UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ Faculdade de Medicina
Departamento de Patologia e Medicina Legal
AVALIAÇÃO DO EFEITO LEISHMANICIDA IN VITRO E IN VIVO
DE CONSTITUINTES QUÍMICOS ATIVOS DERIVADOS DE
PLANTAS MEDICINAIS
Maria Jania Teixeira
Fortaleza – Ceará
1999
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ Faculdade de Medicina
Departamento de Patologia e Medicina Legal
AVALIAÇÃO DO EFEITO LEISHMANICIDA IN VITRO E IN VIVO DE CONSTITUINTES QUÍMICOS ATIVOS DERIVADOS DE
PLANTAS MEDICINAIS
Maria Jania Teixeira
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em
Patologia, do Departamento de Patologia e Medicina Legal da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Patologia. Orientadora: Profa. Dra. Yacy Mendonça de Almeida
Co-orientadora: Profª Margarida Maria de Lima Pompeu
Fortaleza – Ceará
1999
ii
FICHA CATALOGRÁFICA
T267a Teixeira, Maria Jania
1999 Avaliação do efeito leishmanicida in vitro e in vivo de constituintes químicos ativos derivados de plantas medicinais/ Maria Jania Teixeira. Fortaleza, 1999.
73 f.: il. Orientadora: Profª. Dra. Yacy Mendonça de Almeida. Co-orientadora: Profª. Dra. Margarida Maria de Lima Pompeu. Dissertação (Mestrado). Universidade Federal do Ceará. Faculdade de
Medicina. Departamento de Patologia e Medicina Legal.
1.PLANTAS MEDICINAIS. 2. EFEITO LEISHMANICIDA. 3. TRATAMENTO. CDD 581.634
Esta dissertação foi submetida como parte dos requisitos necessários à obtenção do
Grau de Mestre em Patologia, outorgado pela Universidade Federal do Ceará e encontra-se
à disposição dos interessados na Biblioteca da Faculdade de Medicina da referida
Universidade.
A citação de qualquer trecho desta Tese é permitida, desde que seja feita de
conformidade com as normas da ética científica.
_____________________________
Maria Jania Teixeira
Dissertação aprovada em: 13/04/1999
_____________________________
Profª. Yacy Mendonça de Almeida
(Orientadora)
_____________________________
Prof. Antônio Wilson Vasconcelos
_____________________________
Prof. Vietla Satyanarayana Rao
iii
Esta tese é dedicada “in memoriam” a meu pai,
Joaquim Américo Teixeira, um farmacêutico
competente e dedicado, com quem, ainda na
infância, aprendi a reconhecer a leishmaniose e
acompanhar o prolongado tratamento desta doença.
iv
É a inquietude que liberta a plântula da
semente e, ávida de luz, transfigura em
amorosas folhas a terra informe e soturna onde
foi lançada.
José Leone de Araújo
v
AGRADECIMENTOS
À Profª. Yacy Medonça de Almeida pela inestimável orientação científica que me
foi dada, por sua amizade, paciência, sugestões sempre pertinentes e constante incentivo
durante a realização deste trabalho.
À Profª. Cristina de Sousa Chaves, que me abriu pela primeira vez os horizontes
para a pesquisa e me mostrou o mundo da Parasitologia.
Ao Dr. Thomas George Evans, que me ensinou a trabalhar com o conhecimento
científico.
Ao Prof. Vietla Satyanarayana Rao e Flávia Almeida Santos, que me deram a
inspiração para trabalhar com o princípio ativo lapachol, pela inestimável colaboração no
decorrer deste trabalho.
Ao Prof. Said Fonseca pelo fornecimento de parte do material estudado e
disponibilidade em me intermediar com o laboratório LAFEPE.
Ao Prof. Francisco Abreu Matos pelo fornecimento de parte do material aqui
estudado, valiosas sugestões, esclarecimentos e colaboração no decorrer dos experimentos.
Ao Dr. Ivo Castelo Branco Coêlho, Coordenador do Núcleo de Medicina Tropical,
pelo apoio imensurável e confiança depositada no meu trabalho.
Aos Profs. Antônio Wilson Vasconcelos e Izabel de Alencar Barros Vasconcelos
pela inestímavel amizade e incentivo na carreira científica.
Às adoráveis amigas Geanne Matos de Andrade Cunha, Maria Isabel MacAullife
e Maria do Carmo Nunes de Pinho pelo suporte e amizade durante o desenvolvimento
deste trabalho.
À Lurdemiler Sabóia Mota e Falba Bernadete dos Anjos pela prestimosa
orientação e ajuda nos experimentos de neurotoxicidade.
vi
À Paula da Paz Palácio, da pós-graduação, pela eficiência no atendimento e na
resolução dos problemas.
À amiga bibliotecária Veronice Souza de Oliveira pelo trabalho de revisão
bibliográfica, estímulo e colaboração, além de sua valiosa amizade.
Um especial agradecimento ao amigo Haroldo Sérgio da Silva Bezerra pelo apoio,
incentivo, amizade e incontáveis horas de alegres e proveitosas discussões.
Ao amigo Eddie William de Pinho Santana pela inestimável colaboração na
digitalização das imagens deste trabalho.
Também agradeço aos demais professores, colegas e funcionários do Departamento
de Patologia e Medicina Legal, bem como aos funcionários do Núcleo de Medicina
Tropical J.E.A., pelo ambiente de cooperação, estímulo e amizade.
Carinhosamente, o meu mais sincero agradecimento aos amigos e colaboradores:
Maria Claúdia C. Façanha, Joseval da Rocha Viana, Joana Gurgel Holanda Filha,
Tatiana Paschoalette Rodrigues, José Rômulo Cavalcante Prata Junior, Herivaldo
Lima Costa e Adriana Pereira do Nascimento, a minha maravilhosa equipe que tornou
possível a realização deste trabalho.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS À minha mãe, Luizinha, e irmãos, Ademir, Rosa Maria, Rosinéa, Adriana Luiza,
Doris e Maria Bernadete que sempre me incentivaram e acreditaram na minha
capacidade.
À Profª. Margarida Maria de Lima Pompeu, co-orientadora deste trabalho, minha
mentora científica, que me tem dado suporte e amizade nos momentos mais difícies desse
meu longo aprendizado científico e que é um exemplo de abnegação pela pesquisa e
ensino.
vii
ÍNDICE
Lista de Tabelas ............................................................................................................. x
Lista de Figuras ............................................................................................................. xi
Resumo .......................................................................................................................... xiii
Abstract .......................................................................................................................... xiv
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
1.1 Considerações gerais ........................................................................................... 1
1.2 Leishmaniose tegumentar .................................................................................... 3
1.2.1 Breve histórico .......................................................................................... 3
1.2.2 Aspectos clínico-epidemiológicos ............................................................ 5
1.2.3 Tratamento ................................................................................................ 8
1.3 Plantas medicinais ............................................................................................... 13
1.3.1 Generalidades ............................................................................................ 13
1.3.2 Uso de plantas medicinais na leishmaniose .............................................. 15
1.4 Timol .................................................................................................................... 18
1.5 Lapachol ............................................................................................................... 20
1.6 Objetivos .............................................................................................................. 24
2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 25
2.1 Substâncias avaliadas .......................................................................................... 25
2.2 Preparo e solubilização das susbtâncias .............................................................. 25
2.3 Meios de cultura .................................................................................................. 25
2.4 Parasitas .............................................................................................................. 26
2.5 Ensaios in vitro ................................................................................................... 26
2.5.1 Purificação de macrófagos ....................................................................... 26
2.5.2 Citotoxicidade em macrófagos ................................................................. 26
2.5.3 Avaliação da atividade anti-amastigota .................................................... 27
viii
2.6 Ensaios in vivo .................................................................................................... 28
2.6.1 Animais experimentais ............................................................................. 28
2.6.2 Infecção experimental .............................................................................. 28
2.6.3 Tratamento com timol .............................................................................. 28
2.6.4 Tratamento com lapachol ......................................................................... 28
2.6.5 Avaliação do efeito terapêutico ............................................................... 29
2.6.6 Estudo histopatológico ............................................................................ 29
2.7 Análise estatística dos dados .............................................................................. 29
3 RESULTADOS ........................................................................................................ 30
3.1 Ensaios in vitro .................................................................................................. 30
3.2 Ensaio in vivo com timol ................................................................................... 32
3.3 Ensaio in vivo com lapachol e sua associação com Pentostam® ...................... 34
3.4 Achados histopatológicos .................................................................................. 38
3.4.1 Alterações no linfonodo de drenagem da lesão ...................................... 38
3.4.2 Alterações no baço .................................................................................. 40
4 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 45
5 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 55
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 57
ix
LISTA DE TABELAS
TABELA PÁGINA
1 - Plantas medicinais com atividade leishmanicida ....................................................... 16
2 - Efeito citotóxico do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes (Pentostam® e
Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos ................................................. 30
3 - Efeito leishmanicida in vitro do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes
(Pentostam® e Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos infectados com
Leishmania (Viannia) braziliensis ........................................................................... 31
4 - Avaliação do efeito do tratamento com timol (14mg/kg/dia), administrado por 42 dias,
via I.M., em hamsters (n = 6) infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis... 33
5 - Avaliação do efeito do tratamento oral por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) ou sua
associação com Pentostam® (60mg/kg/dia) em hamsters (n = 8) infectados com
Leishmania (Viannia) braziliensis........................................................................... 36
6 – Alteração ponderal dos animais durante o tratamento oral por 42 dias com lapachol
(300mg/kg/dia) ou sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia) ....................... 36
7 - Percentagem de animais com lesões ulceradas durante o curso da infecção por
Leishmania (Viannia) braziliensis e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia)
ou sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia)................................................. 38
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA PÁGINA
1 - Estrutura química do timol ...................................................................................... 18
2 - Estrutura química do lapachol ................................................................................. 21
3 - Efeito leishmanicida in vitro do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes
(Pentostam® e Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos infectados
com Leishmania (Viannia) braziliensis.................................................................. 32
4 - Efeito do tratamento I.M. com timol (14mg/kg/dia) em hamsters (n = 6) infectados
com Leishmania (Viannia) braziliensis.................................................................. 33
5 - Efeito do tratamento oral com lapachol (300mg/kg/dia) ou da sua associação com
Pentostam® (60mg/kg/dia) em hamsters (n = 8) infectados com Leishmania
(Viannia) braziliensis ............................................................................................. 34
6 - Carga parasitária no linfonodo de drenagem da pata de hamsters infectados por
Leishmania (Viannia) braziliensis ao final de 42 dias de tratamento oral com
lapachol (300mg/kg/dia) associado ou não ao Pentostam® (60mg/kg/dia) .......... 35
7A - Peso relativo do linfonodo de drenagem de hamsters infectados com Leishmania
(Viannia) braziliensis e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) associado
ou não ao Pentostam® (60mg/kg/dia) ................................................................. 37
7B - Peso relativo do baço de hamsters infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis
e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) associado ou não ao Pentostam®
(60mg/kg/dia) ......................................................................................................... 37
7C - Peso relativo do fígado de hamsters infectados com Leishmania (Viannia)
braziliensis e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) associado ou não
ao Pentostam® (60mg/kg/dia) ............................................................................... 37
8A - Linfonodo de controle não tratado. Intensa histiocitose sinusal e parenquimal, sem
formação de granulomas. HE, 40x. ....................................................................... 41
8B – Maior aumento da Fig. 8A. HE, 100x. ................................................................... 41
xi
9 - Linfonodo de controle não tratado. Macrófagos vacuolados, volumosos e parasitados.
HE, 400x. ............................................................................................................... 41
10A – Linfonodo de controle não tratado. Intensa hiperplasia folicular. HE, 40x. ...... 42
10B - Hiperplasia folicular em destaque. HE, 100x. .................................................... 42
11 – Linfonodo de controle não tratado mostrando intensa plasmocitose. HE, 400x. .. 42
12A – Linfonodo de hamster tratado com lapachol. Extensas áreas de necrose e apoptose
com acentuada hipoplasia folicular. HE, 40x ...................................................... 43
12B – Detalhe da Fig. 12A. HE, 100x. ......................................................................... 43
12C – Linfonodo. Amastigotas parasitando macrófagos. HE, 1000x. .......................... 43
13 – Linfonodo de hamster tratado com antimonial. Histiocitose, hiperplasia folicular e
plasmocitose discretas. HE, 40x. .......................................................................... 44
14A – Baço de controle não tratado. Marcante hipoplasia de polpa branca. HE, 40x. .. 44
14B – Maior aumento da Fig. 14A. Macrófagos intensamente vacuolados e volumosos.
HE, 100x ................................................................................................................ 44
xii
RESUMO
Os antimoniais, drogas de escolha no tratamento da leishmaniose, apresentam bons
resultados, porém com vários efeitos colaterais e registros de resistência. Nos últimos anos,
vem ocorrendo um aumento na busca por novas drogas antiparasitárias a partir de
extrações de plantas. Este trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito leishmanicida in vitro
e in vivo, de duas substâncias isoladas de plantas medicinais, timol e lapachol, em relação
aos antimoniais. Bem como comparar os resultados obtidos in vitro com a resposta
terapêutica in vivo. As drogas, em concentrações que variaram de 0,008 a 4,0mg/ml, foram
avaliadas contra amastigotas intracelulares de Leishmania (Viannia) braziliensis (LVb) in
vitro e, em seguida, testadas em um modelo animal susceptível (hamster) para confirmar a
ação leishmanicida. In vitro, ambos, timol e lapachol, apresentaram efeito anti-amastigota,
entretanto, in vivo, não foram capazes de conter o desenvolvimento de lesões por LVb, nas
concentrações de 14mg/kg/dia/i.m e 300mg/kg/dia/v.o, respectivamente. Tais resultados
sugerem que possam ser convertidas em metabólitos inativos ou neutralizadas, perdendo
sua ação leishmanicida. Os antimoniais apresentaram significante efeito anti-amastigota
para LVb in vitro, entretanto, in vivo, apesar da aparente cura clínica, estas drogas
(60mg/kg/dia) não foram capazes de erradicar os parasitas dos tecidos. Na histopatologia,
foi visto que lapachol induziu intensa necrose e apoptose no linfonodo, no entanto, não
reduziu a carga parasitária neste sítio. Encontramos ainda que, baço e linfonodo respondem
de maneira diferente à infecção por Leishmania, uma vez que no baço ocorreu hipoplasia
da polpa branca e no linfonodo, hiperplasia folicular. A leishmaniose tegumentar por LVb,
no hamster, apresentou um padrão de infecção não resolutivo, com linfadenopatia,
hepatoesplenomegalia, perda de peso e ausência de granulomas no linfonodo e baço. Como
a ação das drogas não foi semelhante nos modelos in vitro e in vivo utilizados, o modelo in
vivo parece refletir melhor o potencial terapêutico das drogas, sendo, portanto, mais
adequado à triagem de novas substâncias para o tratamento da leishmaniose.
xiii
ABSTRACT
Antimonials, drugs of choice for the treatment of leishmaniasis, provide good
results but have side effects and cases of resistance have been reported. In recent years,
there has been an increase in the search for new antiparasitic drugs developed from plants
extracts. This study aims to evaluate the leishmanicidal effects, both in vitro and in vivo, of
two chemicals isolated from medicinal plants, tymol and lapachol, and compare that effect
with the one obtained by antimonials. As well as to compare the results obtained in vitro
with the therapeutical response in vivo. These compounds (0,008 to 4,0mg/ml) were
evaluated in vitro against intracellular amastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis
(LVb), then tested in an animal model (hamster) to confirm the leishmanicidal activity. In
vitro, both tymol and lapachol, exhibited an anti-amastigote effect whereas in vivo these
substances were not able to stop the development of LVb-induced lesions in the
concentrations of 14mg/kg/day/i.m and 300mg/kg/day/p.o, respectively. These results
suggest that they might be getting transformed into non-active metabolite(s) or is
neutralized, losing their leishmanicidal activity. The antimonials demonstrated efficacy in
vitro as well in vivo. But, in spite of presenting a significant anti-amastigote effect in vitro
for LVb and apparent clinical cure in vivo, these drugs (60mg/kg/day/i.m) could not
completely eradicate the parasites from the tissues of LVb-infected animals. In the
histopathological findings disclosed that, lapachol induced a severe lymph node necrosis
and apoptosis, although it didn’t reduce the parasitic load in that site. We also found out
the spleen and lymph node respond differently to Leishmania infection, since in the spleen
an intense withe pulp hypoplasia occurred whereas in the lymph node a remarkable
follicular hyperplasia was the rule. LVb-induced tegumentary leishmaniasis in the hamster,
showed an unresolved pattern of infection, characterized by lymphadenopathy,
hepatosplenomegaly, weight loss and absence of granulomas in the lymph node and spleen.
