1
The Therapeutic Effect of Goat Milk Yogurt to Inducible Nitric Oxyde Synthase (iNOS)
Expression and Malondialdehyde (MDA) Levels in Aorta of Animal Model
(Rattus norvegicus) Hypercholesterolemia
Muhammad Sugiarto*, Masdiana C. Padaga, Dyah K. Wuragil Program Studi Kedokteran Hewan, Program Kedokteran Hewan,
Universitas Brawijaya
ABSTRAK
Hiperkolesterolemia adalah kondisi ketika kolesterol yang beredar di dalam darah
melebihi batas normal. Diet yang kaya akan kolesterol dan lemak jenuh dapat menekan
pembentukan reseptor Low Density Lipoprotein (LDL) sehingga meningkatkan jumlah
kolesterol yang beredar di dalam darah, keadaan ini dapat memicu terjadinya kondisi
hiperkolesterolemia. Yogurt susu kambing memiliki kandungan seperti antioksidan, bakteri
asam laktat (BAL) dan biopeptida yang dapat menurunkan kadar kolesterol plasma sehingga
dapat digunakan sebagai alternatif penurun kolesterol. Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui pengaruh terapi yogurt susu kambing terhadap ekspresi inducible Nitric Oxyde
Synthase (iNOS) dan kadar malondialdehida (MDA) pada aorta. Penelitian ini menggunakan
tikus (Rattus norvegicus) jantan berumur 10-12 minggu yang dibagi dalam 5 kelompok yaitu
kelompok kontrol, kelompok kontrol yang diberi pakan diet hiperkolesterol, kelompok tikus
yang diberi pakan hiperkolesterol dan terapi yogurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB, 600
mg/kg BB dan 900 mg/kg BB. Analisis statistik yang digunakan dalam penelitian ini adalah
one way Analisis of Variance (ANOVA) dengan uji lanjutan Tukey 5%. Terapi yogurt susu
kambing berpengaruh nyata (p<0,05) terhadap ekspresi iNOS yang ditunjukkan dengan
penurunan ekspresi iNOS pada aorta tikus hiperkolesterolemia. Ekspresi iNOS pada terapi
yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB merupakan dosis optimal dalam menurunkan
ekspresi iNOS yang menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol.
Terapi dosis 900 mg/kg BB memberikan hasil optimal yang tidak berbeda nyata dengan
kontrol. Penelitian ini menunjukkan terapi yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB mampu
menurunkan ekspresi iNOS 69,7% dan menurunkan kadar MDA 50,04% pada aorta tikus
hiperkolesterolemia.
Kata kunci : Hiperkolesterolemia, Yogurt susu kambing, inducible Nitric Oxyde Synthase
(iNOS) dan Malondialdehida (MDA).
Efek Terapi Yogurt Susu Kambing Terhadap Ekspresi Inducible Nitric Oxyde Synthase (iNOS)
dan Kadar Malondialdehida (MDA) Pada Aorta Hewan Model Tikus
(Rattus norvegicus) Hiperkolesterolemia
2
ABSTRACT
Hypercholesterolemia is a state when the cholesterol level on the blood over the
normal range. The consumption of high cholesterol and saturated fatty acid can suppress the
formation of Low Density Lipoprotein (LDL) receptor that increase cholesterol level on the
blood and triggers hypercholesterolemia. Goat milk yogurt contains antioxidant, probiotics of
lactic acid bacteria, and biopeptide to decrease cholesterol levels. The purpose of this
research was to study therapeutic effect of goat milk yogurt to inducible nitric oxyde synthase
(iNOS) expression and malondialdehyde (MDA) levels in aorta. This research used male
Rattus norvegicus, aged 10-12 weeks, devided into five groups: control group,
hypercholesterolemic group, hypercholesterolemic with goat milk yogurt therapy dose of 300
mg/kg BW, 600 mg/kg BW, and 900 mg/kg BW. This research were analysed using one way
Analysis of Variance (ANOVA), continued by Tukey test (p<0.05). The therapeutic goat
milk yogurt resulted significantly different (p<0.05) of iNOS expression in aorta. iNOS
expression in therapeutic goat milk yogurt dose of 900 mg/kg BW was an optimum dose in
decreasing iNOS expression that was not significantly different with control group. MDA
level in theraupeutic goat milk yogurt dose of 900 mg/kg BW not significantly different from
normal rat. The therapeutic goat milk yogurt dose of 900 mg/kg BW gave an optimilized
result that was not significantly different with control. This research also showed the goat
milk yogurt therapy dose of 900 mg/kg BW had a potential to decrease iNOS expression to
be 69.7% and decrease MDA levels to be 50.04% in aorta of hypercholesterolemic rat.
Keywords: Hypercholesterolemia, Goat Milk Yogurt, iNOS, MDA.
PENDAHULUAN
Penyakit jantung koroner
merupakan salah satu penyakit
kardiovaskuler yang menyebabkan
kematian. Salah satu penyebabnya yaitu
hiperkolesterolemia. Hiperkolesterolemia
adalah suatu keadaan dimana kadar
kolesterol darah melebihi batas normal,
karena asupan dan perombakan kolesterol
tidak seimbang (Dalimartha, 2008).
