Scuola di Specialità

Argomento

• Immunità naturale

Recettori

8-10-12

Risposta immune innata

-E’ la prima linea di difesa

-L’approfondimento della ricerca di

quest’arma potente è stata sottovalutata

per la scoperta degli anticorpi,

cellule B e T.

Immediate protection

Low specificity broad reactivity

Important for first exposure

Innate immunity

Tre linee di difese contro le infezioni

Difese dell’organismo

Cute e mucose

Superfici labili, movimenti peristaltici, clearance mucociliare, vomito, urine lacrime,

tosse.

Difese Umorali e Cellulari Innate

Lisozima, secrezioni sebacee /mucose, acidità stomaco, organismi commensali,

proteine del complemento,

fagocitosi, cellule NK

Invasione & infezione

Barriere

Immunità Innata

Immunita Adottiva

+

+

Infiammazione Difese Umorali e Cellulari Specifiche

Anticorpi, citochine,

Linfociti T helper, linfociti T citotossici

Reazione della microcircolazione caratterizzata da movimento di

fluidi e leucociti dal sangue ai tessuti extravascolari con lo scopo

di bloccare e riparare i danni fisici (ferite, bruciature, traumi) o

eliminare agenti patogeni ( virus,batteri,funghi,cellule tumorali).

Infiammazione

Comparison of Innate and Adaptive

immune system

Innate Adaptive

Receptors/Ligands

Conserved

Immediate

Fully mature at birth

Diverse

Slow,

increase with time

(i.e. memory)

Immature at birth

Comparison of the adaptive and innate immune responses

innate adaptive

Response time hours days

Response to identical to primary stronger response upon

repeat infection (no memory) second exposure (memory)

Receptors that pattern recognition receptors antibodies and T cell antigen receptors (TCR)

Mediate pathogen e.g. Toll-like receptors (TLR)

Recognition limited diversity, unlimited diversity

fixed in germline generated by V(D)J recombination

Ligands Pathogen associated molecular virtually any component of pathogen

patterns (PAMPs)

Comparison of innate and adaptive immune recognition

Receptors that mediate

innate immune recognition: Toll-

like receptors (TLR)

Receptors that mediate adaptive immune recognition:

Antibody and the T cell receptor (TCR)

• B cells

• T cells

• NK cells

• Monocytes/macrophages

• Neutrophils

• Eosinophils

• Basophils/Mast cells

Cells of the immune system

Cell types of innate immunity

Immunità innata e acquisita

Takeda and Akira. Int Immunol 2005;17:1-14

Componenti dell’ immunità innata • Humorale • Systema del Complement

• Citochime/chemochine

• Diversi enzimi

Cellulare Granulociti

Monociti/macrofagi

Cellule NK

Mastociti

Cellule Dendritic he

Cellule epiteliali

Fibroblasti

Adipociti

Recettori

Caratteristiche e meccanismi dell’immunità innata

• Presente in tutti gli organismi multicellulari.

• Prima linea immunologica di difesa contro le infezioni.

• Funziona prima dello sviluppo dell’immunità specifica (adattativa).

• L’attivazione del sistema immune innato è cruciale per una protezione

adeguata dell’immunità acquisita (TH1 o TH2) (Kimbrell & Beutler 2001 Nature Rev 2).

• In alcuni casi è sufficente per controllare o eliminare l’infezione.

• Cooperazione vicina all’immunità specifica.

Riconoscimento dei prodotti microbici

Conservato tra I microbi.

Conosciuto come “patroni molecolari associati ai patogeni” (PAMPs).

PAMPs possono essere riconosciuti da sistemi immuni di piante e di animali.

Soltanto I vertebrati hanno un sistema immune adattativo.

• Riconoscono dei profili molecolari associati al patogeno

(PAMPs: Pathogen-associated molecular patterns)

Doan et al. Le basi dell’immunologia. Zanichelli

• I microrganismi patogeni vengono RICONOSCIUTI

dall'immunità innata grazie a molecole recettoriali dette

Pattern Recogntion Receptors (PRR). Sono in numero

limitato. Direttamente codificati nel genoma.