Since the effect of the substances was not similar in the two models studied, in vitro and in
vivo, the in vivo model appears to better reflect the therapeutic potencial of the drugs,
therefore being more adequate for the screening of new substances for the treatment of
leishmaniasis.
xiv
1. INTRODUÇÃO 1.1. Considerações gerais
leishmaniose tegumentar (LT) é um problema de saúde pública de
considerável magnitude na América do Sul, estando incluida entre as seis
mais importantes doenças infectoparasitárias do mundo, não somente por
sua frequência, mas, principalmente, devido as mutilações que pode causar,
comprometendo o estado geral do paciente, bem como dificultando sua integração social,
com sérias repercussões psicológicas.
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), as leishmanioses afetam cerca
de 12 milhões de pessoas no mundo, com 350 milhões vivendo em áreas de risco e
aproximadamente 2 milhões de casos novos por ano (1-1,5 milhões de casos de
leishmaniose cutânea e 500 000 de leishmaniose visceral) (World Health Organization,
[online] 1998). Um estudo prospectivo realizado em região endêmica de leishmaniose
cutânea, no Brasil, causada por Leishmania braziliensis, revelou uma incidência anual de
8.1 casos para 1.000 indivíduos, constituindo-se em uma das mais importantes endemias
do país (Jones et al., 1987). No Ceará, a incidência de LT é elevada, em 1998 foram
registrados 20,2 casos novos para 100.000 habitantes (Ministério da Saúde, 1999).
A leishmaniose tegumentar distribui-se amplamente em todos os continentes, com
exceção da Oceania. São 88 países afetados (22 no Novo Mundo e 66 no Velho Mundo),
concentrados principalmente nas regiões tropicais. É endêmica na América do Sul e
Central, tendo Brasil e Peru como os países onde a doença é mais prevalente (WHO,
[online] 1998). Focos de leishmaniose cutânea difusa têm sido identificados na República
Dominicana e casos autóctones de LT têm sido reportados no Texas, deixando Uruguai,
Chile e Canadá como os únicos países nas Américas onde a doença ainda não foi
encontrada (Pearson & Sousa, 1995).
No Brasil, a distribuição geográfica de LT é ampla e, com exceção do Rio Grande do
Sul, a doença tem sido registrada em todo o território nacional. Dados da Fundação
Nacional de Saúde (FNS) mostram que cerca de 50% dos casos registrados no país
A
2
procedem da região Nordeste, sendo que os maiores focos endêmicos são encontrados nos
estados da Bahia, Maranhão e Ceará. Somente no período de abril a junho de 1997, o
estado do Ceará foi responsável por cerca de 14% dos casos de LT da região, percentual
este que pode está aquém da realidade, devido as subnotificações (FNS/MS, 1997).
A diversidade do espectro clínico da doença parece depender, dentre outras coisas,
da resposta imunológica do hospedeiro, do tropismo e virulência do parasita envolvido. A
manifestação clínica mais comum da LT é caracterizada por lesões crônicas que podem ou
não regredir espontaneamente. A leishmaniose cutâneo-mucosa (ou espúndia) é a forma
mais grave, podendo causar severa destruição das mucosas e estruturas do orofaringe e
apresentando significante morbidade. Uma manifestação rara da doença, na maioria das
vezes refratária aos tratamentos, é a forma difusa, caracterizada por lesões múltiplas não
ulceradas, que contém um grande número de parasitas.
Há mais de 50 anos os antimoniais pentavalentes têm sido as drogas de escolha no
tratamento da leishmaniose, com bons resultados, no entanto, são observados vários efeitos
colaterais e existem alguns registros de casos de resistência (Olliaro & Bryceson, 1993).
Na ocorrência de falha terapêutica, as drogas de segunda escolha são anfotericina B e
isotionato de pentamidina, mas ambas também demandam aplicação por via parenteral e
exibem apreciável toxicidade (Berman, 1997). Apesar das diversas tentativas na pesquisa
de novos agentes terapêuticos para o tratamento da leishmaniose, até o momento nenhuma
outra droga mostrou possuir eficácia comprovada (Berman, 1997). Considerando que a
terapêutica da leishmaniose pouco evoluiu, torna-se necessário a descoberta de novos
medicamentos, que apresentem menor toxicidade e que sejam preferencialmente utilizados
por via oral, adequando-se mais facilmente às condições das áreas endêmicas.
Plantas com atividades medicinais sempre foram usadas para o tratamento da
leishmaniose cutânea pelas populações rurais (Fournet et al. 1994a; França et al., 1996) e a
cada dia têm despertado mais o interesse da comunidade científica. Com o surgimento dos
medicamentos químicos, as ervas foram sendo colocadas de lado, principalmente no
ocidente, mas hoje, devido ao conhecimento dos efeitos colaterais adversos de boa parte
dos medicamentos sintéticos, vem-se buscando, nas plantas medicinais, uma alternativa
para a cura das mais diversas doenças. Em 1978, a OMS determinou o início de um
programa mundial com o fim de avaliar e utilizar os métodos da medicina popular e, desde
3
então, vem estimulando o uso racional das plantas medicinais em países pobres e em
desenvolvimento (WHO, 1991). Ainda hoje as substâncias naturais, seus derivados e
análogos, representam cerca de 50% de todas as drogas medicinais, e é importante salientar
que aproximadamente 25% destas são obtidas de plantas superiores (Balandrin et al.,
1993).
No Brasil, em 1995, o consumo de medicamentos caiu muito. Uma pesquisa feita
para levantar as causas desta queda mostrou que das 400 famílias pesquisadas, 91,9% se
automedicavam com ervas e 46,6% as cultivavam nos quintais. Dados da Associação
Brasileira da Indústria Farmacêutica apontam que as vendas de medicamentos sintéticos
cresceram 16% naquele ano, enquanto o consumo de fitoterápicos subiu 20% (Oka &
Roperto, [online] 1998).
As plantas têm sido ao longo dos tempos fontes potenciais para o desenvolvimento
de novas drogas por terem uma complexa composição e demonstrarem uma grande
variedade de ações farmacológicas.
1.2. Leishmaniose tegumentar
1.2.1. Breve histórico
leishmaniose tegumentar (LT) é conhecida há milênios, encontrando-se
referências a ela nos textos bíblicos e nos manuscritos orientais. A doença
parece ser autóctone do continente americano, pois já era retratada através
de figuras com mutilações dos lábios e do nariz e em vasos de cerâmica feitos pelos Incas,
do Peru, no período pré-hispânico. Essa representação inequívoca da leishmaniose
cutâneo-mucosa, ou “espúndia”, denominação da doença naquele país, vem corroborar a
hipótese da sua existência nas Américas (Pessôa & Martins, 1982).
Os parasitas do gênero Leishmania Ross, 1903 (Protozoa: Trypanosomatidae) foram
vistos pela primeira vez em 1885, por Cunningham, na Índia, em indivíduos com
leishmaniose visceral (Calazar). Em 1895, Breda, na Itália, já descrevia minuciosamente
lesões laringo-traqueais em italianos que haviam morado no estado de São Paulo e voltado
para sua Pátria. No entanto, as primeiras observações e a primeira descrição detalhada do
A
4
agente etiológico da leishmaniose foram feitas por Borovsky em 1898, na Rússia, em um
paciente com a forma cutânea da doença (Pessôa & Martins, 1982). Em 1903, Leishman e
Donovan, independentes um do outro, e desconhecendo os trabalhos de Borovsky,
descreveram os mesmos “corpúsculos” relatados pelo cientista russo. Nesse mesmo ano,
Ross criou o nome genérico de Leishmania para os organismos descritos por Leishman e
Donovan. Ainda em 1903, em Boston, EUA, Wright isolou o parasita de uma criança
armênia com leishmaniose cutânea, chamando-o de Leishmania tropica (Rey, 1991). Em
1906, Seldelin encontrou o parasita em esfregaços tirados de doentes portadores de
“úlceras de los chicleros” na península de Yucatan, no México, e em 1911, Splendore
conseguiu isolar parasitas das lesões mucosas (Marsden & Zamith, 1982).
No Brasil, a doença já era conhecida desde o início do século passado. Moreira, em
1885 e Cerqueira, em 1895, diagnosticaram, na Bahia, lesões cutâneas clinicamente
idênticas ao botão de Biskra (botão-do-oriente), uma das muitas denominações da forma
cutânea do Velho Mundo. Em 1909, Lindenberg, mais tarde confirmado por Carini e
Paranhos, conseguiu demonstrar a presença dos parasitas nas lesões de pacientes com a
então chamada “úlcera de Bauru”, considerando-os idênticos à L. tropica responsável pela
leishmaniose cutânea do Oriente (Marsden & Zamith, 1982; Rey, 1991). Em 1911, Gaspar
Vianna, julgando que o agente etiológico da leishmaniose cutâneo-mucosa era
morfologicamente diferente da L. tropica, criou uma espécie distinta, a L. braziliensis
(Marsden & Zamith, 1982).
Com relação a epidemiologia, em 1905, Sergent & Sergent sugeriram pela primeira
vez que a leishmaniose cutânea fosse transmitida por insetos do gênero Phlebotomus
(Pessôa & Martins, 1982), no entanto, as primeiras contribuições epidemiológicas sobre a
doença só vieram em 1913, com Brumpt & Pedroso. Eles a denominaram de “leishmaniose
americana das florestas”, já que a sua transmissão tinha relação direta com o ambiente
silvestre. Em 1957, Hertig demonstrou pela primeira vez a infecção em roedores silvestres,
no Panamá, e em 1960, Foratinni encontrou animais parasitados em áreas florestais do
estado de São Paulo (Falqueto & Sessa, 1996).
5
Ao longo dos anos, seguiram-se outras descobertas importantes que contribuiram
para um melhor entendimento da doença, definição do quadro epidemiológico, tratamento
e medidas de controle. 1.2.2. Aspectos clínico-epidemiológicos
leishmaniose tegumentar é causada por protozoário do gênero Leishmania
Ross, 1903 (ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae),
pertencendo a dois subgêneros, Viannia Lainson & Shaw, 1987 e
Leishmania Saf’janova, 1982. Pode ocorrer sob duas formas evolutivas: a forma flagelada,
extracelular, denominada promastigota, encontrada no trato digestivo dos flebotomíneos
vetores; e a forma amastigota, intracelular, encontrada predominantemente parasitando
células do sistema fagócito-mononuclear dos hospedeiros mamíferos (Rey, 1991).
As espécies que causam LT no Velho Mundo são Leishmania (Leishmania) major
Yakimoff & Schokhor, 1914, L. (L.) tropica Wright, 1903 e L. (L.) aethiopica Bray,
Ashford & Bray, 1973; enquanto no Novo Mundo, as várias espécies de Leishmania
podem ser classificadas taxonomicamente segundo os critérios de Lainson & Shaw (1987)
acrescidas de espécies descritas posteriormente por outros autores (Lainson et al, 1994). As
espécies responsáveis pela doença no Novo Mundo estão agrupadas em dois complexos:
“Leishmania braziliensis” e “Leishmania mexicana” Lainson & Shaw, 1972. Dentro do
complexo “Leishmania braziliensis”, subgênero Viannia, estão as espécies Leishmania
(Viannia) braziliensis Vianna, 1911 emend Matta, 1916, L. (V.) guyanensis Floch, 1954, L
(V.) peruviana Velez, 1913 e L. (V.) panamensis Lainson & Shaw, 1972. As outras
espécies, L.(L.) amazonensis Lainson & Shaw, 1972, L. (L.) mexicana Biagi, 1953 emend
Garnham, 1962, L. (L.) venezuelensis Bonfante-Garrido, 1980, L. (L.) garnhami Scorza et.
al., 1979 e L. (L.) pifanoi Medina & Romero, 1959 emend Medina & Romero, 1962, fazem
parte do complexo “Leishmania mexicana”, subgênero Leishmania. No Brasil, as espécies
que têm sido encontradas com mais frequência parasitando o homem são L. (L.)
amazonensis, L. (V.) braziliensis e L. (V.) guyanensis. Além destas, outras três espécies
têm sido apontadas como causadoras de leishmaniose na região amazônica do Brasil: L.
(V.) lainsoni Silveira et al., 1987, L. (V.) shawi Lainson et al., 1989 e L. (V.) naiffi Lainson
A
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& Shaw, 1989 (Lainson & Shaw, 1992). No Ceará, a espécie causadora da LT foi
caracterizada por Vasconcelos et. al. (1988) como L. (V.) braziliensis.
Cada espécie de parasita é usualmente responsável por uma forma da doença em
humanos, entretanto, infecção mista determinada por duas espécies diferentes de
Leishmania pode ocorrer apesar de esse fato ser incomum (Silveira et al.,1984; Barral et
al., 1986).
O modo de transmissão habitual da doença ocorre sempre por meio da picada de
espécies fêmeas de insetos da subfamília Phlebotominae, os flebótomos, pertencentes a
diferentes gêneros: Lutzomyia (Novo Mundo) ou Phlebotomus (Velho Mundo). Destes,
somente as fêmeas são hematófagas e, ao realizarem repasto sanguíneo em mamíferos
infectados, ingerem as formas amastigotas, que no seu tubo digestivo evoluem para as
formas infectantes, as promastigotas metacíclicas (Rey, 1991). Quando o inseto volta a se
alimentar em hospedeiro susceptível, as formas promastigotas são regurgitadas e
introduzidas através da picada, juntamente com a saliva do vetor, que parece ter papel
importante na sobrevida do parasita, no início da infecção (Titus & Ribeiro, 1988). Em
seguida, as promastigotas invadem macrófagos e células de Langerhans da epiderme, onde
se transformam em amastigotas, e dentro do fagolisossoma são capazes de sobreviver e se
multiplicar (Pearson et al., 1983; Blank et al., 1993). Os parasitas podem continuar na pele
em um curso crônico ou, provavelmente serem carreados por células de Langerhans (Moll
et al., 1993), e se disseminarem para órgãos do sistema fagocíto-mononuclear, pelas vias
sanguíneas e, ou linfáticas (Bowdre et al., 1981; Nuwayri-Salti et al., 1992; Moraes et al.,
1993). Esse mecanismo explicaria a ocorrência de casos com numerosas lesões cutâneas,
como ocorre na forma disseminada, e o aparecimento de lesões mucosas, em regra,
secundárias às cutâneas, como se verificam nas infecções por L. amazonensis, L.
braziliensis e L. guyanensis (Azambuja et al., 1985). A documentação de amastigotas de
Leishmania nos linfonodos, antes de qualquer evidência clínica da doença cutânea, pode
indicar que a disseminação do parasita da pele para estes ocorre antes do desenvolvimento
da lesão local (Moraes et al., 1993; Ardehali et al., 1995).
