1

The Therapeutic Effect of Goat Milk Yogurt to Inducible Nitric Oxyde Synthase (iNOS)

Expression and Malondialdehyde (MDA) Levels in Aorta of Animal Model

(Rattus norvegicus) Hypercholesterolemia

Muhammad Sugiarto*, Masdiana C. Padaga, Dyah K. Wuragil Program Studi Kedokteran Hewan, Program Kedokteran Hewan,

Universitas Brawijaya

*muhammadsugi23@gmail.com

ABSTRAK

Hiperkolesterolemia adalah kondisi ketika kolesterol yang beredar di dalam darah

melebihi batas normal. Diet yang kaya akan kolesterol dan lemak jenuh dapat menekan

pembentukan reseptor Low Density Lipoprotein (LDL) sehingga meningkatkan jumlah

kolesterol yang beredar di dalam darah, keadaan ini dapat memicu terjadinya kondisi

hiperkolesterolemia. Yogurt susu kambing memiliki kandungan seperti antioksidan, bakteri

asam laktat (BAL) dan biopeptida yang dapat menurunkan kadar kolesterol plasma sehingga

dapat digunakan sebagai alternatif penurun kolesterol. Penelitian ini bertujuan untuk

mengetahui pengaruh terapi yogurt susu kambing terhadap ekspresi inducible Nitric Oxyde

Synthase (iNOS) dan kadar malondialdehida (MDA) pada aorta. Penelitian ini menggunakan

tikus (Rattus norvegicus) jantan berumur 10-12 minggu yang dibagi dalam 5 kelompok yaitu

kelompok kontrol, kelompok kontrol yang diberi pakan diet hiperkolesterol, kelompok tikus

yang diberi pakan hiperkolesterol dan terapi yogurt susu kambing dosis 300 mg/kg BB, 600

mg/kg BB dan 900 mg/kg BB. Analisis statistik yang digunakan dalam penelitian ini adalah

one way Analisis of Variance (ANOVA) dengan uji lanjutan Tukey 5%. Terapi yogurt susu

kambing berpengaruh nyata (p<0,05) terhadap ekspresi iNOS yang ditunjukkan dengan

penurunan ekspresi iNOS pada aorta tikus hiperkolesterolemia. Ekspresi iNOS pada terapi

yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB merupakan dosis optimal dalam menurunkan

ekspresi iNOS yang menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata dengan kelompok kontrol.

Terapi dosis 900 mg/kg BB memberikan hasil optimal yang tidak berbeda nyata dengan

kontrol. Penelitian ini menunjukkan terapi yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB mampu

menurunkan ekspresi iNOS 69,7% dan menurunkan kadar MDA 50,04% pada aorta tikus

hiperkolesterolemia.

Kata kunci : Hiperkolesterolemia, Yogurt susu kambing, inducible Nitric Oxyde Synthase

(iNOS) dan Malondialdehida (MDA).

Efek Terapi Yogurt Susu Kambing Terhadap Ekspresi Inducible Nitric Oxyde Synthase (iNOS)

dan Kadar Malondialdehida (MDA) Pada Aorta Hewan Model Tikus

(Rattus norvegicus) Hiperkolesterolemia

2

ABSTRACT

Hypercholesterolemia is a state when the cholesterol level on the blood over the

normal range. The consumption of high cholesterol and saturated fatty acid can suppress the

formation of Low Density Lipoprotein (LDL) receptor that increase cholesterol level on the

blood and triggers hypercholesterolemia. Goat milk yogurt contains antioxidant, probiotics of

lactic acid bacteria, and biopeptide to decrease cholesterol levels. The purpose of this

research was to study therapeutic effect of goat milk yogurt to inducible nitric oxyde synthase

(iNOS) expression and malondialdehyde (MDA) levels in aorta. This research used male

Rattus norvegicus, aged 10-12 weeks, devided into five groups: control group,

hypercholesterolemic group, hypercholesterolemic with goat milk yogurt therapy dose of 300

mg/kg BW, 600 mg/kg BW, and 900 mg/kg BW. This research were analysed using one way

Analysis of Variance (ANOVA), continued by Tukey test (p<0.05). The therapeutic goat

milk yogurt resulted significantly different (p<0.05) of iNOS expression in aorta. iNOS

expression in therapeutic goat milk yogurt dose of 900 mg/kg BW was an optimum dose in

decreasing iNOS expression that was not significantly different with control group. MDA

level in theraupeutic goat milk yogurt dose of 900 mg/kg BW not significantly different from

normal rat. The therapeutic goat milk yogurt dose of 900 mg/kg BW gave an optimilized

result that was not significantly different with control. This research also showed the goat

milk yogurt therapy dose of 900 mg/kg BW had a potential to decrease iNOS expression to

be 69.7% and decrease MDA levels to be 50.04% in aorta of hypercholesterolemic rat.

Keywords: Hypercholesterolemia, Goat Milk Yogurt, iNOS, MDA.

PENDAHULUAN

Penyakit jantung koroner

merupakan salah satu penyakit

kardiovaskuler yang menyebabkan

kematian. Salah satu penyebabnya yaitu

hiperkolesterolemia. Hiperkolesterolemia

adalah suatu keadaan dimana kadar

kolesterol darah melebihi batas normal,

karena asupan dan perombakan kolesterol

tidak seimbang (Dalimartha, 2008).