Pathogen / Danger

Associated Molecular Patterns

(PAMPs / DAMPs)

PAMPs: componenti unici dei microrganismi (non prodotte

dall'ospite) spesso essenziali per il patogeno.

es. LPS, acido lipoteicoico, GPI, CpG, RNA a doppia elica,

flagellina.

DAMPs: sono prodotte nel ospite durante l’infiammazione

o possono provenire dal esterno.

es. heat-shock proteins, RNA da cellule morte, proteina

BA, Mrp8/14, fosfolipidi ossidati, fibrinogeno, acido

ialuronico, silica, asbestos.

Amplificano la risposta infiammatoria

LPS: Carboidrati e Lipidi

Peptidoglicano: Carboidrati e Proteine

PAMPs:

Piccoli motivi invariati tra microrganismi della stessa classe

(zuccheri, proteine, lipidi, acidi nucleici o combinazioni).

Essempi:

Recettori dell'immunità innata

• Possono essere

– secreti (solubili),

– localizzati sulla membrana plasmatica

– intracellulari

• Ogni cellula esprime più di un tipo di recettore

• Il numero dei recettori PRR è limitato

Recettori solubili

• Riconoscono strutture microbiche

• Riconoscono strutture alterate del self

Recettori solubili

• Fattori del complemento – MBL: lectina legante il mannosio

• Pentrassine

– Corte (PCR) prodotte dal fegato – Lunghe (PTX3) prodotte dai tessuti

extraepatici

• Aumentano fortemente durante la risposta

infiammatoria

• Recettori del complemento (CR3, CR4)

• Recettori Fc (frammento cristallizzabile Ab)

• Recettore per il mannosio

• CLRs (C-type lectin receptor)

• SRCR

• Scavenger receptor cysteine rich (acidi nucleici, acido lipoteicoico G+)

• TLR • Toll-like receptor

Recettori localizzati

sulla membrana plasmatica

Recettori della famiglia Toll

• Costituiscono la classe più importante di recettori dell'immunità innata

• Possono riconoscere PAMPs sulla membrana cellulare o da vescicole intracellulari quali gli endosomi

• Scoperto in Drosophila melanogaster come gene importante per l’orientamento dorso-ventrale dell’insetto e per la resistenza ai funghi

• Parola dal tedesco che significa: grande, magnifico.

Christiane Nüsslein-Volhard

Nobel laureate (Medicina 1995)

• Insieme a Wieshcaus ha identificato i geni coinvolti nello svillupo degli

embrioni della Drosophila melanogaster. (1985)

• Lei ha chiamato alla proteina: “Toll” (che in tedesco singifica grande,

magnifico).

Toll gene

1988 TOLL gen: importante per lo sviluppo di polarità dorso-ventrale della Drosophila (Hashimoto)

1996 TOLL gen: controlla la risposta antifungica nella Drosophila (Lemaitre)

1997 Toll umano omologo al toll delle proteine toll d’attivazione dell’immunità nella Drosophila (Medzhitov and Janeway)

1998 Si scopre che topi con un’alterata risposta al LPS era dovuto ad una mutazione del gene TLR4 (Beutler)

L’osservazione che il recettore Toll aveva un dominio in comune con il recettore dell’IL-

1 (IL-1R) portò all’ipostesi che Toll era coinvolto nella immunità innata.

Source: www.darwin.museum.ru

Aspergillus fumigatus

Esperimento su Drosophila

Aspergillus fumigatus

Lemaitre et al., Cell 1996; 86: 973-83

• Infected Tl-deficient adult flies with Aspergillus fumigatus

• All flies died after 2-3 days

• Flies use Toll to defend from fungi • Thus, in Drosophila, Toll seems to

be involved in embryonic development and adult immunity

Recettori Toll-like

• Sono codificati nella linea germinativa (non

sono prodotti per ricombinazione somatica

dei geni come i recettori dell'immunità

specifica)

• La loro espressione è modulata dai patogeni,

dalle citochine e da vari stress ambientali

• Il recettore Toll è stato clonato da Schneider e

Anderson

• Sono i primi PRR ad esere identificati.