Aterosklerosis merupakan suatu kelainan
yang terdiri atas pembentukan fibrolipid
dalam bentuk plak-plak yang menonjol
atau penebalan yang disebut ateroma yang
terdapat di dalam tunika intima dan bagian
dalam tunika media pembuluh darah arteri
(Gani, 2013). Resiko terjadinya penyakit
jantung koroner meningkat pada
peningkatan kadar kolesterol LDL dalam
darah (Butterfield, 2006).
Menurut Bastard (2006) LDL yang
tinggi dalam darah akan menempel dan
menumpuk pada dinding pembuluh darah.
Radikal bebas dan LDL akan bereaksi
menyebabkan terjadinya LDL teroksidasi.
LDL teroksidasi akan menempel pada
endotel dan menyebabkan kerusakan sel-
sel endotel. Kerusakan ini akan memicu
teraktivasinya makrofag sehingga akan
meningkatkan produksi mediator-
mediator inflamasi atau sitokin
proinflamasi seperti tumor necrosis factor
(TNF), interleukin (IL) serta interferon
gamma (IFN- γ). Peningkatan mediator-
mediator inflamasi ini akan memacu
peningkatan produksi nitric oxide (NO)
dalam jumlah besar melalui aktivasi
inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS).
Tubuh dalam keadaan
hiperkolesterolemia akan berusaha untuk
menyeimbangkan kadar kolesterol dengan
cara sintesis asam empedu. Semakin
banyak asam empedu yang disintesis maka
semakin banyak pula radikal bebas yang
dihasilkan sebagai hasil sampingan. Bila
produksi radikal bebas terjadi secara
berlebih, maka enzim antioksidan tubuh
tidak mampu mengatasinya (Wresdiyati
dkk, 2006). Menurunnya enzim
antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh
akan menyebabkan H2O2 oleh pereaksi
3
fenton akan diubah menjadi radikal
hidroksil (OH-) yang bersifat lebih toksik
terhadap senyawa PUFA. Radikal bebas
akan terbentuk terus-menerus dan berperan
dalam oksidasi LDL. Salah satu indikator
terjadinya oksidasi LDL adalah
malondialdehida (MDA). Malondialdehida
digunakan sebagai tolak ukur dari
banyaknya radikal bebas di dalam tubuh.
Semakin tinggi kadar MDA maka semakin
tinggi pula jumlah radikal bebas dalam
tubuh. Salah satu metode pengukuran
MDA adalah dengan Thiobarbituric Acid
Reactivity Test (Ratnawati, 2010).
Dalam penelitian yang dipublikasi
The American Journal of Clinical
Nutrition, susu kambing terbukti
mempercepat pembakaran lemak rendah
kolesterol dan kadar laktosa lebih rendah
13% dari susu sapi dan 41% lebih rendah
dari air susu ibu. Susu kambing tidak
mengandung beta-lactoglobulin, senyawa
ini sering disebut sebagai pemicu reaksi
alergi. Susu kambing memiliki potensi
yang besar sebagai pembawa bakteri
probiotik karena memiliki komposisi
bahan yang relatif baik, yang dapat
mendukung ketersediaan energi bagi
fungsi dan aktifitas metabolisme bakteri
probiotik di dalamnya.
Yogurt terbuat dari susu yang
kemudian ditambahkan dengan bakteri
yang akan membentuk asam laktat. Bakteri
yang digunakan dalam proses pembuatan
yogurt adalah bakteri Lactobacillus
bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, dan
Streptococcus thermophilus. Berdasarkan
penelitian sebelumnya menyebutkan
bahwa bakteri asam laktat berpotensi
menurunkan kadar kolesterol darah karena
bakteri dalam produk tersebut
menghasilkan asam-asam organik seperti
asam propionat dan asam laktat yang dapat
berperan sebagai agen penurun kadar
kolesterol darah (Muti, 2002). Bakteri
asam laktat mampu memetabolisme
kolesterol dari makanan dalam usus halus
sehingga tidak diserap oleh tubuh. Bakteri
asam laktat memiliki kemampuan
mendekonjugasi garam empedu karena
aktivitas Bile salt hydrolase (BSH) (Liong
dan Shah, 2005). Mekanisme penurunan
kolesterol oleh aktivitas BAL disebabkan
oleh enzim BSH yang mendekonjugasi
garam empedu, dimana glisin atau taurin
dipisahkan dari steroid, sehingga
menghasilkan garam empedu bebas atau
terdekonjugasi. Penelitian ini dilakukan
untuk mengetahui pengaruh pemberian
yogurt susu kambing sebagai bahan terapi
hiperkolesterol berdasarkan gambaran
ekspresi iNOS dan kadar MDA pada organ
aorta hewan model tikus (Rattus
norvegicus) wistar jantan yang mendapat
diet hiperkolesterolemia.
MATERI DAN METODE
Preparasi Hewan Coba
Hewan coba dibagi menjadi lima
kelompok perlakuan yaitu kelompok
kontrol (A), kelompok hiperkolesterolemia
(B), hiperkolesterolemia dan terapi yogurt
susu kambing dosis 300 mg/kg BB (C),
dosis 600 mg/kg BB (D), dan dosis 900
mg/kg BB (E). Masing-masing kelompok
perlakuan terdiri dari empat ekor tikus
sebagai ulangan. Hewan coba
menggunakan hewan coba tikus (Rattus
norvegicus) yang diperoleh dari Unit
Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP)
UGM Yogyakarta dengan umur 10-12
minggu dan berat badan sekitar 150 gram.
