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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ Faculdade de Medicina

Departamento de Patologia e Medicina Legal

AVALIAÇÃO DO EFEITO LEISHMANICIDA IN VITRO E IN VIVO

DE CONSTITUINTES QUÍMICOS ATIVOS DERIVADOS DE

PLANTAS MEDICINAIS

Maria Jania Teixeira

Fortaleza – Ceará

1999

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ Faculdade de Medicina

Departamento de Patologia e Medicina Legal

AVALIAÇÃO DO EFEITO LEISHMANICIDA IN VITRO E IN VIVO DE CONSTITUINTES QUÍMICOS ATIVOS DERIVADOS DE

PLANTAS MEDICINAIS


Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em

Patologia, do Departamento de Patologia e Medicina Legal da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para

obtenção do título de Mestre em Patologia. Orientadora: Profa. Dra. Yacy Mendonça de Almeida

Co-orientadora: Profª Margarida Maria de Lima Pompeu

Fortaleza – Ceará

1999

ii

FICHA CATALOGRÁFICA

T267a Teixeira, Maria Jania

1999 Avaliação do efeito leishmanicida in vitro e in vivo de constituintes químicos ativos derivados de plantas medicinais/ Maria Jania Teixeira. Fortaleza, 1999.

73 f.: il. Orientadora: Profª. Dra. Yacy Mendonça de Almeida. Co-orientadora: Profª. Dra. Margarida Maria de Lima Pompeu. Dissertação (Mestrado). Universidade Federal do Ceará. Faculdade de

Medicina. Departamento de Patologia e Medicina Legal.

1.PLANTAS MEDICINAIS. 2. EFEITO LEISHMANICIDA. 3. TRATAMENTO. CDD 581.634

Esta dissertação foi submetida como parte dos requisitos necessários à obtenção do

Grau de Mestre em Patologia, outorgado pela Universidade Federal do Ceará e encontra-se

à disposição dos interessados na Biblioteca da Faculdade de Medicina da referida

Universidade.

A citação de qualquer trecho desta Tese é permitida, desde que seja feita de

conformidade com as normas da ética científica.

_____________________________


Dissertação aprovada em: 13/04/1999

_____________________________

Profª. Yacy Mendonça de Almeida

(Orientadora)

_____________________________

Prof. Antônio Wilson Vasconcelos

_____________________________

Prof. Vietla Satyanarayana Rao

iii

Esta tese é dedicada “in memoriam” a meu pai,

Joaquim Américo Teixeira, um farmacêutico

competente e dedicado, com quem, ainda na

infância, aprendi a reconhecer a leishmaniose e

acompanhar o prolongado tratamento desta doença.

iv

É a inquietude que liberta a plântula da

semente e, ávida de luz, transfigura em

amorosas folhas a terra informe e soturna onde

foi lançada.

José Leone de Araújo

v

AGRADECIMENTOS

À Profª. Yacy Medonça de Almeida pela inestimável orientação científica que me

foi dada, por sua amizade, paciência, sugestões sempre pertinentes e constante incentivo

durante a realização deste trabalho.

À Profª. Cristina de Sousa Chaves, que me abriu pela primeira vez os horizontes

para a pesquisa e me mostrou o mundo da Parasitologia.

Ao Dr. Thomas George Evans, que me ensinou a trabalhar com o conhecimento

científico.

Ao Prof. Vietla Satyanarayana Rao e Flávia Almeida Santos, que me deram a

inspiração para trabalhar com o princípio ativo lapachol, pela inestimável colaboração no

decorrer deste trabalho.

Ao Prof. Said Fonseca pelo fornecimento de parte do material estudado e

disponibilidade em me intermediar com o laboratório LAFEPE.

Ao Prof. Francisco Abreu Matos pelo fornecimento de parte do material aqui

estudado, valiosas sugestões, esclarecimentos e colaboração no decorrer dos experimentos.

Ao Dr. Ivo Castelo Branco Coêlho, Coordenador do Núcleo de Medicina Tropical,

pelo apoio imensurável e confiança depositada no meu trabalho.

Aos Profs. Antônio Wilson Vasconcelos e Izabel de Alencar Barros Vasconcelos

pela inestímavel amizade e incentivo na carreira científica.

Às adoráveis amigas Geanne Matos de Andrade Cunha, Maria Isabel MacAullife

e Maria do Carmo Nunes de Pinho pelo suporte e amizade durante o desenvolvimento

deste trabalho.

À Lurdemiler Sabóia Mota e Falba Bernadete dos Anjos pela prestimosa

orientação e ajuda nos experimentos de neurotoxicidade.

vi

À Paula da Paz Palácio, da pós-graduação, pela eficiência no atendimento e na

resolução dos problemas.

À amiga bibliotecária Veronice Souza de Oliveira pelo trabalho de revisão

bibliográfica, estímulo e colaboração, além de sua valiosa amizade.

Um especial agradecimento ao amigo Haroldo Sérgio da Silva Bezerra pelo apoio,

incentivo, amizade e incontáveis horas de alegres e proveitosas discussões.

Ao amigo Eddie William de Pinho Santana pela inestimável colaboração na

digitalização das imagens deste trabalho.

Também agradeço aos demais professores, colegas e funcionários do Departamento

de Patologia e Medicina Legal, bem como aos funcionários do Núcleo de Medicina

Tropical J.E.A., pelo ambiente de cooperação, estímulo e amizade.

Carinhosamente, o meu mais sincero agradecimento aos amigos e colaboradores:

Maria Claúdia C. Façanha, Joseval da Rocha Viana, Joana Gurgel Holanda Filha,

Tatiana Paschoalette Rodrigues, José Rômulo Cavalcante Prata Junior, Herivaldo

Lima Costa e Adriana Pereira do Nascimento, a minha maravilhosa equipe que tornou

possível a realização deste trabalho.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS À minha mãe, Luizinha, e irmãos, Ademir, Rosa Maria, Rosinéa, Adriana Luiza,

Doris e Maria Bernadete que sempre me incentivaram e acreditaram na minha

capacidade.

À Profª. Margarida Maria de Lima Pompeu, co-orientadora deste trabalho, minha

mentora científica, que me tem dado suporte e amizade nos momentos mais difícies desse

meu longo aprendizado científico e que é um exemplo de abnegação pela pesquisa e

ensino.

vii

ÍNDICE

Lista de Tabelas ............................................................................................................. x

Lista de Figuras ............................................................................................................. xi

Resumo .......................................................................................................................... xiii

Abstract .......................................................................................................................... xiv

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1

1.1 Considerações gerais ........................................................................................... 1

1.2 Leishmaniose tegumentar .................................................................................... 3

1.2.1 Breve histórico .......................................................................................... 3

1.2.2 Aspectos clínico-epidemiológicos ............................................................ 5

1.2.3 Tratamento ................................................................................................ 8

1.3 Plantas medicinais ............................................................................................... 13

1.3.1 Generalidades ............................................................................................ 13

1.3.2 Uso de plantas medicinais na leishmaniose .............................................. 15

1.4 Timol .................................................................................................................... 18

1.5 Lapachol ............................................................................................................... 20

1.6 Objetivos .............................................................................................................. 24

2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 25

2.1 Substâncias avaliadas .......................................................................................... 25

2.2 Preparo e solubilização das susbtâncias .............................................................. 25

2.3 Meios de cultura .................................................................................................. 25

2.4 Parasitas .............................................................................................................. 26

2.5 Ensaios in vitro ................................................................................................... 26

2.5.1 Purificação de macrófagos ....................................................................... 26

2.5.2 Citotoxicidade em macrófagos ................................................................. 26

2.5.3 Avaliação da atividade anti-amastigota .................................................... 27

viii

2.6 Ensaios in vivo .................................................................................................... 28

2.6.1 Animais experimentais ............................................................................. 28

2.6.2 Infecção experimental .............................................................................. 28

2.6.3 Tratamento com timol .............................................................................. 28

2.6.4 Tratamento com lapachol ......................................................................... 28

2.6.5 Avaliação do efeito terapêutico ............................................................... 29

2.6.6 Estudo histopatológico ............................................................................ 29

2.7 Análise estatística dos dados .............................................................................. 29

3 RESULTADOS ........................................................................................................ 30

3.1 Ensaios in vitro .................................................................................................. 30

3.2 Ensaio in vivo com timol ................................................................................... 32

3.3 Ensaio in vivo com lapachol e sua associação com Pentostam® ...................... 34

3.4 Achados histopatológicos .................................................................................. 38

3.4.1 Alterações no linfonodo de drenagem da lesão ...................................... 38

3.4.2 Alterações no baço .................................................................................. 40

4 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 45

5 CONCLUSÕES ....................................................................................................... 55

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 57

ix

LISTA DE TABELAS

TABELA PÁGINA

1 - Plantas medicinais com atividade leishmanicida ....................................................... 16

2 - Efeito citotóxico do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes (Pentostam® e

Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos ................................................. 30

3 - Efeito leishmanicida in vitro do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes

(Pentostam® e Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos infectados com

Leishmania (Viannia) braziliensis ........................................................................... 31

4 - Avaliação do efeito do tratamento com timol (14mg/kg/dia), administrado por 42 dias,

via I.M., em hamsters (n = 6) infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis... 33

5 - Avaliação do efeito do tratamento oral por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) ou sua

associação com Pentostam® (60mg/kg/dia) em hamsters (n = 8) infectados com

Leishmania (Viannia) braziliensis........................................................................... 36

6 – Alteração ponderal dos animais durante o tratamento oral por 42 dias com lapachol

(300mg/kg/dia) ou sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia) ....................... 36

7 - Percentagem de animais com lesões ulceradas durante o curso da infecção por

Leishmania (Viannia) braziliensis e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia)

ou sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia)................................................. 38

x

LISTA DE FIGURAS

FIGURA PÁGINA

1 - Estrutura química do timol ...................................................................................... 18

2 - Estrutura química do lapachol ................................................................................. 21

3 - Efeito leishmanicida in vitro do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes

(Pentostam® e Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos infectados

com Leishmania (Viannia) braziliensis.................................................................. 32

4 - Efeito do tratamento I.M. com timol (14mg/kg/dia) em hamsters (n = 6) infectados

com Leishmania (Viannia) braziliensis.................................................................. 33

5 - Efeito do tratamento oral com lapachol (300mg/kg/dia) ou da sua associação com

Pentostam® (60mg/kg/dia) em hamsters (n = 8) infectados com Leishmania

(Viannia) braziliensis ............................................................................................. 34

6 - Carga parasitária no linfonodo de drenagem da pata de hamsters infectados por

Leishmania (Viannia) braziliensis ao final de 42 dias de tratamento oral com

lapachol (300mg/kg/dia) associado ou não ao Pentostam® (60mg/kg/dia) .......... 35

7A - Peso relativo do linfonodo de drenagem de hamsters infectados com Leishmania

(Viannia) braziliensis e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) associado

ou não ao Pentostam® (60mg/kg/dia) ................................................................. 37

7B - Peso relativo do baço de hamsters infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis

e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) associado ou não ao Pentostam®

(60mg/kg/dia) ......................................................................................................... 37

7C - Peso relativo do fígado de hamsters infectados com Leishmania (Viannia)

braziliensis e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) associado ou não

ao Pentostam® (60mg/kg/dia) ............................................................................... 37

8A - Linfonodo de controle não tratado. Intensa histiocitose sinusal e parenquimal, sem

formação de granulomas. HE, 40x. ....................................................................... 41

8B – Maior aumento da Fig. 8A. HE, 100x. ................................................................... 41

xi

9 - Linfonodo de controle não tratado. Macrófagos vacuolados, volumosos e parasitados.

HE, 400x. ............................................................................................................... 41

10A – Linfonodo de controle não tratado. Intensa hiperplasia folicular. HE, 40x. ...... 42

10B - Hiperplasia folicular em destaque. HE, 100x. .................................................... 42

11 – Linfonodo de controle não tratado mostrando intensa plasmocitose. HE, 400x. .. 42

12A – Linfonodo de hamster tratado com lapachol. Extensas áreas de necrose e apoptose

com acentuada hipoplasia folicular. HE, 40x ...................................................... 43

12B – Detalhe da Fig. 12A. HE, 100x. ......................................................................... 43

12C – Linfonodo. Amastigotas parasitando macrófagos. HE, 1000x. .......................... 43

13 – Linfonodo de hamster tratado com antimonial. Histiocitose, hiperplasia folicular e

plasmocitose discretas. HE, 40x. .......................................................................... 44

14A – Baço de controle não tratado. Marcante hipoplasia de polpa branca. HE, 40x. .. 44

14B – Maior aumento da Fig. 14A. Macrófagos intensamente vacuolados e volumosos.