• Sono i PRR meglio caracterizzati e

riconoscono una ampia gama di PAMPs (Akira

et al. 2006, Beutler, 2009; Hoffmann, 2003;

Medzhitov, 2007).

Recettori Toll-like

La risposta dell’immunità innata è stata conservata tra la Drosophila e gli umani

Conserved pathways in innate immunity in Drosophila and mammals

Examples chosen are, left: induction of the antifungal gene drosomycin by binding of processed Spaetzle protein to the transmembrane receptor Toll Right: activation of costimulatory protein genes by binding of a LPS-LBP-CD14 complex to a human Toll homolog, TLR

Source: Hoffman 1999 Science 284

Recettori toll-like (TLR)

• Si localizzano sia a livello

della membrana plasmatica

che a livello endosomiale

• Sono proteine

transmembrana che hanno

un comune dominio

extracellulare, ricco di

leucina e un dominio

citoplasmatico comune.

Insert Fig 3-11

Different mammalian Toll-like receptors (TLRs) are specific for different classes of microbial products

TLR

Omologo al IL-1R Regione extracellulare: • TLR: ricco in leucina • IL-1R: 3 domini immunoglobulinici

Porzione citoplasmatica: • dominio TIR (Toll/IL1receptor) nei

mammiferi, il dominio TIR è condiviso dai recettori Toll e dai recettori di IL1

• conservato nell’evoluzione dalle piante all’uomo.

• attiva una cascata di eventi che porta all’attivazione dei meccanismi di resistenza innati

Takeda and Akira. 2005. Int Immunol 2005;17:1-14

Dominio extracellulare:

Leucin Reach Repeat motifs (LRR)

BINDING

Dominio citoplasmatico:

Toll-interleukin 1 resitance (TIR) domain

SIGNALING

Due domini dei TLRs: Extracellulare-Citoplasmatico

TLR Cell Type Distribution

Receptor Cell Type

TLR1 Ubiquitous

TLR2 DCs, PMLs, and monocytes

TLR3 DC and NK cells, upregulated on epithelial and endothelial cells

TLR4 Macrophages, PMLs, DCs, ECs, but not on lymphocytes

TLR5 Monocytes, immature DCs, epithelial, NK, and T cells

TLR6 High expression in B cells, lower on monocytes and NK cells

TLR7 B cells, plasmacytoid percursor DCs

TLR8 Monocytes, low in NK cells and T cells

TLR9 Plasmacytoid percursor DCs, B cells, macrophages, PMLs, NK cells, and microglial cells

TLR10 B cells, plasmacytoid precursor DCs

TLR11 Not Determined

Different mammalian Toll-like receptors (TLRs) are specific for different classes of microbial products

PGN

Gram+

Micoplasmi,

micobatteri,

spirochete

Zymosan

Lieviti

TLR1 TLR2

TLR2 TLR6

T

I

R

T

I

R

T

I

R

T

I

R

Ancora GPI

Tripanosoma

Eterodimeri costituiti da TLR1 e TLR2

o TLR2 e TLR6 riconoscono i

peptidoglicani della parete batterica

e costituenti di funghi, micoplasmi,

micolbatteri, spirochete e parassiti.

TLR3

TLR5

TLR4

T

I

R

T

I

R

T

I

R

RNA Doppia elica flagellina

T

I

R

CD14 MD2

LPS

LTA HSP60

TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 riconoscono acidi nucleici derivati da virus e batteri

Si trovano in compartimenti intracellulari e i loro ligandi devono essere internalizzati negli endosomi per attivare il segnale

La loro attivazione porta alla produzione di IFNs di tipo I oltre che di citochine

I recettori Toll portano all’attivazione di geni

proinfiammatori

Principale meccanismo è l’attivazione di NFkB

The NF-kB Family of Transcription

Factors • Trovato in tutti i tipi di cellule

• Descritto per la prima volta nel 1986 come un fattore nucleare

• E’ fondamentale nell’induzione di molte proteine infiammatorie: citochine, proteine di fase acuta, molecole di adesione