Aterosklerosis merupakan suatu kelainan

yang terdiri atas pembentukan fibrolipid

dalam bentuk plak-plak yang menonjol

atau penebalan yang disebut ateroma yang

terdapat di dalam tunika intima dan bagian

dalam tunika media pembuluh darah arteri

(Gani, 2013). Resiko terjadinya penyakit

jantung koroner meningkat pada

peningkatan kadar kolesterol LDL dalam

darah (Butterfield, 2006).

Menurut Bastard (2006) LDL yang

tinggi dalam darah akan menempel dan

menumpuk pada dinding pembuluh darah.

Radikal bebas dan LDL akan bereaksi

menyebabkan terjadinya LDL teroksidasi.

LDL teroksidasi akan menempel pada

endotel dan menyebabkan kerusakan sel-

sel endotel. Kerusakan ini akan memicu

teraktivasinya makrofag sehingga akan

meningkatkan produksi mediator-

mediator inflamasi atau sitokin

proinflamasi seperti tumor necrosis factor

(TNF), interleukin (IL) serta interferon

gamma (IFN- γ). Peningkatan mediator-

mediator inflamasi ini akan memacu

peningkatan produksi nitric oxide (NO)

dalam jumlah besar melalui aktivasi

inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS).

Tubuh dalam keadaan

hiperkolesterolemia akan berusaha untuk

menyeimbangkan kadar kolesterol dengan

cara sintesis asam empedu. Semakin

banyak asam empedu yang disintesis maka

semakin banyak pula radikal bebas yang

dihasilkan sebagai hasil sampingan. Bila

produksi radikal bebas terjadi secara

berlebih, maka enzim antioksidan tubuh

tidak mampu mengatasinya (Wresdiyati

dkk, 2006). Menurunnya enzim

antioksidan yang dihasilkan oleh tubuh

akan menyebabkan H2O2 oleh pereaksi

3

fenton akan diubah menjadi radikal

hidroksil (OH-) yang bersifat lebih toksik

terhadap senyawa PUFA. Radikal bebas

akan terbentuk terus-menerus dan berperan

dalam oksidasi LDL. Salah satu indikator

terjadinya oksidasi LDL adalah

malondialdehida (MDA). Malondialdehida

digunakan sebagai tolak ukur dari

banyaknya radikal bebas di dalam tubuh.

Semakin tinggi kadar MDA maka semakin

tinggi pula jumlah radikal bebas dalam

tubuh. Salah satu metode pengukuran

MDA adalah dengan Thiobarbituric Acid

Reactivity Test (Ratnawati, 2010).

Dalam penelitian yang dipublikasi

The American Journal of Clinical

Nutrition, susu kambing terbukti

mempercepat pembakaran lemak rendah

kolesterol dan kadar laktosa lebih rendah

13% dari susu sapi dan 41% lebih rendah

dari air susu ibu. Susu kambing tidak

mengandung beta-lactoglobulin, senyawa

ini sering disebut sebagai pemicu reaksi

alergi. Susu kambing memiliki potensi

yang besar sebagai pembawa bakteri

probiotik karena memiliki komposisi

bahan yang relatif baik, yang dapat

mendukung ketersediaan energi bagi

fungsi dan aktifitas metabolisme bakteri

probiotik di dalamnya.

Yogurt terbuat dari susu yang

kemudian ditambahkan dengan bakteri

yang akan membentuk asam laktat. Bakteri

yang digunakan dalam proses pembuatan

yogurt adalah bakteri Lactobacillus

bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, dan

Streptococcus thermophilus. Berdasarkan

penelitian sebelumnya menyebutkan

bahwa bakteri asam laktat berpotensi

menurunkan kadar kolesterol darah karena

bakteri dalam produk tersebut

menghasilkan asam-asam organik seperti

asam propionat dan asam laktat yang dapat

berperan sebagai agen penurun kadar

kolesterol darah (Muti, 2002). Bakteri

asam laktat mampu memetabolisme

kolesterol dari makanan dalam usus halus

sehingga tidak diserap oleh tubuh. Bakteri

asam laktat memiliki kemampuan

mendekonjugasi garam empedu karena

aktivitas Bile salt hydrolase (BSH) (Liong

dan Shah, 2005). Mekanisme penurunan

kolesterol oleh aktivitas BAL disebabkan

oleh enzim BSH yang mendekonjugasi

garam empedu, dimana glisin atau taurin

dipisahkan dari steroid, sehingga

menghasilkan garam empedu bebas atau

terdekonjugasi. Penelitian ini dilakukan

untuk mengetahui pengaruh pemberian

yogurt susu kambing sebagai bahan terapi

hiperkolesterol berdasarkan gambaran

ekspresi iNOS dan kadar MDA pada organ

aorta hewan model tikus (Rattus

norvegicus) wistar jantan yang mendapat

diet hiperkolesterolemia.

MATERI DAN METODE

Preparasi Hewan Coba

Hewan coba dibagi menjadi lima

kelompok perlakuan yaitu kelompok

kontrol (A), kelompok hiperkolesterolemia

(B), hiperkolesterolemia dan terapi yogurt

susu kambing dosis 300 mg/kg BB (C),

dosis 600 mg/kg BB (D), dan dosis 900

mg/kg BB (E). Masing-masing kelompok

perlakuan terdiri dari empat ekor tikus

sebagai ulangan. Hewan coba

menggunakan hewan coba tikus (Rattus

norvegicus) yang diperoleh dari Unit

Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP)

UGM Yogyakarta dengan umur 10-12

minggu dan berat badan sekitar 150 gram.