HE, 100x ................................................................................................................ 44

xii

RESUMO

Os antimoniais, drogas de escolha no tratamento da leishmaniose, apresentam bons

resultados, porém com vários efeitos colaterais e registros de resistência. Nos últimos anos,

vem ocorrendo um aumento na busca por novas drogas antiparasitárias a partir de

extrações de plantas. Este trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito leishmanicida in vitro

e in vivo, de duas substâncias isoladas de plantas medicinais, timol e lapachol, em relação

aos antimoniais. Bem como comparar os resultados obtidos in vitro com a resposta

terapêutica in vivo. As drogas, em concentrações que variaram de 0,008 a 4,0mg/ml, foram

avaliadas contra amastigotas intracelulares de Leishmania (Viannia) braziliensis (LVb) in

vitro e, em seguida, testadas em um modelo animal susceptível (hamster) para confirmar a

ação leishmanicida. In vitro, ambos, timol e lapachol, apresentaram efeito anti-amastigota,

entretanto, in vivo, não foram capazes de conter o desenvolvimento de lesões por LVb, nas

concentrações de 14mg/kg/dia/i.m e 300mg/kg/dia/v.o, respectivamente. Tais resultados

sugerem que possam ser convertidas em metabólitos inativos ou neutralizadas, perdendo

sua ação leishmanicida. Os antimoniais apresentaram significante efeito anti-amastigota

para LVb in vitro, entretanto, in vivo, apesar da aparente cura clínica, estas drogas

(60mg/kg/dia) não foram capazes de erradicar os parasitas dos tecidos. Na histopatologia,

foi visto que lapachol induziu intensa necrose e apoptose no linfonodo, no entanto, não

reduziu a carga parasitária neste sítio. Encontramos ainda que, baço e linfonodo respondem

de maneira diferente à infecção por Leishmania, uma vez que no baço ocorreu hipoplasia

da polpa branca e no linfonodo, hiperplasia folicular. A leishmaniose tegumentar por LVb,

no hamster, apresentou um padrão de infecção não resolutivo, com linfadenopatia,

hepatoesplenomegalia, perda de peso e ausência de granulomas no linfonodo e baço. Como

a ação das drogas não foi semelhante nos modelos in vitro e in vivo utilizados, o modelo in

vivo parece refletir melhor o potencial terapêutico das drogas, sendo, portanto, mais

adequado à triagem de novas substâncias para o tratamento da leishmaniose.

xiii

ABSTRACT

Antimonials, drugs of choice for the treatment of leishmaniasis, provide good

results but have side effects and cases of resistance have been reported. In recent years,

there has been an increase in the search for new antiparasitic drugs developed from plants

extracts. This study aims to evaluate the leishmanicidal effects, both in vitro and in vivo, of

two chemicals isolated from medicinal plants, tymol and lapachol, and compare that effect

with the one obtained by antimonials. As well as to compare the results obtained in vitro

with the therapeutical response in vivo. These compounds (0,008 to 4,0mg/ml) were

evaluated in vitro against intracellular amastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis

(LVb), then tested in an animal model (hamster) to confirm the leishmanicidal activity. In

vitro, both tymol and lapachol, exhibited an anti-amastigote effect whereas in vivo these

substances were not able to stop the development of LVb-induced lesions in the

concentrations of 14mg/kg/day/i.m and 300mg/kg/day/p.o, respectively. These results

suggest that they might be getting transformed into non-active metabolite(s) or is

neutralized, losing their leishmanicidal activity. The antimonials demonstrated efficacy in

vitro as well in vivo. But, in spite of presenting a significant anti-amastigote effect in vitro

for LVb and apparent clinical cure in vivo, these drugs (60mg/kg/day/i.m) could not

completely eradicate the parasites from the tissues of LVb-infected animals. In the

histopathological findings disclosed that, lapachol induced a severe lymph node necrosis

and apoptosis, although it didn’t reduce the parasitic load in that site. We also found out

the spleen and lymph node respond differently to Leishmania infection, since in the spleen

an intense withe pulp hypoplasia occurred whereas in the lymph node a remarkable

follicular hyperplasia was the rule. LVb-induced tegumentary leishmaniasis in the hamster,

showed an unresolved pattern of infection, characterized by lymphadenopathy,

hepatosplenomegaly, weight loss and absence of granulomas in the lymph node and spleen.

Since the effect of the substances was not similar in the two models studied, in vitro and in

vivo, the in vivo model appears to better reflect the therapeutic potencial of the drugs,

therefore being more adequate for the screening of new substances for the treatment of

leishmaniasis.

xiv

1. INTRODUÇÃO 1.1. Considerações gerais

leishmaniose tegumentar (LT) é um problema de saúde pública de

considerável magnitude na América do Sul, estando incluida entre as seis

mais importantes doenças infectoparasitárias do mundo, não somente por

sua frequência, mas, principalmente, devido as mutilações que pode causar,

comprometendo o estado geral do paciente, bem como dificultando sua integração social,

com sérias repercussões psicológicas.

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), as leishmanioses afetam cerca

de 12 milhões de pessoas no mundo, com 350 milhões vivendo em áreas de risco e

aproximadamente 2 milhões de casos novos por ano (1-1,5 milhões de casos de

leishmaniose cutânea e 500 000 de leishmaniose visceral) (World Health Organization,

[online] 1998). Um estudo prospectivo realizado em região endêmica de leishmaniose

cutânea, no Brasil, causada por Leishmania braziliensis, revelou uma incidência anual de

8.1 casos para 1.000 indivíduos, constituindo-se em uma das mais importantes endemias

do país (Jones et al., 1987). No Ceará, a incidência de LT é elevada, em 1998 foram

registrados 20,2 casos novos para 100.000 habitantes (Ministério da Saúde, 1999).

A leishmaniose tegumentar distribui-se amplamente em todos os continentes, com

exceção da Oceania. São 88 países afetados (22 no Novo Mundo e 66 no Velho Mundo),

concentrados principalmente nas regiões tropicais. É endêmica na América do Sul e

Central, tendo Brasil e Peru como os países onde a doença é mais prevalente (WHO,

[online] 1998). Focos de leishmaniose cutânea difusa têm sido identificados na República

Dominicana e casos autóctones de LT têm sido reportados no Texas, deixando Uruguai,

Chile e Canadá como os únicos países nas Américas onde a doença ainda não foi

encontrada (Pearson & Sousa, 1995).

No Brasil, a distribuição geográfica de LT é ampla e, com exceção do Rio Grande do

Sul, a doença tem sido registrada em todo o território nacional. Dados da Fundação

Nacional de Saúde (FNS) mostram que cerca de 50% dos casos registrados no país

A

2

procedem da região Nordeste, sendo que os maiores focos endêmicos são encontrados nos

estados da Bahia, Maranhão e Ceará. Somente no período de abril a junho de 1997, o

estado do Ceará foi responsável por cerca de 14% dos casos de LT da região, percentual

este que pode está aquém da realidade, devido as subnotificações (FNS/MS, 1997).

A diversidade do espectro clínico da doença parece depender, dentre outras coisas,

da resposta imunológica do hospedeiro, do tropismo e virulência do parasita envolvido. A

manifestação clínica mais comum da LT é caracterizada por lesões crônicas que podem ou

não regredir espontaneamente. A leishmaniose cutâneo-mucosa (ou espúndia) é a forma

mais grave, podendo causar severa destruição das mucosas e estruturas do orofaringe e

apresentando significante morbidade. Uma manifestação rara da doença, na maioria das

vezes refratária aos tratamentos, é a forma difusa, caracterizada por lesões múltiplas não

ulceradas, que contém um grande número de parasitas.

Há mais de 50 anos os antimoniais pentavalentes têm sido as drogas de escolha no

tratamento da leishmaniose, com bons resultados, no entanto, são observados vários efeitos

colaterais e existem alguns registros de casos de resistência (Olliaro & Bryceson, 1993).

Na ocorrência de falha terapêutica, as drogas de segunda escolha são anfotericina B e

isotionato de pentamidina, mas ambas também demandam aplicação por via parenteral e

exibem apreciável toxicidade (Berman, 1997). Apesar das diversas tentativas na pesquisa

de novos agentes terapêuticos para o tratamento da leishmaniose, até o momento nenhuma

outra droga mostrou possuir eficácia comprovada (Berman, 1997). Considerando que a

terapêutica da leishmaniose pouco evoluiu, torna-se necessário a descoberta de novos

medicamentos, que apresentem menor toxicidade e que sejam preferencialmente utilizados

por via oral, adequando-se mais facilmente às condições das áreas endêmicas.

Plantas com atividades medicinais sempre foram usadas para o tratamento da

leishmaniose cutânea pelas populações rurais (Fournet et al. 1994a; França et al., 1996) e a

cada dia têm despertado mais o interesse da comunidade científica. Com o surgimento dos

medicamentos químicos, as ervas foram sendo colocadas de lado, principalmente no

ocidente, mas hoje, devido ao conhecimento dos efeitos colaterais adversos de boa parte

dos medicamentos sintéticos, vem-se buscando, nas plantas medicinais, uma alternativa

para a cura das mais diversas doenças. Em 1978, a OMS determinou o início de um

programa mundial com o fim de avaliar e utilizar os métodos da medicina popular e, desde

3

então, vem estimulando o uso racional das plantas medicinais em países pobres e em

desenvolvimento (WHO, 1991). Ainda hoje as substâncias naturais, seus derivados e

análogos, representam cerca de 50% de todas as drogas medicinais, e é importante salientar

que aproximadamente 25% destas são obtidas de plantas superiores (Balandrin et al.,

1993).

No Brasil, em 1995, o consumo de medicamentos caiu muito. Uma pesquisa feita

para levantar as causas desta queda mostrou que das 400 famílias pesquisadas, 91,9% se

automedicavam com ervas e 46,6% as cultivavam nos quintais. Dados da Associação

Brasileira da Indústria Farmacêutica apontam que as vendas de medicamentos sintéticos

cresceram 16% naquele ano, enquanto o consumo de fitoterápicos subiu 20% (Oka &

Roperto, [online] 1998).

As plantas têm sido ao longo dos tempos fontes potenciais para o desenvolvimento

de novas drogas por terem uma complexa composição e demonstrarem uma grande

variedade de ações farmacológicas.

1.2. Leishmaniose tegumentar

1.2.1. Breve histórico

leishmaniose tegumentar (LT) é conhecida há milênios, encontrando-se

referências a ela nos textos bíblicos e nos manuscritos orientais. A doença

parece ser autóctone do continente americano, pois já era retratada através

de figuras com mutilações dos lábios e do nariz e em vasos de cerâmica feitos pelos Incas,

do Peru, no período pré-hispânico. Essa representação inequívoca da leishmaniose

cutâneo-mucosa, ou “espúndia”, denominação da doença naquele país, vem corroborar a

hipótese da sua existência nas Américas (Pessôa & Martins, 1982).

Os parasitas do gênero Leishmania Ross, 1903 (Protozoa: Trypanosomatidae) foram

vistos pela primeira vez em 1885, por Cunningham, na Índia, em indivíduos com

leishmaniose visceral (Calazar). Em 1895, Breda, na Itália, já descrevia minuciosamente

lesões laringo-traqueais em italianos que haviam morado no estado de São Paulo e voltado

para sua Pátria. No entanto, as primeiras observações e a primeira descrição detalhada do

A

4

agente etiológico da leishmaniose foram feitas por Borovsky em 1898, na Rússia, em um

paciente com a forma cutânea da doença (Pessôa & Martins, 1982). Em 1903, Leishman e

Donovan, independentes um do outro, e desconhecendo os trabalhos de Borovsky,

descreveram os mesmos “corpúsculos” relatados pelo cientista russo. Nesse mesmo ano,

Ross criou o nome genérico de Leishmania para os organismos descritos por Leishman e

Donovan. Ainda em 1903, em Boston, EUA, Wright isolou o parasita de uma criança

armênia com leishmaniose cutânea, chamando-o de Leishmania tropica (Rey, 1991). Em

1906, Seldelin encontrou o parasita em esfregaços tirados de doentes portadores de

“úlceras de los chicleros” na península de Yucatan, no México, e em 1911, Splendore

conseguiu isolar parasitas das lesões mucosas (Marsden & Zamith, 1982).

No Brasil, a doença já era conhecida desde o início do século passado. Moreira, em

1885 e Cerqueira, em 1895, diagnosticaram, na Bahia, lesões cutâneas clinicamente

idênticas ao botão de Biskra (botão-do-oriente), uma das muitas denominações da forma

cutânea do Velho Mundo. Em 1909, Lindenberg, mais tarde confirmado por Carini e

Paranhos, conseguiu demonstrar a presença dos parasitas nas lesões de pacientes com a

então chamada “úlcera de Bauru”, considerando-os idênticos à L. tropica responsável pela

leishmaniose cutânea do Oriente (Marsden & Zamith, 1982; Rey, 1991). Em 1911, Gaspar

Vianna, julgando que o agente etiológico da leishmaniose cutâneo-mucosa era

morfologicamente diferente da L. tropica, criou uma espécie distinta, a L. braziliensis

(Marsden & Zamith, 1982).