Clinicamente, a LT apresenta-se de maneira variada, desde as formas inaparentes
ou com ulcerações de pele, que podem ser discretas ou extensas e com evolução
espontânea para cura após alguns meses, até aquelas com ulcerações múltiplas ou
7
disseminadas. A forma clínica mais frequente da doença é a leishmaniose cutânea
localizada, que se caracteriza por lesões ulceradas, de bordos elevados e circulares, com
pouca secreção e indolores, localizadas na parte exposta do corpo onde os flebotótomos
inoculam as promastigotas. Estas podem ou não regredir espontaneamente (Costa et al.,
1990; Convit et al., 1993; Pearson & Sousa, 1995). A forma disseminada é caracterizada
por úlceras típicas associadas a inúmeras lesões papulares ou acneiformes, decorrentes de
disseminação hematogênica, podendo, por contiguidade comprometer a mucosa (Costa et
al, 1986; Carvalho et al., 1994). A leishmaniose difusa, síndrome relativamente incomum,
tem como lesão inicial uma pápula localizada e desta se dissemina por todo o tegumento,
com lesões nodulares não ulceradas e deformantes, onde se observa extraordinária riqueza
parasitária, com tendência à cronicidade (Convit et al, 1972; Llanos Cuentas et al., 1984;
Pearson & Sousa, 1995). Esta é uma variante anérgica da leishmaniose cutânea e o
tratamento é muito pouco eficaz. A forma mais grave do espectro clínico é a mucocutânea
(ou espúndia), que apresenta significante morbidade, tendo início com uma simples úlcera
na pele que pode desaparecer em pouco tempo, e, após alguns meses ou anos, novas lesões
surgem na mucosa nasal. Essas lesões aumentam progressivamente, comprometendo as
mucosas do nasorofaringe, podendo ocorrer destruição do septo nasal e áreas vizinhas,
levando a um quadro bastante desfigurante e com complicações secundárias como as
infecções bacterianas, que podem evoluir de maneira fatal. Paradoxalmente, essas lesões
mucosas contém um número bastante reduzido de parasitas (Azambuja et al., 1985;
Pearson & Sousa, 1995). Acredita-se que os possíveis fatores de risco para a leishmaniose
mucocutânea são a presença de múltiplas lesões cutâneas por L. (V.) braziliensis na
infecção primária e tratamento incompleto ou inadequado (Marsden, 1986). Recentemente,
uma variante dita bubônica, causada por L. (V.) braziliensis, tem sido descrita nos estados
do Ceará e da Bahia, sendo caracterizada por linfonodos satélites hipertrofiados em
associação com lesões cutâneas ulceradas (Sousa et al, 1995; Barral et al, 1992; 1995).
Existem evidências sugerindo que a infecção por L. (V.) braziliensis pode persistir
indefinidamente no hospedeiro humano (Saraiva et al., 1990; Guevara et al., 1993;
Delgado et al., 1996), o que poderia explicar, nos últimos anos, o surgimento da
leishmaniose como uma das infecções oportunistas em pessoas com doenças neoplásicas,
infecção pelo vírus HIV, transplantadas e em associação com outras condições nas quais a
imunidade celular está comprometida (Bouree & Belec, 1993; Venencie et al., 1993;
Nicolas et al., 1995).
8
Apesar dos inúmeros avanços que se têm conseguido no entendimento da imunologia
das leishmanioses e na tentativa de se desenvolver uma vacina, não há ainda nenhuma
forma efetiva de imunoprofilaxia. Até agora, o controle da doença tem se baseado em
medidas profiláticas de combate ao vetor e cães infectados, no caso do Calazar, assim
como em medidas terapêuticas de tratamento de pessoas infectadas com os medicamentos
disponíveis no mercado.
1.2.4. Tratamento
o passado, foram testados vários tratamentos para a leishmaniose, tendo-
se utilizado quinino, injeção de aguarrás (essência de terebintina),
arsenicais e atebrina, todos com resultados diversos, mas nenhum deles
realmente efetivo (Rees et al., 1985). O grande achado foi o advento do uso dos
antimoniais. No início do século XX, o médico Gaspar Vianna usou pela primeira vez
tártaro emético (tartarato duplo de potássio e antimônio) para tratar com sucesso um caso
de leishmaniose mucocutânea (Vianna, 1912) e desde então, os antimoniais vêm sendo
utilizados como as drogas de escolha para o tratamento da leishmaniose. Inicialmente eram
usados na forma de sais trivalentes (SbIII), como o tártaro emético e o tartarato antimonial
de sódio, mas a partir da década de 20, surgiram antimonais pentavalentes (SbV), como a
uréia-estibamina e a etil-estibamina. Depois, vieram outros antimoniais pentavalentes
menos tóxicos que são utilizados até hoje: o estibogluconato de sódio, Pentostam®, que
passou a ser fabricado e usado entre 1935 e 1945 e o antimoniato de meglumina,
Glucantime®, testado pela primeira vez em 1946 (Berman, 1988). Pentostam® é
amplamente usado nos países de língua inglesa, incluindo os Estados Unidos, enquanto
Glucantime® é usado nos países da América Latina e demais países de língua não-inglesa,
inclusive no Brasil. Recentemente, o uso de Glucantime® no Brasil tem sido substituído
por um estibogluconato de sódio, de fabricação chinesa, mas este tem se mostrado mais
tóxico que o antimoniato de meglumina e menos eficaz (Hueb, 1997).
Os antimoniais ainda são as drogas mais recomendadas no tratamento das diversas
formas de leishmaniose, com comprovada eficácia e algumas vantagens, como a rápida
eliminação renal e a limitada acumulação nos tecidos (Berman, 1988; Koff & Rosen, 1994;
Berman, 1997). Contudo, apresentam vários inconvenientes, tais como: a via de aplicação,
N
9
que é intramuscular ou endovenosa e a ocorrência de falhas terapêuticas na forma mucosa.
Além disso, são drogas que precisam ser administradas diariamente por longos períodos, o
que as vezes requer hospitalização, acarretando desconforto para o doente e alto custo para
a União. Os antimoniais vêm também mostrando uma taxa crescente de ineficácia ao longo
dos anos (Ercoli, 1966; Belazzoug & Neal, 1985; WHO, TDR News, 1990; Berman,
1997), em parte devido ao surgimento de algumas cepas resistentes à droga (Olliaro &
Bryceson, 1993). Essas drogas apresentam ainda efeitos colaterais sérios, que se traduzem
em: toxicidade cardíaca, alterações de intervalo ST no eletrocardiograma, arritmias
(Mainzer & Krause, 1940; Berman, 1988; Hepburn et al., 1994), trombocitopenia
(Hepburn, 1993), alterações de enzimas hepáticas, artralgias, mialgias, naúseas e vômitos
(Berman, 1988; Tracy & Webster, 1996). São ainda relatados casos de pancreatite (Gasser
et al., 1994) e até mesmo morte súbita em pacientes que receberam altas doses do
medicamento (Pearson & Sousa, 1995). Mais recentemente, surgiram indícios de que essas
drogas podem induzir mutagênese (Léonard & Gerber, 1996).
O tratamento alternativo tem sido feito com anfotericina B ou isotionato de
pentamidina, no entanto, ambos também apresentam a inconveniência da via de
administração, intramuscular ou endovenosa, além de uma toxicidade intolerável nas doses
terapêuticas eficazes e ainda o alto custo. No tratamento com pentamidina podem aparecer
efeitos tóxicos como hipotensão, astenia, dispnéia, dor de cabeça, sudorese e sensação de
formigamento, vômitos e dores epigástricas. Além disso, podem surgir lesões hepáticas,
pancreáticas, renais e do sistema nervoso (Sands et al., 1985). Em relação a anfotericina B,
os efeitos colaterais mais observados são: anorexia, náuseas e vômitos, febre, calafrios,
elevação da uréia e creatinina no sangue e anemia, podendo ainda ocorrer tromboflebite
localizada no sítio de aplicação (Bennett, 1996).
Muitos agentes sistêmicos como metronidazol, tuberculostáticos (rifampina e
isoniazida), pamoato de cicloguanil, nitrofuranos (nifurtimox), sulfametoxazol-trimetoprim
e dapsona, já foram testados no tratamento da LT nos anos 60, 70 e 80, com eficácia
variada e por essa razão nunca foi possível recomendá-los para tratamento de rotina
(Berman, 1988). Outras drogas alternativas utilizadas por via oral continuam sendo
testadas, sozinhas ou associadas com antimoniais, no entanto, ainda apresentam resultados
que precisam ser melhor avaliados. O cetoconazol parece ser efetivo no tratamento da
maioria dos indivíduos com L. mexicana e L. major, mas falhas terapêuticas têm sido
10
comuns em pacientes com L. braziliensis, L. tropica e L. aethiopica (Navin et al, 1992;
Singh et al., 1995; Alsaleh et al., 1995). Para a forma cutânea, causada por L. tropica,
alguns estudos com itraconazol demonstraram perspectivas promissoras (Van den Enden et
al., 1994; Koff & Rosen, 1995; Dogra & Saxena, 1996), no entanto, Momeni et al. (1996)
mostraram-na ineficaz no tratamento de lesões causadas por L. major. O alopurinol vem
sendo utilizado no tratamento da leishmaniose há mais de 15 anos, principalmente na
leishmaniose visceral, contudo, até o momento a sua eficácia para tratar lesões cutâneas
não foi confirmada (Herwaldt et al., 1992; Velez et al., 1997; D’Oliveira Jr. et al., 1997).
Alguns estudos não controlados demonstraram que alopurinol teve mais sucesso quando
combinado com antimoniato de meglumina (Glucantime®), aumentando desta forma a
eficácia do antimonial (Llanos-Cuentas et al., 1997; Martinez et al., 1997). Recentemente
foi tentado o tratamento da leishmaniose mucosa com sulfato de aminosidina, mas os
resultados obtidos durante dois anos de seguimento mostraram que a eficácia da droga
(com uma série de 20 dias) é baixa (33,3%), sendo indicado o acompanhamento
prolongado dos pacientes, pela possibilidade de recidiva (Romero et al., 1998).
Sampaio & Marsden (1997) mostraram, pela primeira vez, que anfotericina B
lipossomal apresentava-se eficaz no tratamento da forma muco-cutânea da LT, com
excelente tolerabilidade. Além dessa indicação, a droga tem sido utilizada com sucesso em
casos de LT onde o parasita mostra-se resistente aos antimoniais (Torre-Cisneros et al.,
1994), mas, infelizmente, é um medicamento ainda muito caro e não disponível
comercialmente. As outras formulações lípidicas da anfotericina B (dispersão coloidal e
complexo lipídico) têm apresentado sucesso na terapia da leishmaniose visceral (Chance,
1995; Berman, 1997), contudo, mais recentemente, não se mostraram eficientes no
tratamento de leishmaniose cutânea (Wortmann et al., 1998). Além destas, outras drogas
como certas pirazolopirimidinas e a 8-aminoquinolina WR6026 vêm sendo testadas
(Berman, 1997). Esta última, no entanto, tem se mostrado mais efetiva para o tratamento
da forma visceral causada por Leishmania donovani (Velho Mundo) do que para as formas
cutâneas (Sherwood et al., 1994).
O tratamento local também tem sido utilizado, mostrando-se uma alternativa atrativa
pelo fato de poder ser feito, algumas vezes, pelo próprio paciente e ter uma toxicidade
sistêmica essencialmente menor. Algumas técnicas físicas como cauterização, irradiação
local e congelamento já foram usadas, mas não são recomendadas por não surtirem
11
nenhum efeito benéfico (Cook, 1993). Outros tratamentos locais são citados na literatura,
entre eles: o calor, que aplicado de maneira cautelosa, tem se mostrado eficaz para curar
lesões cutâneas causadas por L. mexicana, na Guatemala e no México (Navin et al., 1990;
Velasco-Castrejon et al., 1997); e a injeção intralesional de antimonial pentavalente, que,
na grande maioria dos casos, tem conseguido cicatrização total das lesões (Faris et al.,
1993; Tallab et al., 1996; Oliveira-Neto et al., 1997; Aste et al., 1998). Apesar da
administração intralesional de agentes anti-leishmânia mostrar-se eficaz, existem algumas
inconveniências nesse tipo de tratamento, como o fato de que as injeções devem ser
administradas ininterruptamente por mais de um mês, cada lesão tem que ser tratada
individualmente e a droga tem que ser infiltrada de forma profunda, já que amastigotas de
Leishmania residem profundamente na derme.
Algumas preparações tópicas como sulfato ácido de berberina, mepacrina,
metronidazol, emetina hidroclorada, clorpromazina e paromomicina, também já foram
testadas (Cook, 1993). Destas, a mais estudada tem sido a do aminoglicosídeo
paromomicina (aminosidina). Estudos desenvolvidos em Israel por El-On et al. (1986),
usando uma mistura de sulfato de paromomicina (15%) e cloreto de metilbenzetônio
(12%), mostraram que lesões causadas por L. major, tratadas por 10 dias, evoluiam mais
rapidamente para a cura do que lesões não tratadas, no mesmo paciente. Entretanto, nos
estudos de Ben Salah et al. (1995), a preparação não mostrou eficácia no tratamento de
lesões causadas por esta mesma cepa. Com cepas do Novo Mundo, os resultados são
variados e sua eficácia até o momento não foi confirmada (Berman, 1996; Neva et al.,
1997; Soto et al., 1998). Embora a associação dessa droga com Glucantime®, administrada
por 7 dias, pareça aumentar a eficácia do tratamento (Soto et al., 1995), um estudo
controlado usando um curso menor de administração do antimonal precisa ser feito para
confirmar estes achados.
O problema fundamental com o tratamento local da LT é que a doença não é
superficial como as infecções causadas por dermatófitos. Amastigotas de Leishmania se
disseminam da derme para o sistema linfático e membranas mucosas, sendo consenso que
a terapia local pode não curar infecção no linfonodo ou proteger contra doença mucosa, se
o processo de metastatização já estiver em curso.
12
Outra alternativa de tratamento tem sido a imunoterapia. Estudos randomizados, na
Venezuela, descreveram a aplicação de uma vacina consistindo de bacilos vivos de
Calmette-Guerin (BCG) (para estimular a produção de interferon-γ) junto com
promastigotas mortas de L. mexicana amazonensis, para tratar pacientes com as formas:
cutânea localizada, intermediária e difusa da LT (Convit et al., 1987; 1989). Comparando a
imunoterapia e a quimioterapia convencional com Glucantime® para o tratamento de
infecção causada por L. braziliensis, Convit et al. (1987; 1989) encontraram que a
percentagem e o tempo médio de cura foram semelhantes para os dois tratamentos, sendo
que os efeitos colaterais ocorreram 10 vezes mais frequentemente entre os pacientes que
receberam o Glucantime®, do que entre aqueles que receberam o imunoterápico. Parise et
al. (in press), usando o mesmo protocolo em pacientes com LT, no Ceará, verificaram que
a imunoterapia foi associada com menor percentagem de cura e maior taxa de
superinfecções por bactérias, além de recidivas.
Nos últimos anos, o uso de interferon-γ, uma citocina que ativa macrófago com
subsequente destruição de leishmania, associado ao Glucantime® parece tornar o emprego
deste último mais eficaz, principalmente nos casos mais resistentes, como na leishmaniose
cutânea difusa (Badaro & Johnson, 1993) e na forma cutâneo-mucosa (Falcoff et al.,
1994). Apesar de interferon-γ não ser considerado suficientemente ativo quando utilizado
sozinho, Kolde et al. (1996) mostraram-no eficaz como imunoterapia de pacientes com
leishmaniose cutânea. Além de interferon-γ, tem sido avaliada também a aplicação de
outras citocinas: interleucina-2 (IL-2), que tem sido usada para tratar alguns pacientes com
leishmaniose cutânea disseminada (Akuffo et al., 1990), e interleucina-12 (IL-12), que, em
camundongos, é capaz de estimular a produção de interferon-γ e a expansão de linfócitos
TH1 (Scott & Farrel, 1996). No entanto, o grande problema para o uso das citocinas, além
do alto custo, são os inúmeros efeitos colaterais, entre eles, febre, fadiga, mialgias, dor de
cabeça e algumas vezes leucopenia (Berman, 1997).