Penggunaan hewan coba dalam penelitian

ini mendapatkan persetujuan laik etik dari

Komisi Etik Penelitian Universitas

Brawijaya, No: 217-KEP-UB.

Pembuatan Diet Hiperkolesterol

Pakan hiperkolesterol dibuat

dengan mencampurkan minyak babi, asam

kolat dan kuning telur puyuh rebus. Hasil

campuran kemudian dilarutkan dengan

akuades sebanyak 2 ml. Pakan diet

hiperkolesterol diberikan setiap hari

selama 14 hari dan disondekan pada

masing-masing tikus. Pakan standar yang

diberikan sebanyak 20 g/ekor/hari (Gani,

2013). Komposisi bahan pakan

4

hiperkolesterol dalam 20 gram pakan dapat

dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Komposisi bahan pakan

hiperkolesterol dalam 20 gram pakan

Bahan Jumlah

Kandungan

(%)

Jumlah

Bahan

(gram)

Asam

kholat 0,1 0,02

Minyak

babi 10 2

Kuning

telur puyuh 5 1

Pembuatan Starter Yogurt Susu Kambing

Susu kambing 100 ml dituangkan

ke dalam erlenmeyer 250 ml steril lalu

ditutup dengan aluminium foil. Susu

dipasteurisasi pada suhu 72oC selama 5

menit, kemudian didinginkan hingga suhu

turun sampai 40oC-45

oC. Starter ditimbang

sebanyak 0,5 gram lalu dicampur sedikit

dengan susu kambing dan dihomogenkan.

Inokulasi starter selanjutnya dilakukan ke

dalam susu kambing 100 ml (w/v).

Inkubasi dilakukan pada suhu 40oC-45

oC

selama 4-8 jam dan sampai pH rata-rata

yogurt sekitar 4,00-4,5 (Posecion et al.,

2005).

Pembuatan Yogurt Susu Kambing

Susu kambing 485 ml dituangkan

ke dalam botol tutup berulir 1000 ml lalu

ditutup dengan aluminium foil. Susu

dipasteurisasi pada suhu 72oC selama 5

menit kemudian didinginkan hingga suhu

susu turun sampai 40oC-45

oC. Inokulasi

starter dengan kosentrasi 3% ke dalam

susu kambing 485 ml (v/v) lalu

dihomogenkan secara perlahan. Inkubasi

dilakukan pada suhu 40oC-45

oC selama 4-

8 jam dan sampai pH rata-rata yogurt

sekitar 4,5-5 (Posecion et al., 2005).

Yogurt susu kambing dijadikan kering

beku dan disimpan pada suhu 4-5oC.

Pemberian Terapi Yogurt Susu Kambing

Terapi yogurt susu kambing

diberikan setelah tikus diinduksi diet

hiperkolesterolemia selama 14 hari.

Kelompok tikus yang diberikan terapi

yaitu kelompok C, D, dan E dengan dosis

berturut-tutut sebesar 300 mg/kg BB, 600

mg/kg BB, dan 900 mg/kg BB. Terapi

diberikan secara per oral dengan sonde

lambung sebanyak 1,5 ml selama 28 hari.

Pembuatan Kurva Baku MDA

Larutan stok kit standar MDA

dengan konsentrasi sebesar 1, 2, 3, 4, 5, 6,

7 dan 8 mg/mL diambil masing-masing

100 μL. Larutan dimasukkan ke tabung

reaksi yang berbeda dan ditambahkan 550

μL akuades dan 100 μL TCA 100% lalu

dihomogenkan degan vortex. Larutan

ditambahkan 250 μL HCl 1N dan 100 μL

Na-Thio 1% ke dalam tabung dan

dihomogenkan. Sentrifugasi pada

kecepatan 500 rpm selama 10 menit.

Setelah itu, dipanaskan selama 30 menit

dalam suhu 1000C. Larutan didiamkan

pada suhu ruang lalu supernatan diambil

dan larutan standar kemudian dibaca

menggunakan spektrofotometer pada

panjang gelombang maksimun dan hasil

absorbansi MDA larutan baku dan dibuat

kurva.

Pengukuran Kadar MDA

Aorta dengan berat 0,5 gram

dimasukkan ke dalam mortar dingin dan

digerus hingga halus. Ditambahkan 500 μl

NaCl 0,9% dan dihomogenkan.

Homogenat diambil dan dipindahkan ke

tabung microtube. Disentrifugasi dengan

kecepatan 8000 rpm selama 20 menit dan

diambil supernatannya. Supernatan

sebanyak 100 μL dimasukkan ke dalam

microtube, ditambah 550 μl akuades dan

dihomogenkan. Dimasukkan 100 μl TCA

100% dan dihomogenkan. Ditambahkan

100 μL HCL 1 N dan Na-Thio 1 %

sebanyak 100 μL dan dihomogenkan.

Mulut tabung ditutup dengan aluminium

foil dan dipanaskan dalam water bath

1000C selama 10 menit. Didinginkan dan

disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm

selama 20 menit dan supernatannya

diambil untuk dipindah ke tabung

5

microtube. Diukur absorbansinya dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang

maksimum (Aulanni’am et al., 2012).