Com relação a epidemiologia, em 1905, Sergent & Sergent sugeriram pela primeira

vez que a leishmaniose cutânea fosse transmitida por insetos do gênero Phlebotomus

(Pessôa & Martins, 1982), no entanto, as primeiras contribuições epidemiológicas sobre a

doença só vieram em 1913, com Brumpt & Pedroso. Eles a denominaram de “leishmaniose

americana das florestas”, já que a sua transmissão tinha relação direta com o ambiente

silvestre. Em 1957, Hertig demonstrou pela primeira vez a infecção em roedores silvestres,

no Panamá, e em 1960, Foratinni encontrou animais parasitados em áreas florestais do

estado de São Paulo (Falqueto & Sessa, 1996).

5

Ao longo dos anos, seguiram-se outras descobertas importantes que contribuiram

para um melhor entendimento da doença, definição do quadro epidemiológico, tratamento

e medidas de controle. 1.2.2. Aspectos clínico-epidemiológicos

leishmaniose tegumentar é causada por protozoário do gênero Leishmania

Ross, 1903 (ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae),

pertencendo a dois subgêneros, Viannia Lainson & Shaw, 1987 e

Leishmania Saf’janova, 1982. Pode ocorrer sob duas formas evolutivas: a forma flagelada,

extracelular, denominada promastigota, encontrada no trato digestivo dos flebotomíneos

vetores; e a forma amastigota, intracelular, encontrada predominantemente parasitando

células do sistema fagócito-mononuclear dos hospedeiros mamíferos (Rey, 1991).

As espécies que causam LT no Velho Mundo são Leishmania (Leishmania) major

Yakimoff & Schokhor, 1914, L. (L.) tropica Wright, 1903 e L. (L.) aethiopica Bray,

Ashford & Bray, 1973; enquanto no Novo Mundo, as várias espécies de Leishmania

podem ser classificadas taxonomicamente segundo os critérios de Lainson & Shaw (1987)

acrescidas de espécies descritas posteriormente por outros autores (Lainson et al, 1994). As

espécies responsáveis pela doença no Novo Mundo estão agrupadas em dois complexos:

“Leishmania braziliensis” e “Leishmania mexicana” Lainson & Shaw, 1972. Dentro do

complexo “Leishmania braziliensis”, subgênero Viannia, estão as espécies Leishmania

(Viannia) braziliensis Vianna, 1911 emend Matta, 1916, L. (V.) guyanensis Floch, 1954, L

(V.) peruviana Velez, 1913 e L. (V.) panamensis Lainson & Shaw, 1972. As outras

espécies, L.(L.) amazonensis Lainson & Shaw, 1972, L. (L.) mexicana Biagi, 1953 emend

Garnham, 1962, L. (L.) venezuelensis Bonfante-Garrido, 1980, L. (L.) garnhami Scorza et.

al., 1979 e L. (L.) pifanoi Medina & Romero, 1959 emend Medina & Romero, 1962, fazem

parte do complexo “Leishmania mexicana”, subgênero Leishmania. No Brasil, as espécies

que têm sido encontradas com mais frequência parasitando o homem são L. (L.)

amazonensis, L. (V.) braziliensis e L. (V.) guyanensis. Além destas, outras três espécies

têm sido apontadas como causadoras de leishmaniose na região amazônica do Brasil: L.

(V.) lainsoni Silveira et al., 1987, L. (V.) shawi Lainson et al., 1989 e L. (V.) naiffi Lainson

A

6

& Shaw, 1989 (Lainson & Shaw, 1992). No Ceará, a espécie causadora da LT foi

caracterizada por Vasconcelos et. al. (1988) como L. (V.) braziliensis.

Cada espécie de parasita é usualmente responsável por uma forma da doença em

humanos, entretanto, infecção mista determinada por duas espécies diferentes de

Leishmania pode ocorrer apesar de esse fato ser incomum (Silveira et al.,1984; Barral et

al., 1986).

O modo de transmissão habitual da doença ocorre sempre por meio da picada de

espécies fêmeas de insetos da subfamília Phlebotominae, os flebótomos, pertencentes a

diferentes gêneros: Lutzomyia (Novo Mundo) ou Phlebotomus (Velho Mundo). Destes,

somente as fêmeas são hematófagas e, ao realizarem repasto sanguíneo em mamíferos

infectados, ingerem as formas amastigotas, que no seu tubo digestivo evoluem para as

formas infectantes, as promastigotas metacíclicas (Rey, 1991). Quando o inseto volta a se

alimentar em hospedeiro susceptível, as formas promastigotas são regurgitadas e

introduzidas através da picada, juntamente com a saliva do vetor, que parece ter papel

importante na sobrevida do parasita, no início da infecção (Titus & Ribeiro, 1988). Em

seguida, as promastigotas invadem macrófagos e células de Langerhans da epiderme, onde

se transformam em amastigotas, e dentro do fagolisossoma são capazes de sobreviver e se

multiplicar (Pearson et al., 1983; Blank et al., 1993). Os parasitas podem continuar na pele

em um curso crônico ou, provavelmente serem carreados por células de Langerhans (Moll

et al., 1993), e se disseminarem para órgãos do sistema fagocíto-mononuclear, pelas vias

sanguíneas e, ou linfáticas (Bowdre et al., 1981; Nuwayri-Salti et al., 1992; Moraes et al.,

1993). Esse mecanismo explicaria a ocorrência de casos com numerosas lesões cutâneas,

como ocorre na forma disseminada, e o aparecimento de lesões mucosas, em regra,

secundárias às cutâneas, como se verificam nas infecções por L. amazonensis, L.

braziliensis e L. guyanensis (Azambuja et al., 1985). A documentação de amastigotas de

Leishmania nos linfonodos, antes de qualquer evidência clínica da doença cutânea, pode

indicar que a disseminação do parasita da pele para estes ocorre antes do desenvolvimento

da lesão local (Moraes et al., 1993; Ardehali et al., 1995).

Clinicamente, a LT apresenta-se de maneira variada, desde as formas inaparentes

ou com ulcerações de pele, que podem ser discretas ou extensas e com evolução

espontânea para cura após alguns meses, até aquelas com ulcerações múltiplas ou

7

disseminadas. A forma clínica mais frequente da doença é a leishmaniose cutânea

localizada, que se caracteriza por lesões ulceradas, de bordos elevados e circulares, com

pouca secreção e indolores, localizadas na parte exposta do corpo onde os flebotótomos

inoculam as promastigotas. Estas podem ou não regredir espontaneamente (Costa et al.,

1990; Convit et al., 1993; Pearson & Sousa, 1995). A forma disseminada é caracterizada

por úlceras típicas associadas a inúmeras lesões papulares ou acneiformes, decorrentes de

disseminação hematogênica, podendo, por contiguidade comprometer a mucosa (Costa et

al, 1986; Carvalho et al., 1994). A leishmaniose difusa, síndrome relativamente incomum,

tem como lesão inicial uma pápula localizada e desta se dissemina por todo o tegumento,

com lesões nodulares não ulceradas e deformantes, onde se observa extraordinária riqueza

parasitária, com tendência à cronicidade (Convit et al, 1972; Llanos Cuentas et al., 1984;

Pearson & Sousa, 1995). Esta é uma variante anérgica da leishmaniose cutânea e o

tratamento é muito pouco eficaz. A forma mais grave do espectro clínico é a mucocutânea

(ou espúndia), que apresenta significante morbidade, tendo início com uma simples úlcera

na pele que pode desaparecer em pouco tempo, e, após alguns meses ou anos, novas lesões

surgem na mucosa nasal. Essas lesões aumentam progressivamente, comprometendo as

mucosas do nasorofaringe, podendo ocorrer destruição do septo nasal e áreas vizinhas,

levando a um quadro bastante desfigurante e com complicações secundárias como as

infecções bacterianas, que podem evoluir de maneira fatal. Paradoxalmente, essas lesões

mucosas contém um número bastante reduzido de parasitas (Azambuja et al., 1985;

Pearson & Sousa, 1995). Acredita-se que os possíveis fatores de risco para a leishmaniose

mucocutânea são a presença de múltiplas lesões cutâneas por L. (V.) braziliensis na

infecção primária e tratamento incompleto ou inadequado (Marsden, 1986). Recentemente,

uma variante dita bubônica, causada por L. (V.) braziliensis, tem sido descrita nos estados

do Ceará e da Bahia, sendo caracterizada por linfonodos satélites hipertrofiados em

associação com lesões cutâneas ulceradas (Sousa et al, 1995; Barral et al, 1992; 1995).

Existem evidências sugerindo que a infecção por L. (V.) braziliensis pode persistir

indefinidamente no hospedeiro humano (Saraiva et al., 1990; Guevara et al., 1993;

Delgado et al., 1996), o que poderia explicar, nos últimos anos, o surgimento da

leishmaniose como uma das infecções oportunistas em pessoas com doenças neoplásicas,

infecção pelo vírus HIV, transplantadas e em associação com outras condições nas quais a

imunidade celular está comprometida (Bouree & Belec, 1993; Venencie et al., 1993;

Nicolas et al., 1995).

8

Apesar dos inúmeros avanços que se têm conseguido no entendimento da imunologia

das leishmanioses e na tentativa de se desenvolver uma vacina, não há ainda nenhuma

forma efetiva de imunoprofilaxia. Até agora, o controle da doença tem se baseado em

medidas profiláticas de combate ao vetor e cães infectados, no caso do Calazar, assim

como em medidas terapêuticas de tratamento de pessoas infectadas com os medicamentos

disponíveis no mercado.

1.2.4. Tratamento

o passado, foram testados vários tratamentos para a leishmaniose, tendo-

se utilizado quinino, injeção de aguarrás (essência de terebintina),

arsenicais e atebrina, todos com resultados diversos, mas nenhum deles

realmente efetivo (Rees et al., 1985). O grande achado foi o advento do uso dos

antimoniais. No início do século XX, o médico Gaspar Vianna usou pela primeira vez

tártaro emético (tartarato duplo de potássio e antimônio) para tratar com sucesso um caso

de leishmaniose mucocutânea (Vianna, 1912) e desde então, os antimoniais vêm sendo

utilizados como as drogas de escolha para o tratamento da leishmaniose. Inicialmente eram

usados na forma de sais trivalentes (SbIII), como o tártaro emético e o tartarato antimonial

de sódio, mas a partir da década de 20, surgiram antimonais pentavalentes (SbV), como a

uréia-estibamina e a etil-estibamina. Depois, vieram outros antimoniais pentavalentes

menos tóxicos que são utilizados até hoje: o estibogluconato de sódio, Pentostam®, que

passou a ser fabricado e usado entre 1935 e 1945 e o antimoniato de meglumina,

Glucantime®, testado pela primeira vez em 1946 (Berman, 1988). Pentostam® é

amplamente usado nos países de língua inglesa, incluindo os Estados Unidos, enquanto

Glucantime® é usado nos países da América Latina e demais países de língua não-inglesa,

inclusive no Brasil. Recentemente, o uso de Glucantime® no Brasil tem sido substituído

por um estibogluconato de sódio, de fabricação chinesa, mas este tem se mostrado mais

tóxico que o antimoniato de meglumina e menos eficaz (Hueb, 1997).

Os antimoniais ainda são as drogas mais recomendadas no tratamento das diversas

formas de leishmaniose, com comprovada eficácia e algumas vantagens, como a rápida

eliminação renal e a limitada acumulação nos tecidos (Berman, 1988; Koff & Rosen, 1994;

Berman, 1997). Contudo, apresentam vários inconvenientes, tais como: a via de aplicação,

N

9

que é intramuscular ou endovenosa e a ocorrência de falhas terapêuticas na forma mucosa.

Além disso, são drogas que precisam ser administradas diariamente por longos períodos, o

que as vezes requer hospitalização, acarretando desconforto para o doente e alto custo para

a União. Os antimoniais vêm também mostrando uma taxa crescente de ineficácia ao longo

dos anos (Ercoli, 1966; Belazzoug & Neal, 1985; WHO, TDR News, 1990; Berman,

1997), em parte devido ao surgimento de algumas cepas resistentes à droga (Olliaro &

Bryceson, 1993). Essas drogas apresentam ainda efeitos colaterais sérios, que se traduzem

em: toxicidade cardíaca, alterações de intervalo ST no eletrocardiograma, arritmias

(Mainzer & Krause, 1940; Berman, 1988; Hepburn et al., 1994), trombocitopenia

(Hepburn, 1993), alterações de enzimas hepáticas, artralgias, mialgias, naúseas e vômitos

(Berman, 1988; Tracy & Webster, 1996). São ainda relatados casos de pancreatite (Gasser

et al., 1994) e até mesmo morte súbita em pacientes que receberam altas doses do

medicamento (Pearson & Sousa, 1995). Mais recentemente, surgiram indícios de que essas

drogas podem induzir mutagênese (Léonard & Gerber, 1996).

