Post on 24-Aug-2020
AGENDA
• CHAPITRE II : METHODES D'ETUDE DE LA CELLULE
• I / ETUDE MORPHOLOGIQUE:
A ) LE MICROSCOPE OPTIQUE (ou PHOTONIQUE) Quelques aspects avancés
B ) LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE
C) MICROSCOPIES EN CHAMP PROCHE
• II / DETERMINATION DE LA NATURE CHIMIQUE DES CONSTITUANTS CELLULAIRES
A / ANALYSE CHIMIQUE GLOBALE
B / METHODES CYTOCHIMIQUES
III / DETERMINATION DU CHEMINEMENT D'UNE SUBSTANCE :
AUTORADIOGRAPHIE et FRAP
IV / AUTRES TECHNIQUES
A / LES CULTURES
B / CYTOMETRIE
Sans le microscope…
• On fait pitié.
• Notre résolution maximale :
Nous ne pouvons pas distinguer deux objets (ou points) qui se situent plus près que 0,1 mm.
But de la microscopie…
• Voir la structure fine des objets biologiques
• Explorer les propriétés moléculaires des échantillons !
(fixés ou vivants), de manière non-invasive (non-destructive) :!
- Localisation : marquages, colorations, colocations…!
- Dynamique : Time-lapse, FRAP, FCS, …!
- Interactions : FRET, FLIM, …!
Comment voir les détails d’un échantillon ?!
…élémentaire, mon cher Watson !!
Autre réflexion :
Le monde microscopique est très différent de notre monde macroscopique.
La microscopie
Introduction:
• La taille moyenne d’une cellule est 20 µm, inaccessible à l’oeil nu.
• Nous avons donc besoin d’une prothèse, le microscope. L’organe
permettant de décrire une forme étant l’oeil, les premiers microscopes
furent donc optiques ou photoniques, avant de mettre à profit d’autres
rayonnements ou effets physiques.
Cours de Cytologie
BASES DE LA MICROSCOPIE
Qu’est ce qu’un microscope?
Instrument qui: - donne une image grossie d’un petit objet (grossissement)
- sépare les détails de celui-ci sur l’image (résolution)
- rend les détails visibles à l’œil ou avec une caméra
Le microscope est une évolution de la loupe,
utilisée dès le XIIème siècle.
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Le microscope permet d'observer les cellules d'un tissu, mais dans des conditions très strictes :
il faut que l'objet à examiner soit transparent à la lumière. Les objets biologiques ne le sont que rarement,
à l’exception des objets naturellement très minces : suspensions (sang, ..) ou cultures cellulaires.
“Kitab al-Manazir , le livre des optiques, el Hasan Ibn al-Haytham - donne une
expression « المظامالبيت » ce qui signifie camera obscura
L’optique et la microscopie
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1632: Invention du microscope optique
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-Anton Van Leeuwenhoek (1632-1723), naturaliste Hollandais et marchand
d’étoffes, connu comme étant le père du microscope optique.
- Il développa la conception du microscope.
1632: Invention du microscope optique
Il fabriqua ses propres microscopes, constitués chacun d’une petite plaque de métal portant
une lentille simple extrêmement convexe qui permettait d’observer l’objet monté sur une
pointe très fine.
Grossissement: X 266
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Les origines du microscope!
1632: Invention du microscope optique
- En 1680 Anton Van Leeuwenhoeck a fait les premières observations en microscopie optique
avec un grossissement de 300 fois environ.
- Il publie ses lettres et ses dessins de bactéries, protozoaires, spermatozoïdes,
globules rouges et autres dans la revue Philosophical Transactions of Royal Society.
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1665: découverte des cellules grâce au microscope
1665 : Robert Hooke découvre des cellules dans du liège en utilisant les premiers microscopes.
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Echelle des dimensions
Diagramme représentant l’échelle des dimensions aux
niveaux atomique, moléculaire, biologique et cosmique
L’unité choisie est le nanomètre. (D’après A. Lehninger,
1974).
CARACTÉRISTIQUES OPTIQUES
DU MICROSCOPE -
CLASSIFICATION DES MICROSCOPES
• En transmission (MET)
• À balayage (MEB) (ou SEM)
Microscope optique
• Simple
• Composé
Microscope électronique
• À effet tunnel
• Piezo
Autres type de microscope
L’optique/ principe
Structure du microscope optique
Laser
Lampe UV
…
Absorbants
Diffusants
Dépolarisants
Fluorescents
…
Objectifs
Lentilles
…
Caméras
Photodiodes
…
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L’optique
Structure du microscope optiqueCours de Cytologie
Caractéristiques d ’un microscope
L ’intervalle optique Δ
La latitude de mise au point
Le cercle oculaire
Le grossissement standard G
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L ’objectif
C ’est une lentille convergente de courte focale (quelques mm)
Un objet placé à proximité de son foyer donne une image intermédiaire agrandie et renversée
Le grandissement de l ’objectif est noté G1
Un dispositif de rotation permet de changer l ’objectif.