Pengamatan Ekspresi iNOS

Preparat direndam dalam larutan

xylol 1, xylol 2 kali, alkohol 100%,

alkohol 90%, alkohol 80% dan alkohol

70% dan akuades steril masing-masing

selama 2 menit. Disimpan selama 24 jam

pada suhu 4oC. Preparat dicuci dalam PBS

pH 7,4 dan direndam dalam 3% Hidrogen

Peroksida (H2O2) selama 10 menit (dalam

PBS) dan dicuci dalam PBS pH 7,4,

direndam dalam 1% BSA selama 1 jam

pada suhu ruang. Preparat ditetesi dengan

antibodi primer, anti-rat iNOS (dalam

BSA 1% dalam PBS) 1:100 dan diinkubasi

pada suhu 4oC selama 24 jam. Preparat

dikeluarkan dari refrigerator dan dibiarkan

selama 30 menit dalam suhu ruang, dicuci

dengan PBS pH 7,4. Ditambahkan

antibody sekunder, anti rabbit labelled

biotin dalam PBS (1:200) selama 1 jam

pada suhu ruang, dicuci dengan PBS pH

7,4 (3x5 menit). Ditambahkan SA-HRP

dalam PBS (1:500) selama 40 menit pada

suhu ruang, dicuci dengan PBS pH 7,4

(3x5 menit). Ditambahkan kromogen DAB

(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)

selama 20 menit pada suhu ruang, dicuci

dengan PBS pH 7,4 (3x5 menit).

Dilakukan counter staining dengan

pewarna Major hematoxylin secukupnya

hingga warna biru terlihat, dibilas dengan

air 2x5 menit dan akuades steril 1x5 menit,

dibiarkan semalam dalam suhu ruang.

Dilakukan mounting dengan entellan.

Hasil akhir diamati dibawah mikroskop

cahaya dengan perbesaran sedang (400x).

Keberadaan iNOS pada aorta yang

diamati melalui metode imunohistokimia

(IHK) dianalisis secara kualitatif dengan

cara membandingkan distribusi iNOS pada

sediaan histologi aorta kontrol dengan

perlakuan pada perbesaran rendah (400x)

yang kemudian dibandingkan

penghitungan per luas bidang pandang

pada 5 seri sayatan yang diambil secara

acak untuk setiap kelompok perlakuan

menggunakan software Axio Vision.

Analisa Data

Data yang diperoleh dari hasil

pengukuran ekspresi iNOS dan kadar

MDA pada aorta dianalisis dengan suatu

program SPSS versi 16.0 dengan

melakukan uji analisis varian (ANOVA)

dan dilakukan analisis lebih lanjut dengan

uji Tukey (α = 5 %), apabila terdapat

perbedaan yang nyata.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Efek Terapi Yogurt Susu Kambing

Terhadap Kadar Malondialdehida

(MDA) Pada Aorta Hewan Model Tikus

(Rattus norvegicus) Hiperkolesterolemia Rata-rata hasil kadar MDA aorta

pada kelompok perlakuan (Tabel 2)

menunjukkan adanya perbedaan nyata

antar perlakuan (p<0,05).

Tabel 2. Rata-rata kadar MDA aorta pada

kelompok perlakuan

Kelompok

Rata-rata

kadar MDA

(μg/ml)

Penurunan

(%)

A 1,72 ± 0,51a -

B 4,41 ± 0,44c

-

C 3,75 ± 0,48bc

14,80

D 2,81 ± 0,38ab

36,10

E 2,20 ± 0,19a 50,04

Keterangan : (A) Kontrol ; (B)

Hiperkolesterolemia (C)

Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt

dosis 300 mg/kg BB ; (D)

Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt

dosis 600 mg/kg BB ; (E)

Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt

dosis 900 mg/kg BB. Perbedaan notasi a,

b dan c menunjukkan perbedaan yang

signifikan (p<0,05) antara kelompok

perlakuan.

Berdasarkan rata-rata kadar MDA

pada Tabel 2 rata-rata kadar MDA

tertinggi didapatkan pada tikus

hiperkolesterolemia yang berbeda nyata

dengan tikus hiperkolesterolemia yang

6

diterapi yogurt susu kambing 600 mg/kg

BB dan 900 mg/kg BB, namun tidak

berbeda nyata dengan tikus

hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt

susu kambing 300 mg/kg BB. Hal ini

menunjukkan terapi yogurt susu kambing

300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB dan 900

mg/kg BB mampu menurunkan kadar

MDA aorta tetapi memiliki pengaruh yang

berbeda. Dosis terapi yogurt susu kambing

yang paling berpotensi untuk menurunkan

kadar MDA aorta yaitu dosis 900 mg/kg

BB dengan intensitas penurunan kadar

MDA aorta sebesar 50,04%. Peningkatan

kadar MDA yang tinggi sebesar 156%

terjadi pada tikus kelompok

hiperkolesterolemia. Kadar MDA yang

tinggi mengindikasikan meningkatnya

jumlah radikal bebas yang diakibatkan

karena hiperkolesterolemia. Peningkatan

radikal bebas mengakibatkan stres

oksidatif yaitu jumlah radikal bebas lebih

banyak dari jumlah antioksidan dalam

tubuh. Diet hiperkolesterol mampu

meningkatkan jumlah radikal bebas dalam

tubuh yang merupakan hasil samping dari

sintesis asam empedu dari hati. Reaksi 7α-

hidroksilasi merupakan tahap pertama

pada biosintesis asam empedu yang

memerlukan oksigen, NADPH dan

sitokrom p-450. Menurut Wresdiyati dkk.