O tratamento alternativo tem sido feito com anfotericina B ou isotionato de

pentamidina, no entanto, ambos também apresentam a inconveniência da via de

administração, intramuscular ou endovenosa, além de uma toxicidade intolerável nas doses

terapêuticas eficazes e ainda o alto custo. No tratamento com pentamidina podem aparecer

efeitos tóxicos como hipotensão, astenia, dispnéia, dor de cabeça, sudorese e sensação de

formigamento, vômitos e dores epigástricas. Além disso, podem surgir lesões hepáticas,

pancreáticas, renais e do sistema nervoso (Sands et al., 1985). Em relação a anfotericina B,

os efeitos colaterais mais observados são: anorexia, náuseas e vômitos, febre, calafrios,

elevação da uréia e creatinina no sangue e anemia, podendo ainda ocorrer tromboflebite

localizada no sítio de aplicação (Bennett, 1996).

Muitos agentes sistêmicos como metronidazol, tuberculostáticos (rifampina e

isoniazida), pamoato de cicloguanil, nitrofuranos (nifurtimox), sulfametoxazol-trimetoprim

e dapsona, já foram testados no tratamento da LT nos anos 60, 70 e 80, com eficácia

variada e por essa razão nunca foi possível recomendá-los para tratamento de rotina

(Berman, 1988). Outras drogas alternativas utilizadas por via oral continuam sendo

testadas, sozinhas ou associadas com antimoniais, no entanto, ainda apresentam resultados

que precisam ser melhor avaliados. O cetoconazol parece ser efetivo no tratamento da

maioria dos indivíduos com L. mexicana e L. major, mas falhas terapêuticas têm sido

10

comuns em pacientes com L. braziliensis, L. tropica e L. aethiopica (Navin et al, 1992;

Singh et al., 1995; Alsaleh et al., 1995). Para a forma cutânea, causada por L. tropica,

alguns estudos com itraconazol demonstraram perspectivas promissoras (Van den Enden et

al., 1994; Koff & Rosen, 1995; Dogra & Saxena, 1996), no entanto, Momeni et al. (1996)

mostraram-na ineficaz no tratamento de lesões causadas por L. major. O alopurinol vem

sendo utilizado no tratamento da leishmaniose há mais de 15 anos, principalmente na

leishmaniose visceral, contudo, até o momento a sua eficácia para tratar lesões cutâneas

não foi confirmada (Herwaldt et al., 1992; Velez et al., 1997; D’Oliveira Jr. et al., 1997).

Alguns estudos não controlados demonstraram que alopurinol teve mais sucesso quando

combinado com antimoniato de meglumina (Glucantime®), aumentando desta forma a

eficácia do antimonial (Llanos-Cuentas et al., 1997; Martinez et al., 1997). Recentemente

foi tentado o tratamento da leishmaniose mucosa com sulfato de aminosidina, mas os

resultados obtidos durante dois anos de seguimento mostraram que a eficácia da droga

(com uma série de 20 dias) é baixa (33,3%), sendo indicado o acompanhamento

prolongado dos pacientes, pela possibilidade de recidiva (Romero et al., 1998).

Sampaio & Marsden (1997) mostraram, pela primeira vez, que anfotericina B

lipossomal apresentava-se eficaz no tratamento da forma muco-cutânea da LT, com

excelente tolerabilidade. Além dessa indicação, a droga tem sido utilizada com sucesso em

casos de LT onde o parasita mostra-se resistente aos antimoniais (Torre-Cisneros et al.,

1994), mas, infelizmente, é um medicamento ainda muito caro e não disponível

comercialmente. As outras formulações lípidicas da anfotericina B (dispersão coloidal e

complexo lipídico) têm apresentado sucesso na terapia da leishmaniose visceral (Chance,

1995; Berman, 1997), contudo, mais recentemente, não se mostraram eficientes no

tratamento de leishmaniose cutânea (Wortmann et al., 1998). Além destas, outras drogas

como certas pirazolopirimidinas e a 8-aminoquinolina WR6026 vêm sendo testadas

(Berman, 1997). Esta última, no entanto, tem se mostrado mais efetiva para o tratamento

da forma visceral causada por Leishmania donovani (Velho Mundo) do que para as formas

cutâneas (Sherwood et al., 1994).

O tratamento local também tem sido utilizado, mostrando-se uma alternativa atrativa

pelo fato de poder ser feito, algumas vezes, pelo próprio paciente e ter uma toxicidade

sistêmica essencialmente menor. Algumas técnicas físicas como cauterização, irradiação

local e congelamento já foram usadas, mas não são recomendadas por não surtirem

11

nenhum efeito benéfico (Cook, 1993). Outros tratamentos locais são citados na literatura,

entre eles: o calor, que aplicado de maneira cautelosa, tem se mostrado eficaz para curar

lesões cutâneas causadas por L. mexicana, na Guatemala e no México (Navin et al., 1990;

Velasco-Castrejon et al., 1997); e a injeção intralesional de antimonial pentavalente, que,

na grande maioria dos casos, tem conseguido cicatrização total das lesões (Faris et al.,

1993; Tallab et al., 1996; Oliveira-Neto et al., 1997; Aste et al., 1998). Apesar da

administração intralesional de agentes anti-leishmânia mostrar-se eficaz, existem algumas

inconveniências nesse tipo de tratamento, como o fato de que as injeções devem ser

administradas ininterruptamente por mais de um mês, cada lesão tem que ser tratada

individualmente e a droga tem que ser infiltrada de forma profunda, já que amastigotas de

Leishmania residem profundamente na derme.

Algumas preparações tópicas como sulfato ácido de berberina, mepacrina,

metronidazol, emetina hidroclorada, clorpromazina e paromomicina, também já foram

testadas (Cook, 1993). Destas, a mais estudada tem sido a do aminoglicosídeo

paromomicina (aminosidina). Estudos desenvolvidos em Israel por El-On et al. (1986),

usando uma mistura de sulfato de paromomicina (15%) e cloreto de metilbenzetônio

(12%), mostraram que lesões causadas por L. major, tratadas por 10 dias, evoluiam mais

rapidamente para a cura do que lesões não tratadas, no mesmo paciente. Entretanto, nos

estudos de Ben Salah et al. (1995), a preparação não mostrou eficácia no tratamento de

lesões causadas por esta mesma cepa. Com cepas do Novo Mundo, os resultados são

variados e sua eficácia até o momento não foi confirmada (Berman, 1996; Neva et al.,

1997; Soto et al., 1998). Embora a associação dessa droga com Glucantime®, administrada

por 7 dias, pareça aumentar a eficácia do tratamento (Soto et al., 1995), um estudo

controlado usando um curso menor de administração do antimonal precisa ser feito para

confirmar estes achados.

O problema fundamental com o tratamento local da LT é que a doença não é

superficial como as infecções causadas por dermatófitos. Amastigotas de Leishmania se

disseminam da derme para o sistema linfático e membranas mucosas, sendo consenso que

a terapia local pode não curar infecção no linfonodo ou proteger contra doença mucosa, se

o processo de metastatização já estiver em curso.

12

Outra alternativa de tratamento tem sido a imunoterapia. Estudos randomizados, na

Venezuela, descreveram a aplicação de uma vacina consistindo de bacilos vivos de

Calmette-Guerin (BCG) (para estimular a produção de interferon-γ) junto com

promastigotas mortas de L. mexicana amazonensis, para tratar pacientes com as formas:

cutânea localizada, intermediária e difusa da LT (Convit et al., 1987; 1989). Comparando a

imunoterapia e a quimioterapia convencional com Glucantime® para o tratamento de

infecção causada por L. braziliensis, Convit et al. (1987; 1989) encontraram que a

percentagem e o tempo médio de cura foram semelhantes para os dois tratamentos, sendo

que os efeitos colaterais ocorreram 10 vezes mais frequentemente entre os pacientes que

receberam o Glucantime®, do que entre aqueles que receberam o imunoterápico. Parise et

al. (in press), usando o mesmo protocolo em pacientes com LT, no Ceará, verificaram que

a imunoterapia foi associada com menor percentagem de cura e maior taxa de

superinfecções por bactérias, além de recidivas.

Nos últimos anos, o uso de interferon-γ, uma citocina que ativa macrófago com

subsequente destruição de leishmania, associado ao Glucantime® parece tornar o emprego

deste último mais eficaz, principalmente nos casos mais resistentes, como na leishmaniose

cutânea difusa (Badaro & Johnson, 1993) e na forma cutâneo-mucosa (Falcoff et al.,

1994). Apesar de interferon-γ não ser considerado suficientemente ativo quando utilizado

sozinho, Kolde et al. (1996) mostraram-no eficaz como imunoterapia de pacientes com

leishmaniose cutânea. Além de interferon-γ, tem sido avaliada também a aplicação de

outras citocinas: interleucina-2 (IL-2), que tem sido usada para tratar alguns pacientes com

leishmaniose cutânea disseminada (Akuffo et al., 1990), e interleucina-12 (IL-12), que, em

camundongos, é capaz de estimular a produção de interferon-γ e a expansão de linfócitos

TH1 (Scott & Farrel, 1996). No entanto, o grande problema para o uso das citocinas, além

do alto custo, são os inúmeros efeitos colaterais, entre eles, febre, fadiga, mialgias, dor de

cabeça e algumas vezes leucopenia (Berman, 1997).

13

1.3. Plantas medicinais

1.3.1. Generalidades

e todos os métodos da medicina natural, a fitoterapia é sem dúvida o mais

antigo. Dele já lançava mão o homem pré-histórico, que aprendeu como

os animais, a distinguir as plantas comestíveis daquelas que podiam

ajudá-lo a curar suas doenças. Já no ano 3.000 a.C., a China se dedicava ao cultivo de

plantas medicinais, iniciado por Sheu-ing. A obra do imperador Cho-Chin-Kei traz um

estudo bem detalhado sobre o poder terapêutico das plantas, sendo mencionadas as

virtudes da raiz de ginseng, do ruibarbo, do acônito e da cânfora. Placas de barro de 3.000

a.C. registram importações de ervas para a Babilônia (trocas com a China de ginseng

aconteceram por volta de 2.000 a.C). A farmacopéia babilônia abrangia 1.400 plantas e

está comprovado que, desde 2.300 a.C., os egípcios cultivavam diversas ervas e traziam de

suas expedições tantas outras. Com estas plantas, produziram purgantes, vermífugos,

diuréticos, anti-sépticos e cosméticos, além dos diversos produtos usados para embalsamar

suas múmias. Os Papiros de Ebers do Egito foram um dos herbários mais antigos que se

têm conhecimento, datando de 1.550 a.C., relaciona 125 plantas e 811 receitas (Plantas que

curam, 1983; Carvalho, 1986; Oka & Roperto, [online] 1998).

Assírios e hebreus, ao que se sabe, também cultivaram diversas plantas medicinais.

Os primeiros elaboravam águas aromáticas, tinturas e unguentos, enquanto os hebreus

empregavam em seus rituais religiosos e sacrifícios plantas como a mirra e o incenso. A

Índia, cognominada o “eldorado dos medicamentos ativos” pela riqueza e exuberância de

sua flora medicinal, desenvolveu importantes pesquisas, criando substratos de drogas como

o sândalo, a canela e o cardamomo. Na Antiga Grécia, as plantas e o valor terapêutico ou

tóxico de algumas delas eram bastante conhecidos, existindo cultivos em muitos jardins e

hortas. Em um dos mais importantes tratados médicos gregos, o “De Materia Médica”,

escrito no século I d.C. por Dioscórides, constam 600 ervas, seus nomes, suas descrições e

qualidades medicinais. A farmacopéia grega, na verdade, assimilou grande parte da

cretense e da micênia, que conheciam várias plantas medicinais como a dormideira, o

sésamo, o açafrão e os líquens (Plantas que curam, 1983; Oka & Roperto, [online] 1998).

D

14

Nas Américas, o primeiro herbário foi o Manuscrito Badanius, asteca, do século

XVI, escrito em nahuatl (Oka & Roperto, [online] 1998). No Brasil, o primeiro

levantamento das plantas medicinais utilizadas pela população, foi feito por uma expedição

científica, trazida por Maurício de Nassau ao nordeste do país, no período da ocupação

holandesa (1630-1654). Foi o médico Guilherme Piso, membro desta expedição, quem

descreveu no livro “Historia naturalis brasiliae”, editado em 1648, as principais plantas

usadas pelos índios, como o jaborandi, a ipeca e o tabaco (Rodrigues, 1949).