Penggunaan hewan coba dalam penelitian
ini mendapatkan persetujuan laik etik dari
Komisi Etik Penelitian Universitas
Brawijaya, No: 217-KEP-UB.
Pembuatan Diet Hiperkolesterol
Pakan hiperkolesterol dibuat
dengan mencampurkan minyak babi, asam
kolat dan kuning telur puyuh rebus. Hasil
campuran kemudian dilarutkan dengan
akuades sebanyak 2 ml. Pakan diet
hiperkolesterol diberikan setiap hari
selama 14 hari dan disondekan pada
masing-masing tikus. Pakan standar yang
diberikan sebanyak 20 g/ekor/hari (Gani,
2013). Komposisi bahan pakan
4
hiperkolesterol dalam 20 gram pakan dapat
dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Komposisi bahan pakan
hiperkolesterol dalam 20 gram pakan
Bahan Jumlah
Kandungan
(%)
Jumlah
Bahan
(gram)
Asam
kholat 0,1 0,02
Minyak
babi 10 2
Kuning
telur puyuh 5 1
Pembuatan Starter Yogurt Susu Kambing
Susu kambing 100 ml dituangkan
ke dalam erlenmeyer 250 ml steril lalu
ditutup dengan aluminium foil. Susu
dipasteurisasi pada suhu 72oC selama 5
menit, kemudian didinginkan hingga suhu
turun sampai 40oC-45
oC. Starter ditimbang
sebanyak 0,5 gram lalu dicampur sedikit
dengan susu kambing dan dihomogenkan.
Inokulasi starter selanjutnya dilakukan ke
dalam susu kambing 100 ml (w/v).
Inkubasi dilakukan pada suhu 40oC-45
oC
selama 4-8 jam dan sampai pH rata-rata
yogurt sekitar 4,00-4,5 (Posecion et al.,
2005).
Pembuatan Yogurt Susu Kambing
Susu kambing 485 ml dituangkan
ke dalam botol tutup berulir 1000 ml lalu
ditutup dengan aluminium foil. Susu
dipasteurisasi pada suhu 72oC selama 5
menit kemudian didinginkan hingga suhu
susu turun sampai 40oC-45
oC. Inokulasi
starter dengan kosentrasi 3% ke dalam
susu kambing 485 ml (v/v) lalu
dihomogenkan secara perlahan. Inkubasi
dilakukan pada suhu 40oC-45
oC selama 4-
8 jam dan sampai pH rata-rata yogurt
sekitar 4,5-5 (Posecion et al., 2005).
Yogurt susu kambing dijadikan kering
beku dan disimpan pada suhu 4-5oC.
Pemberian Terapi Yogurt Susu Kambing
Terapi yogurt susu kambing
diberikan setelah tikus diinduksi diet
hiperkolesterolemia selama 14 hari.
Kelompok tikus yang diberikan terapi
yaitu kelompok C, D, dan E dengan dosis
berturut-tutut sebesar 300 mg/kg BB, 600
mg/kg BB, dan 900 mg/kg BB. Terapi
diberikan secara per oral dengan sonde
lambung sebanyak 1,5 ml selama 28 hari.
Pembuatan Kurva Baku MDA
Larutan stok kit standar MDA
dengan konsentrasi sebesar 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7 dan 8 mg/mL diambil masing-masing
100 μL. Larutan dimasukkan ke tabung
reaksi yang berbeda dan ditambahkan 550
μL akuades dan 100 μL TCA 100% lalu
dihomogenkan degan vortex. Larutan
ditambahkan 250 μL HCl 1N dan 100 μL
Na-Thio 1% ke dalam tabung dan
dihomogenkan. Sentrifugasi pada
kecepatan 500 rpm selama 10 menit.
Setelah itu, dipanaskan selama 30 menit
dalam suhu 1000C. Larutan didiamkan
pada suhu ruang lalu supernatan diambil
dan larutan standar kemudian dibaca
menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang maksimun dan hasil
absorbansi MDA larutan baku dan dibuat
kurva.
Pengukuran Kadar MDA
Aorta dengan berat 0,5 gram
dimasukkan ke dalam mortar dingin dan
digerus hingga halus. Ditambahkan 500 μl
NaCl 0,9% dan dihomogenkan.
Homogenat diambil dan dipindahkan ke
tabung microtube. Disentrifugasi dengan
kecepatan 8000 rpm selama 20 menit dan
diambil supernatannya. Supernatan
sebanyak 100 μL dimasukkan ke dalam
microtube, ditambah 550 μl akuades dan
dihomogenkan. Dimasukkan 100 μl TCA
100% dan dihomogenkan. Ditambahkan
100 μL HCL 1 N dan Na-Thio 1 %
sebanyak 100 μL dan dihomogenkan.
Mulut tabung ditutup dengan aluminium
foil dan dipanaskan dalam water bath
1000C selama 10 menit. Didinginkan dan
disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm
selama 20 menit dan supernatannya
diambil untuk dipindah ke tabung
5
microtube. Diukur absorbansinya dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang
maksimum (Aulanni’am et al., 2012).