(2006) pada kondisi hiperkolesterolemia,

tubuh akan berusaha menyeimbangkan

kolesterol dalam tubuh dengan cara

mengubah kolesterol menjadi asam

empedu. Semakin banyak asam empedu

yang disintesis, semakin banyak oksigen

yang diperlukan. Peningkatan tersebut

akan menghasilkan radikal bebas O2-

sebagai hasil sampingan.

Radikal bebas dalam jumlah yang

berlebihan dapat berpotensi untuk

menimbulkan kerusakan membran yang

merupakan akibat dari peristiwa

peroksidasi lipid, yaitu reaksi berantai

radikal bebas oleh radikal hidroksil (OH·)

yang sangat reaktif dapat bereaksi dengan

lipid membran, yaitu polyunsaturated fatty

acid (PUFA) sehingga terbentuk

Malondialdehida (MDA), suatu radikal

bebas hasil metabolit reaktif peroksidasi

lipid yang umumnya digunakan sebagai

biomarker biologis peroksidasi lipid untuk

menilai stress oksidatif. Radikal bebas

dapat diukur dengan mengetahui kadar

peroksidasi lipid, yaitu pengukuran kadar

MDA jaringan yang dilakukan dengan

metode TBA. MDA dapat diidentifikasi

sebagai produk hasil dekomposisi asam

amino kompleks, karbohidrat, pentosa dan

heksosa. MDA juga merupakan produk

yang dihasilkan oleh radikal bebas.

Pengukuran MDA dengan TBA

didasarkan pada reaksi antara MDA dan

TBA dalam suasana asam.

Penurunan kadar MDA terendah

didapatkan pada tikus hiperkolesterolemia

yang diterapi yogurt susu kambing 900

mg/kg BB yang tidak berbeda nyata

dengan tikus kontrol dengan penurunan

sebesar 50,04%. Hal ini menunjukkan

bahwa tikus hiperkolesterolemia yang

mendapat terapi yogurt susu kambing

dapat menurunkan kadar MDA aorta.

Penurunan kadar MDA dikarenakan

adanya antioksidan dan bakteri asam laktat

(BAL) yang terdapat dalam yogurt susu

kambing. Antioksidan di dalam yogurt

susu kambing seperti vitamin C dan E

mampu berikatan dengan radikal bebas,

sehingga peroksidasi lipid pun dapat

dicegah. Vitamin C Sebagai antioksidan

dapat langsung bereaksi dengan anion

superoksida, radikal hidroksil, oksigen

singlet dan lipid peroksida. Vitamin C

sebagai reduktor akan mendonorkan satu

elektron membentuk semidehidroaskorbat

yang tidak bersifat reaktif dan selanjutnya

mengalami reaksi disproporsionasi

membentuk dehidroaskorbat yang bersifat

tidak stabil. Dehidroaskorbat akan

terdegradasi membentuk asam oksalat dan

asam treonat. Vitamin E sebagai sumber

antioksidan yang larut dalam lemak dan

mudah memberikan hidrogen dari gugus

hodroksil (OH) pada struktur cincin ke

radikal bebas. Cara kerja vitamin E dengan

cara mencari, bereaksi, dan merusak rantai

reaksi radikal bebas serta mencegah lipid

7

peroksidasi dari asam lemak tak jenuh

dalam membran sel.

Penelitian Rival (2001)

menyatakan bahwa biopeptida dalam

yogurt susu kambing mampu menangkap

radikal bebas salah satunya yaitu

laktoferin. Menurut Artym (2003)

laktoferin merupakan extraceluller iron

binding. Iron (besi) intraseluler disimpan

dalam bentuk ferritin, sedangkan

ekstraseluler terikat oleh protein transferin

atau laktoferin. Besi yang tidak terikat

akan mengkatalis produksi ROS melalui

reaksi fenton yang akan mengubah H2O2

menjadi radikal hidrosil (OH-) yang

bersifat toksik terhadap senyawa lipid

tidak jenuh. Melalui biopeptida laktoferin

besi akan diikat, sehingga pembentukan

ROS terhambat dan jumlah ROS di dalam

tubuh juga akan berkurang. Muti (2002)

menyatakan bakteri asam laktat (BAL)

sebagai probiotik alternatif penurun

kolesterol memiliki kemampuan bertahan

terhadap garam empedu, kondisi asam,

dapat mengikat kolesterol dengan

menempel pada dinding saluran

pencernaan dan mampu menghambat

bakteri patogen dengan cara menghasilkan

senyawa anti mikroba seperti bakteriosin.

