, likelihood ratios and Youden's index were used as indices of test accuracy. Our results indicate that the ELISA applied to sera is a highly accurate test for indirect diagnosis of toxoplasmosis.

INTRODUZIONE La toxoplasmosi è una malattia di origine protozoaria notevolmente diffusa nella specie ovina; la sua diffusione è testimoniata dall’elevata sieroprevalenza riscontrata negli allevamenti. Tale patologia comporta notevoli problemi di ordine sanitario ed economico essendo responsabile di aborti, natimortalità e calo delle produzioni. Le indagini sierologiche rappresentano un valido strumento per la valutazione della diffusione dell’infezione negli allevamenti (1,5). Per la ricerca di anticorpi anti-toxoplasma è possibile utilizzare varie tecniche di analisi (DT, IFAT, MAT, ELISA). Il Manuale OIE definisce il Dye test (DT) come il gold standard per la ricerca di anticorpi anti-toxoplasma (2). Tuttavia tale metodica non si è dimostrata sempre utilizzabile in specie differenti da quella umana. In campo veterinario l’immunofluorescenza indiretta (IFAT) è considerato il test di riferimento, sebbene risulti avere tempi di esecuzione lunghi, costi elevati e risultati di difficile interpretazione legati alla soggettività dell’operatore (3,6). Per ovviare a tali inconvenienti e per effettuare lo screening di elevate quantità di campioni, è preferibile l’impiego di tecniche immunoenzimatiche (ELISA) (3,4) Scopo del presente lavoro è illustrare lo sviluppo di un test ELISA home-made per la ricerca di anticorpi anti-toxoplasma e valutare le performance di tale metodica mediante confronto con la tecnica IFAT di riferimento e con un test ELISA in commercio.

MATERIALI E METODI

Campioni di siero - In assenza di sieri di riferimento certificati, l‘IFAT è stata utilizzata per individuare campioni di siero ovino positivi e negativi per la presenza di anticorpi anti-toxoplasma e utilizzabili come controllo di reazione della tecnica ELISA. Uno stock omogeneo di controllo positivo e negativo è stato conservato a -20°C ed utilizzato p er la standardizzazione del metodo. Per la validazione del metodo ELISA è stata inoltre costituita una banca di 416 sieri ovini, scelti con criterio randomizzato tra quelli afferenti ai laboratori dell’IZSUM. Anche questi sieri sono stati analizzati con il metodo IFAT. Sviluppo test ELISA home made Antigene - Toxoplasma gondii ceppo RH è stato coltivato su linee cellulari di fibroblasti umani (HS68). Una volta raggiunta una concentrazione di tachizoiti pari a 5x108/ml si è proceduto all’estrazione dell’antigene mediante lisi, ottenuta con cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Il prodotto ottenuto è stato poi centrifugato a 4°C per 20 min. a 900 x g. ed il surnatante conservato a -70°C. fino al momento dell’uso.

Anticorpi policlonali anti-specie - Sono state utilizzate IgG policlonali anti-ovino, prodotte secondo la metodica comunemente utilizzata nei Laboratori del nostro Istituto, purificate e coniugate con perossidasi del rafano. Descrizione del metodo - Piastre per prove immunoenzimatiche in polistirene (Nunc- Polysorp) vengono sensibilizzate tramite adsorbimento dell’antigene opportunamente diluito in tampone carbonato/bicarbonato a pH 9.6, ed in seguito incubate overnight a 4°C. Dopo lavaggio con tampone PBS a pH 7,4 con Tween 20 allo 0,05% (PBST), si provvede a dispensare 100 µl di campioni di siero in esame e dei sieri di controllo, previa diluizione 1/40 con PBST addizionato del 1% di siero bovino fetale (PBSTB). I campioni devono essere distribuiti in doppio; i sieri di controllo positivo e negativo vengono saggiati in quattro repliche ciascuno. Dopo incubazione per 1h30’ a 37°C in camera umida e successivo lavaggio, vengono dispensati nei pozzetti 100µl di anticorpi anti-specie diluiti in PBSTB. Seguono un’ulteriore incubazione delle piastre per 30’ a 37°C in camera umida e lavaggio con PBST. Si aggiunge il substrato di rivelazione (1:100 TMB 10 mg/ml in tampone acetato pH 6) e, dopo circa 15’, si esegue la lettura mediante spettrofotometro ad una lunghezza d’onda 450nm, previa aggiunta di acido solforico 0,5M. Validazione del metodo - Sono stati collezionati i dati sperimentali delle prove effettuate con i sieri standardizzati e con i 416 campioni di siero ovino della banca sieri. Il cut off è stato stabilito attraverso l’analisi statistica dei dati ed in particolare utilizzando il metodo Receiver operator characteristics (ROC) curves (7) mediante il software analyse-it. Test ELISA commerciale - I campioni sono stati analizzati mediante test commerciale “Toxoplasmosis Indirect” (ID.VET Innovative Diagnostics) seguendo le indicazioni fornite dal produttore. Valutazione delle Performances – E’ stata realizzata un’analisi statistica dei risultati espressi dalle prove Elisa; le valutazioni sono state condotte sia singolarmente sia considerando i due test in associazione. I principali indicatori di performances dei test sono stati stimati con l’ausilio del software WIN EPISCOPE 2.0 prodotto freeware elaborato dalle Università di Edimburgo, Saragozza, Utrecht e Wageningen.