13
1.3. Plantas medicinais
1.3.1. Generalidades
e todos os métodos da medicina natural, a fitoterapia é sem dúvida o mais
antigo. Dele já lançava mão o homem pré-histórico, que aprendeu como
os animais, a distinguir as plantas comestíveis daquelas que podiam
ajudá-lo a curar suas doenças. Já no ano 3.000 a.C., a China se dedicava ao cultivo de
plantas medicinais, iniciado por Sheu-ing. A obra do imperador Cho-Chin-Kei traz um
estudo bem detalhado sobre o poder terapêutico das plantas, sendo mencionadas as
virtudes da raiz de ginseng, do ruibarbo, do acônito e da cânfora. Placas de barro de 3.000
a.C. registram importações de ervas para a Babilônia (trocas com a China de ginseng
aconteceram por volta de 2.000 a.C). A farmacopéia babilônia abrangia 1.400 plantas e
está comprovado que, desde 2.300 a.C., os egípcios cultivavam diversas ervas e traziam de
suas expedições tantas outras. Com estas plantas, produziram purgantes, vermífugos,
diuréticos, anti-sépticos e cosméticos, além dos diversos produtos usados para embalsamar
suas múmias. Os Papiros de Ebers do Egito foram um dos herbários mais antigos que se
têm conhecimento, datando de 1.550 a.C., relaciona 125 plantas e 811 receitas (Plantas que
curam, 1983; Carvalho, 1986; Oka & Roperto, [online] 1998).
Assírios e hebreus, ao que se sabe, também cultivaram diversas plantas medicinais.
Os primeiros elaboravam águas aromáticas, tinturas e unguentos, enquanto os hebreus
empregavam em seus rituais religiosos e sacrifícios plantas como a mirra e o incenso. A
Índia, cognominada o “eldorado dos medicamentos ativos” pela riqueza e exuberância de
sua flora medicinal, desenvolveu importantes pesquisas, criando substratos de drogas como
o sândalo, a canela e o cardamomo. Na Antiga Grécia, as plantas e o valor terapêutico ou
tóxico de algumas delas eram bastante conhecidos, existindo cultivos em muitos jardins e
hortas. Em um dos mais importantes tratados médicos gregos, o “De Materia Médica”,
escrito no século I d.C. por Dioscórides, constam 600 ervas, seus nomes, suas descrições e
qualidades medicinais. A farmacopéia grega, na verdade, assimilou grande parte da
cretense e da micênia, que conheciam várias plantas medicinais como a dormideira, o
sésamo, o açafrão e os líquens (Plantas que curam, 1983; Oka & Roperto, [online] 1998).
D
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Nas Américas, o primeiro herbário foi o Manuscrito Badanius, asteca, do século
XVI, escrito em nahuatl (Oka & Roperto, [online] 1998). No Brasil, o primeiro
levantamento das plantas medicinais utilizadas pela população, foi feito por uma expedição
científica, trazida por Maurício de Nassau ao nordeste do país, no período da ocupação
holandesa (1630-1654). Foi o médico Guilherme Piso, membro desta expedição, quem
descreveu no livro “Historia naturalis brasiliae”, editado em 1648, as principais plantas
usadas pelos índios, como o jaborandi, a ipeca e o tabaco (Rodrigues, 1949).
Até 1828, quando Friedrich Wohler produziu a síntese da uréia a partir de uma
substância inorgânica, o cianato de amônio, o homem não concebia como fonte de matéria
orgânica qualquer coisa que não fosse vegetal ou animal. Com a maior utilização dos
medicamentos sintéticos, no início do século XX, o uso das plantas diminuiu. Contudo, por
causa dos efeitos secundários destas drogas, seus custos, e diante do incentivo da ecologia
para um retorno ao natural, e a busca por formas alternativas de cura, as plantas estão
voltando a ser utilizadas, apresentando-se principalmente como uma boa alternativa para a
cura das mais diversas doenças.
As plantas superiores sempre foram uma das fontes mais importantes de novas
substâncias utilizadas diretamente como agentes medicinais. A maioria das drogas ativas
contra agentes infecciosos é na verdade derivada de produtos naturais ou de estruturas
sugeridas pelos produtos naturais. Assim, as plantas medicinais, usadas na preparação de
remédios tradicionais, trouxeram para a medicina moderna drogas de comprovada eficácia
para o tratamento de algumas doenças parasitárias. Como exemplo, temos a quinina, um
alcalóide quinolínico, isolada pela primeira vez da planta peruana Cinchona succiruba e
agora obtida de várias espécies de Cinchona encontradas em muitos países tropicais. Esta
foi a primeira droga anti-malárica descoberta e permanece sendo usada no tratamento e
profilaxia da doença há mais de um século. Além disso, serviu como base para a síntese de
novos agentes como cloroquina, primaquina e mefloquina. Com o aumento de casos
resistentes à cloroquina e à quinina, na década de 70 surgiu a artemisinina, um composto
sesquiterpênico isolado da Artemisia annua, essencialmente sem toxicidade, que, assim
como no caso da quinina, serviu de base para a síntese e produção comercial do artemeter e
do artesunato de sódio, substâncias com melhores atividades anti-malárica, tanto in vitro
como in vivo (Chawira & Warhurst, 1987; Chawira et al., 1987). Outro exemplo é a
emetina, uma droga com ação amebicida, obtida da Cephaelis ipecacuanha, planta que já
15
era usada na medicina tradicional, na China, há centenas de anos e que teve sua atividade
reconhecida pela medicina moderna, sendo utilizada até hoje.
Nos últimos anos, alguns trabalhos revisaram estruturas e atividades de componentes
químicos ativos derivados de plantas, incluindo referências aos produtos de plantas com
atividade anti-protozoária (Phillipson et al., 1993, 1995; Iwu et al., 1994; Kirby, 1996). Na
pesquisa de novos medicamentos e substâncias bioativas para o tratamento das doenças
parasitárias, a ênfase maior tem sido dada aos estudos com drogas anti-maláricas, com um
grande número de publicações, seguidas pelas pesquisas com drogas leishmanicidas e
tripanosomatidas.
1.3.2. Uso de plantas medicinais na leishmaniose
a maior parte do mundo, a leishmaniose é endêmica em áreas onde os
sistemas tradicionais de medicina são praticados. Em muitos casos, a
terapia tradicional consiste na administração oral de extratos de plantas
para a forma sistêmica da doença e como preparações tópicas para a forma cutânea (Netto
et al., 1985). Como exemplo, França et al. (1996) realizaram um inquérito na população
rural da faixa litorânea produtora de cacau do estado da Bahia, uma região endêmica para
leishmaniose cutânea, causada por L. (V.) braziliensis, e identificaram 49 espécies de
plantas usadas pelos pacientes no tratamento da doença. Fournet et al. (1994a), na Bolívia,
encontraram, na floresta ocupada pelos índios Chimanos e regiões tropicais de
colonização, cerca de 40 espécies de plantas usadas por estas populações para tratar
leishmaniose cutânea.
Ainda não existe nenhum produto natural licenciado para o tratamento da
leishmaniose humana. Iwu et al. (1994) citam em sua revisão mais de vinte espécies de
plantas que têm demonstrado conter componentes que apresentam atividade significativa
contra várias espécies de Leishmania (TAB. 1). Os constituintes ativos de algumas destas
plantas já foram isolados e suas atividades têm sido confirmadas através de ensaios in vitro
e in vivo, mas para a grande maioria destas plantas tem sido reportado apenas a atividade
de extratos in vitro, faltando o isolamento dos componentes responsáveis por esta atividade
biológica, com subsequentes estudos para a confirmação in vivo. Até o momento, os
N
16
estudos experimentais citados na literatura permitiram a identificação de várias classes de
substâncias com atividade leishmanicida e entre as mais promissoras estão: os alcalóides
isoquinolínicos e β-carbolínicos, os glicosídeos iridóides e esteroidais, além das quinonas
(Iwu et al., 1994).
TABELA 1 - Plantas medicinais com atividade leishmanicida.
Planta Família Constituinte(s) Berberis aristat Berberidaceae Berberine Diospyros montana Ebenaceae Diospirina Dracaena mannii Agavaceae Saponinas Gongronema latifolia Asclepiadaceae Lignanas Hedera helix Araliaceae Saponina Jacaranda copaia Bignoniaceae Jacaranona, ácido ursólico Munnozia maronii Asteraceae Sesquiterpeno Nyctanthes arbortristis Verbenaceae Glicosídeos iridóides Oxandra espintana Annonaceae Espintanol Peganum harmala Zygophyllaceae Harmalina Pera benensis Euphorbiaceae Naftoquinonas Phytolacca americana Phytolaccaceae Proteínas Picralima nitida Apocynaceae Alcalóides indólicos Picrohiza kurroa Scrophulariaceae Glicosídeos iridóides Plumbago zeylanica Plumbaginaceae Plumbagina Polyalthia macropoda Annonaceae Labdana Ricinus communis Euphorbiaceae Proteínas Tabebuia rosea Bignoniaceae Quinonas
Fonte: Iwu et al. (1994)
Alcalóides quinolínicos. Chimanina D e 2-n-propilquinolina têm se mostrado
eficazes contra L. amazonensis, L. venezuelensis e L. donovani in vitro e in vivo (Fournet et
al., 1993a; Fournet et al., 1994b), e mais recentemente, chimanina B apresentou excelentes
resultados para o tratamento de L. amazonensis e L. venezuelensis (Fournet et al., 1996).
Alcalóides isoquinolínicos. Berberina tem sido apontado como o mais importante
componente de planta medicinal com atividade leishmanicida e tem sido usado largamente
na medicina tradicional para o tratamento da leishmaniose e outras doenças parasitárias por
mais de 50 anos (Purohit et al., 1982). Estudos laboratoriais têm confirmado que esta
substância e seus derivados possuem significativa atividade in vitro e in vivo contra várias
espécies de Leishmania (Ghosh et al., 1985; Vennestrom et al., 1990; Ahuja et al., 1993).
17
Alcalóides benzilisoquinolínicos. Na literatura são citados três componentes desta
classe que apresentaram atividade in vitro contra cepas de L. donovani, L. braziliensis e L.
amazonensis, são eles: girocarpina, dafenandrina e obaberina (Fournet et al., 1988).
Alcalóides indólicos. Harmalina tem se mostrado uma substância com significativa
atividade in vitro contra amastigotas de L. amazonensis (Evans & Croft, 1987). Outros
constituintes químicos desta classe também têm sido estudados, entre eles estão alstonina,
acuamina, acuamicina, picralina, picranitidina (Iwu et al., 1994), n-dimetilconodurina
(gabunina) e conoduramina (Munoz et al., 1994), todos apresentando atividade
leishmanicida in vitro.
Quinonas. Jacaronona tem mostrado possuir significativa atividade in vitro contra
promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, mas fraca atividade in vivo, quando testada
em camundongos infectados com L. amazonensis (Sauvain et al., 1993). Mais
recentemente, hidropiperona tem exibido potente atividade anti-parasitária contra espécies
de Leishmania (Mahiou et al., 1996).
Naftoquinonas. Plumbagina tem sido a substância desta classe química mais
estudada e citada na literatura. Tem apresentado atividade in vitro e in vivo contra cepas de
L. amazonensis e L. venezuelensis (Croft et al., 1985; Fournet et al., 1992a; Fournet et al.,
1992b). Buparvaquona, uma hidroxinaftoquinona, e diospirina, uma bis-naftoquinona, têm
mostrado atividade in vitro contra amastigotas e promastigotas de L. donovani,
respectivamente (Hazra et al., 1987; Croft et al., 1992).
Terpenos. São citados como tendo atividade anti-leishmânia: espintanol
(Hocquemiller et al., 1991), ácido ursólico (Sauvain et al., 1993), desidrozaluzanina C
(Fournet et al., 1993b), labdana diterpênica (Richomme et al., 1991), artemisina e
artemeter (Yang & Liew, 1993) e glicosídeos iridóides (Tandon et al., 1991; Ray et al.,
1996).
Algumas outras classes de substâncias também têm sido citadas na literatura como
apresentando atividade leishmanicida, entre elas estão lignanas (Ex. pinoresinol,
medioresinol e lirioresinol: Sauvain et al., 1996), chalconas (Ex. licochalcona A: Chen et
18
al., 1993, 1994, Zhai et al., 1995) e lactonas (Ex. argentilactona: Waechter et al., 1997),
além de outras.
Das 500 mil espécies de plantas estimadas existirem no mundo, o Brasil, sozinho,
possui cerca de 120 mil, sendo o país de maior cobertura vegetal em todo o planeta e,
paradoxalmente, um dos maiores importadores de matéria prima para a fabricação de
medicamentos sintéticos. O aproveitamento racional da sua enorme biodiversidade pode
ser um passo importante para a melhoria dos seus problemas de saúde pública, inclusive
com perspectivas para o controle da leishmaniose.
1.4. Timol
timol é um dos principais constituintes químicos de muitos óleos voláteis
de plantas tais como Thymus vulgaris L., Thymus serpyllum L., Ocimum
gratissimum L., O. viride Willd. e Monarda punctata L., sendo ainda
encontrado em várias plantas brasileiras do gênero Lippia. O óleo essencial obtido das
folhas da Lippia sidoides Cham. (Alecrim-pimenta) é principalmente constituído por timol
(50-60%), que é o seu princípio ativo extraível por arraste com vapor d’água (Sousa et al.,
1991).
C10H14O CH3 PM = 150,22
Pf 48-51o
OH
H3C CH3
FIGURA 1 – Estrutura química do timol.
O
19
O timol (3-p-cimenol, m-timol) é um composto oxigenado da classe dos fenóis e sua
estrutura química foi estabelecida como 2-isopropil-5-metilfenol (FIG. 1). Apresenta-se
como um sólido cristalino, com odor característico, pungente e um tanto caústico. É
solúvel em ácido acético e soluções aquosas de hidróxidos alcalinos. Como todos os
fenóis, é bastante ativo quimicamente e por isto pode provocar irritação.
A L. sidoides, alecrim-pimenta ou estrepa-cavalo, é um arbusto próprio da vegetação
do Nordeste, de caule quebradiço e tanto as folhas frescas como as secas têm odor forte,
canforáceo e sabor aromático picante. Abundante ao norte da Chapada do Apodi, faz parte
da vegetação da caatinga entre os municípios de Mossoró, no Rio Grande do Norte e
Tabuleiro do Norte, no Ceará. Segundo a Flora Brasiliensis de Martius, ocorre também nos
estados de Minas Gerais e São Paulo (Craveiro et al., 1981). Pode ser usada como fonte
industrial de timol, ainda hoje importado pelo país. Por causa das propriedades
antissépticas do timol, o infuso (chá) das folhas é utilizado na medicina popular na forma
de aplicação local em inalação, gargarejos e lavagens da pele, couro cabeludo e mucosas, e
no tratamento caseiro da rinite alérgica (estalicido), além disso, as folhas são mastigadas e
deixadas na boca em casos de dores de garganta e inflamação das gengivas (Craveiro et al.,
1981; Matos, 1994).
O timol foi originalmente introduzido como desinfetante em lugar do ácido carbólico
ou fenol comum, tendo a vantagem de apresentar odor mais agradável do que este último.
Sua eficácia antisséptica excede a do fenol em 20 vezes. Devido ao seu gosto agradável, é
empregado em muitas fórmulas antissépticas bucais, especialmente em gargarejos, sendo
também incorporado a pastas dentais. Já foi usado no tratamento da acne, das tinhas (Tinea
pedis), hemorróidas e na higiene feminina, entrando na composição de alguns colutórios e
analgésicos externos. Foi utilizado como desinfetante gastro-intestinal nas gastrites
fermentativas, enterites e casos semelhantes (Sousa et al., 1991).