Bakteriosin adalah toksin yang menyerupai

protein yang disekresikan oleh bakteri

untuk menghambat pertumbuhan bakteri

lain. Menurut penelitian Liong dan Shah

(2005) bakteri asam laktat mampu

memetabolisme kolesterol dari makanan

dalam usus halus sehingga tidak diserap

oleh tubuh. Bakteri asam laktat memiliki

kemampuan mendekonjugasi garam

empedu karena aktivitas Bile salt

hydrolase (BSH). Mekanisme penurunan

kolesterol oleh aktivitas BAL disebabkan

oleh enzim BSH yang mendekonjugasi

garam empedu, dimana glisin atau taurin

dipisahkan dari steroid, sehingga

menghasilkan garam empedu bebas atau

terdekonjugasi. Enzim BSH menghasilkan

garam empedu terdekonjugasi dalam

bentuk asam kolat bebas yang kurang

diserap oleh usus halus. Hal ini

menyebabkan garam empedu yang

kembali ke hati selama sirkulasi

enterohepatik menjadi berkurang, sehingga

total kolesterol dalam tubuh menjadi

berkurang. Beberapa jenis BAL memiliki

dinding sel yang mampu mengikat

kolesterol dalam usus halus sebelum

kolesterol diserap oleh tubuh.

Pemberian terapi yogurt susu

kambing dalam penelitian ini

menunjukkan adanya penurunan kadar

MDA. Dosis 900 mg/kg BB efektif dalam

menurunkan kadar MDA aorta tikus

hiperkolestreolemia yang menghasilkan

penurunan mendekati normal.

Efek Terapi Yogurt Susu Kambing

Terhadap Ekspresi inducible Nitric

Oxide Synthase (iNOS) Pada Aorta

Hewan Model Tikus (Rattus norvegicus)

Hiperkolesterolemia Hasil penelitian pada kelompok tikus

hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt

susu kambing dibandingkan dengan

kelompok tikus hiperkolesterolemia

menunjukkan penurunan ekspresi iNOS.

iNOS merupakan enzim penanda adanya

inflamasi dan diinduksi oleh sitokin yang

akan menghasilkan NO dalam jumlah yang

besar. Sitokin-sitokin proinflamasi yang

muncul pada saat terjadinya inflamasi akan

menstimulus iNOS pada sel otot polos. NO

dihasilkan salah satunya di sel otot polos

yang dibentuk dari asam amino L-arginin

oleh Nitric Oxyde Synthase (NOS) menjadi

L-citrulin dan NO.

Ekspresi iNOS diamati pada preparat

aorta dengan metode imunohistokimia.

Ekspresi iNOS ditunjukkan dengan warna

coklat yang menunjukkan dua reaksi

antara iNOS pada jaringan dengan antibodi

yang ditambahkan (antibodi primer anti-

iNOS, anti rabbit labeled biotin, Strep

avidin horseradish peroxidase dan

kromagen DAB) dapat dilihat pada

Gambar 1.

8

Keterangan: (A) kontrol; (B) Hiperkolesterolemia; (C) Hiperkolesterolemia

yang diterapi yoghurt dosis 300 mg/kg BB; (D) Hiperkolesterolemia yang

diterapi yoghurt dosis 600 mg/kg BB; (E) Hiperkolesterolemia yang diterapi

yoghurt dosis 900 mg/kg BB dan tanda panah menunjukkan ekspresi iNOS.

A B

C D

E

Gambar 1. Ekspresi iNOS Pada Aorta (400x)

9

Ekspresi inducible Nitric Oxyde

Synthase (iNOS) pada kelompok normal

atau kontrol terlihat muncul namun dalam

intensitas yang rendah (2,26 ± 1,25)

(Gambar 1 A), sedangkan pada tikus

hiperkolesterolemia ekspresi iNOS terlihat

mengalami kenaikan (15,65 ± 1,73) yang

tersebar pada tunika media (Gambar 1 B).

Ekspresi iNOS pada kelompok tikus

hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt

susu kambing menunjukkan penurunan

intensitas pada bagian tunika media

dibandingkan dengan kelompok tikus

hiperkolesterolemia (Gambar 1 C, D, E).

Hasil analisa statistik menggunakan

SPSS. 16 dan hasil uji lanjutan

menggunakan uji Tukey menunjukkan

bahwa pemberian pakan hiperkolesterol

dan terapi yogurt susu kambing

menyebabkan perbedaan yang signifikan

terhadap ekspresi iNOS aorta (p<0,05)

yang ditunjukkan pada Tabel 3.

Tabel 3. Rata-rata ekspresi iNOS aorta

pada kelompok perlakuan

Kelompok

Rata-rata

ekspresi

iNOS

Penurunan

(%)

A 2,26 ± 1,25a -

B 15,65±1,73c

-

C 9,75 ± 0,94b 37,6

D 7,86 ± 0,38b 49,7

E 4,74 ± 0,31a 69,7

Keterangan : (A) Kontrol ; (B)

Hiperkolesterolemia (C)

Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt

dosis 300 mg/kg BB ; (D)

Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt

dosis 600 mg/kg BB ; (E)

Hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt

dosis 900 mg/kg BB. Perbedaan notasi a,

b dan c menunjukkan perbedaan yang

signifikan (p<0,05) antara kelompok

perlakuan.

Berdasarkan rata-rata ekspresi

iNOS aorta pada Tabel 3 rata-rata ekspresi

iNOS terendah didapatkan pada tikus

normal yang tidak berbeda nyata dengan

tikus hiperkolesterolemia yang diterapi

yogurt susu kambing dosis 900 mg/kg BB.

Ekspresi iNOS pada tikus normal terjadi

karena adanya apoptosis pada sejumlah sel

(Mahdi, 2008). Rata-rata ekspresi iNOS

tertinggi didapatkan pada tikus

hiperkolesterolemia yang berbeda nyata

dengan tikus hiperkolesterolemia yang

diterapi yogurt susu kambing 300 mg/kg

BB, 600 mg/kg BB dan 900 mg/kg BB.