Pengamatan Ekspresi iNOS
Preparat direndam dalam larutan
xylol 1, xylol 2 kali, alkohol 100%,
alkohol 90%, alkohol 80% dan alkohol
70% dan akuades steril masing-masing
selama 2 menit. Disimpan selama 24 jam
pada suhu 4oC. Preparat dicuci dalam PBS
pH 7,4 dan direndam dalam 3% Hidrogen
Peroksida (H2O2) selama 10 menit (dalam
PBS) dan dicuci dalam PBS pH 7,4,
direndam dalam 1% BSA selama 1 jam
pada suhu ruang. Preparat ditetesi dengan
antibodi primer, anti-rat iNOS (dalam
BSA 1% dalam PBS) 1:100 dan diinkubasi
pada suhu 4oC selama 24 jam. Preparat
dikeluarkan dari refrigerator dan dibiarkan
selama 30 menit dalam suhu ruang, dicuci
dengan PBS pH 7,4. Ditambahkan
antibody sekunder, anti rabbit labelled
biotin dalam PBS (1:200) selama 1 jam
pada suhu ruang, dicuci dengan PBS pH
7,4 (3x5 menit). Ditambahkan SA-HRP
dalam PBS (1:500) selama 40 menit pada
suhu ruang, dicuci dengan PBS pH 7,4
(3x5 menit). Ditambahkan kromogen DAB
(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)
selama 20 menit pada suhu ruang, dicuci
dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit).
Dilakukan counter staining dengan
pewarna Major hematoxylin secukupnya
hingga warna biru terlihat, dibilas dengan
air 2x5 menit dan akuades steril 1x5 menit,
dibiarkan semalam dalam suhu ruang.
Dilakukan mounting dengan entellan.
Hasil akhir diamati dibawah mikroskop
cahaya dengan perbesaran sedang (400x).
Keberadaan iNOS pada aorta yang
diamati melalui metode imunohistokimia
(IHK) dianalisis secara kualitatif dengan
cara membandingkan distribusi iNOS pada
sediaan histologi aorta kontrol dengan
perlakuan pada perbesaran rendah (400x)
yang kemudian dibandingkan
penghitungan per luas bidang pandang
pada 5 seri sayatan yang diambil secara
acak untuk setiap kelompok perlakuan
menggunakan software Axio Vision.
Analisa Data
Data yang diperoleh dari hasil
pengukuran ekspresi iNOS dan kadar
MDA pada aorta dianalisis dengan suatu
program SPSS versi 16.0 dengan
melakukan uji analisis varian (ANOVA)
dan dilakukan analisis lebih lanjut dengan
uji Tukey (α = 5 %), apabila terdapat
perbedaan yang nyata.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Efek Terapi Yogurt Susu Kambing
Terhadap Kadar Malondialdehida
(MDA) Pada Aorta Hewan Model Tikus
(Rattus norvegicus) Hiperkolesterolemia Rata-rata hasil kadar MDA aorta
pada kelompok perlakuan (Tabel 2)
menunjukkan adanya perbedaan nyata
antar perlakuan (p<0,05).
Tabel 2. Rata-rata kadar MDA aorta pada
kelompok perlakuan
Kelompok
Rata-rata
kadar MDA
(μg/ml)
Penurunan
(%)
A 1,72 ± 0,51a -
B 4,41 ± 0,44c
-
C 3,75 ± 0,48bc
14,80
D 2,81 ± 0,38ab
36,10
E 2,20 ± 0,19a 50,04
Keterangan : (A) Kontrol ; (B)
Hiperkolesterolemia (C)
Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt
dosis 300 mg/kg BB ; (D)
Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt
dosis 600 mg/kg BB ; (E)
Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt
dosis 900 mg/kg BB. Perbedaan notasi a,
b dan c menunjukkan perbedaan yang
signifikan (p<0,05) antara kelompok
perlakuan.
Berdasarkan rata-rata kadar MDA
pada Tabel 2 rata-rata kadar MDA
tertinggi didapatkan pada tikus
hiperkolesterolemia yang berbeda nyata
dengan tikus hiperkolesterolemia yang
6
diterapi yogurt susu kambing 600 mg/kg
BB dan 900 mg/kg BB, namun tidak
berbeda nyata dengan tikus
hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt
susu kambing 300 mg/kg BB. Hal ini
menunjukkan terapi yogurt susu kambing
300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB dan 900
mg/kg BB mampu menurunkan kadar
MDA aorta tetapi memiliki pengaruh yang
berbeda. Dosis terapi yogurt susu kambing
yang paling berpotensi untuk menurunkan
kadar MDA aorta yaitu dosis 900 mg/kg
BB dengan intensitas penurunan kadar
MDA aorta sebesar 50,04%. Peningkatan
kadar MDA yang tinggi sebesar 156%
terjadi pada tikus kelompok
hiperkolesterolemia. Kadar MDA yang
tinggi mengindikasikan meningkatnya
jumlah radikal bebas yang diakibatkan
karena hiperkolesterolemia. Peningkatan
radikal bebas mengakibatkan stres
oksidatif yaitu jumlah radikal bebas lebih
banyak dari jumlah antioksidan dalam
tubuh. Diet hiperkolesterol mampu
meningkatkan jumlah radikal bebas dalam
tubuh yang merupakan hasil samping dari
sintesis asam empedu dari hati. Reaksi 7α-
hidroksilasi merupakan tahap pertama
pada biosintesis asam empedu yang
memerlukan oksigen, NADPH dan
sitokrom p-450. Menurut Wresdiyati dkk.