Les objectifs donnent une image réelle, inversée et agrandie de l’objet. Éléments essentiels dans la
constitution des images, les objectifs sont définis par plusieurs caractéristiques, certaines étant gravées sur le
fût de l’objectif.
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Les Objectifs de Microscope
Structure du microscope optique
Élément le plus important du microscope, détermine la qualité de l’image qu’on
peut obtenir (forme l’image primaire)
Principales spécifications :
- ouverture numérique (ex. : 1,4)
- grandissement (ex.: 60x)
- milieu d’immersion (air, eau, huile)
- type de correction!
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L’ouverture numérique
L’ouverture numérique du microscope, notée ON, est définie par la relation :
ON = n.sin u
n = indice du milieu objet;
u = demi angle d’ouverture du faisceau
utile issu de A.
capacité à capter les rayons lumineux diffractés (envoyés obliquement pour simplifier à
l’extrême) par l’objet éclairé.
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Rappelons que ce faisceau s’appuie sur les bords de la pupille
d’entrée et constitue donc le faisceau le plus large possible pouvant entrer et traverser le microscope.
Plus leur angle de capture est grand, plus ils sont aptes à montrer les petits détails.
Plus l’objectif grandit l’image, plus son ON augmente.
Pour les objectifs 100 à immersion l’ouverture numérique dépasse 1 (1,25 à 1,40 pour les
plus performants).
Objectif x100 dit à immersion (utilisation d’huile d'immersion ou huile de cèdre)
Ces 3 objectifs (Nikon, Zeiss et Olympus) portent un anneau de couleur
conventionnelle, rouge pour le x4
Code coloré d’identification des grandissements des objectifs pour microscope
Grandissement 1 x 2 x 4 x 10 x 20 x 40 x 50 x 60 x 100 x
Code couleur
L ’oculaire
C ’est une lentille convergente de plus grande focale (quelques cm)
Il sert de loupe en grossissant l ’image intermédiaire donnée par l ’objectif
Le grossissement de l ’objectif est noté G2
Le grossissement commercial Gc d’un oculaire est généralement compris
entre 5 et 25. C’est l’indication mentionnée sur l’oculaire.
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Le cercle oculaire
C ’est l ’image de l ’objectif à travers l ’oculaire.
L ’œil doit être placé au cercle oculaire pour recevoir toute lalumière émergente de l ’objet.
Lentille
objectif Lentille
oculaire
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Le grossissement standard G
C ’est un nombre qui dépend :
– Du grandissement G1 ou g1 de l ’objectif
– Du grossissement G2 de l ’oculaire
Il se calcule par la relation : G= l g1l . G2
grossissement du microscope = grossissement objectif x grossissement oculaire
le grossissement maximal est de l’ordre de x1000 à x2000.
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Le pouvoir de séparation
Pouvoir de séparation = Pouvoir de résolution =
Or n= c/v donc dépend de la vitesse de la lumière dans le vide et de la vitesse de la lumière
dans le milieu.
0,61λ/n sin α
n = caractérise un milieu translucide
α = demi angle du cône de vision de l’objet par l’objectif du microscope.
λ = longueur d’onde
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Agrandir ne suffit pas !!
Résolution !!
Grossissement identique !!
faible !
résolution
haute!
résolution
0,12 0,87
L’ouverture numérique ↗
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l’imagerie microscopique
Structure du microscope électronique
G=1 (à 25cm)
R=100μm
G=1000
R= 0,2μm
G=250000
R= 2.10-4μm
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L ’intervalle optique Δ
F 2
F ’1
D
• C ’est la distance qui sépare le foyer image de l ’objectif du foyerobjet de l ’oculaire
• Cette distance est fixe :
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D 20 cm
L’ANATOMIE
DU MICROSCOPE
Le microscope à transmission
Eléments de la partie mécanique du microscope a fond clair
1: tube binoculaire 2: vis de blocage du tube binoculaire 3: potence du statif 4: sur platine (ou chariot) guide objet 5: vis micrométrique de
mise au point 6: vis micrométrique de mise au point 7: vis de déplacement bidirectionnel du chariot guide objet 8: pied du statif 9: vis de
centrage du collecteur 10 : vis de réglage de hauteur du condenseur 11: platine porte-objet 12: chevalet de fixation de lame porte-objet
13: revolver porte-objectif.