Dosis terapi yogurt susu kambing 300

mg/kg BB tidak berbeda nyata dengan

dosis 600 mg/kg BB namun berbeda nyata

dengan dosis 900 mg/kg BB. Hal ini

menunjukkan terapi yogurt susu kambing

dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB, dan

900 mg/kg BB mampu menurunkan

ekspresi iNOS aorta tetapi memiliki

pengaruh yang berbeda. Peningkatan

ekspresi iNOS aorta yang tinggi sebesar

116% terjadi pada kelompok

hiperkolesterolemia. Peningkatan ekspresi

iNOS ini mengindikasikan adanya

inflamasi yang diakibatkan radikal bebas

karena kondisi hiperkolesterolemia.

Menurut penelitian Djatmiko (2010),

Nitric oxide (NO) merupakan radikal

bebas yang dibentuk dari asam amino

Larginin oleh Nitric Oxide Synthase

(NOS). NO banyak terdapat pada kondisi

inflamasi. Kerusakan sel endotel

diakibatkan oleh LDL yang teroksidasi

yang akan melepaskan anionsuperoksida

(O2-), dimana endotel menjadi lebih

permeabel terhadap lipoprotein, sehingga

LDL penetrasi ke dinding vascular dan

menuju tunika intima. LDL oksidasi

kemudian merangsang ekspresi dari

Vascular Cell Adhesion Molecule – 1

(VCAM-1) dan Monocyte Chemotactic

Protein-1 (MCP-1) yang akan menarik

monosit ke dinding arteri dan monosit

berdiferensiasi menjadi makrofag sebagai

respon atas diproduksinya Monocyte

Colony Stimulating Factor (MCSF).

Menurut Chapman dan Kontush (2006),

LDL oksidasi akan difagositosis oleh

makrofag sehingga makrofag penuh

dengan lemak yang biasa disebut dengan

sel busa (Foam cell). Sel busa akan

memacu keluarnya sitokin-sitokin

proinflamasi seperti TNF-α, IL-1, dan

10

iNOS. Menurut Bray (2006), ROS akan

menyebabkan aktifnya Nuclear Factor

Kappa Beta (NF-κB) dengan cara ROS

akan menginisisai cascade serin sehingga

iKB akan mengalami fosforilasi

(penambahan fosfat) sehingga ikatan

antara NF-κB dan iKB terlepas, NF-κB

akan berpindah ke dalam inti sel sehingga

menginduksi keluarnya sitokin-sitokin

proinlamasi.

Penurunan ekspresi iNOS aorta

terendah didapatkan pada tikus

hiperkolesterolemia yang diterapi yogurt

susu kambing 900 mg/kg BB yaitu sebesar

69,7% dari tikus hiperkolesterolemia.

Menurut Mirsha (2008) penurunan

ekspresi iNOS menunjukkan adanya

biopeptida aktif dan vitamin yang

terkandung dalam yogurt susu kambing.

Biopeptida aktif, vitamin dan kandungan

BAL yang terkandung dalam yogurt susu

kambing mampu untuk mengurangi

jumlah radikal bebas dalam tubuh,

sehingga ekspresi iNOS yang terbentuk

pada kondisi hiperkolesterolemia dapat

menurun. Biopeptida aktif seperti

laktoferin yang terkandung di dalam

yogurt susu kambing mampu menurunkan

sitokin proinflamasi iNOS melalui peranan

NF-κB. Mekanisme penurunan aktivasi

NF-κB tersebut, antara lain melalui

biopeptida laktoferin besi akan diikat,

sehingga pembentukan ROS terhambat dan

jumlah ROS di dalam tubuh juga akan

berkurang. Berkurangnya jumlah ROS

akan menghambat translokasi NF-κB ke

dalam nucleus, menghambat fosforilasi

iKB, menghambat aktivasi gen yang

mengkode transaktivasi NF-κB dan

degradasi iKB ataupun hambatan

degradasi iKB oleh proteasome.

Penurunan aktivasi NF-κB mengakibatkan

turunnya signaling NF-κB pada sel imun

sehingga meregulasi turunnya iNOS.

Berkurangnya ROS dalam tubuh

dapat mencegah terjadinya LDL oksidasi

sehingga kerusakan endotel pembuluh

darah dapat berkurang. Sesuai dengan

penelitian Pribadi (2009), bahwa

antioksidan bekerja mencegah proses

oksidasi dari LDL dengan cara menangkap

radikal bebas, sehingga tidak akan terjadi

oksidasi LDL. Pendapat tersebut didukung

oleh Brasier et al. (2002), antioksidan

merupakan penangkap dari radikal bebas

yang kuat, dapat menurunkan adhesi

monosit terhadap sel endotel dan

menghambat oksidasi LDL.

Pemberian terapi yogurt susu

kambing dalam penelitian ini

menunjukkan adanya penurunan ekspresi

iNOS. Dosis 900 mg/kg BB efektif dalam

menurunkan ekspresi iNOS aorta tikus

hiperkolestreolemia yang menghasilkan

penurunan mendekati normal.

KESIMPULAN

1. Pemberian terapi yogurt susu kambing

dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB

dan 900 mg/kg BB dapat menurunkan

kadar MDA pada aorta tikus

hiperkolesterolemia tetapi memiliki

pengaruh yang berbeda. Penurunan

terbaik sebesar 50,04% dihasilkan dari

terapi yogurt susu kambing dosis 900

mg/kg BB.