O timol é bactericida e antimicótico, destacando-se sua atividade contra espécies do
gênero Penicillium (Shapiro et al., 1994). Quando testado em meio de cultura, inibiu
totalmente o crescimento de fungos como Aspergillus flavus e A. versicolor em
concentrações ≤ 0,4mg/ml (Sousa et al., 1991; Mahmoud, 1994). Mais recentemente,
Viollon & Chaumont (1994) mostraram o efeito antifúngico do timol sobre Cryptococcus
neoformans.
20
O timol é ainda referido na literatura como tendo ação citolítica. Buccellato &
Valguarnera (1965) mostraram que o timol foi capaz de induzir inibição irreversível do
desenvolvimento de culturas de células da linhagem contínua de Hela. Quando infiltrado
localmente, demonstrou uma ação degenerativa das células de epiteliomas basocelular,
espinocelular e células de adenocarcinoma, além de destruir tecidos neoformados de
sarcoma de Kaposi (Bucellato, 1965). Outro importante uso do timol foi como vermífugo
contra platelmintos e provavelmente em todas as formas de parasitas intestinais,
especialmente ancilóstomo (Gupta et al., 1967; Gaitonde et al., 1968; Sanghavi & Mistry,
1971).
O timol é pouco tóxico, apresentando em ratos, uma DL50 de 1,8g/kg por via oral
(Sousa et al., 1991) e 110,0mg/kg por via intraperitonial (Matos, 1980).
1.5. Lapachol
s plantas da família Bignoniaceae apresentam uma diversidade de classes
de constituintes químicos, entre os quais as naftoquinonas são os mais
frequentes, distinguindo-se um grupo estrutural mais simples constituído
por prenilnaftoquinonas, piranonaftoquinonas e furanonaftoquinonas e um outro
representado por estruturas mais complexas, em geral diméricas. O primeiro grupo conta
com o maior número de representantes, sendo o lapachol o mais frequente e algumas vezes
o mais abundante (De Oliveira et al., 1990). O lapachol ocorre largamente no reino vegetal,
sendo especialmente comum em espécies de Bignoniaceae, tais como Zehyera digitalis, Z.
tuberculosa, Tabebuia serratifolia, Tabebuia avellanedeae e T. serratifolia, entre outras, podendo ser isolado também de espécies de Verbenaceae, como a Tectona grandis (De
Oliveira et al., 1990).
O lapachol (ácido lapáchico, ácido taíguico, tecomina) foi isolado pela primeira vez
no final do século passado por Paternó, 1882, teve a sua estrutura química estabelecida por
Hooker, 1896, como 2-hidroxi-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-naftoquinona (FIG. 2) e sua
síntese foi realizada por Fieser, 1927. Apresenta-se como prismas amarelos, solúveis em
álcool, clorofórmio, benzenos e outros solventes orgânicos, assim também como em
solução aquosa de hidróxido de sódio (NaOH).
A
21
C15H14O3
O OH PM = 242,26
CH3 Pf 139-140o (EtOH)
CH2CH = C O CH3
FIGURA 2 – Estrutura química do lapachol.
Plantas da família das Bignoniaceae ocorrem nas regiões tropicais e sub-tropicais do
Velho e Novo Mundos, contando com cerca de 700-800 espécies e, aproximadamente, 100
gêneros. Na América do Norte, algumas espécies crescem como árvores ornamentais ou
arbustos. São comuns no Nordeste do Brasil, onde recebem os nomes de pau-d’arco roxo,
pau-d’arco rosa e pau-d’arco amarelo (ipê, ipê-roxo, ipê-rosa ou ipê-amarelo). Nos países
de língua espanhola, algumas variedades são chamadas de lapacho, e são também usados
os nomes tahebo, queschua e tabebuia (Oswald, 1993/94).
Pau-d’arco (Tabebuia ssp.), ou lapacho, tem sido usada como planta medicinal há
mais de mil anos, era considerada indispensável pelos índios brasileiros Callawaya e pelos
Incas. De acordo com relatos, os Incas usavam a planta para curar muitas doenças,
incluindo até mesmo distúrbios degenerativos. Os índios brasileiros usavam a casca do
pau-d’arco para tratar um grande número de doenças, tais como: inflamação intestinal,
disenteria, febre, dor de garganta, feridas, artrites, cistite, problemas do trato respiratório,
distúrbios circulatórios, picada de cobra, e diferentes tipos de tumores (Oswald, 1993/94).
Esta propriedade antineoplásica foi avaliada no tratamento clínico experimental de alguns
tipos de câncer no Brasil, ainda nos anos 50, pelo Prof. Walter Ramades Acorsi. Este foi o
primeiro pesquisador, no Brasil, a usar o pau-d’arco para tratar pacientes sofrendo de
leucemia, carcinoma, condições inflamatórias e imunodeficiências. Seus achados foram
22
incluidos na Farmacopéia Brasileira, onde consta que a planta pode ser usada em todos os
tipos de carcinoma e leucemia.
A partir da década de 60, os efeitos biológicos do lapachol passaram a ser estudados
com mais detalhes. Em animais de laboratório, a droga apresentou atividade antineoplásica
na dose de 100mg/kg de peso corporal, administrada por via oral ou parenteral, frente ao
sarcoma de Yoshida e ao carcinosarcoma de Walker 256 (Rao et al., 1968; Santana et al.,
1968). Alguns ensaios clínicos, usando o lapachol, também foram realizados, obtendo-se
resultados satisfatórios no tratamento de adenocarcinoma e carcinoma epidermóide (Rao,
1974; Santana et al., 1980/1).
O lapachol foi testado extensivamente como agente antimalárico nos anos 40
(Wendel, 1946; Fieser & Richardson, 1948), mas nos estudos de Carvalho et al. (1988) a
droga demonstrou uma baixa atividade para inibir in vitro a fase de esquizogonia. Tem
apresentado também atividade antimicrobiana contra bactérias do gênero Brucella e alguns
outros microorganismos gram-positivos, entre eles Bacillus subtilis, Micrococcus pyogenes
var. aureous e, em menor intensidade, contra outras espécies (Lima et al., 1956). No
entanto, quanto mais purificado, menor parece ser seu efeito antibiótico (Lima et al., 1962).
Entre outras quinonas, o lapachol mostrou a mais alta atividade contra a penetração
de cercárias de Schistossoma mansoni em camundongos (Pinto et al., 1977). Apresentou
também atividade in vitro contra Trypanosoma cruzi (Lopes et al., 1978), assim como
contra Trypanosoma brucei in vitro e in vivo (Shapiro et al., 1982). O lapachol tem
provado ainda ser muito efetivo contra o vírus herpes, tipo I e II, vírus da pólio e vírus da
estomatite vesicular (Linhares & de Santana, 1975; Do Carmo Lagrota et al., 1986; Pinto et
al., 1987). Ademais, apresenta ação anti-inflamatória (De Almeida et. al., 1990). Ensaios
clínicos utilizando o lapachol foram completamente satisfatórios (100% de êxito) em
pacientes portadores de bursites e tendinites e altamente satisfatórios em portadores de
otites e sinusites agudas e crônicas, com resultados significativos em 95,2 e 92% dos casos,
respectivamente (De Oliveira et al., 1990).
O lapachol apresenta ainda ação anticoagulante (Morrison et al., 1970) e a inibição
de enzimas envolvidas na bioquímica da vitamina K, observada por Preusch & Suttie
(1984), possivelmente explicaria esse efeito. Também, em animais, o lapachol,
23
administrado por via oral, promoveu uma proteção significativa contra úlceras gástricas e
duodenais, o que justifica o uso medicinal, na Índia, de Tectona grandis (Verbenaceae),
cujo extrato contém essa substância (Goel et al., 1987).
A toxicidade do lapachol é pouco acentuada (DL50 = 0,621g/kg, em camundongos
BALB/c e > 2,4g/kg, em ratos albinos, por via oral), não tendo sido relatadas alterações
anátomo-patológicas de importância em qualquer órgão (Morrison et al., 1970).
24
1.6. Objetivos Os objetivos do presente trabalho são:
Estudar o efeito leishmanicida in vitro do timol e do lapachol em macrófagos
infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis;
Avaliar a atividade terapêutica do timol e do lapachol na infecção experimental do
hamster (Mesocricetus auratus) por L. (V.) braziliensis;
Comparar os resultados encontrados in vivo com os obtidos in vitro.
25
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Substâncias avaliadas
• Timol, 2-isopropil-5-metilfenol (Merck, Alemanha), fornecida pelo laboratório de
Química Orgânica da Universidade Federal do Ceará.
• Lapachol, 2-hidroxi-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-naftoquinona, fornecida pelo
Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco (LAFEPE).
As drogas de referência utilizadas foram os antimoniais pentavalentes:
• Glucantime®, antimoniato de meglumina (Rhodia, França), fornecida pela
Fundação Nacional de Saúde-Ceará.
• Pentostam®, estibogluconato de sódio (MEHECO, China), fornecida pelo
Hospital São José de Doenças Infecciosas, Ceará.
2.2. Preparo e solubilização das substâncias
• Nos ensaios in vitro, as substâncias foram solubilizadas e diluídas em meio RPMI-
1640 contendo dimetilsulfóxido (DMSO) a 2%, solução esta que será designada como
“RPMI+DMSO”.
• Nos ensaios in vivo, o timol foi diluído em etanol a 10% e o lapachol em água
destilada contendo tween 80 a 0,1% e etanol a 0,5%.
2.3. Meios de cultura
Ao longo deste trabalho foram utilizados três tipos de meios de cultura:
• Meio RPMI-1640
O meio RPMI-1640 foi complementado com 100UI/ml de penicilina e 100µg/ml de
estreptomicina, e será designado ao longo do trabalho como “RPMI”. Este meio foi
suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) inativado pelo calor (RPMI+SBF).
26
• Meio Schneider para Drosophila
O meio Schneider para Drosophila foi complementado com 100UI/ml de penicilina e
100µg/ml de estreptomicina, e será chamado de “meio Schneider”. Este meio foi
enriquecido com 10% de SBF inativado pelo calor e urina humana estéril a 2%
(Schneider+SBF+urina).
• Meio N.N.N.
O meio N.N.N. foi suplementado com meio Schneider para Drosophila e 100UI/ml
de penicilina e 100µg/ml de estreptomicina, e será mencionado como “NNN”.
2.4. Parasitas
Cepa de Leishmania (Viannia) braziliensis, MHOM/BR/94/H-3227, isolada de
paciente do estado do Ceará com a forma cutânea da doença e caracterizada previamente
por anticorpos monoclonais e por eletroforese de isoenzimas. A cepa foi mantida como
promastigotas em meio NNN, suplementado com meio Schneider, ou criopreservada, com
passagens periódicas em hamster, para reativação da virulência. Repiques foram feitos a
partir da fase estacionária de crescimento e os parasitas usados somente até a quinta
passagem, após o que procedia-se à criopreservação.
2.5. Ensaios in vitro 2.5.1. Purificação de macrófagos
Macrófagos residentes de camundongos albinos Swiss (Mus musculus), previamente
estimulados com 1ml de solução de amido a 3% por via i.p, foram obtidos por lavagem
peritoneal com 10ml de RPMI contendo heparina (10UI/ml). As células foram
centrifugadas (1.200 rpm, 40C) e lavadas com salina a 0,85% e ajustadas para a
concentração desejada em RPMI+SBF e antibióticos.
2.5.2. Citotoxicidade em macrófagos
O método utilizado foi a coloração pelo azul de tripan a 0,4%, que é baseado no
princípio de que células vivas (viáveis) não incorporam o corante, enquanto as células
mortas o fazem. Macrófagos foram cultivados em tubos estéreis de 1ml (tipo eppendorf),
27
na concentração de 2x106 células/ml em RPMI+SBF e antibióticos e as drogas timol,
lapachol e os antimoniais (Glucantime® e Pentostam®) foram adicionadas em seguida,
diluídas com RPMI+DMSO, em diversas concentrações (0,008 a 4mg/ml). Foram usados
dois controles: um apenas com macrófagos e outro com macrófagos e DMSO a 2%. As
culturas foram incubadas por 12 horas a 370C e 5% de CO2. Após esse período, as células
foram coradas com uma solução de azul de tripan a 0,4% e a percentagem de células não
viáveis foi determinada em microscópio óptico, usando Câmara de Neubauer.
O cálculo das células não viáveis foi feito aplicando-se a seguinte fórmula: lise
celular (%) = número de células não viáveis (coradas) ÷ total de células (coradas e não
coradas) x 100. Foi considerado como sendo tóxica, a droga que apresentasse efeito tóxico
a partir de 20%.
2.5.3. Avaliação da atividade anti-amastigota
Macrófagos foram cultivados em placas de 96 poços (Falcon®, U.S.A), em
sextuplicatas, fundo chato, na concentração de 106 células/ml em RPMI+SBF e
antibióticos, e incubados por um período de 3h a 370C e 5% de CO2, tempo necessário para
que ocorresse aderência das células. Em seguida, as células foram lavadas com RPMI à
370C a fim de remover as não aderentes. Promastigotas de L. (V.) braziliensis, em fase
estacionária de crescimento, foram adicionadas na razão de 3:1 macrófago e as culturas
incubadas por 24-48h a 370C e 5% de CO2. Após esse período, as células foram lavadas
novamente com RPMI à 370C para remover os parasitas livres. As drogas em estudo foram
adicionadas em diversas concentrações e a placa reincubada. Após 24h de incubação com
as drogas, as células foram lavadas mais uma vez com meio RPMI à 370C e cultivadas em
meio Schneider+SBF+urina por 24-48h, a 260C, para transformação das formas
amastigotas intracelulares em promastigotas. Após isso, foi adicionado 1µCi/poço de [3H]-
metil-timidina a cada poço e os parasitas incubados por um tempo adicional de 24h, para
que a timidina marcada se incorporasse ao DNA dos parasitas em divisão. Em seguida,
foram extensivamente lavadas e coletadas em papel filtro (Skatron Inst., U.K) com um
coletor de células (Cambridge Technology, U.S.A) e a leitura final feita através de um
Cintilador-β (Pharmacia, Finlândia).
28
Para calcular o efeito leishmanicida foi aplicado a seguinte fórmula: atividade
leshmanicida (%) = CPM (cintilação por minuto) do controle (macrófagos parasitados) -
CPM da amostra (macrófagos parasitados + droga) ÷ CPM do controle (macrófagos
parasitados) x 100. Foi considerado como apresentando aceitável efeito leishmanicida as
drogas que mostraram atividade anti-leishmania igual ou maior que 70%, em relação aos
controles não tratados.
2.6. Ensaios in vivo
2.6.1. Animais experimentais
Hamsters (Mesocricetus auratus), adultos, de ambos os sexos, com idade variando de
3 a 4 meses, provenientes do biotério do Núcleo de Medicina Tropical Prof. Joaquim
Eduardo de Alencar da UFC, foram mantidos à temperatura ambiente, com ração
comercial apropiada e água “ad libitum”.
2.6.2. Infecção experimental
Os animais foram infectados com 20µl de promastigotas de fase estacionária, na
concentração de 1x106, no coxim plantar da pata posterior direita. Ficaram em observação
até o surgimento da lesão, quando se iniciou o tratamento.
2.6.3. Tratamento com timol
Os animais foram divididos em 03 grupos, contendo 06 animais/grupo. As drogas
foram administradas por 42 dias:
• Veículo de solubilização - I.M., l x dia;
• Glucantime® - 60 mg/kg (1/25 da DL50; DL50 = 1500mg/kg, I.M.,em hamster), I.M., 1 x dia;
• Timol - 7 mg/kg (1/15 da DL50;; DL50 = 110mg/kg, I.P., em ratos), I.M., 2 x dia.