(2006) pada kondisi hiperkolesterolemia,
tubuh akan berusaha menyeimbangkan
kolesterol dalam tubuh dengan cara
mengubah kolesterol menjadi asam
empedu. Semakin banyak asam empedu
yang disintesis, semakin banyak oksigen
yang diperlukan. Peningkatan tersebut
akan menghasilkan radikal bebas O2-
sebagai hasil sampingan.
Radikal bebas dalam jumlah yang
berlebihan dapat berpotensi untuk
menimbulkan kerusakan membran yang
merupakan akibat dari peristiwa
peroksidasi lipid, yaitu reaksi berantai
radikal bebas oleh radikal hidroksil (OH·)
yang sangat reaktif dapat bereaksi dengan
lipid membran, yaitu polyunsaturated fatty
acid (PUFA) sehingga terbentuk
Malondialdehida (MDA), suatu radikal
bebas hasil metabolit reaktif peroksidasi
lipid yang umumnya digunakan sebagai
biomarker biologis peroksidasi lipid untuk
menilai stress oksidatif. Radikal bebas
dapat diukur dengan mengetahui kadar
peroksidasi lipid, yaitu pengukuran kadar
MDA jaringan yang dilakukan dengan
metode TBA. MDA dapat diidentifikasi
sebagai produk hasil dekomposisi asam
amino kompleks, karbohidrat, pentosa dan
heksosa. MDA juga merupakan produk
yang dihasilkan oleh radikal bebas.
Pengukuran MDA dengan TBA
didasarkan pada reaksi antara MDA dan
TBA dalam suasana asam.
Penurunan kadar MDA terendah
didapatkan pada tikus hiperkolesterolemia
yang diterapi yogurt susu kambing 900
mg/kg BB yang tidak berbeda nyata
dengan tikus kontrol dengan penurunan
sebesar 50,04%. Hal ini menunjukkan
bahwa tikus hiperkolesterolemia yang
mendapat terapi yogurt susu kambing
dapat menurunkan kadar MDA aorta.
Penurunan kadar MDA dikarenakan
adanya antioksidan dan bakteri asam laktat
(BAL) yang terdapat dalam yogurt susu
kambing. Antioksidan di dalam yogurt
susu kambing seperti vitamin C dan E
mampu berikatan dengan radikal bebas,
sehingga peroksidasi lipid pun dapat
dicegah. Vitamin C Sebagai antioksidan
dapat langsung bereaksi dengan anion
superoksida, radikal hidroksil, oksigen
singlet dan lipid peroksida. Vitamin C
sebagai reduktor akan mendonorkan satu
elektron membentuk semidehidroaskorbat
yang tidak bersifat reaktif dan selanjutnya
mengalami reaksi disproporsionasi
membentuk dehidroaskorbat yang bersifat
tidak stabil. Dehidroaskorbat akan
terdegradasi membentuk asam oksalat dan
asam treonat. Vitamin E sebagai sumber
antioksidan yang larut dalam lemak dan
mudah memberikan hidrogen dari gugus
hodroksil (OH) pada struktur cincin ke
radikal bebas. Cara kerja vitamin E dengan
cara mencari, bereaksi, dan merusak rantai
reaksi radikal bebas serta mencegah lipid
7
peroksidasi dari asam lemak tak jenuh
dalam membran sel.
Penelitian Rival (2001)
menyatakan bahwa biopeptida dalam
yogurt susu kambing mampu menangkap
radikal bebas salah satunya yaitu
laktoferin. Menurut Artym (2003)
laktoferin merupakan extraceluller iron
binding. Iron (besi) intraseluler disimpan
dalam bentuk ferritin, sedangkan
ekstraseluler terikat oleh protein transferin
atau laktoferin. Besi yang tidak terikat
akan mengkatalis produksi ROS melalui
reaksi fenton yang akan mengubah H2O2
menjadi radikal hidrosil (OH-) yang
bersifat toksik terhadap senyawa lipid
tidak jenuh. Melalui biopeptida laktoferin
besi akan diikat, sehingga pembentukan
ROS terhambat dan jumlah ROS di dalam
tubuh juga akan berkurang. Muti (2002)
menyatakan bakteri asam laktat (BAL)
sebagai probiotik alternatif penurun
kolesterol memiliki kemampuan bertahan
terhadap garam empedu, kondisi asam,
dapat mengikat kolesterol dengan
menempel pada dinding saluran
pencernaan dan mampu menghambat
bakteri patogen dengan cara menghasilkan
senyawa anti mikroba seperti bakteriosin.