• NF-kB esiste nel citoplasma come un eterotrimero inattivo composto da due proteine (p50 e p65) e un inibitore detto inibitore di kB (IkB)

• Chinasi fosforilano IkB. IkB fosforilato si stacca dal complesso proteico che quindi migra al nucleo dove si lega a siti di consenso NFkB situati a monte di diversi geni infiammatori

IkB IkB p50 p65

p50 p65

P P

NFkB

Radiazioni,

radicali liberi

TLR

patogeni

IL1 TNF

citochine chemochine Molecole di

adesione

NO sintasi

COX2

Fattori della

coagulazione

-Produzione di citochine

e chemochine pro-

infiammatorie

-Attivazione del

complemento

-Reclutazione di

cellule fagocitiche

-Mobilizzazione di

cellule APC

Funzioni effetrici dei TLRs:

MyD88 è costituita da un dominio TIR

(rosso) e da un dominio DD (death

domain, dominio di interazione

proteina-proteina; verde)

Grazie a DD, MyD88 recluta alcune

chinasi denominate IRAK

Le IRAK fosforilano un adattatore

(TRAF6) che recluta chinasi

diverse

A valle di TRAF6 viene attivata una

via che attiva NFkB e una via che

porta all’attivazione delle chinasi

da stress (JNK, p38)

IL-1R

MyD88

TRAF6

IRAK

TLR4

MyD88

TRAF6

IRAK

TAK1 MKK6

NF-kB JNK, p38 NF-kB

TAK1 MKK6

JNK, p38

Essempio: TLR4

TLR4 TLR 4 rileva la presenza

di batteri Gram-

attraverso la presenza

di LPS.

Il dominio extracellulare

di TLR4, cooperando

con CD14 e con la

proteina accessoria

MD-2, riconosce LPS.

Topi con mutazioni o mancanti di TLR4 e topi

mancanti di MD2 sono altamente suscettibili a

infezioni da Gram- (Qureshi ST et al. J. Exp.

Med 1999; Nagai Y et al. Nat Immunol 2002)

Modulazione di TLR-4 come strategia

per trattare la sepsi

Overstimolazione di TLR-4 nella sepsi

Nell’uomo: elevati livelli di MD-2 si ritrovano nel plasma e nelle urine di pazienti con infezioni gravi o sepsi.

L’espressione di TLR4 è aumentata in monociti da volontari a cui è stato somministrato LPS e nei pazienti con sepsi

Modulatori di TLR-4

Mrp8/14 o S100A8/S100A9 o calprotectin

• Etrodimero rilasciato da neutrofili e monociti

(essempio di DAMPs)

• Diverse patologie infiammatorie (artrite reumoatoide,

fibrosi cistica, bronchite cronica) si associano a

elevati livelli di concentrazione plasmatica di

MRP8/14

• Marker di processi infiammatori

Mrp8/14 lega TLR4 e amplifica

l’infiammazione

Topi mancanti di Mrp8/14 hanno ridotti segni di infiammazione

sistemica quando infettati con E.coli e sono protetti da shock

Elevati livelli di Mrp8/14 si trovano nel plasma di pazienti con

peritonite e sepsi

• Myeloid-related protein 8/14 complex is released by monocytes and granulocytes at the site of coronary occlusion: a novel, early, and sensitive marker of acute coronary syndromes

• L.A. Altweggl et al., 2007, European Heart Journal, Vol 28, p.941-948

Figure 5 Percentage of patients with myocardial infarction (MI)

and levels above the respective cut-offs for MRP8/14 and the

classical markers of myocardial necrosis in relation to time (h;

hours) from symptom onset to blood sampling. The number of

patients for the three different time intervals are 4, 11, and 9,

respectively. Patients presenting after 12 h are not shown.