Até 1828, quando Friedrich Wohler produziu a síntese da uréia a partir de uma

substância inorgânica, o cianato de amônio, o homem não concebia como fonte de matéria

orgânica qualquer coisa que não fosse vegetal ou animal. Com a maior utilização dos

medicamentos sintéticos, no início do século XX, o uso das plantas diminuiu. Contudo, por

causa dos efeitos secundários destas drogas, seus custos, e diante do incentivo da ecologia

para um retorno ao natural, e a busca por formas alternativas de cura, as plantas estão

voltando a ser utilizadas, apresentando-se principalmente como uma boa alternativa para a

cura das mais diversas doenças.

As plantas superiores sempre foram uma das fontes mais importantes de novas

substâncias utilizadas diretamente como agentes medicinais. A maioria das drogas ativas

contra agentes infecciosos é na verdade derivada de produtos naturais ou de estruturas

sugeridas pelos produtos naturais. Assim, as plantas medicinais, usadas na preparação de

remédios tradicionais, trouxeram para a medicina moderna drogas de comprovada eficácia

para o tratamento de algumas doenças parasitárias. Como exemplo, temos a quinina, um

alcalóide quinolínico, isolada pela primeira vez da planta peruana Cinchona succiruba e

agora obtida de várias espécies de Cinchona encontradas em muitos países tropicais. Esta

foi a primeira droga anti-malárica descoberta e permanece sendo usada no tratamento e

profilaxia da doença há mais de um século. Além disso, serviu como base para a síntese de

novos agentes como cloroquina, primaquina e mefloquina. Com o aumento de casos

resistentes à cloroquina e à quinina, na década de 70 surgiu a artemisinina, um composto

sesquiterpênico isolado da Artemisia annua, essencialmente sem toxicidade, que, assim

como no caso da quinina, serviu de base para a síntese e produção comercial do artemeter e

do artesunato de sódio, substâncias com melhores atividades anti-malárica, tanto in vitro

como in vivo (Chawira & Warhurst, 1987; Chawira et al., 1987). Outro exemplo é a

emetina, uma droga com ação amebicida, obtida da Cephaelis ipecacuanha, planta que já

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era usada na medicina tradicional, na China, há centenas de anos e que teve sua atividade

reconhecida pela medicina moderna, sendo utilizada até hoje.

Nos últimos anos, alguns trabalhos revisaram estruturas e atividades de componentes

químicos ativos derivados de plantas, incluindo referências aos produtos de plantas com

atividade anti-protozoária (Phillipson et al., 1993, 1995; Iwu et al., 1994; Kirby, 1996). Na

pesquisa de novos medicamentos e substâncias bioativas para o tratamento das doenças

parasitárias, a ênfase maior tem sido dada aos estudos com drogas anti-maláricas, com um

grande número de publicações, seguidas pelas pesquisas com drogas leishmanicidas e

tripanosomatidas.

1.3.2. Uso de plantas medicinais na leishmaniose

a maior parte do mundo, a leishmaniose é endêmica em áreas onde os

sistemas tradicionais de medicina são praticados. Em muitos casos, a

terapia tradicional consiste na administração oral de extratos de plantas

para a forma sistêmica da doença e como preparações tópicas para a forma cutânea (Netto

et al., 1985). Como exemplo, França et al. (1996) realizaram um inquérito na população

rural da faixa litorânea produtora de cacau do estado da Bahia, uma região endêmica para

leishmaniose cutânea, causada por L. (V.) braziliensis, e identificaram 49 espécies de

plantas usadas pelos pacientes no tratamento da doença. Fournet et al. (1994a), na Bolívia,

encontraram, na floresta ocupada pelos índios Chimanos e regiões tropicais de

colonização, cerca de 40 espécies de plantas usadas por estas populações para tratar

leishmaniose cutânea.

Ainda não existe nenhum produto natural licenciado para o tratamento da

leishmaniose humana. Iwu et al. (1994) citam em sua revisão mais de vinte espécies de

plantas que têm demonstrado conter componentes que apresentam atividade significativa

contra várias espécies de Leishmania (TAB. 1). Os constituintes ativos de algumas destas

plantas já foram isolados e suas atividades têm sido confirmadas através de ensaios in vitro

e in vivo, mas para a grande maioria destas plantas tem sido reportado apenas a atividade

de extratos in vitro, faltando o isolamento dos componentes responsáveis por esta atividade

biológica, com subsequentes estudos para a confirmação in vivo. Até o momento, os

N

16

estudos experimentais citados na literatura permitiram a identificação de várias classes de

substâncias com atividade leishmanicida e entre as mais promissoras estão: os alcalóides

isoquinolínicos e β-carbolínicos, os glicosídeos iridóides e esteroidais, além das quinonas

(Iwu et al., 1994).

TABELA 1 - Plantas medicinais com atividade leishmanicida.

Planta Família Constituinte(s) Berberis aristat Berberidaceae Berberine Diospyros montana Ebenaceae Diospirina Dracaena mannii Agavaceae Saponinas Gongronema latifolia Asclepiadaceae Lignanas Hedera helix Araliaceae Saponina Jacaranda copaia Bignoniaceae Jacaranona, ácido ursólico Munnozia maronii Asteraceae Sesquiterpeno Nyctanthes arbortristis Verbenaceae Glicosídeos iridóides Oxandra espintana Annonaceae Espintanol Peganum harmala Zygophyllaceae Harmalina Pera benensis Euphorbiaceae Naftoquinonas Phytolacca americana Phytolaccaceae Proteínas Picralima nitida Apocynaceae Alcalóides indólicos Picrohiza kurroa Scrophulariaceae Glicosídeos iridóides Plumbago zeylanica Plumbaginaceae Plumbagina Polyalthia macropoda Annonaceae Labdana Ricinus communis Euphorbiaceae Proteínas Tabebuia rosea Bignoniaceae Quinonas

Fonte: Iwu et al. (1994)

Alcalóides quinolínicos. Chimanina D e 2-n-propilquinolina têm se mostrado

eficazes contra L. amazonensis, L. venezuelensis e L. donovani in vitro e in vivo (Fournet et

al., 1993a; Fournet et al., 1994b), e mais recentemente, chimanina B apresentou excelentes

resultados para o tratamento de L. amazonensis e L. venezuelensis (Fournet et al., 1996).

Alcalóides isoquinolínicos. Berberina tem sido apontado como o mais importante

componente de planta medicinal com atividade leishmanicida e tem sido usado largamente

na medicina tradicional para o tratamento da leishmaniose e outras doenças parasitárias por

mais de 50 anos (Purohit et al., 1982). Estudos laboratoriais têm confirmado que esta

substância e seus derivados possuem significativa atividade in vitro e in vivo contra várias

espécies de Leishmania (Ghosh et al., 1985; Vennestrom et al., 1990; Ahuja et al., 1993).

17

Alcalóides benzilisoquinolínicos. Na literatura são citados três componentes desta

classe que apresentaram atividade in vitro contra cepas de L. donovani, L. braziliensis e L.

amazonensis, são eles: girocarpina, dafenandrina e obaberina (Fournet et al., 1988).

Alcalóides indólicos. Harmalina tem se mostrado uma substância com significativa

atividade in vitro contra amastigotas de L. amazonensis (Evans & Croft, 1987). Outros

constituintes químicos desta classe também têm sido estudados, entre eles estão alstonina,

acuamina, acuamicina, picralina, picranitidina (Iwu et al., 1994), n-dimetilconodurina

(gabunina) e conoduramina (Munoz et al., 1994), todos apresentando atividade

leishmanicida in vitro.

Quinonas. Jacaronona tem mostrado possuir significativa atividade in vitro contra

promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, mas fraca atividade in vivo, quando testada

em camundongos infectados com L. amazonensis (Sauvain et al., 1993). Mais

recentemente, hidropiperona tem exibido potente atividade anti-parasitária contra espécies

de Leishmania (Mahiou et al., 1996).

Naftoquinonas. Plumbagina tem sido a substância desta classe química mais

estudada e citada na literatura. Tem apresentado atividade in vitro e in vivo contra cepas de

L. amazonensis e L. venezuelensis (Croft et al., 1985; Fournet et al., 1992a; Fournet et al.,

1992b). Buparvaquona, uma hidroxinaftoquinona, e diospirina, uma bis-naftoquinona, têm

mostrado atividade in vitro contra amastigotas e promastigotas de L. donovani,

respectivamente (Hazra et al., 1987; Croft et al., 1992).

Terpenos. São citados como tendo atividade anti-leishmânia: espintanol

(Hocquemiller et al., 1991), ácido ursólico (Sauvain et al., 1993), desidrozaluzanina C

(Fournet et al., 1993b), labdana diterpênica (Richomme et al., 1991), artemisina e

artemeter (Yang & Liew, 1993) e glicosídeos iridóides (Tandon et al., 1991; Ray et al.,

1996).

Algumas outras classes de substâncias também têm sido citadas na literatura como

apresentando atividade leishmanicida, entre elas estão lignanas (Ex. pinoresinol,

medioresinol e lirioresinol: Sauvain et al., 1996), chalconas (Ex. licochalcona A: Chen et

18

al., 1993, 1994, Zhai et al., 1995) e lactonas (Ex. argentilactona: Waechter et al., 1997),

além de outras.

Das 500 mil espécies de plantas estimadas existirem no mundo, o Brasil, sozinho,

possui cerca de 120 mil, sendo o país de maior cobertura vegetal em todo o planeta e,

paradoxalmente, um dos maiores importadores de matéria prima para a fabricação de

medicamentos sintéticos. O aproveitamento racional da sua enorme biodiversidade pode

ser um passo importante para a melhoria dos seus problemas de saúde pública, inclusive

com perspectivas para o controle da leishmaniose.

1.4. Timol

timol é um dos principais constituintes químicos de muitos óleos voláteis

de plantas tais como Thymus vulgaris L., Thymus serpyllum L., Ocimum

gratissimum L., O. viride Willd. e Monarda punctata L., sendo ainda

encontrado em várias plantas brasileiras do gênero Lippia. O óleo essencial obtido das

folhas da Lippia sidoides Cham. (Alecrim-pimenta) é principalmente constituído por timol

(50-60%), que é o seu princípio ativo extraível por arraste com vapor d’água (Sousa et al.,

1991).

C10H14O CH3 PM = 150,22

Pf 48-51o

OH

H3C CH3

FIGURA 1 – Estrutura química do timol.

O

19

O timol (3-p-cimenol, m-timol) é um composto oxigenado da classe dos fenóis e sua

estrutura química foi estabelecida como 2-isopropil-5-metilfenol (FIG. 1). Apresenta-se

como um sólido cristalino, com odor característico, pungente e um tanto caústico. É

solúvel em ácido acético e soluções aquosas de hidróxidos alcalinos. Como todos os

fenóis, é bastante ativo quimicamente e por isto pode provocar irritação.

A L. sidoides, alecrim-pimenta ou estrepa-cavalo, é um arbusto próprio da vegetação

do Nordeste, de caule quebradiço e tanto as folhas frescas como as secas têm odor forte,

canforáceo e sabor aromático picante. Abundante ao norte da Chapada do Apodi, faz parte

da vegetação da caatinga entre os municípios de Mossoró, no Rio Grande do Norte e

Tabuleiro do Norte, no Ceará. Segundo a Flora Brasiliensis de Martius, ocorre também nos

estados de Minas Gerais e São Paulo (Craveiro et al., 1981). Pode ser usada como fonte

industrial de timol, ainda hoje importado pelo país. Por causa das propriedades

antissépticas do timol, o infuso (chá) das folhas é utilizado na medicina popular na forma

de aplicação local em inalação, gargarejos e lavagens da pele, couro cabeludo e mucosas, e

no tratamento caseiro da rinite alérgica (estalicido), além disso, as folhas são mastigadas e

deixadas na boca em casos de dores de garganta e inflamação das gengivas (Craveiro et al.,

1981; Matos, 1994).

O timol foi originalmente introduzido como desinfetante em lugar do ácido carbólico

ou fenol comum, tendo a vantagem de apresentar odor mais agradável do que este último.

Sua eficácia antisséptica excede a do fenol em 20 vezes. Devido ao seu gosto agradável, é

empregado em muitas fórmulas antissépticas bucais, especialmente em gargarejos, sendo

também incorporado a pastas dentais. Já foi usado no tratamento da acne, das tinhas (Tinea

pedis), hemorróidas e na higiene feminina, entrando na composição de alguns colutórios e

analgésicos externos. Foi utilizado como desinfetante gastro-intestinal nas gastrites

fermentativas, enterites e casos semelhantes (Sousa et al., 1991).

O timol é bactericida e antimicótico, destacando-se sua atividade contra espécies do

gênero Penicillium (Shapiro et al., 1994). Quando testado em meio de cultura, inibiu

totalmente o crescimento de fungos como Aspergillus flavus e A. versicolor em

concentrações ≤ 0,4mg/ml (Sousa et al., 1991; Mahmoud, 1994). Mais recentemente,

Viollon & Chaumont (1994) mostraram o efeito antifúngico do timol sobre Cryptococcus

neoformans.