Bakteriosin adalah toksin yang menyerupai
protein yang disekresikan oleh bakteri
untuk menghambat pertumbuhan bakteri
lain. Menurut penelitian Liong dan Shah
(2005) bakteri asam laktat mampu
memetabolisme kolesterol dari makanan
dalam usus halus sehingga tidak diserap
oleh tubuh. Bakteri asam laktat memiliki
kemampuan mendekonjugasi garam
empedu karena aktivitas Bile salt
hydrolase (BSH). Mekanisme penurunan
kolesterol oleh aktivitas BAL disebabkan
oleh enzim BSH yang mendekonjugasi
garam empedu, dimana glisin atau taurin
dipisahkan dari steroid, sehingga
menghasilkan garam empedu bebas atau
terdekonjugasi. Enzim BSH menghasilkan
garam empedu terdekonjugasi dalam
bentuk asam kolat bebas yang kurang
diserap oleh usus halus. Hal ini
menyebabkan garam empedu yang
kembali ke hati selama sirkulasi
enterohepatik menjadi berkurang, sehingga
total kolesterol dalam tubuh menjadi
berkurang. Beberapa jenis BAL memiliki
dinding sel yang mampu mengikat
kolesterol dalam usus halus sebelum
kolesterol diserap oleh tubuh.
Pemberian terapi yogurt susu
kambing dalam penelitian ini
menunjukkan adanya penurunan kadar
MDA. Dosis 900 mg/kg BB efektif dalam
menurunkan kadar MDA aorta tikus
hiperkolestreolemia yang menghasilkan
penurunan mendekati normal.
Efek Terapi Yogurt Susu Kambing
Terhadap Ekspresi inducible Nitric
Oxide Synthase (iNOS) Pada Aorta
Hewan Model Tikus (Rattus norvegicus)
Hiperkolesterolemia Hasil penelitian pada kelompok tikus
hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt
susu kambing dibandingkan dengan
kelompok tikus hiperkolesterolemia
menunjukkan penurunan ekspresi iNOS.
iNOS merupakan enzim penanda adanya
inflamasi dan diinduksi oleh sitokin yang
akan menghasilkan NO dalam jumlah yang
besar. Sitokin-sitokin proinflamasi yang
muncul pada saat terjadinya inflamasi akan
menstimulus iNOS pada sel otot polos. NO
dihasilkan salah satunya di sel otot polos
yang dibentuk dari asam amino L-arginin
oleh Nitric Oxyde Synthase (NOS) menjadi
L-citrulin dan NO.
Ekspresi iNOS diamati pada preparat
aorta dengan metode imunohistokimia.
Ekspresi iNOS ditunjukkan dengan warna
coklat yang menunjukkan dua reaksi
antara iNOS pada jaringan dengan antibodi
yang ditambahkan (antibodi primer anti-
iNOS, anti rabbit labeled biotin, Strep
avidin horseradish peroxidase dan
kromagen DAB) dapat dilihat pada
Gambar 1.
8
Keterangan: (A) kontrol; (B) Hiperkolesterolemia; (C) Hiperkolesterolemia
yang diterapi yoghurt dosis 300 mg/kg BB; (D) Hiperkolesterolemia yang
diterapi yoghurt dosis 600 mg/kg BB; (E) Hiperkolesterolemia yang diterapi
yoghurt dosis 900 mg/kg BB dan tanda panah menunjukkan ekspresi iNOS.
A B
C D
E
Gambar 1. Ekspresi iNOS Pada Aorta (400x)
9
Ekspresi inducible Nitric Oxyde
Synthase (iNOS) pada kelompok normal
atau kontrol terlihat muncul namun dalam
intensitas yang rendah (2,26 ± 1,25)
(Gambar 1 A), sedangkan pada tikus
hiperkolesterolemia ekspresi iNOS terlihat
mengalami kenaikan (15,65 ± 1,73) yang
tersebar pada tunika media (Gambar 1 B).
Ekspresi iNOS pada kelompok tikus
hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt
susu kambing menunjukkan penurunan
intensitas pada bagian tunika media
dibandingkan dengan kelompok tikus
hiperkolesterolemia (Gambar 1 C, D, E).
Hasil analisa statistik menggunakan
SPSS. 16 dan hasil uji lanjutan
menggunakan uji Tukey menunjukkan
bahwa pemberian pakan hiperkolesterol
dan terapi yogurt susu kambing
menyebabkan perbedaan yang signifikan
terhadap ekspresi iNOS aorta (p<0,05)
yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Rata-rata ekspresi iNOS aorta
pada kelompok perlakuan
Kelompok
Rata-rata
ekspresi
iNOS
Penurunan
(%)
A 2,26 ± 1,25a -
B 15,65±1,73c
-
C 9,75 ± 0,94b 37,6
D 7,86 ± 0,38b 49,7
E 4,74 ± 0,31a 69,7
Keterangan : (A) Kontrol ; (B)
Hiperkolesterolemia (C)
Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt
dosis 300 mg/kg BB ; (D)
Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt
dosis 600 mg/kg BB ; (E)
Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt
dosis 900 mg/kg BB. Perbedaan notasi a,
b dan c menunjukkan perbedaan yang
signifikan (p<0,05) antara kelompok
perlakuan.
Berdasarkan rata-rata ekspresi
iNOS aorta pada Tabel 3 rata-rata ekspresi
iNOS terendah didapatkan pada tikus
normal yang tidak berbeda nyata dengan
tikus hiperkolesterolemia yang diterapi
yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB.
Ekspresi iNOS pada tikus normal terjadi
karena adanya apoptosis pada sejumlah sel
(Mahdi, 2008). Rata-rata ekspresi iNOS
tertinggi didapatkan pada tikus
hiperkolesterolemia yang berbeda nyata
dengan tikus hiperkolesterolemia yang
diterapi yogurt susu kambing 300 mg/kg
BB, 600 mg/kg BB dan 900 mg/kg BB.