2. Pemberian terapi yogurt susu kambing

dosis 300 mg/kg BB, 600 mg/kg BB

dan 900 mg/kg BB dapat menurunkan

ekspresi iNOS pada aorta tikus

hiperkolesterolemia tetapi memiliki

pengaruh yang berbeda. Penurunan

terbaik sebesar 69,7% dihasilkan dari

terapi yogurt susu kambing dosis 900

mg/kg BB.

UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih kepada:

1. Prof. Dr. Ir. Chanif Mahdi, MS

sebagai ketua dari payung penelitian

atas kesempatan bergabung dalam

penelitian ini.

2. Staff Laboratorium Kesehatan

Masyarakat Veteriner, Laboratorium

Biokimia, Laboratorium Fisiologi

Hewan, Universitas Brawijaya,

Malang dan staff Laboratorium

Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas

11

Farmasi Universitas Airlangga,

Surabaya.

3. Staff Poliklinik Universitas Brawijaya,

Malang.

DAFTAR PUSTAKA

Artym, J. 2003. Orally Administered

Lactoferrin Restores Humoral

Immune Response in

Immunocompromised Mice.

Immunol Lett. 9(1):9-15.

Aulanni’am. 2012. The Potency of

Sargassum duplicatum Bory

Extract on Inflammatory Bowel

Disease Therapy in Rattus

norvegicus. Journal of Life

Sciences 6: 144-154.

Bastard, J.P., Maachi, M., Lagathu , C.,

Kim, M.J., Caron, M., Vidal, H.,

Capeau, J.,dan Feve, B. 2006.

Recent Advances in the

Relationship Between Obesity,

Inflamation, and Insulin

Resistance. Eur Cytokin Netw.

Mar;17(1);4-12. PubMed US

National Library of Medicine.

Bray, L. 2006. Oxidative Stress in

Toxicology: Established

Mammalian and Emerging Piscine

Model Systems. J Enviromental

Health Perspective, 106(7).

Brasier, B. 2002. Reactive species and

antioxidants: Redox biology is

fundamental theme of aerobic life.

J Plant Physiology, 141:312–322.

Butterfield, TA., TM. Best dan MA.

Merrick. 2006. The dual Roles of

Neutrophils and Macrophages in

Inflamation : A Critical Balance

Between Tissue Damage and

Repair. Journal of Athelic

Trainning 41 (4) : 457-465.

Chapman, L.P dan Kontush, W. 2006.

Role of Oxidative Stress in

Atherosclerosis, Am.J Cardiol,

91:7A-11A.

Dalimartha, S. 2008. Atlas Tumbuhan

Obat Indonesia. Jakarta : Trubus

Agriwidya.

Djatmiko. 2010. The protective ability of

Mediterranean dietary plants against

the oxidative damage: The role of

radical oxygen species in

inflammation and the polyphenol,

flavonoid and sterol content. J. Food

Chemistry. Vol. 112 : 587-594.

Gani, N., IM Lidya, MP. Mariska. 2013.

Profil Lipida Plasma Tikus Wistar

yang Hiperkolesterolemia pada

Pemberian Gedi Merah

(Abelmoschus manihot L.). Jurnal

MIPA UNSRAT Online 2 (1) 44-49.

Liong , K. H dan Shah, R. 2005.

Production Of Free Conjugated

Linoleic Acid by Lactobacillus

acidophilus and Lactobacillus

casei Of Human Intestinal Origin.

Journal Dairy Sci. 86 : 673-681.

Mahdi, Chanif. 2010. Efek Paparan

Formaldehid dan Suplementasi

Yogurt terhadap Aktivitas

Antioksidan Kerusakan Oksidatif,

Profil dan Karakter Protein

Jaringan Hepar Tikus (Rattus

norvegicus). Indo. J. Chem (1) :

132 – 137.

Mirsha, K.V. 2008. Immunomodulatory

and Anticancer Potential of Yogurt

Probiotic. Biotechnology 7. 177-

174.

Muti, T.W. 2002. Effect of Low pH On

The Ability of Lactobacillus

acidophilus To Survey and

Adherence To Human Intestinal

12

Cells. Journal of Food Science 53:

1514-1516.

Posecion, N.C., Crowe, N.L., Robinson,

A.R., Asiedu, S.K. 2005. The

Development Of A Goat’s Milk

Yogurt. Journal of the science of

Food and Agriculture, 85(11):

1909­1913.

Pribadi, J. 2009. Free Radical and

Antioxidant Vitamints in

Degenerative Disease. J IMA,

2(5):1-3.

Ratnawati. 2010. Blood Cholesterol Level

of Hypercholesterolemia Rat (Rattus

norvegicus) After VCO Treatment.

Journal Bioscience Vol 1 No 2 : 53-

58.

Rivai, A. 2001. Ace Inhibitory and Radical

Scavenging Activity of Peptides

Derived from Lactoglobulin. J.

Agric Food Chem. 55 : 3392-

3397.

Wresdiyati, T, Astawan M, Hastanti LY.

2006. Profil Imunohistokimia

Superoksida Dismutase (SOD)

Pada Jaringan Hati Tikus Dengan

Kondisi Hiperkolesterolemia.

Jurnal Hayati 13: 85-89.