20

O timol é ainda referido na literatura como tendo ação citolítica. Buccellato &

Valguarnera (1965) mostraram que o timol foi capaz de induzir inibição irreversível do

desenvolvimento de culturas de células da linhagem contínua de Hela. Quando infiltrado

localmente, demonstrou uma ação degenerativa das células de epiteliomas basocelular,

espinocelular e células de adenocarcinoma, além de destruir tecidos neoformados de

sarcoma de Kaposi (Bucellato, 1965). Outro importante uso do timol foi como vermífugo

contra platelmintos e provavelmente em todas as formas de parasitas intestinais,

especialmente ancilóstomo (Gupta et al., 1967; Gaitonde et al., 1968; Sanghavi & Mistry,

1971).

O timol é pouco tóxico, apresentando em ratos, uma DL50 de 1,8g/kg por via oral

(Sousa et al., 1991) e 110,0mg/kg por via intraperitonial (Matos, 1980).

1.5. Lapachol

s plantas da família Bignoniaceae apresentam uma diversidade de classes

de constituintes químicos, entre os quais as naftoquinonas são os mais

frequentes, distinguindo-se um grupo estrutural mais simples constituído

por prenilnaftoquinonas, piranonaftoquinonas e furanonaftoquinonas e um outro

representado por estruturas mais complexas, em geral diméricas. O primeiro grupo conta

com o maior número de representantes, sendo o lapachol o mais frequente e algumas vezes

o mais abundante (De Oliveira et al., 1990). O lapachol ocorre largamente no reino vegetal,

sendo especialmente comum em espécies de Bignoniaceae, tais como Zehyera digitalis, Z.

tuberculosa, Tabebuia serratifolia, Tabebuia avellanedeae e T. serratifolia, entre outras, podendo ser isolado também de espécies de Verbenaceae, como a Tectona grandis (De

Oliveira et al., 1990).

O lapachol (ácido lapáchico, ácido taíguico, tecomina) foi isolado pela primeira vez

no final do século passado por Paternó, 1882, teve a sua estrutura química estabelecida por

Hooker, 1896, como 2-hidroxi-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-naftoquinona (FIG. 2) e sua

síntese foi realizada por Fieser, 1927. Apresenta-se como prismas amarelos, solúveis em

álcool, clorofórmio, benzenos e outros solventes orgânicos, assim também como em

solução aquosa de hidróxido de sódio (NaOH).

A

21

C15H14O3

O OH PM = 242,26

CH3 Pf 139-140o (EtOH)

CH2CH = C O CH3

FIGURA 2 – Estrutura química do lapachol.

Plantas da família das Bignoniaceae ocorrem nas regiões tropicais e sub-tropicais do

Velho e Novo Mundos, contando com cerca de 700-800 espécies e, aproximadamente, 100

gêneros. Na América do Norte, algumas espécies crescem como árvores ornamentais ou

arbustos. São comuns no Nordeste do Brasil, onde recebem os nomes de pau-d’arco roxo,

pau-d’arco rosa e pau-d’arco amarelo (ipê, ipê-roxo, ipê-rosa ou ipê-amarelo). Nos países

de língua espanhola, algumas variedades são chamadas de lapacho, e são também usados

os nomes tahebo, queschua e tabebuia (Oswald, 1993/94).

Pau-d’arco (Tabebuia ssp.), ou lapacho, tem sido usada como planta medicinal há

mais de mil anos, era considerada indispensável pelos índios brasileiros Callawaya e pelos

Incas. De acordo com relatos, os Incas usavam a planta para curar muitas doenças,

incluindo até mesmo distúrbios degenerativos. Os índios brasileiros usavam a casca do

pau-d’arco para tratar um grande número de doenças, tais como: inflamação intestinal,

disenteria, febre, dor de garganta, feridas, artrites, cistite, problemas do trato respiratório,

distúrbios circulatórios, picada de cobra, e diferentes tipos de tumores (Oswald, 1993/94).

Esta propriedade antineoplásica foi avaliada no tratamento clínico experimental de alguns

tipos de câncer no Brasil, ainda nos anos 50, pelo Prof. Walter Ramades Acorsi. Este foi o

primeiro pesquisador, no Brasil, a usar o pau-d’arco para tratar pacientes sofrendo de

leucemia, carcinoma, condições inflamatórias e imunodeficiências. Seus achados foram

22

incluidos na Farmacopéia Brasileira, onde consta que a planta pode ser usada em todos os

tipos de carcinoma e leucemia.

A partir da década de 60, os efeitos biológicos do lapachol passaram a ser estudados

com mais detalhes. Em animais de laboratório, a droga apresentou atividade antineoplásica

na dose de 100mg/kg de peso corporal, administrada por via oral ou parenteral, frente ao

sarcoma de Yoshida e ao carcinosarcoma de Walker 256 (Rao et al., 1968; Santana et al.,

1968). Alguns ensaios clínicos, usando o lapachol, também foram realizados, obtendo-se

resultados satisfatórios no tratamento de adenocarcinoma e carcinoma epidermóide (Rao,

1974; Santana et al., 1980/1).

O lapachol foi testado extensivamente como agente antimalárico nos anos 40

(Wendel, 1946; Fieser & Richardson, 1948), mas nos estudos de Carvalho et al. (1988) a

droga demonstrou uma baixa atividade para inibir in vitro a fase de esquizogonia. Tem

apresentado também atividade antimicrobiana contra bactérias do gênero Brucella e alguns

outros microorganismos gram-positivos, entre eles Bacillus subtilis, Micrococcus pyogenes

var. aureous e, em menor intensidade, contra outras espécies (Lima et al., 1956). No

entanto, quanto mais purificado, menor parece ser seu efeito antibiótico (Lima et al., 1962).

Entre outras quinonas, o lapachol mostrou a mais alta atividade contra a penetração

de cercárias de Schistossoma mansoni em camundongos (Pinto et al., 1977). Apresentou

também atividade in vitro contra Trypanosoma cruzi (Lopes et al., 1978), assim como

contra Trypanosoma brucei in vitro e in vivo (Shapiro et al., 1982). O lapachol tem

provado ainda ser muito efetivo contra o vírus herpes, tipo I e II, vírus da pólio e vírus da

estomatite vesicular (Linhares & de Santana, 1975; Do Carmo Lagrota et al., 1986; Pinto et

al., 1987). Ademais, apresenta ação anti-inflamatória (De Almeida et. al., 1990). Ensaios

clínicos utilizando o lapachol foram completamente satisfatórios (100% de êxito) em

pacientes portadores de bursites e tendinites e altamente satisfatórios em portadores de

otites e sinusites agudas e crônicas, com resultados significativos em 95,2 e 92% dos casos,

respectivamente (De Oliveira et al., 1990).

O lapachol apresenta ainda ação anticoagulante (Morrison et al., 1970) e a inibição

de enzimas envolvidas na bioquímica da vitamina K, observada por Preusch & Suttie

(1984), possivelmente explicaria esse efeito. Também, em animais, o lapachol,

23

administrado por via oral, promoveu uma proteção significativa contra úlceras gástricas e

duodenais, o que justifica o uso medicinal, na Índia, de Tectona grandis (Verbenaceae),

cujo extrato contém essa substância (Goel et al., 1987).

A toxicidade do lapachol é pouco acentuada (DL50 = 0,621g/kg, em camundongos

BALB/c e > 2,4g/kg, em ratos albinos, por via oral), não tendo sido relatadas alterações

anátomo-patológicas de importância em qualquer órgão (Morrison et al., 1970).

24

1.6. Objetivos Os objetivos do presente trabalho são:

Estudar o efeito leishmanicida in vitro do timol e do lapachol em macrófagos

infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis;

Avaliar a atividade terapêutica do timol e do lapachol na infecção experimental do

hamster (Mesocricetus auratus) por L. (V.) braziliensis;

Comparar os resultados encontrados in vivo com os obtidos in vitro.

25

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Substâncias avaliadas

• Timol, 2-isopropil-5-metilfenol (Merck, Alemanha), fornecida pelo laboratório de

Química Orgânica da Universidade Federal do Ceará.

• Lapachol, 2-hidroxi-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-naftoquinona, fornecida pelo

Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco (LAFEPE).

As drogas de referência utilizadas foram os antimoniais pentavalentes:

• Glucantime®, antimoniato de meglumina (Rhodia, França), fornecida pela

Fundação Nacional de Saúde-Ceará.

• Pentostam®, estibogluconato de sódio (MEHECO, China), fornecida pelo

Hospital São José de Doenças Infecciosas, Ceará.

2.2. Preparo e solubilização das substâncias

• Nos ensaios in vitro, as substâncias foram solubilizadas e diluídas em meio RPMI-

1640 contendo dimetilsulfóxido (DMSO) a 2%, solução esta que será designada como

“RPMI+DMSO”.

• Nos ensaios in vivo, o timol foi diluído em etanol a 10% e o lapachol em água

destilada contendo tween 80 a 0,1% e etanol a 0,5%.

2.3. Meios de cultura

Ao longo deste trabalho foram utilizados três tipos de meios de cultura:

• Meio RPMI-1640

O meio RPMI-1640 foi complementado com 100UI/ml de penicilina e 100µg/ml de

estreptomicina, e será designado ao longo do trabalho como “RPMI”. Este meio foi

suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF) inativado pelo calor (RPMI+SBF).

26

• Meio Schneider para Drosophila

O meio Schneider para Drosophila foi complementado com 100UI/ml de penicilina e

100µg/ml de estreptomicina, e será chamado de “meio Schneider”. Este meio foi

enriquecido com 10% de SBF inativado pelo calor e urina humana estéril a 2%

(Schneider+SBF+urina).

• Meio N.N.N.

O meio N.N.N. foi suplementado com meio Schneider para Drosophila e 100UI/ml

de penicilina e 100µg/ml de estreptomicina, e será mencionado como “NNN”.

2.4. Parasitas

Cepa de Leishmania (Viannia) braziliensis, MHOM/BR/94/H-3227, isolada de

paciente do estado do Ceará com a forma cutânea da doença e caracterizada previamente

por anticorpos monoclonais e por eletroforese de isoenzimas. A cepa foi mantida como

promastigotas em meio NNN, suplementado com meio Schneider, ou criopreservada, com

passagens periódicas em hamster, para reativação da virulência. Repiques foram feitos a

partir da fase estacionária de crescimento e os parasitas usados somente até a quinta

passagem, após o que procedia-se à criopreservação.

2.5. Ensaios in vitro 2.5.1. Purificação de macrófagos

Macrófagos residentes de camundongos albinos Swiss (Mus musculus), previamente

estimulados com 1ml de solução de amido a 3% por via i.p, foram obtidos por lavagem

peritoneal com 10ml de RPMI contendo heparina (10UI/ml). As células foram

centrifugadas (1.200 rpm, 40C) e lavadas com salina a 0,85% e ajustadas para a

concentração desejada em RPMI+SBF e antibióticos.

2.5.2. Citotoxicidade em macrófagos

O método utilizado foi a coloração pelo azul de tripan a 0,4%, que é baseado no

princípio de que células vivas (viáveis) não incorporam o corante, enquanto as células

mortas o fazem. Macrófagos foram cultivados em tubos estéreis de 1ml (tipo eppendorf),

27

na concentração de 2x106 células/ml em RPMI+SBF e antibióticos e as drogas timol,

lapachol e os antimoniais (Glucantime® e Pentostam®) foram adicionadas em seguida,

diluídas com RPMI+DMSO, em diversas concentrações (0,008 a 4mg/ml). Foram usados

dois controles: um apenas com macrófagos e outro com macrófagos e DMSO a 2%. As

culturas foram incubadas por 12 horas a 370C e 5% de CO2. Após esse período, as células

foram coradas com uma solução de azul de tripan a 0,4% e a percentagem de células não

viáveis foi determinada em microscópio óptico, usando Câmara de Neubauer.

O cálculo das células não viáveis foi feito aplicando-se a seguinte fórmula: lise

celular (%) = número de células não viáveis (coradas) ÷ total de células (coradas e não

coradas) x 100. Foi considerado como sendo tóxica, a droga que apresentasse efeito tóxico

a partir de 20%.