2.6.4. Tratamento com lapachol
Os animais foram divididos em 04 grupos contendo 08 animais/grupo. As drogas
foram administradas por 42 dias:
• Veículo de solubilização - V.O., l x dia.
• Lapachol - 150 mg/kg (1/16 da DL50; DL50 = 2400mg/kg, V.O., em ratos), V.O., 2 x dia.
• Lapachol - 150 mg/kg, V.O., 2 x dia, associado ao Pentostam® - 60 mg/kg, I.M., l x dia.
• Pentostam® - 60 mg/kg (1/25 da DL50), I.M., l x dia.
29
2.6.5. Avaliação do efeito terapêutico:
A avaliação do efeito terapêutico foi realizada através de duas abordagens:
Tamanho da lesão
Durante a evolução do tratamento, foram realizadas medidas semanais do tamanho
das patas dos animais, com paquímetro de escala circular (Mitutoyo, Japão). O tamanho da
lesão foi representado pela diferença entre a pata infectada e a contralateral não infectada.
Quantificação da carga parasitária no linfonodo regional
A carga parasitária foi quantificada através da técnica de diluição limitante (Titus et
al., 1985), modificada por Silva et. al. (1994). Após o término do tratamento, os animais
foram sacrificados por inalação de éter sulfúrico e os linfonodos poplíteos de drenagem das
lesões foram isolados assepticamente, macerados em 2ml de Schneider e deixados em
repouso por 5 minutos. A partir dessa suspensão de células, foram feitas diluições seriadas
a 1:10 em Schneider+SBF+urina. Cem microlitros destas diluições foram distribuídos em
placas de 96 poços, fundo chato, 12 poços/diluição. As placas foram vedadas e incubadas a
260C, por 3 semanas. Foram observadas em microscópio óptico invertido (AusJena,
Alemanha) de 3 em 3 dias para o registro das diluições que continham promastigotas.
2.6.6. Estudo histopatológico
Foram coletadas amostras de pulmão, rim, bexiga, baço e linfonodo poplíteo, dos
animais sacrificados ao final do tratamento, e de um grupo de animais sadios (controle não
infectado), bem como dos que morreram no decorrer do experimento. As amostras foram
fixadas em formol tamponado a 10%, processadas e incluídas em parafina. O material foi
cortado em secções de espessura de 5-6µm e corado pela hematoxilina-eosina. As
alterações microscópicas foram observadas e analisadas.
2.7. Análise estatística dos dados O número de parasitas presentes no linfonodo poplíteo de drenagem das lesões foi
determinado pela análise do qui-quadrado mínimo aplicada à distribuição de Poisson
(Taswell, 1984). Os dados referentes à carga parasitária foram analisados utilizando o teste
não paramétrico de Mann-Whitney e os demais, teste t para amostras não pareadas. Em
todos os testes utilizados, a significância mínima foi aceita quando p < 0,05.
30
3. RESULTADOS
3.1. Ensaios in vitro
Nos ensaios de citotoxicidade para macrófagos, o lapachol apresentou efeito tóxico a
partir de 0,1mg/ml, enquanto o timol foi tóxico em dose ≥ 0,062mg/ml. O Glucantime®
não mostrou efeito citotóxico para macrófagos nas concentrações testadas, até 4,0mg/ml,
no entanto, o Pentostam® apresentou toxicidade mesmo com 1,0mg/ml (TAB. 2).
TABELA 2 - Efeito citotóxico do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes (Pentostam® e Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos.
Drogas Concentração (mg/ml) % lise celular DMSO a 2% - 2,0 ± 0,0
Timol 0,125 73,9 ± 1,79
0,062 44,5 ± 5,50
0,031 16,2 ± 3,78
0,016 14,5 ± 3,18
0,008 11,3 ± 3,43
Lapachol 0,4 36,5 ± 3,04
0,2 32,8 ± 2,85
0,1 24,9 ± 0,07
0,05 13,8 ± 0,07
0,025 4,4 ± 0,74
Pentostam® 4,0 59,1 ± 0,85
2,0 50,2 ± 0,14
1,00 32,4 ± 0,60
0,50 18,7 ± 2,12
0,25 5,7 ± 0,36
Glucantime® 4,0 16,7 ± 1,60
2,0 14,2 ± 2,00
1,0 10,8 ± 0,46
0,50 8,2 ± 2,20
0,25 3,7 ± 0,32
Os valores representam a média aritmética de 3 ensaios ± E.P. Dados sombreados mostram doses com lise celular ≥ 20%.
31
Todas as drogas apresentaram atividade leishmanicida sobre amastigotas
intracelulares. Para o timol, esta atividade anti-amastigota foi observada a partir de
0,50mg/ml e de 0,50mg/ml e 1,0mg/ml, para o Pentostam® e o Glucantime®,
respectivamente. O lapachol mostrou atividade anti-amastigota em todas as concentrações
avaliadas (TAB. 3 e FIG. 3).
TABELA 3 - Efeito leishmanicida in vitro do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes (Pentostam® e Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis.
Drogas Concentração % atividade (mg/ml) leishmanicida Meio RPMI - - Timol 1,0 95,0 ± 1,75
0,50 82,0 ± 1,00
0,25 60,0 ± 1,85
0,125 52,6 ± 0,45
0,062 38,4 ± 0,10
0,031 26,5 ± 0,45
Lapachol 0,20 96,8 ± 2,20
0,10 90,2 ± 2,90
0,05 88,8 ± 3,25
0,025 80,7 ± 0,65
0,0125 76,4 ± 1,65
Pentostam® 2,0 95,5 ± 0,81
1,0 92,1 ± 3,30
0,50 74,3 ± 13,3
0,25 64,0 ± 12,0
0,125 59,8 ± 8,55
Glucantime® 4,0 97,5 ± 0,0
2,0 97,2 ± 0,35
1,0 83,1 ± 4,25
0,50 67,2 ± 2,80
0,25 32,9 ± 2,10
Os valores representam a média aritmética de 3 ensaios ± E.P. Dados sombreados mostram atividade leishmanicida ≥ 70%.
32
FIGURA 3 - Efeito leishmanicida in vitro do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes (Pentostam® e Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis. Os resultados mostram a média aritmética de 3 ensaios ± E.P.
3.2. Ensaio in vivo com timol
Os animais tratados com o timol (14mg/kg/dia, I.M.) apresentaram lesões com 1,30 ±
0,42mm, ao final do estudo, o que representa uma redução de apenas 13,3%, quando
comparada com os controles não tratados (1,50 ± 0,24mm). Nos animais que receberam o
Glucantime® (60mg/kg/dia, I.M.), a redução do tamanho das lesões correspondeu a 98,0%
(0,030 ± 0,12mm; p = 0,0001) (FIG. 4 e TAB. 4).
Durante o tratamento com o timol, ocorreu a morte de apenas um animal, 16,7%
(1/6). A tolerabilidade à droga foi boa e, apesar de que substâncias da classe dos fenóis,
como o timol, são irritantes, somente 40% (2/5) dos animais tratados apresentaram
hemorragia tecidual no local da aplicação. Outro sintoma detectado foi irritabilidade,
verificado somente nos últimos dias de tratamento (TAB. 4).
0
20
40
60
80
100
0,5 0,25 0,125 0,062 0,031 0,2 0,1 0,05 0,025 0,0125 2,0 1,0 0,50 0,25 0,125 4,0 2,0 1,0 0,50 0,25 mg/ml
Timol Lapachol Pentostam® Glucantime®
% a
tivi
dade
leis
hman
icid
a
33
FIGURA 4 - Efeito do tratamento I.M. com timol (14mg/kg/dia) em hamsters (n=6) infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis. Cada ponto representa a média aritmética do tamanho da lesão ± E.P. A região sombreada mostra o período de tratamento.
TABELA 4 – Avaliação do efeito do tratamento com timol (14mg/kg/dia), administrado por 42 dias, via I.M., em hamsters (n=6) infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis.
Tamanho da lesão (mm) Redução da Nº de Grupo (média ± E.P) lesão (%)b sobreviventes
Controle 1,50 ± 0,24 - 6/6
Timol 1,30 ± 0,42 13,3 5/6 Glucantime® 0,03 ± 0,12a 98,0 6/6
a = Glucantime® comparado ao Controle (p = 0,0001). b = redução do tamanho da lesão comparada ao controle.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5ControleTimolGlucantime®
Tempo de infecção (semanas)
Tam
anho
da
lesã
o (m
m)
34
3.3. Ensaio in vivo com lapachol e sua associação com Pentostam®
Os animais que receberam o lapachol (300mg/kg/dia, V.O.) não apresentaram
diferença significativa em relação ao tamanho da lesão, quando comparados aos não
tratados (lapachol 2,6 ± 1,13mm; controle não tratado 2,8 ± 0,43mm), representando uma
redução de apenas 6% (FIG. 5 e TAB. 5).
FIGURA 5 - Efeito do tratamento oral com lapachol (300mg/kg/dia) ou da sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia) em hamsters (n=8) infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis. Cada ponto representa a média aritmética do tamanho da lesão ± E.P. A região sombreada mostra o período de tratamento.
Em relação à carga parasitária, pôde-se observar que os animais tratados com o
lapachol apresentavam, ao final do tratamento, parasitismo tão alto (1,4x107 ± 1,1x107
parasitas/linfonodo) quanto o observado no controle não tratado (5,8x107 ± 4,7x107
parasitas/linfonodo) (FIG. 6 e TAB. 5).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 90
1
2
3
4ControleLapachol Lapachol e Pentostam®
Pentos tam®
Tempo de infecção (semanas)
Tam
anho
da
lesã
o (m
m)
35
FIGURA 6 - Carga parasitária no linfonodo de drenagem da pata de hamsters infectados por Leishmania (Viannia) braziliensis ao final de 42 dias de tratamento oral com lapachol (300mg/kg/dia) associado ou não ao Pentostam® (60mg/kg/dia). Cada grupo está representado por 5 animais e sua mediana.
Quando se avaliou a associação do lapachol com o Pentostam®, comparado ao grupo
tratado apenas com o antimonial, verificou-se que não houve diferença significante.
Entretanto, ambos os grupos, tanto o que recebeu a associação Lapachol+Pentostam®,
quanto o que recebeu apenas o Pentostam®, quando comparados com o controle não
tratado, mostraram uma redução estatisticamente significante, tanto em relação ao tamanho
da lesão quanto à carga parasitária (FIG. 5, FIG. 6 e TAB. 5).
A mortalidade foi de 37,5% (3/8) no grupo tratado com o lapachol, 25% (2/8) no
grupo Lapachol+Pentostam® e 25% (2/8) no grupo Controle (TAB. 5). Os principais
efeitos colaterais observados nos animais que receberam o lapachol ou a sua associação
com o Pentostam®, foram ptose da pálpebra esquerda, 18,75% (3/16) e paresia da pata
anterior esquerda, 12,5% (2/16). Outra alteração observada em todos os animais que
receberam o lapachol foi urina castanha-avermelhada.
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
10 5
10 6
10 7
10 8
10 9
1010
1011
1012
Para
sita
s/ór
gão
Controle Lapachol Lapachol + Pentostam Pentostam
36
TABELA 5 – Avaliação do efeito do tratamento oral por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) ou sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia) em hamsters (n=8) infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis.
Tamanho da Carga parasitária lesão (mm) Redução da no linfonodo Nº de Grupo (média ± E.P) lesão (%)e (média ± E.P) sobreviventes
Controle 2,78 ± 0,43 - 5,8 x 107 ± 4,7 x 107 6/8
Lapachol 2,62 ± 1,13 6,0 1,4 x 107 ± 1,1 x 107 5/8
Lapachol+ 0,30 ± 0,08a 98,9 2,4 x 103 ± 2,0 x 103c 6/8 Pentostam®
Pentostam® 0,47 ± 0,12b 83,2 1,5 x 104 ± 1,3 x104d 8/8
a = Lapachol+Pentostam® comparado ao controle (tamanho da lesão; p = 0,0050); b = Pentostam® comparado ao controle (tamanho da lesão; p = 0,0007); c = Lapachol+Pentostam® comparado ao controle (carga parasitária; p = 0,0079); d = Pentostam® comparado ao controle (carga parasitária; p = 0,0159). e = redução do tamanho da lesão comparada ao controle.
Quanto ao estado nutricional, foi observada significativa perda de peso nos animais
do grupo controle, que em média perderam 18% (20,1g) do seu peso inicial (p = 0,0160).
Os demais grupos não apresentaram alterações ponderais importantes (TAB. 6).
TABELA 6 – Alteração ponderal dos animais durante o tratamento oral por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) ou sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia). Dias Controle Lapachol Lapachol+Pentostam® Pentostam® D 0 114,2 ± 5,1 102,4 ± 3,9 108,6 ± 4,6 101,3 ± 3,1
D 20 102,5 ± 3,9 93,4 ± 6,3 101,0 ± 4,5 102,2 ± 3,1
D 50 94,1 ± 4,8 93,7 ± 5,4 103,2 ± 5,4 99,2 ± 3,3
Perda Peso 18% (20,1g) a 8,5% (8,7g) 5% (5,4g) 2% (2,1g)
Os valores representam a média aritmética ± E.P. a = perda ponderal ao final do experimento, D50, em relação ao peso inicial, D0 (p = 0,0160).
37
Na análise do peso relativo dos órgãos de disseminação, foi possível observar
significante redução no peso relativo do linfonodo poplíteo, nos animais tratados com a
associação Lapachol+Pentostam® (p = 0,0056) ou apenas Pentostam® (p = 0,0102),
quando comparado ao dos controles não tratados (FIG. 7A). Em relação ao baço e
fígado, nenhum dos grupos mostrou diferença significativa (FIG. 7B e 7C).
FIGURA 7 - Peso relativo do linfonodo de drenagem (A), baço (B) e fígado (C) de hamsters infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) associado ou não a Pentostam® (60mg/kg/dia). CONT, Controle; LAP, Lapachol; LAP+PENT, Lapachol associado a Pentostam®; PENT, Pentostam®. Cada grupo está representado por 3-5 animais e sua mediana.
10-4
10-3
10-2
B
CONT LAP LAP+PENT PENT
Pes
o re
lati
vo
10-2
10-1
CONT LAP LAP+PENT PENT
C
Pes
o re
lati
vo
10-4
10-3
10-2
A
CONT LAP LAP+PENT PENT
Pes
o re
lati
vo
38
Os animais apresentaram lesões ulceradas a partir da 3ª semana de infecção, sendo
mais frequente nos grupos controle não tratado e Lapachol (TAB. 7). Quando se iniciou o
tratamento, as úlceras dos animais que receberam somente o Pentostam® ou a associação
Lapachol+Pentostam®, fecharam a partir da 4ª semana de infecção; entretanto, nos
animais dos grupos Controle e Lapachol, as úlceras mostraram uma evolução diferente.
Nestes dois grupos, ao final do tratamento, a percentagem de animais com lesões ulceradas
havia aumentado, sendo que, no grupo tratado com lapachol, todos os animais
apresentavam úlceras (TAB. 7). Vale ressaltar que as lesões dos animais do grupo
Lapachol mostravam-se menos úmidas e aparentemente sem infecção bacteriana quando
comparadas às lesões dos animais do grupo Controle.
TABELA 7 - Percentagem de animais com lesões úlceradas durante o curso da infecção por Leishmania (Viannia) braziliensis e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) ou sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia).
Grupo 1ªsem 2ªsem 3ªsem 4ªsem 5ªsem 6ªsem 7ªsem 8ªsem 9ªsem
Cont 0 0 50,0 75,0 75,0 87,5 87,5 87,5 87,5
Lap 0 0 50,0 71,4 83,3 100,0 100,0 100,0 100,0
Lp+Pt 0 0 25,0 25,0 0 0 0 0 0
Pent 0 0 12,5 0 0 0 0 0 0
Sem = semana; Cont = Controle; Lap = Lapachol; Lp+Pt = Lapachol associado a Pentostam®; Pent = Pentostam®.