CONCLUSION

This study for the first time demonstrates

that MRP8/14, a heterodimeric protein

complex expressed by activated

monocytes and granulocytes, is elevated

in ACS (acute coronary syndromes) at

the site of coronary occlusion and in the

systemic circulation. Importantly,

MRP8/14 was increased prior to necrosis

markers such as myoglobin, CK-MB, and

troponin, and separated patients with

ACS from those with stable or no CAD

(coronary artery disease ). This makes

this protein a prime candidate and a novel

biomarker of unstable plaques in patients

with chest pain.

Toll come bersaglio terapeutico

Modulatori endogeni della risposta

infiammatoria possono indurre una mancata

regolazione della risposta immune come si

osserva nella sepsi.

Mpr8/14 potrebbe essere uno di questi

modulatori endogeni

Anticorpi Anti TLR4

Inibiscono in vitro la risposta di cellule

immunitarie a LPS o a batteri Gram-

Proteggono dalla morte topi esposti a

endotossina o a E.coli (Roger et al. PNAS,

2009)

Eritroran: antagonista del TLR4

Eritoran (molecola

sintetica, analoga del

lipide A) inibisce

l’attivazione di TLR4

legando MD-2 in una

tasca idrofobica.

(Esai Co.) Crystal Structure of the TLR4-MD-2 Complex with Bound Endotoxin Antagonist Eritoran Kim HM et al. Cell 2007

ERITORAN

• In vitro blocca la produzione di citochine dal

sangue intero

• Nei pazienti diminuisce i sintomi clinici (per

ess. febbre) e la risposta infiammatoria (conta

leucociti, livelli di PCR, IL-6, TNF-a) indotta

da endotossina in volontari sani

TLR4 signaling pathway potrebbe costituire un

importante target terapeutico

Varie molecole potrebbero diventare nuove

terapie adiuvanti capaci di diminuire gli effetti

deleteri di una eccessiva risposta

infiammatoria

Recettori intracellulari

TLRs (Toll-like receptors) (Takeda and Akira, 2005)

NLR family (Nod-like receptor) (Meylan et al., 2006)

Recettori di membrana Possono riconoscere PAMPs

sulla membrana cellulare

o da vescicole intracellulari (endosomi)

Recettori del citosolo: Possono riconoscere molecole

microbiche nel citosolo

Sensori del DNA Burckstummer et al., 2009; Fernandes-Alnemri et al. 2009;

Hornung et al., 2009, Roberts et al.,

2009, Takaoka et al., 2007)

RLRs (RIG-like helicases)

sensori del RNA (Yoneyama and Fujita, 2007)

CLRs (C-type lectin receptors) (Huysamen and Brown, 2009)

Attivazione intracellulare dei NLRs: sensori di bacteri, virus, segnali di pericolo

Meylan 2006

Struttura dei NLRs

Meylan 2006

N-terminal domain C-terminal domain (recognize microbial agents)

L’Inflammasoma: un complesso multiproteinico

PYD

NATCH

PYD

CARD CARD CARD CARD

NALP3

Cardinal

ASC

NLR

Adapter

Caspase-1

Promuove la secrezione di IL-1b, una citochina pro-infiammatoria

NALP1 NALP3 NLRC4

Tipi d’inflammasoma:

L’inflammasoma NALP3 è un sensore generale di stress cellurare:

la fagocitosi di particole inerti risulta nell danno al fagolisosoma

• Monosodio urato

• Asbestos

• Beta amiloide

– Proteina insolubile asociata all’Alzheimer

• Ossido di silicio («silica»)

• Pigmento malarico (emozoina)

normal x-ray silicosis -- diffuse

Chest x-rays – silicosis

• E’ una malattia polmonare grave, irreversibile, non-curabile, dovuta alla’inalazione del silicio.

• E’ caratterizzata per una infiammazione acuta e fibrosi polmorane irreversibile alterandone così la capacità respiratoria (cioè l’intercambio di anidride carbonica ed ossigeno).

Il ossido di silicio causa la Silicosi

Se è silicio, non è solo polvere!

SiO2 attiva l’inflammasoma per la

produzione di IL-1b

(Hornung J Immunology 2008)