2.5.3. Avaliação da atividade anti-amastigota

Macrófagos foram cultivados em placas de 96 poços (Falcon®, U.S.A), em

sextuplicatas, fundo chato, na concentração de 106 células/ml em RPMI+SBF e

antibióticos, e incubados por um período de 3h a 370C e 5% de CO2, tempo necessário para

que ocorresse aderência das células. Em seguida, as células foram lavadas com RPMI à

370C a fim de remover as não aderentes. Promastigotas de L. (V.) braziliensis, em fase

estacionária de crescimento, foram adicionadas na razão de 3:1 macrófago e as culturas

incubadas por 24-48h a 370C e 5% de CO2. Após esse período, as células foram lavadas

novamente com RPMI à 370C para remover os parasitas livres. As drogas em estudo foram

adicionadas em diversas concentrações e a placa reincubada. Após 24h de incubação com

as drogas, as células foram lavadas mais uma vez com meio RPMI à 370C e cultivadas em

meio Schneider+SBF+urina por 24-48h, a 260C, para transformação das formas

amastigotas intracelulares em promastigotas. Após isso, foi adicionado 1µCi/poço de [3H]-

metil-timidina a cada poço e os parasitas incubados por um tempo adicional de 24h, para

que a timidina marcada se incorporasse ao DNA dos parasitas em divisão. Em seguida,

foram extensivamente lavadas e coletadas em papel filtro (Skatron Inst., U.K) com um

coletor de células (Cambridge Technology, U.S.A) e a leitura final feita através de um

Cintilador-β (Pharmacia, Finlândia).

28

Para calcular o efeito leishmanicida foi aplicado a seguinte fórmula: atividade

leshmanicida (%) = CPM (cintilação por minuto) do controle (macrófagos parasitados) -

CPM da amostra (macrófagos parasitados + droga) ÷ CPM do controle (macrófagos

parasitados) x 100. Foi considerado como apresentando aceitável efeito leishmanicida as

drogas que mostraram atividade anti-leishmania igual ou maior que 70%, em relação aos

controles não tratados.

2.6. Ensaios in vivo

2.6.1. Animais experimentais

Hamsters (Mesocricetus auratus), adultos, de ambos os sexos, com idade variando de

3 a 4 meses, provenientes do biotério do Núcleo de Medicina Tropical Prof. Joaquim

Eduardo de Alencar da UFC, foram mantidos à temperatura ambiente, com ração

comercial apropiada e água “ad libitum”.

2.6.2. Infecção experimental

Os animais foram infectados com 20µl de promastigotas de fase estacionária, na

concentração de 1x106, no coxim plantar da pata posterior direita. Ficaram em observação

até o surgimento da lesão, quando se iniciou o tratamento.

2.6.3. Tratamento com timol

Os animais foram divididos em 03 grupos, contendo 06 animais/grupo. As drogas

foram administradas por 42 dias:

• Veículo de solubilização - I.M., l x dia;

• Glucantime® - 60 mg/kg (1/25 da DL50; DL50 = 1500mg/kg, I.M.,em hamster), I.M., 1 x dia;

• Timol - 7 mg/kg (1/15 da DL50;; DL50 = 110mg/kg, I.P., em ratos), I.M., 2 x dia.

2.6.4. Tratamento com lapachol

Os animais foram divididos em 04 grupos contendo 08 animais/grupo. As drogas

foram administradas por 42 dias:

• Veículo de solubilização - V.O., l x dia.

• Lapachol - 150 mg/kg (1/16 da DL50; DL50 = 2400mg/kg, V.O., em ratos), V.O., 2 x dia.

• Lapachol - 150 mg/kg, V.O., 2 x dia, associado ao Pentostam® - 60 mg/kg, I.M., l x dia.

• Pentostam® - 60 mg/kg (1/25 da DL50), I.M., l x dia.

29

2.6.5. Avaliação do efeito terapêutico:

A avaliação do efeito terapêutico foi realizada através de duas abordagens:

Tamanho da lesão

Durante a evolução do tratamento, foram realizadas medidas semanais do tamanho

das patas dos animais, com paquímetro de escala circular (Mitutoyo, Japão). O tamanho da

lesão foi representado pela diferença entre a pata infectada e a contralateral não infectada.

Quantificação da carga parasitária no linfonodo regional

A carga parasitária foi quantificada através da técnica de diluição limitante (Titus et

al., 1985), modificada por Silva et. al. (1994). Após o término do tratamento, os animais

foram sacrificados por inalação de éter sulfúrico e os linfonodos poplíteos de drenagem das

lesões foram isolados assepticamente, macerados em 2ml de Schneider e deixados em

repouso por 5 minutos. A partir dessa suspensão de células, foram feitas diluições seriadas

a 1:10 em Schneider+SBF+urina. Cem microlitros destas diluições foram distribuídos em

placas de 96 poços, fundo chato, 12 poços/diluição. As placas foram vedadas e incubadas a

260C, por 3 semanas. Foram observadas em microscópio óptico invertido (AusJena,

Alemanha) de 3 em 3 dias para o registro das diluições que continham promastigotas.

2.6.6. Estudo histopatológico

Foram coletadas amostras de pulmão, rim, bexiga, baço e linfonodo poplíteo, dos

animais sacrificados ao final do tratamento, e de um grupo de animais sadios (controle não

infectado), bem como dos que morreram no decorrer do experimento. As amostras foram

fixadas em formol tamponado a 10%, processadas e incluídas em parafina. O material foi

cortado em secções de espessura de 5-6µm e corado pela hematoxilina-eosina. As

alterações microscópicas foram observadas e analisadas.

2.7. Análise estatística dos dados O número de parasitas presentes no linfonodo poplíteo de drenagem das lesões foi

determinado pela análise do qui-quadrado mínimo aplicada à distribuição de Poisson

(Taswell, 1984). Os dados referentes à carga parasitária foram analisados utilizando o teste

não paramétrico de Mann-Whitney e os demais, teste t para amostras não pareadas. Em

todos os testes utilizados, a significância mínima foi aceita quando p < 0,05.

30

3. RESULTADOS

3.1. Ensaios in vitro

Nos ensaios de citotoxicidade para macrófagos, o lapachol apresentou efeito tóxico a

partir de 0,1mg/ml, enquanto o timol foi tóxico em dose ≥ 0,062mg/ml. O Glucantime®

não mostrou efeito citotóxico para macrófagos nas concentrações testadas, até 4,0mg/ml,

no entanto, o Pentostam® apresentou toxicidade mesmo com 1,0mg/ml (TAB. 2).

TABELA 2 - Efeito citotóxico do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes (Pentostam® e Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos.

Drogas Concentração (mg/ml) % lise celular DMSO a 2% - 2,0 ± 0,0

Timol 0,125 73,9 ± 1,79

0,062 44,5 ± 5,50

0,031 16,2 ± 3,78

0,016 14,5 ± 3,18

0,008 11,3 ± 3,43

Lapachol 0,4 36,5 ± 3,04

0,2 32,8 ± 2,85

0,1 24,9 ± 0,07

0,05 13,8 ± 0,07

0,025 4,4 ± 0,74

Pentostam® 4,0 59,1 ± 0,85

2,0 50,2 ± 0,14

1,00 32,4 ± 0,60

0,50 18,7 ± 2,12

0,25 5,7 ± 0,36

Glucantime® 4,0 16,7 ± 1,60

2,0 14,2 ± 2,00

1,0 10,8 ± 0,46

0,50 8,2 ± 2,20

0,25 3,7 ± 0,32

Os valores representam a média aritmética de 3 ensaios ± E.P. Dados sombreados mostram doses com lise celular ≥ 20%.

31

Todas as drogas apresentaram atividade leishmanicida sobre amastigotas

intracelulares. Para o timol, esta atividade anti-amastigota foi observada a partir de

0,50mg/ml e de 0,50mg/ml e 1,0mg/ml, para o Pentostam® e o Glucantime®,

respectivamente. O lapachol mostrou atividade anti-amastigota em todas as concentrações

avaliadas (TAB. 3 e FIG. 3).

TABELA 3 - Efeito leishmanicida in vitro do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes (Pentostam® e Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis.

Drogas Concentração % atividade (mg/ml) leishmanicida Meio RPMI - - Timol 1,0 95,0 ± 1,75

0,50 82,0 ± 1,00

0,25 60,0 ± 1,85

0,125 52,6 ± 0,45

0,062 38,4 ± 0,10

0,031 26,5 ± 0,45

Lapachol 0,20 96,8 ± 2,20

0,10 90,2 ± 2,90

0,05 88,8 ± 3,25

0,025 80,7 ± 0,65

0,0125 76,4 ± 1,65

Pentostam® 2,0 95,5 ± 0,81

1,0 92,1 ± 3,30

0,50 74,3 ± 13,3

0,25 64,0 ± 12,0

0,125 59,8 ± 8,55

Glucantime® 4,0 97,5 ± 0,0

2,0 97,2 ± 0,35

1,0 83,1 ± 4,25

0,50 67,2 ± 2,80

0,25 32,9 ± 2,10

Os valores representam a média aritmética de 3 ensaios ± E.P. Dados sombreados mostram atividade leishmanicida ≥ 70%.

32

FIGURA 3 - Efeito leishmanicida in vitro do timol, lapachol e dos antimoniais pentavalentes (Pentostam® e Glucantime®) em macrófagos peritoniais murinos infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis. Os resultados mostram a média aritmética de 3 ensaios ± E.P.

3.2. Ensaio in vivo com timol

Os animais tratados com o timol (14mg/kg/dia, I.M.) apresentaram lesões com 1,30 ±

0,42mm, ao final do estudo, o que representa uma redução de apenas 13,3%, quando

comparada com os controles não tratados (1,50 ± 0,24mm). Nos animais que receberam o

Glucantime® (60mg/kg/dia, I.M.), a redução do tamanho das lesões correspondeu a 98,0%

(0,030 ± 0,12mm; p = 0,0001) (FIG. 4 e TAB. 4).

Durante o tratamento com o timol, ocorreu a morte de apenas um animal, 16,7%

(1/6). A tolerabilidade à droga foi boa e, apesar de que substâncias da classe dos fenóis,

como o timol, são irritantes, somente 40% (2/5) dos animais tratados apresentaram

hemorragia tecidual no local da aplicação. Outro sintoma detectado foi irritabilidade,

verificado somente nos últimos dias de tratamento (TAB. 4).

0

20

40

60

80

100

0,5 0,25 0,125 0,062 0,031 0,2 0,1 0,05 0,025 0,0125 2,0 1,0 0,50 0,25 0,125 4,0 2,0 1,0 0,50 0,25 mg/ml

Timol Lapachol Pentostam® Glucantime®

% a

tivi

dade

leis

hman

icid

a

33

FIGURA 4 - Efeito do tratamento I.M. com timol (14mg/kg/dia) em hamsters (n=6) infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis. Cada ponto representa a média aritmética do tamanho da lesão ± E.P. A região sombreada mostra o período de tratamento.

TABELA 4 – Avaliação do efeito do tratamento com timol (14mg/kg/dia), administrado por 42 dias, via I.M., em hamsters (n=6) infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis.

Tamanho da lesão (mm) Redução da Nº de Grupo (média ± E.P) lesão (%)b sobreviventes

Controle 1,50 ± 0,24 - 6/6

Timol 1,30 ± 0,42 13,3 5/6 Glucantime® 0,03 ± 0,12a 98,0 6/6

a = Glucantime® comparado ao Controle (p = 0,0001). b = redução do tamanho da lesão comparada ao controle.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5ControleTimolGlucantime®

Tempo de infecção (semanas)

Tam

anho

da

lesã

o (m

m)

34

3.3. Ensaio in vivo com lapachol e sua associação com Pentostam®

Os animais que receberam o lapachol (300mg/kg/dia, V.O.) não apresentaram

diferença significativa em relação ao tamanho da lesão, quando comparados aos não

tratados (lapachol 2,6 ± 1,13mm; controle não tratado 2,8 ± 0,43mm), representando uma

redução de apenas 6% (FIG. 5 e TAB. 5).

FIGURA 5 - Efeito do tratamento oral com lapachol (300mg/kg/dia) ou da sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia) em hamsters (n=8) infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis. Cada ponto representa a média aritmética do tamanho da lesão ± E.P. A região sombreada mostra o período de tratamento.

Em relação à carga parasitária, pôde-se observar que os animais tratados com o

lapachol apresentavam, ao final do tratamento, parasitismo tão alto (1,4x107 ± 1,1x107

parasitas/linfonodo) quanto o observado no controle não tratado (5,8x107 ± 4,7x107

parasitas/linfonodo) (FIG. 6 e TAB. 5).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90

1

2

3

4ControleLapachol Lapachol e Pentostam®

Pentos tam®

Tempo de infecção (semanas)

Tam

anho

da

lesã

o (m

m)

35

FIGURA 6 - Carga parasitária no linfonodo de drenagem da pata de hamsters infectados por Leishmania (Viannia) braziliensis ao final de 42 dias de tratamento oral com lapachol (300mg/kg/dia) associado ou não ao Pentostam® (60mg/kg/dia). Cada grupo está representado por 5 animais e sua mediana.

Quando se avaliou a associação do lapachol com o Pentostam®, comparado ao grupo

tratado apenas com o antimonial, verificou-se que não houve diferença significante.