3.4. Achados histopatológicos 3.4.1. Alterações no linfonodo de drenagem da lesão
Comparados aos linfonodos dos animais sadios, os do grupo controle infectado
apresentaram intensa histiocitose sinusal, observada em 100% (5/5) dos linfonodos, e
histiocitose parenquimal, que variou de moderada a intensa, também verificada em todos
os animais (FIG. 8A e 8B). Os macrófagos, moderadamente infectados e vacuolados,
estavam distribuídos como células isoladas ou em grupamentos de tamanhos variados, mas
sem formação de granulomas (FIG. 9). Podiam ser observados em focos ou difusamente
39
pelo parênquima e seios linfáticos (FIG. 8A e FIG. 8B). Marcantes hiperplasia folicular e
plasmocitose ocorreram em todos os animais, com ausência de hiperplasia paracortical
(FIG. 10A, FIG. 10B e FIG. 11). Foi observada ainda, presença de escassos eosinófilos e
ausência de neutrófilos.
Nos linfonodos dos animais tratados com o lapachol observou-se intensa apoptose e
necrose, associada com depósito de cálcio em um dos animais (FIG. 12A e FIG. 12B). A
necrose acometia extensas áreas do parênquima, envolvendo tanto a região cortical como a
medular (FIG. 12A). A histiocitose ocorreu em menor intensidade do que a observada nos
controles infectados e sem formação de granulomas. Chamou atenção a presença de
mielopoiese, observada em todos os animais, e a acentuada hipoplasia folicular, onde não
se visualizava nem mesmo o esboço dos folículos (FIG. 12A e 12B). Ainda foi observado
plasmocitose, embora, em menor intensidade que a dos controles infectados, sendo
frequente o achado de plasmócitos em apoptose. Moderada quantidade de amastigotas foi
detectada no interior de macrófagos ou no interstício (FIG. 12C).
No grupo tratado com o timol chamou atenção a intensa congestão cortical,
observada em todos os animais. Histiocitose sinusal e parenquimal estavam presentes em
todos os linfonodos, variando de moderada a intensa, sem formação de granulomas e com
macrófagos intensamente vacuolados e moderadamente parasitados, quando comparados
aos do controle infectado. Hiperplasia folicular e plasmocitose ainda foram encontradas, no
entanto, de maneira menos intensa do que as observadas nos animais do grupo controle.
Nos linfonodos dos animais tratados com antimonial (Glucantime® ou Pentostam®)
foi observado histiocitose, presente apenas nos seios linfáticos, sem formação de
granulomas, bem como hiperplasia folicular associada com plasmocitose. Entretanto, todas
estas alterações foram estimadas discretas quando comparadas àquelas encontradas nos
controles infectados (FIG. 13). Outros achados dignos de nota foram a presença de
escassos neutrófilos e raros macrófagos parasitados.
40
3.4.2. Alterações no baço
Nos baços dos animais dos grupos Controle, Lapachol e Timol, chamou atenção a
intensa hipoplasia da polpa branca, sendo menos frequente nos animais tratados com os
antimoniais (Glucantime® ou Pentostam®) ou com a associação Lapachol+Pentostam®
(FIG. 14A).
Em todos os grupos, foi observada discreta histiocitose sem formação de granulomas.
Apenas dois animais do grupo controle apresentaram raros granulomas, distribuídos na
polpa vermelha de forma não organizada. Os macrófagos apresentavam-se intensamente
vacuolados, entretanto, amastigotas não foram visualizadas em nenhum grupo, apesar de
diligente procura (FIG. 14B).
Ainda foram encontradas outras alterações tais como, congestão sinusoidal e
mielopoiese aumentada. A mielopoiese foi mais frequente nos animais do grupo Controle,
Lapachol e Timol, sendo menos observada nos animais tratados com Pentostam® ou com a
associação Lapachol+ Pentostam®.
41
FIGURA 8 – Linfonodo de controle não tratado. (A) Intensa histiocitose sinusal e parenquimal, sem formação de granulomas. S, sinusal; P, parenquimal. HE, 40x. (B) Maior aumento da Fig. 8. HE, 100x. FIGURA 9 – Linfonodo de controle não tratado. Setas indicando macrófagos vacuolados, volumosos e parasitados. HE, 400x.
8A
8B
9
P
S
42
FIGURA 10 – Linfonodo de controle não tratado. (A) Intensa hiperplasia folicular. HE, 40x. (B) Destaque para os folículos linfáticos. CG, centro germinativo; SM, seio medular. HE, 100x. FIGURA 11 – Linfonodo de controle não tratado mostrando intensa plasmocitose. HE, 400x.
CG
CG
SM
10A
10B
11
43
FIGURA 12 – Linfonodo de hamster tratado com lapachol. (A) Extensas áreas de necrose e apoptose com acentuada hipoplasia folicular. NC, necrose; AP, apoptose. HE, 40x. (B) Detalhe da Fig. 12A. HE, 400x. (C) Setas indicando amastigotas parasitando macrófagos. HE, 1000x.
AP
NC
12A
12B
12C
44
FIGURA 13 – Linfonodo de hamster tratado com antimonial. Histiocitose, hiperplasia folicular e plasmocitose discretas. HE, 40x. FIGURA 14 – Baço de controle não tratado. (A) Marcante hipoplasia da polpa branca. FL, folículo linfático. HE, 40x. (B) Maior aumento da Fig. 14A, com setas indicando os macrófagos vacuolados e volumosos. HE, 100x.
FL
13
14A
14B
45
4. DISCUSSÃO
os últimos anos vem ocorrendo um aumento na busca por novas drogas
antiparasitárias a partir de extrações de plantas (Phillipson et al., 1993,
1995; Iwu et al., 1994; Kirby, 1996). O timol e o lapachol são
constituintes químicos isolados originalmente de plantas consideradas medicinais (Sousa et
al., 1991). O uso do timol para o tratamento de algumas helmintíases (Gupta et al., 1967;
Gaitonde et al., 1968; Sanghavi & Mistry, 1971) e suas propriedades bactericida,
antimicótica e antisséptica já estão bem estabelecidas (Shapiro et al., 1994; Mahmoud,
1994; Viollon & Chaumont, 1994). O lapachol foi testado no passado como agente
antimalárico (Wendel, 1946; Fieser & Richardson, 1948) e são reconhecidas suas
atividades antimicrobiana (Lima et al., 1956) e anti-parasitária (Pinto et al., 1977; Lopes et
al., 1978; Shapiro et al., 1982). O conhecimento das propriedades biológicas dessas duas
drogas instigou-nos a investigar a possibilidade da existência de atividade leishmanicida, o
que ensejaria uma alternativa para o tratamento da leishmaniose.
Na literatura observa-se que muitos constituintes químicos extraídos de plantas que
apresentaram efeito leishmanicida, já eram conhecidos previamente por seus efeitos anti-
parasitários e, ou antimicrobianos. No entanto, boa parte destas substâncias foi testada
somente para a forma promastigota de Leishmania, in vitro, faltando ensaios in vivo para
confirmação dessa atividade leishmanicida (Iwu et al., 1994).
A triagem de drogas com base na atividade leishmanicida para a forma promastigota
serve como um indicativo de ação da droga, e muitos pesquisadores utilizam-na, mas não
tem sido suficiente para determinar se essas substâncias serão ativas também contra as
formas intracelulares amastigotas. As formas amastigotas residem nos fagolisossomos de
macrófagos, o que significa que a droga deve ser capaz de atravessar as membranas da
célula hospedeira e atingir o interior do vacúolo fagolisossomal. Além disso, existem
evidências de diferenças metabólicas entre promastigotas e amastigotas. Por exemplo,
amastigotas consomem mais ácidos graxos do meio de cultura do que promastigotas em
fase logarítmica de crescimento (Berman, 1988). Diferenças como essa podem explicar o
fato de determinadas substâncias serem ativas contra uma forma e não contra a outra, como
é o caso dos antimoniais, que atuam sobre amastigotas, mas são muito pouco eficazes
N
46
contra promastigotas (Moreira et al., 1995; Callahan et al., 1997). Optamos por avaliar as
substâncias em estudo contra amastigotas intracelulares in vitro e, subsequentemente, testá-
las no modelo in vivo para confirmação do efeito leishmanicida.
Parasita intracelular estrito como a Leishmania compartilha muitas vias bioquímicas
com sua célula hospedeira, portanto, para testar se as drogas eram seletivas para lisar
apenas as amastigotas, sem causar danos à célula hospedeira, foi investigada a
citotoxicidade para macrófagos. Os resultados mostraram que o timol foi a mais tóxica das
drogas testadas. Esta marcante toxicidade do timol para macrófagos, em doses ≥
0,062mg/ml, possivelmente pode ser explicada pelo fato dessa droga ser um composto
fenólico. Sabe-se que alguns fenóis são substâncias bastante ativas quimicamente, podendo
ser muito irritantes (Alterthum, 1982). Entre os antimoniais, o estibogluconato de sódio
(Pentostam®) mostrou-se o mais tóxico. Saldanha (1997) encontrou que o estibogluconato
de sódio BP88®, fabricado na China e importado pelo Ministério da Saúde a partir de
1996, o mesmo utilizado neste trabalho, é mais tóxico que o antimoniato de meglumina
(Glucantime®), o que vem corroborar nossos achados.
As substâncias em estudo foram em seguida avaliadas contra amastigotas
intracelulares e, com exceção do timol, todas apresentaram efeito leishmanicida em
concentrações não tóxicas para macrófagos. Para o timol, este efeito só foi encontrado nas
concentrações acima de 0,25mg/ml, que também foram tóxicas para macrófagos. Portanto,
o percentual da atividade leishmanicida observado com o timol, nestas concentrações, pode
não representar necessariamente uma ação direta sobre o parasita, mas sim o somatório de
sua ação tóxica para macrófago e seu efeito leishmanicida. Esses resultados leishmanicidas
in vitro, do timol e lapachol, estão de acordo com os dados encontrados na literatura.
Classes de substâncias como os terpenos e as naftoquinonas, das quais fazem parte o timol
e o lapachol, respectivamente, são citadas na revisão de Iwu et al. (1994) como tendo
apresentado atividade sobre algumas espécies de Leishmania, indicando que pudessem ser
importantes classes de novos agentes terapêuticos para a leishmaniose.
Nos ensaios in vivo, demonstramos que, apesar do timol e do lapachol terem
apresentado importante efeito anti-amastigota in vitro, estas substâncias não foram capazes
de conter o desenvolvimento de lesões em hamsters infectados por L. (V.) braziliensis. Tais
47
resultados suscitam a hipótese de que, in vivo, possivelmente as drogas sejam convertidas
em metabólitos inativos ou sejam neutralizadas, perdendo sua ação leishmanicida.
A relação estrutura-atividade do lapachol e de vários de seus análogos foi revisada
por Discroll et al., em 1974. Estes autores demonstraram que a remoção do grupo hidroxila
ou do isopentanila reduzia para 50% a atividade antitumor, enquanto que a remoção do
anel aromático originava um produto inativo. Redução, oxidação ou isomerização de uma
das cadeias também suprimia a atividade, assim como a adição de água para a ligação
dupla de carbonos ou a troca da hidroxila por um grupamento amino ou metilamino (Sieber
et al.,1976). Não podemos descartar a possibilidade do lapachol, uma vez absorvido, ter
sido transformado em um metabólito inativo, podendo ser esta uma das prováveis
explicações para sua fraca atuação in vivo. Outro ponto que merece destaque é a
concentração plasmática do lapachol. Block et al. (1974) relataram que, apesar da
concentração plasmática ideal para a eficácia da atividade antitumor ter sido determinada
como sendo de 30-35µg/ml, esta concentração nunca pôde ser alcançada em pacientes
cancerosos que receberam o lapachol, sem que não apresentassem efeitos colaterais graves
como anemia e diminuição do tempo de protombina. É possível que isso também tenha
acontecido no nosso ensaio e o lapachol não apresente efeito leishmanicida in vivo pela
impossibilidade de atingir um ótimo nível plasmático na concentração utilizada
(300mg/kg/dia).
Drogas administradas por via oral, bem absorvidas no trato gastrointestinal, assim
como drogas aplicadas por via intravenosa, atingem o sítio alvo apropriado através da
corrente sanguínea, sendo carreadas pelo sangue em um estado livre ou ligadas à proteínas
plasmáticas. Uma vez que uma droga se liga a uma proteína ela pode ser
farmacologicamente inativada e isto parece acontecer com β-lapachona e outras
naftoquinonas derivadas do lapachol, cujos efeitos tripanosomatida in vivo não
correspondem aos encontrados in vitro, quando na presença de sangue ou soro. Estas
naftoquinonas derivadas, na presença de oxihemoglobina, induzem a formação de
metahemoglobina com suas concomitantes transformações em substâncias inativas (Lopes
et al., 1978), o que sugere que o lapachol, uma naftoquinona, provavelmente também possa
ser inativado pela redução ou interação com proteínas do soro.
48
As substâncias ativas contra amastigotas de Leishmania podem atuar direta e
seletivamente contra o parasita ou indiretamente, através da ativação de mecanismos
microbicidas do macrófago, como o aumento da produção de radicais livres do oxigênio e
óxido nítrico (NO), provavelmente o mecanismo mais importante de destruição de
Leishmania empregado por essas células (Liew et al., 1990; Stenger et al., 1994). Recentes
estudos, in vitro, utilizando neurônios de ratos, apontam para o fato de que lapachol e
outras quinonas são inibidores da produção de NO, podendo possivelmente afetar, in vivo,
as ações fisiológicas e, ou fisiopatológicas dependentes deste mecanismo oxidativo
(Kumagai et al., 1998). No modelo in vitro, usou-se macrófago infectado por L. (V.)
braziliensis e nele, o lapachol mostrou-se muito ativo; portanto, seria interessante avaliar a
produção de NO neste sistema. É possível que o lapachol possa inibir seletivamente
determinadas funções dos macrófagos, ou seja, como os sinais que estimulam os
mecanismos oxidativos são independentes, não se pode descartar a possibilidade de que o
lapachol possa, ao mesmo tempo, inibir a NO sintetase e aumentar a produção de peróxido
de hidrogênio e outros intermediários reativos do oxigênio. Outra hipótese seria a de que a
droga poderia estar agindo indiretamente sobre o parasita e não necessariamente através da
ativação do macrófago.
Alguns terpenóides extraídos de plantas, como o ácido tormêntico, inibem o
crescimento de promastigotas, mas não têm efeito sobre amastigotas intracelulares (Santos,
1997) e apresentam o mesmo esqueleto básico do ácido ursólico, outro terpenóide descrito
como um potente inibidor do crescimento de promastigotas e amastigotas de L.
amazonensis (Sauvain et al., 1993). Entretanto, o ácido tormêntico possui duas hidroxilas a
mais e este nível de oxidação mais alto provoca uma maior polaridade, consequentemente,
tem menor capacidade de transpor membranas biológicas, o que pode explicar sua
inatividade contra amastigotas intracelulares. No entanto, essa parece não ser a explicação
para a fraca atividade leishmanicida do timol in vivo, que assim como as substâncias
citadas acima, é também um terpenóide, uma vez que sua estrutura química é relativamente
mais simples e apresenta apenas uma hidroxila. Não temos conhecimento de nenhum
estudo mostrando que o timol possa ter dificuldades de atravessar membranas biológicas,
ao contrário, sendo uma substância lipofílica, seus efeitos antimicrobianos são usualmente
atribuídos ao seu tropismo por membranas (Shapiro & Guggenheim, 1995). Portanto, uma
vez que o timol não apresentou efeito terapêutico no modelo in vivo utilizado neste
trabalho, podemos considerar a possibilidade da inativação e, ou neutralização desta droga
49
in vivo. Podemos ainda conjecturar que provavelmente a dose que usamos (14mg/kg/dia)
tenha sido insuficiente para causar alguma atividade leishmanicida in vivo, entretanto,
doses maiores seriam tóxicas para os animais.