Dosis terapi yogurt susu kambing 300
mg/kg BB tidak berbeda nyata dengan
dosis 600 mg/kg BB namun berbeda nyata
dengan dosis 900 mg/kg BB. Hal ini
menunjukkan terapi yogurt susu kambing
dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB, dan
900 mg/kg BB mampu menurunkan
ekspresi iNOS aorta tetapi memiliki
pengaruh yang berbeda. Peningkatan
ekspresi iNOS aorta yang tinggi sebesar
116% terjadi pada kelompok
hiperkolesterolemia. Peningkatan ekspresi
iNOS ini mengindikasikan adanya
inflamasi yang diakibatkan radikal bebas
karena kondisi hiperkolesterolemia.
Menurut penelitian Djatmiko (2010),
Nitric oxide (NO) merupakan radikal
bebas yang dibentuk dari asam amino
Larginin oleh Nitric Oxide Synthase
(NOS). NO banyak terdapat pada kondisi
inflamasi. Kerusakan sel endotel
diakibatkan oleh LDL yang teroksidasi
yang akan melepaskan anionsuperoksida
(O2-), dimana endotel menjadi lebih
permeabel terhadap lipoprotein, sehingga
LDL penetrasi ke dinding vascular dan
menuju tunika intima. LDL oksidasi
kemudian merangsang ekspresi dari
Vascular Cell Adhesion Molecule – 1
(VCAM-1) dan Monocyte Chemotactic
Protein-1 (MCP-1) yang akan menarik
monosit ke dinding arteri dan monosit
berdiferensiasi menjadi makrofag sebagai
respon atas diproduksinya Monocyte
Colony Stimulating Factor (MCSF).
Menurut Chapman dan Kontush (2006),
LDL oksidasi akan difagositosis oleh
makrofag sehingga makrofag penuh
dengan lemak yang biasa disebut dengan
sel busa (Foam cell). Sel busa akan
memacu keluarnya sitokin-sitokin
proinflamasi seperti TNF-α, IL-1, dan
10
iNOS. Menurut Bray (2006), ROS akan
menyebabkan aktifnya Nuclear Factor
Kappa Beta (NF-κB) dengan cara ROS
akan menginisisai cascade serin sehingga
iKB akan mengalami fosforilasi
(penambahan fosfat) sehingga ikatan
antara NF-κB dan iKB terlepas, NF-κB
akan berpindah ke dalam inti sel sehingga
menginduksi keluarnya sitokin-sitokin
proinlamasi.
Penurunan ekspresi iNOS aorta
terendah didapatkan pada tikus
hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt
susu kambing 900 mg/kg BB yaitu sebesar
69,7% dari tikus hiperkolesterolemia.
Menurut Mirsha (2008) penurunan
ekspresi iNOS menunjukkan adanya
biopeptida aktif dan vitamin yang
terkandung dalam yogurt susu kambing.
Biopeptida aktif, vitamin dan kandungan
BAL yang terkandung dalam yogurt susu
kambing mampu untuk mengurangi
jumlah radikal bebas dalam tubuh,
sehingga ekspresi iNOS yang terbentuk
pada kondisi hiperkolesterolemia dapat
menurun. Biopeptida aktif seperti
laktoferin yang terkandung di dalam
yogurt susu kambing mampu menurunkan
sitokin proinflamasi iNOS melalui peranan
NF-κB. Mekanisme penurunan aktivasi
NF-κB tersebut, antara lain melalui
biopeptida laktoferin besi akan diikat,
sehingga pembentukan ROS terhambat dan
jumlah ROS di dalam tubuh juga akan
berkurang. Berkurangnya jumlah ROS
akan menghambat translokasi NF-κB ke
dalam nucleus, menghambat fosforilasi
iKB, menghambat aktivasi gen yang
mengkode transaktivasi NF-κB dan
degradasi iKB ataupun hambatan
degradasi iKB oleh proteasome.
Penurunan aktivasi NF-κB mengakibatkan
turunnya signaling NF-κB pada sel imun
sehingga meregulasi turunnya iNOS.
Berkurangnya ROS dalam tubuh
dapat mencegah terjadinya LDL oksidasi
sehingga kerusakan endotel pembuluh
darah dapat berkurang. Sesuai dengan
penelitian Pribadi (2009), bahwa
antioksidan bekerja mencegah proses
oksidasi dari LDL dengan cara menangkap
radikal bebas, sehingga tidak akan terjadi
oksidasi LDL. Pendapat tersebut didukung
oleh Brasier et al. (2002), antioksidan
merupakan penangkap dari radikal bebas
yang kuat, dapat menurunkan adhesi
monosit terhadap sel endotel dan
menghambat oksidasi LDL.
Pemberian terapi yogurt susu
kambing dalam penelitian ini
menunjukkan adanya penurunan ekspresi
iNOS. Dosis 900 mg/kg BB efektif dalam
menurunkan ekspresi iNOS aorta tikus
hiperkolestreolemia yang menghasilkan
penurunan mendekati normal.
KESIMPULAN
1. Pemberian terapi yogurt susu kambing
dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB
dan 900 mg/kg BB dapat menurunkan
kadar MDA pada aorta tikus
hiperkolesterolemia tetapi memiliki
pengaruh yang berbeda. Penurunan
terbaik sebesar 50,04% dihasilkan dari
terapi yogurt susu kambing dosis 900
mg/kg BB.