RISULTATI E DISCUSSIONE Test ELISA home made - La standardizzazione del metodo ELISA home made è stata condotta analizzando diluizioni scalari dei campioni di controllo. I sieri e i controlli sono stati analizzati prevedendo l’impiego oltre ai due pozzetti per l’analisi in doppio anche un pozzetto con falso antigene (FA) per evidenziare eventuali reazioni aspecifiche dei sieri in esame. Il calcolo dei risultati quindi è avvenuto utilizzando la seguente formula:

s/p= media DO campione - DO campione (FA)

media DO controllo Pos - DO controllo Pos (FA) 416 sieri scelti con criterio random e classificati come positivi e negativi per la presenza di anticorpi anti-toxoplasma mediante l’impiego del test IFAT, sono stati esaminati con il

External Validations

� Detection of antibodies to Toxoplasma gondii in serum from experimentally infected pregnant ewes.

� Proctor AF 1, O’Donovan J 2, Marques PX1, Gutierrez J 1, Sammin D 3, Brady C2, Worrall S 1, Nally JE 1, Bassett H 1, and Markey BK 1

� 1. School of Agriculture, Food Science and Vet. Med., Univ. College Dublin, Ireland. 2. Central Vet. Research Lab, Dept. of Agriculture, Fisheries and Food, Ireland. 3. Regional Veterinary Lab, Department of Agriculture, Fisheries and Food, Kilkenny

� Other external validations ongoing (swine, chicken, dogs etc..)

Methods : Indirect Immunofluorescence (IFAT)IFAT was performed with :� Commercial slides (Toxoplasma gondii, Fuller-Laboratories

Fullerton, CA USA, Ref TX-12) � Anti-dog IgG conjugate (Anti-dog IgG FITC conjugate, SIGMA Ref.

F4012) or an anti-cat IgG conjugate (Anti-cat IgG FITC conjugate, SIGMA Ref. F4262).

� Sera were tested at a screening dilution of 1:20 and positive sera diluted twofold and re-assayed to the end point.

Negative IIF result Positive IIF result

Materials and Methods

� Samples tested : - 110 cat sera- 85 dog sera

� Tested by IFAT and the ID Screen® ELISA in the Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Regioni Lazio e Toscana (IZS LT), Rome, Italy

Results – cat sera

� 66/67 cat negative by IFAT, were also negative by ELISA. One serum was IFAT-negand ELISA-pos, and had a S/P near the cut-off (55%).

� 42/43 cat sera positive by IFAT were also positive by ELISA. The discordant serum had an IFAT titre of 20.

1106743Total

67661IFAT negative

43142IFAT positive

TotalELISA Negative

ELISA Positive

Results – dog sera� 40/44 dog sera positive

by IFAT were also positive by ELISA. The four discordant sera had mainly low IFAT titres and S/P values near the cut-off.

� 39/41 dog sera negative by IFAT were also negative by ELISA; among the two discordant sera, one serum was ELISA-doubtful and one ELISA-positive.

854342Total

41392IFAT negative

44440IFAT positive

TotalELISA Negative

ELISA Positive

S/P distribution dog sera n=85

05

1015

20253035

0-10

11-2

021

-30

31-4

041

-50

51-6

061

-70

71-8

081

-90

91-1

0010

1-11

011

1-12

012

1-13

013

1-14

014

1-15

0>1

50

s/p

num

ber

of s

era

test

ed

IFAT-positive IFAT-negative

Negative Zone

Positive Zone

Dou

btfu

l zon

e

Discussion

� For cat sera, the agreement between ELISA and IFAT was high, with only 2/110 discordant results.

� For dog sera, the observed agreement between ELISA and IFAT was slightly lower, with 6/85 samples giving results around the ELISA or IFAT cut-off. The borderline titers could be the result of older infections

� Such discrepancies are commonly observed when comparing serological techniques, especially for samples near the threshold. This phenomenon can be explained as small difference in analytical sensitivity of these tests.

Conclusion

� The ID Screen Toxoplasmosis Indirect ELISA, already validated for ruminants and swine, gives reliable results for the detection of anti-Toxoplasma gondiiantibodies in cat and dog sera.

� It is an easy-to-use method for T. gondiiantibody detection in multiple species.

Thank you for your attention !