Nos experimentos realizados, o efeito curativo dos antimoniais já pôde ser observado
a partir da segunda semana de tratamento, quando os animais que receberam estas drogas
apresentaram uma redução significativa das lesões em relação aos animais do controle não
tratados. No entanto, apesar destas drogas terem sido capazes de conter o desenvolvimento
das lesões no hamster infectado e da aparente cura clínica, ainda foi possível encontrar
parasitas viáveis nos linfonodos após 42 dias de tratamento (104/linfonodo). Bjorvatn &
Neva (1979), trabalhando com camundongos BALB/c infectados com L. tropica e tratados
com Pentostam® (400mg/kg/dia), relataram que parasitas viáveis ainda foram visualizados
no fígado dos animais ao final de 41 e 83 dias de infecção. Inchausti et al. (1997),
quantificando a carga parasitária das patas lesionadas de camundongos BALB/c infectados
com L. amazonensis e tratados com Glucantime® (28mg/kg/15dias), encontraram 105
parasitas/pata. Diante de tais achados, tem sido postulado que os antimoniais não são
capazes de erradicar completamente os parasitas dos tecidos de animais infectados por
Leishmania, mesmo diante de uma aparente cura clínica, o que explicaria o ressurgimento
das lesões em pacientes imunosuprimidos e que já foram tratados anteriormente para
leishmaniose. Os resultados encontrados são, portanto, compatíveis com estes descritos na
literatura.
Os animais que receberam a associação lapachol+Pentostam® apresentaram o
mesmo comportamento que os tratados apenas com o Pentostam®, indicando que a ação
terapêutica observada deve ser creditada ao efeito do antimonial. Apesar do lapachol não
ter apresentado efeito terapêutico na leishmaniose experimental, vale salientar que as
úlceras desenvolvidas nos animais tratados com esta droga mostraram-se menos úmidas e
aparentemente sem contaminação bacteriana, o que pode ser explicado pelos comprovados
efeitos antiinflamatório e antimicrobiano desta substância (Lima et al., 1956; De Almeida
et al., 1990).
Alguns achados nos animais tratados com lapachol merecem comentários, como por
exemplo, a cor castanha-avermelhada da urina e a neurotoxicidade. Morrison et al. (1970)
50
descreveram, em seus estudos de toxicidade do lapachol, o aparecimento de urina
castanha-avermelhada nos animais submetidos ao tratamento com variadas doses da droga,
explicando este sinal pela combinação do lapachol livre com a bilirrubina. Sabe-se que
soluções de lapachol são amarelas em pH abaixo de 6 e vermelhas acima deste patamar.
Para excluir a possível ocorrência iatrogênica de fenômenos hemorrágicos do sistema
urinário, como cistite hemorrágica ou necrose, os rins e bexigas dos animais foram
examinados e nenhuma alteração foi observada. Entretanto, em relação aos achados de
neurotoxicidade, não encontramos referências na literatura consultada, sendo este o
primeiro trabalho, em nosso conhecimento, que descreve este efeito colateral em hamsters
tratados com esta substância.
Na tentativa de avaliar melhor a neurotoxicidade do lapachol, animais sadios e
animais infectados por L. (V.) braziliensis foram submetidos ao tratamento com a mesma
dose de lapachol (300mg/kg/dia) e pelo mesmo período de tempo (42 dias) que os animais
do ensaio e somente os animais infectados apresentaram sinais neurotóxicos (dados não
apresentados). Esse fato sugere que, possivelmente, substâncias liberadas no processo
inflamatório induzido por L. (V.) braziliensis possam potencializar um efeito tóxico da
droga na concentração utilizada no experimento. Entretanto, este é um ponto que merece
ser esclarecido através de estudos futuros.
Os percentuais de mortalidade de 37,5% e 25% encontrados nos grupos tratados com
o lapachol e com a associação lapachol+Pentostam®, respectivamente, não podem ser
atribuídos exclusivamente à droga, uma vez que ocorreram mortes também no grupo
controle infectado (25%). Infelizmente, foi impossível fazer a histologia do pulmão dos
dois animais do grupo controle mortos, uma vez que já estavam em estado avançado de
decomposição. Entretanto, no estudo histopatológico dos demais animais que morreram ao
longo do tratamento, foi detectado pneumonite. Não foi possível determinar se esta
pneumonite foi causada por aspiração durante a administração da droga ou por
microrganismos oportunistas na vigência de uma imunosupressão induzida pela infecção
leishmaniótica ou pelo lapachol, visto que é uma substância anti-mitótica. Nos estudos de
Morrison et al. (1970), os principais indicativos de toxicidade pelo lapachol, quando
administrado por via oral em altas doses, foram a anemia, nas primeiras duas semanas de
administração da droga, e uma elevação no tempo de protrombina, que podia ser corrigida
ou controlada com uma simples aplicação de Vitamina K. Dos animais testados no estudo
51
de Morrison et al. (1970), tais como camundongos BALB/c, ratos albinos Charles River
CD e cães da raça beagle, todos apresentaram uma transitória leucocitose, e apenas em
macacos foi detectado leucopenia. Para esclarecer nossos achados, submetemos um grupo
de hamsters sadios ao tratamento com o lapachol na mesma dose utilizada em nossos
ensaios e avaliamos o leucograma antes de iniciar o tratamento, com 15, 30 e 40 dias.
Constatamos uma completa ausência de leucopenia (dados não apresentados), sugerindo
que o lapachol, por si só, na dose utilizada nesse trabalho (300mg/kg/dia), não induz
leucopenia em hamster, a despeito de sua ação anti-mitótica.
Um grande número de roedores e primatas são susceptíveis à infecção por
Leishmania sp. e, entre eles, estão os hamsters. Estudos comparativos de susceptibilidade à
infecção por cepas patogênicas do Novo Mundo, utilizando camundongos BALB/c,
CBA/H, CDI e hamsters, puderam mostrar que este último é o hospedeiro mais susceptível
para a L. braziliensis (Neal & Hale, 1983). A ocorrência de disseminação para o linfonodo
regional, baço e fígado do hamster infectado com diferentes espécies de Leishmania
dermotrópicas tem sido bem documentada na literatura (Lainson & Shaw, 1979; Wilson &
Lollini, 1980; Cuba Cuba et al., 1985; Kahl et al., 1990, 1991; Almeida et al., 1996;
Sinagra et al., 1997). Outros estudos têm correlacionado essa disseminação para baço e
linfonodo com a gravidade da doença (Scott & Farrel, 1982).
Os achados histopatológicos do baço dos animais do presente estudo, corroboram
aqueles de Kahl et al. (1991), os quais também encontraram alterações tais como
hipoplasia da polpa branca, congestão sinusoidal e mielopoiese aumentada em hamsters
infectados por L. (V.) braziliensis. Chamou-nos atenção o baixo parasitismo no baço,
inclusive dos animais do grupo controle infectado. Em hamsters, pode ocorrer
visceralização pelo parasita ainda nas primeiras 4 semanas de infecção (Travi et al., 1988;
Sinagra et al., 1997), entretanto, a presença de amastigotas no baço de animais infectados
por espécies dermotrópicas de Leishmania não tem sido descrita com frequência (Kahl et
al., 1991). Tem sido relatada raramente (Wilson & Lollini, 1980; Almeida et al., 1996), ou
parasitas são detectados em baixo número (Sinagra et al., 1997). A presença de L.
braziliensis é mais abundante no sítio cutâneo do que nas vísceras, refletindo o crescimento
diferencial de cepas viscerotrópicas e dermotrópicas em temperaturas acima de 340C
(Almeida et al., 1996). Outra alteração encontrada e digna de comentário é o achado da
marcante hipoplasia de polpa branca nos animais de todos os grupos, embora menos
52
frequente nos animais tratados com antimonial (Glucantime® ou Pentostam®) ou com a
associação lapachol+Pentostam®. Esta alteração indica provavelmente um quadro de
imunosupressão e tem sido descrita em outros estudos com hamsters infectados por
Leishmania, tais como L. braziliensis, L. mexicana e L. donovani, sugerindo que a
hipoplasia esplênica possa ser a base da disseminação do parasita para as vísceras e outros
sítios, bem como, a responsável pelo agravamento das lesões (Wilson & Lollini, 1980;
Veress et al., 1983; Sehgal & Arora, 1985; O’Daly & Cabrera, 1986).
Os achados histopatológicos nos linfonodos satélites dos animais do grupo controle
infectado, consistindo predominantemente de uma intensa histiocitose com magrófagos
vacuolados e volumosos e contendo muitas amastigotas, não diferiram daqueles
encontrados na literatura (Kahl et al., 1991; Almeida et al., 1996). Uma exceção foi a
ausência de granulomas nos linfonodos de todos os grupos, com exceção de dois animais
do grupo controle infectado. Tem sido postulado que na LT a formação de granuloma
maduro ou imune, com a participação de linfócitos T CD4+, fenótipo TH1, e com ativação
de macrófagos por citocinas, provavelmente representam o fator chave na destruição
parasitária, com controle da infecção (Ridley, 1979; Grimaldi, 1982; Magalhães et al.,
1986). A ausência de granulomas nos animais do ensaio pode representar, portanto, um
padrão de infecção não resolutivo.
O quadro histopatológico dos linfonodos nos animais tratados com o lapachol
chamou atenção pela presença de extensas áreas de necrose e apoptose. Esta necrose tanto
pode indicar um importante fator no controle da infecção por mecanismo adquirido de
imunidade celular efetiva, como pode representar um elemento na patogênese da LT ou
ambos. Rocha (1998), estudando linfonodos de pacientes com a forma bubônica de LT,
pôde detectar níveis elevados de TNF-α (fator de necrose tumoral-α) bem como extensa
necrose, principalmente quando o tempo de evolução excedia 7 semanas. Esta citocina
funciona como um importante mediador pró-inflamatório, e em níveis elevados, promove
extensa necrose tumoral e, eventualmente, de tecidos normais. Além disso, pode induzir
apoptose e, ou necrose isquêmica por coagulação intravascular que afeta a microcirculação
local (Abbas et al., 1991). A apoptose deve desempenhar papel significativo na contenção
da replicação da Leishmania, bem como, na regulação da resposta inflamatória, uma vez
que inibe a secreção de citocinas quimiotáticas, como a IL-8 (interleucina-8), diminuindo,
53
desta maneira, o recrutamento de células fagócitas (Savill, 1997). É possível que o quadro
histopatológico encontrado nos linfonodos dos animais tratados com o lapachol, possa
representar mais um fator na patogênese da doença, dado que, apesar da necrose e apoptose
observados, não houve redução significante na carga parasitária.
Diferentemente dos achados histopatológicos dos baços, nos linfonodos dos animais
do grupo controle infectado foram encontradas marcantes hiperplasia folicular e
plasmocitose, com ausência de hiperplasia paracortical (área de linfócitos T), sugestivo de
uma resposta imunológica tipo TH2. Tais resultados suscitam a hipótes de que,
possivelmente, em hamsters, estes dois compartimentos, baço e linfonodo, respondam de
maneira diferente à infecção por Leishmania.
Sousa et al. (1995) encontraram em pacientes com LT um quadro de doença
sistêmica, caracterizado por perda de peso, linfadenopatia e discreta hepatoesplenomegalia,
sugerindo uma disseminação linfo-hematogênica da L. braziliensis ainda no período inicial
da infecção. Os nossos achados indicam que, em muitos aspectos, a doença experimental
causada por L. braziliensis no hamster, se assemelha àquela encontrada no homem. Nos
animais de todos os grupos, já era possível detectar linfonodos palpáveis e lesões ulceradas
a partir da primeira e terceira semanas de infecção, respectivamente, assim também como
perda de peso. Entretanto, apenas os animais do grupo controle infectado apresentaram
uma significativa perda de peso (p = 0,0160), perdendo em média 18% (20,1g) do seu peso
inicial. A excessiva perda de peso na leishmaniose visceral por L. chagasi ou L. donovani,
tem sido relatada tanto em humanos quanto experimentalmente (Shukina & Gorbunova,
1987; Pearson et al., 1990; Pearson et al., 1992), entretanto, este trabalho é, de acordo com
o nosso conhecimento, o primeiro a demonstrar esta característica em hamsters infectados
por L. brazilensis. Possivelmente, citocinas como TNF-α, IL-1β e IL-6 podem estar
envolvidas na perda de peso encontradas nos animais deste trabalho, uma vez que já são
conhecidas como algumas das citocinas que contribuem para a intensa caquexia que
acompanha as doenças parasitárias crônicas (como leishmaniose visceral), infecções virais
e neoplasias (Tracey & Cerami, 1989; Pearson et al., 1990; Tilg et al., 1991; Emilie et al.,
1994; Tisdale, 1999). Estudos posteriores serão necessários para melhor esclarecer estes
achados.
54
Como a ação dos constituintes químicos estudados não foi semelhante nos dois
modelos utilizados, in vitro e in vivo, o modelo de infecção in vivo parece refletir melhor o
potencial terapêutico das drogas, uma vez que as substâncias ficam sujeitas a influência do
sistema imunológico do organismo e as suas propriedades farmacodinâmicas e
farmacocinéticas podem ser melhor visualizadas, sendo, portanto, um modelo mais
adequado à triagem de novas substâncias para o tratamento da leishmaniose.
55
5. CONCLUSÕES
Timol apresentou marcante toxicidade in vitro para macrófagos em doses ≥
0,062mg/ml e efeito anti-amastigota, nas concentrações acima de 0,25mg/ml, que
também foram tóxicas para macrófagos.
Lapachol, Pentostam® e Glucantime® demonstraram, in vitro, significante efeito
anti-amastigota para Leishmania (Viannia) braziliensis, em concentrações não
tóxicas para macrófagos, entretanto, Pentostam® mostrou-se mais tóxico para
macrófagos do que Glucantime®.
Timol e lapachol não mostraram ação terapêutica na infecção experimental por L.
(V.) braziliensis, nas concentrações avaliadas, 14mg/kg/dia e 300mg/kg/dia,
respectivamente, e no modelo in vivo utilizado.
Observou-se toxicidade para o sistema nervoso somente nos animais infectados por
L. (V.) braziliensis e tratados com lapachol, indicando que o estado patológico possa
potencializar essa ação da droga, na concentração utilizada neste trabalho.
Baço e linfonodo parecem responder de maneira diferente à infecção por
Leishmania, enquanto no baço ocorreu intensa hipoplasia da polpa branca, o
linfonodo apresentou marcante hiperplasia folicular.
Lapachol induziu intensa necrose e apoptose no linfonodo, no entanto, não foi capaz
de reduzir a carga parasitária neste sítio.
A leishmaniose tegumentar por L. (V.) braziliensis, no hamster, apresentou-se com
um quadro de linfadenopatia, hepatoesplenomegalia, significativa perda de peso e
ausência de granulomas no linfonodo e baço, mostrando um padrão de infecção não
resolutivo.
56
Não houve correlação entre os modelos in vitro e in vivo para a avaliação do efeito
leishmanicida das substâncias estudadas.
O modelo de infecção in vivo parece refletir melhor o potencial terapêutico das
drogas, uma vez que as substâncias ficam sujeitas a influência do sistema
imunológico do organismo e as suas propriedades farmacodinâmicas e
farmacocinéticas podem ser melhor visualizadas, sendo, portanto, um modelo mais
adequado à triagem de novos constituintes químicos para o tratamento da
leishmaniose.
57
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