2. Pemberian terapi yogurt susu kambing
dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB
dan 900 mg/kg BB dapat menurunkan
ekspresi iNOS pada aorta tikus
hiperkolesterolemia tetapi memiliki
pengaruh yang berbeda. Penurunan
terbaik sebesar 69,7% dihasilkan dari
terapi yogurt susu kambing dosis 900
mg/kg BB.
UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. Ir. Chanif Mahdi, MS
sebagai ketua dari payung penelitian
atas kesempatan bergabung dalam
penelitian ini.
2. Staff Laboratorium Kesehatan
Masyarakat Veteriner, Laboratorium
Biokimia, Laboratorium Fisiologi
Hewan, Universitas Brawijaya,
Malang dan staff Laboratorium
Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas
11
Farmasi Universitas Airlangga,
Surabaya.
3. Staff Poliklinik Universitas Brawijaya,
Malang.
DAFTAR PUSTAKA
Artym, J. 2003. Orally Administered
Lactoferrin Restores Humoral
Immune Response in
Immunocompromised Mice.
Immunol Lett. 9(1):9-15.
Aulanni’am. 2012. The Potency of
Sargassum duplicatum Bory
Extract on Inflammatory Bowel
Disease Therapy in Rattus
norvegicus. Journal of Life
Sciences 6: 144-154.
Bastard, J.P., Maachi, M., Lagathu , C.,
Kim, M.J., Caron, M., Vidal, H.,
Capeau, J.,dan Feve, B. 2006.
Recent Advances in the
Relationship Between Obesity,
Inflamation, and Insulin
Resistance. Eur Cytokin Netw.
Mar;17(1);4-12. PubMed US
National Library of Medicine.
Bray, L. 2006. Oxidative Stress in
Toxicology: Established
Mammalian and Emerging Piscine
Model Systems. J Enviromental
Health Perspective, 106(7).
Brasier, B. 2002. Reactive species and
antioxidants: Redox biology is
fundamental theme of aerobic life.
J Plant Physiology, 141:312–322.
Butterfield, TA., TM. Best dan MA.
Merrick. 2006. The dual Roles of
Neutrophils and Macrophages in
Inflamation : A Critical Balance
Between Tissue Damage and
Repair. Journal of Athelic
Trainning 41 (4) : 457-465.
Chapman, L.P dan Kontush, W. 2006.
Role of Oxidative Stress in
Atherosclerosis, Am.J Cardiol,
91:7A-11A.
Dalimartha, S. 2008. Atlas Tumbuhan
Obat Indonesia. Jakarta : Trubus
Agriwidya.
Djatmiko. 2010. The protective ability of
Mediterranean dietary plants against
the oxidative damage: The role of
radical oxygen species in
inflammation and the polyphenol,
flavonoid and sterol content. J. Food
Chemistry. Vol. 112 : 587-594.
Gani, N., IM Lidya, MP. Mariska. 2013.
Profil Lipida Plasma Tikus Wistar
yang Hiperkolesterolemia pada
Pemberian Gedi Merah
(Abelmoschus manihot L.). Jurnal
MIPA UNSRAT Online 2 (1) 44-49.
Liong , K. H dan Shah, R. 2005.
Production Of Free Conjugated
Linoleic Acid by Lactobacillus
acidophilus and Lactobacillus
casei Of Human Intestinal Origin.
Journal Dairy Sci. 86 : 673-681.
Mahdi, Chanif. 2010. Efek Paparan
Formaldehid dan Suplementasi
Yogurt terhadap Aktivitas
Antioksidan Kerusakan Oksidatif,
Profil dan Karakter Protein
Jaringan Hepar Tikus (Rattus
norvegicus). Indo. J. Chem (1) :
132 – 137.
Mirsha, K.V. 2008. Immunomodulatory
and Anticancer Potential of Yogurt
Probiotic. Biotechnology 7. 177-
174.
Muti, T.W. 2002. Effect of Low pH On
The Ability of Lactobacillus
acidophilus To Survey and
Adherence To Human Intestinal
12
Cells. Journal of Food Science 53:
1514-1516.
Posecion, N.C., Crowe, N.L., Robinson,
A.R., Asiedu, S.K. 2005. The
Development Of A Goat’s Milk
Yogurt. Journal of the science of
Food and Agriculture, 85(11):
19091913.
Pribadi, J. 2009. Free Radical and
Antioxidant Vitamints in
Degenerative Disease. J IMA,
2(5):1-3.
Ratnawati. 2010. Blood Cholesterol Level
of Hypercholesterolemia Rat (Rattus
norvegicus) After VCO Treatment.
Journal Bioscience Vol 1 No 2 : 53-
58.
Rivai, A. 2001. Ace Inhibitory and Radical
Scavenging Activity of Peptides
Derived from Lactoglobulin. J.
Agric Food Chem. 55 : 3392-
3397.
Wresdiyati, T, Astawan M, Hastanti LY.
2006. Profil Imunohistokimia
Superoksida Dismutase (SOD)
Pada Jaringan Hati Tikus Dengan
Kondisi Hiperkolesterolemia.
Jurnal Hayati 13: 85-89.
Top Related