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Le microscope à transmission
Eléments de la partie optique du microscope a fond clair
1 : potentiomètre de réglage de l’intensité lumineuse 2 : diaphragme de champ 3 : cage de la source lumineuse 4 : collecteur de
lumière 5 : filtre bleu ou « lumière du jour » 6 : diaphragme d’ouverture 7 : condenseur 8 : lentille frontale d’objectif 9 : corps de
l’objectif 10 : glissière de réglage de l’écartement inter pupillaire 11 : oculaire à réglage dioptrique 12 : verre d’oeil de l’oculaire.
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C’est l’ensemble du tube que l’on déplace par rapport à l’objet :
Les lentilles objectifs et oculaires sont fixes l’une par rapport à l’autre La distance qui les sépare est
donc constante
Mise au point
objet
Lentille objectif
Lentille oculaire
La mise au point consiste en un réglage permettant d’observer l’image de l’objet au travers du microscope
sans que l’œil ait à accommoder (c’est-à-dire que l’image au travers du microscope se forme à l’infini)
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La latitude de mise au point
Un dispositif avec une vis micrométrique permet de régler ladistance entre l ’objet et l ’objectif
En agissant sur la vis, on place l ’objet près du foyer objet del ’objectif : l ’image finale est à l ’infini
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Le candensateur
Condenseur a lentille escamotable
O.N. 0,16 - 0,9
Situé entre la préparation et le dispositif d’éclairage, le condenseur est un système optique
qui contrôle le cône lumineux envoyé sur la préparation ; la qualité de l’image dépend de son
réglage méticuleux
La lumière issue du condenseur converge vers la préparation ; lors de son passage à travers la
préparation la lumière devient divergente et forme un cône inversé (par rapport au cône
convergent envoyé par le condenseur) qui est capté par la lentille frontale de l’objectif.
La fonction du condensateur est de
concentrer la lumière sur l’objet
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Quelques types de microscopes
Le microscope monoculaire à mise au point par déplacement du tube
optique, oculaire muni d'un micromètre et objectif x100 à immersion
Le microscope binoculaire à mise au point par déplacement de
vertical de la platine
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Quelques types de microscopes
Le microscope trinoculaire avec 5 objectifs plan-achromatiques x4,
x10, x20, x40, x100 et éclairage halogène avec variateur de puissance
Le microscope trinoculaire de recherche avec 5 ou 6 objectifs
planapochromatiques et de nombreux accessoires interchangeables
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Quelques types de microscopes
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Le microscope inversé pour la recherche
Différents type de microscope optique: Une comparaison
Type de microscope Type de microscope
Contraste de phase : augmente lecontraste dans les cellule non coloréesen amplifiant des variation dans l’indexde réfraction dans l’échantillons ellemême; spécialement utile pour l‘examen de cellule vivante nonpigmentées,
Contraste d’interférence différentielle:Utilise une procédure optiquepermettant « d’exagérer » ladifférance d’indexe de réfraction
Confocal: utilise laser et optique spécialpour focaliser un fiscaux sur un seul plan(optique) à l intérieur de l’échantillon,seulement une région dans un champsétroit est visualisée, les régions endessous et en dessus du plan choisie ,apparaissent obscure ou floutées
Champs clair (échantillons non colorés)Faisant passé la lumière directement àtravers l’échantillon, sauf si la cellule estnaturellement pigmenté , l’image obtenueet très peu contrastée,
Champs clair (avec coloration):La coloration de l’échantillon par différentscolorant permet augmente le contrastenéanmoins la plus part des procédures decoloration requirent une fixation descellules
Fluorescence: montrant une localisation demolécules spécifiques dans la cellule Showsthe locations. Les substance fluorescentes(fluorochrome) absorbe les UV pouremmètre ensuite une lumière visible.
Pierre Roux
(CNRS)
Image en microscopie optique selon la technique « Nomarski » qui permet d’améliorer la netteté et le relief.
Cette séquence a été filmée à raison d’une image toutes les 3 secondes, pour une durée d’environ 5 minutes.
Il s’agit ici d’une cellule de type embryonnaire de souris.
Cette cellule émet des extensions, appelées filopodes, en forme de filaments. La membrane forme ensuite des replis, les lamellipodes, pour
rejoindre les filopodes. Ces extensions permettent à la cellule de se déplacer par reptation. C’est le cytosquelette d’actine qui permet la
formation des filopodes et des lamellipodes.
Utilisation du microscope
Comment faire son schéma
•Faire un cercle.
•Dessiner dans ce cercle ce que l’on voit.
•Identifier les parties du dessin.
•Mettre le titre du dessin.
•Préciser le grossissement.
300XLes Gaulois
Astérix
Obélix
Idéfix
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