ABI-7700 User Bulletin #5

3 www.biorad.com

2a.excitationfilters

2b.emissionfilters

1.halogentungstenlamp

4.sampleplate

3.intensifier5.ccddetector350,000pixels

Real-time qPCR

- La fluorescenza aumenta ad ogni ciclo in maniera proporzionale alla quantità di prodotto.

Comparing Ct Values

Curva di dissociazione Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati

e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione

FRET

* stessa Tm (58-60° C)

* 15-30 basi di lunghezza

* contenuto in G+C del 30-80%

* no runs di 4 o più Gs (o altri nucleotidi)

* non più di due G+C all'estremità 3’

* nessuna G all'estremità 5'

* dimensioni dell'amplicone 50-150 bp

* scegliere le giunzioni esone esone nel cDNA

Molecole che hanno la massima sovrapposizione di spettro con il fluoroforo e non hanno una fluorescenza nativa (da qui il nome dark)

Quenchers: Dark Quenching

FRET

•  il quencher è quasi sempre il Dabcyl

•  multiplex

Al terminale 5’ del probe vi è il fluoroforo mentre al terminale 3’ vi è una sequenza (PCR primer) che è specifica per l’ estensione del target. Il probe è legato al terminale 5’ del PCR primer per mezzo di un “blocker”. Il Quencer si trova al 3’ di un oligo complementare alla sequenza del probe.

Sonde d’Ibridazione donatore

accettore

La pendenza delle log-linear phase riflette l’efficienza di amplificazione

L’efficienza di una reazione può essere calcolata con la seguente equazione: Eff = 10 (-1/slope) - 1

L’efficienza di una PCR ottimale dovrebbe essere circa 95-100% (pendenza ideale = -3.3)

Un gran numero di variabili possono influenzare l’efficienza della PCR. Tra questi fattori vi sono la lunghezza degli ampliconi, le

strutture secondarie, i primer stessi etc.

EFFICIENZA

Xn = X0(1+E)n

Xn = prodotto di PCR dopo il ciclo n; X0 = numero iniziale di copie E = efficienza di amplificazione n = numero di cicli

Quantificazione

ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto

 Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve)

 Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni

RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT

 Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve)

 Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro ΔCT con quello del controllo endogeno

10 7

10 6 10 5

10 4 10 3

10 2 10 1

15

2 3 4 5 6 7

Log10 quantity

Ct

unknown sample

3500 copies

35

25

1

Albumin (ALB) gene dosage by real-time PCR

The copy number of ALB (x) can be calculated as follows: y = -3.374x + 40.593, where the Ct value is substituted as y.

Plot di amplificazione

Numero di cicli

ΔCT

Sample Control

Quantizzazione assoluta curva standard, possibilmente con “lo stesso DNA” accuratezza nella quantizzazione dello standard Es. utile per la determinazione della carica virale di un campione

Quantizzazione relativa curva standard con un controllo “interno” diluizioni seriali di uno standard (hk gene) Es. utile per studi di espressione genica

Fold = 2ΔCt

Quantizzazione comparativa determinazione matematica il campione di riferimento (controllo vs hk gene) è considerato 1x Es. serve per verificare il trends di un analisi

Fold Change = 2ΔΔCt

IL1-bvit

RPLP0vit

IL1-bcon

RPLP0con

av=19.80

av=19.93

av=18.03

av=29.63

control

experiment

Quantizzazione Comparativa - metodo del ΔΔCt

Fold = 2ΔCT (assumendo efficienza del 100%)

2 ΔΔCt esprime la variazione del templato nelle due condizioni (assumendo efficienza del 100%)

Fold change = 211.40 = 2702

ma l'efficienza x IL1-beta è 96% Fold change = 1.9311.40 = 1800

Methylation detection

Quota residua di cellule neoplastiche non eradicate dalla terapia di induzione della remissione o dalle successive misure terapeutiche.

•  Perché studiare l’espressione della tirosina Idrossilasi (TH) Le cellule di Neuroblastoma (NB) sintetizzano catecolamine il cui valore è alterato nel 95% dei pazienti. La TH è uno dei marker tumorali tessuto-specifici espresso dalle cellule di NB, ma non dagli altri tumori a piccole cellule rotonde. Anche i valori di HVA e VMA sono notevolmente aumentati.

•  Pertanto l’espressione di questo enzima può essere utilizzata per identificare le metastasi midollari al momento della diagnosi e per monitorare lo stato della MRD (Minimal Residual Disease) in modo da individuare eventuali segnali precoci di ricaduta in pazienti in remissione clinica.

TH (Tirosina Idrossilasi)

Enzima che catalizza la prima reazione di biosintesi delle catecolamine

Rilevazione di diversi retrovirus umani mediante Multiplex Real-Time PCR

Primer x amplificare: Gene gag di HIV-1 Gene env di HIV-2 Gene tax di HTLV-1 Gene pol di HTLV-2

Usati beacon diverse associate a fluorofori specifici

Single-gene copy numbers

Barrois M et al. Clin Genet 2004 (www)