Entretanto, ambos os grupos, tanto o que recebeu a associação Lapachol+Pentostam®,

quanto o que recebeu apenas o Pentostam®, quando comparados com o controle não

tratado, mostraram uma redução estatisticamente significante, tanto em relação ao tamanho

da lesão quanto à carga parasitária (FIG. 5, FIG. 6 e TAB. 5).

A mortalidade foi de 37,5% (3/8) no grupo tratado com o lapachol, 25% (2/8) no

grupo Lapachol+Pentostam® e 25% (2/8) no grupo Controle (TAB. 5). Os principais

efeitos colaterais observados nos animais que receberam o lapachol ou a sua associação

com o Pentostam®, foram ptose da pálpebra esquerda, 18,75% (3/16) e paresia da pata

anterior esquerda, 12,5% (2/16). Outra alteração observada em todos os animais que

receberam o lapachol foi urina castanha-avermelhada.

10 0

10 1

10 2

10 3

10 4

10 5

10 6

10 7

10 8

10 9

1010

1011

1012

Para

sita

s/ór

gão

Controle Lapachol Lapachol + Pentostam Pentostam

36

TABELA 5 – Avaliação do efeito do tratamento oral por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) ou sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia) em hamsters (n=8) infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis.

Tamanho da Carga parasitária lesão (mm) Redução da no linfonodo Nº de Grupo (média ± E.P) lesão (%)e (média ± E.P) sobreviventes

Controle 2,78 ± 0,43 - 5,8 x 107 ± 4,7 x 107 6/8

Lapachol 2,62 ± 1,13 6,0 1,4 x 107 ± 1,1 x 107 5/8

Lapachol+ 0,30 ± 0,08a 98,9 2,4 x 103 ± 2,0 x 103c 6/8 Pentostam®

Pentostam® 0,47 ± 0,12b 83,2 1,5 x 104 ± 1,3 x104d 8/8

a = Lapachol+Pentostam® comparado ao controle (tamanho da lesão; p = 0,0050); b = Pentostam® comparado ao controle (tamanho da lesão; p = 0,0007); c = Lapachol+Pentostam® comparado ao controle (carga parasitária; p = 0,0079); d = Pentostam® comparado ao controle (carga parasitária; p = 0,0159). e = redução do tamanho da lesão comparada ao controle.

Quanto ao estado nutricional, foi observada significativa perda de peso nos animais

do grupo controle, que em média perderam 18% (20,1g) do seu peso inicial (p = 0,0160).

Os demais grupos não apresentaram alterações ponderais importantes (TAB. 6).

TABELA 6 – Alteração ponderal dos animais durante o tratamento oral por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) ou sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia). Dias Controle Lapachol Lapachol+Pentostam® Pentostam® D 0 114,2 ± 5,1 102,4 ± 3,9 108,6 ± 4,6 101,3 ± 3,1

D 20 102,5 ± 3,9 93,4 ± 6,3 101,0 ± 4,5 102,2 ± 3,1

D 50 94,1 ± 4,8 93,7 ± 5,4 103,2 ± 5,4 99,2 ± 3,3

Perda Peso 18% (20,1g) a 8,5% (8,7g) 5% (5,4g) 2% (2,1g)

Os valores representam a média aritmética ± E.P. a = perda ponderal ao final do experimento, D50, em relação ao peso inicial, D0 (p = 0,0160).

37

Na análise do peso relativo dos órgãos de disseminação, foi possível observar

significante redução no peso relativo do linfonodo poplíteo, nos animais tratados com a

associação Lapachol+Pentostam® (p = 0,0056) ou apenas Pentostam® (p = 0,0102),

quando comparado ao dos controles não tratados (FIG. 7A). Em relação ao baço e

fígado, nenhum dos grupos mostrou diferença significativa (FIG. 7B e 7C).

FIGURA 7 - Peso relativo do linfonodo de drenagem (A), baço (B) e fígado (C) de hamsters infectados com Leishmania (Viannia) braziliensis e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) associado ou não a Pentostam® (60mg/kg/dia). CONT, Controle; LAP, Lapachol; LAP+PENT, Lapachol associado a Pentostam®; PENT, Pentostam®. Cada grupo está representado por 3-5 animais e sua mediana.

10-4

10-3

10-2

B

CONT LAP LAP+PENT PENT

Pes

o re

lati

vo

10-2

10-1


C

Pes

o re

lati

vo

10-4

10-3

10-2

A


Pes

o re

lati

vo

38

Os animais apresentaram lesões ulceradas a partir da 3ª semana de infecção, sendo

mais frequente nos grupos controle não tratado e Lapachol (TAB. 7). Quando se iniciou o

tratamento, as úlceras dos animais que receberam somente o Pentostam® ou a associação

Lapachol+Pentostam®, fecharam a partir da 4ª semana de infecção; entretanto, nos

animais dos grupos Controle e Lapachol, as úlceras mostraram uma evolução diferente.

Nestes dois grupos, ao final do tratamento, a percentagem de animais com lesões ulceradas

havia aumentado, sendo que, no grupo tratado com lapachol, todos os animais

apresentavam úlceras (TAB. 7). Vale ressaltar que as lesões dos animais do grupo

Lapachol mostravam-se menos úmidas e aparentemente sem infecção bacteriana quando

comparadas às lesões dos animais do grupo Controle.

TABELA 7 - Percentagem de animais com lesões úlceradas durante o curso da infecção por Leishmania (Viannia) braziliensis e tratados por 42 dias com lapachol (300mg/kg/dia) ou sua associação com Pentostam® (60mg/kg/dia).

Grupo 1ªsem 2ªsem 3ªsem 4ªsem 5ªsem 6ªsem 7ªsem 8ªsem 9ªsem

Cont 0 0 50,0 75,0 75,0 87,5 87,5 87,5 87,5

Lap 0 0 50,0 71,4 83,3 100,0 100,0 100,0 100,0

Lp+Pt 0 0 25,0 25,0 0 0 0 0 0

Pent 0 0 12,5 0 0 0 0 0 0

Sem = semana; Cont = Controle; Lap = Lapachol; Lp+Pt = Lapachol associado a Pentostam®; Pent = Pentostam®.

3.4. Achados histopatológicos 3.4.1. Alterações no linfonodo de drenagem da lesão

Comparados aos linfonodos dos animais sadios, os do grupo controle infectado

apresentaram intensa histiocitose sinusal, observada em 100% (5/5) dos linfonodos, e

histiocitose parenquimal, que variou de moderada a intensa, também verificada em todos

os animais (FIG. 8A e 8B). Os macrófagos, moderadamente infectados e vacuolados,

estavam distribuídos como células isoladas ou em grupamentos de tamanhos variados, mas

sem formação de granulomas (FIG. 9). Podiam ser observados em focos ou difusamente

39

pelo parênquima e seios linfáticos (FIG. 8A e FIG. 8B). Marcantes hiperplasia folicular e

plasmocitose ocorreram em todos os animais, com ausência de hiperplasia paracortical

(FIG. 10A, FIG. 10B e FIG. 11). Foi observada ainda, presença de escassos eosinófilos e

ausência de neutrófilos.

Nos linfonodos dos animais tratados com o lapachol observou-se intensa apoptose e

necrose, associada com depósito de cálcio em um dos animais (FIG. 12A e FIG. 12B). A

necrose acometia extensas áreas do parênquima, envolvendo tanto a região cortical como a

medular (FIG. 12A). A histiocitose ocorreu em menor intensidade do que a observada nos

controles infectados e sem formação de granulomas. Chamou atenção a presença de

mielopoiese, observada em todos os animais, e a acentuada hipoplasia folicular, onde não

se visualizava nem mesmo o esboço dos folículos (FIG. 12A e 12B). Ainda foi observado

plasmocitose, embora, em menor intensidade que a dos controles infectados, sendo

frequente o achado de plasmócitos em apoptose. Moderada quantidade de amastigotas foi

detectada no interior de macrófagos ou no interstício (FIG. 12C).

No grupo tratado com o timol chamou atenção a intensa congestão cortical,

observada em todos os animais. Histiocitose sinusal e parenquimal estavam presentes em

todos os linfonodos, variando de moderada a intensa, sem formação de granulomas e com

macrófagos intensamente vacuolados e moderadamente parasitados, quando comparados

aos do controle infectado. Hiperplasia folicular e plasmocitose ainda foram encontradas, no

entanto, de maneira menos intensa do que as observadas nos animais do grupo controle.

Nos linfonodos dos animais tratados com antimonial (Glucantime® ou Pentostam®)

foi observado histiocitose, presente apenas nos seios linfáticos, sem formação de

granulomas, bem como hiperplasia folicular associada com plasmocitose. Entretanto, todas

estas alterações foram estimadas discretas quando comparadas àquelas encontradas nos

controles infectados (FIG. 13). Outros achados dignos de nota foram a presença de

escassos neutrófilos e raros macrófagos parasitados.

40

3.4.2. Alterações no baço

Nos baços dos animais dos grupos Controle, Lapachol e Timol, chamou atenção a

intensa hipoplasia da polpa branca, sendo menos frequente nos animais tratados com os

antimoniais (Glucantime® ou Pentostam®) ou com a associação Lapachol+Pentostam®

(FIG. 14A).

Em todos os grupos, foi observada discreta histiocitose sem formação de granulomas.

Apenas dois animais do grupo controle apresentaram raros granulomas, distribuídos na

polpa vermelha de forma não organizada. Os macrófagos apresentavam-se intensamente

vacuolados, entretanto, amastigotas não foram visualizadas em nenhum grupo, apesar de

diligente procura (FIG. 14B).

Ainda foram encontradas outras alterações tais como, congestão sinusoidal e

mielopoiese aumentada. A mielopoiese foi mais frequente nos animais do grupo Controle,

Lapachol e Timol, sendo menos observada nos animais tratados com Pentostam® ou com a

associação Lapachol+ Pentostam®.

41

FIGURA 8 – Linfonodo de controle não tratado. (A) Intensa histiocitose sinusal e parenquimal, sem formação de granulomas. S, sinusal; P, parenquimal. HE, 40x. (B) Maior aumento da Fig. 8. HE, 100x. FIGURA 9 – Linfonodo de controle não tratado. Setas indicando macrófagos vacuolados, volumosos e parasitados. HE, 400x.

8A

8B

9

P

S

42

FIGURA 10 – Linfonodo de controle não tratado. (A) Intensa hiperplasia folicular. HE, 40x. (B) Destaque para os folículos linfáticos. CG, centro germinativo; SM, seio medular. HE, 100x. FIGURA 11 – Linfonodo de controle não tratado mostrando intensa plasmocitose. HE, 400x.

CG

CG

SM

10A

10B

11

43

FIGURA 12 – Linfonodo de hamster tratado com lapachol. (A) Extensas áreas de necrose e apoptose com acentuada hipoplasia folicular. NC, necrose; AP, apoptose. HE, 40x. (B) Detalhe da Fig. 12A. HE, 400x. (C) Setas indicando amastigotas parasitando macrófagos. HE, 1000x.

AP

NC

12A

12B

12C

44

FIGURA 13 – Linfonodo de hamster tratado com antimonial. Histiocitose, hiperplasia folicular e plasmocitose discretas. HE, 40x. FIGURA 14 – Baço de controle não tratado. (A) Marcante hipoplasia da polpa branca. FL, folículo linfático. HE, 40x. (B) Maior aumento da Fig. 14A, com setas indicando os macrófagos vacuolados e volumosos. HE, 100x.

FL

13

14A

14B

45

4. DISCUSSÃO

os últimos anos vem ocorrendo um aumento na busca por novas drogas

antiparasitárias a partir de extrações de plantas (Phillipson et al., 1993,

1995; Iwu et al., 1994; Kirby, 1996). O timol e o lapachol são

constituintes químicos isolados originalmente de plantas consideradas medicinais (Sousa et

al., 1991). O uso do timol para o tratamento de algumas helmintíases (Gupta et al., 1967;

Gaitonde et al., 1968; Sanghavi & Mistry, 1971) e suas propriedades bactericida,

antimicótica e antisséptica já estão bem estabelecidas (Shapiro et al., 1994; Mahmoud,

1994; Viollon & Chaumont, 1994). O lapachol foi testado no passado como agente

antimalárico (Wendel, 1946; Fieser & Richardson, 1948) e são reconhecidas suas

atividades antimicrobiana (Lima et al., 1956) e anti-parasitária (Pinto et al., 1977; Lopes et

al., 1978; Shapiro et al., 1982). O conhecimento das propriedades biológicas dessas duas

drogas instigou-nos a investigar a possibilidade da existência de atividade leishmanicida, o

que ensejaria uma alternativa para o tratamento da leishmaniose.

Na literatura observa-se que muitos constituintes químicos extraídos de plantas que

apresentaram efeito leishmanicida, já eram conhecidos previamente por seus efeitos anti-

parasitários e, ou antimicrobianos. No entanto, boa parte destas substâncias foi testada

somente para a forma promastigota de Leishmania, in vitro, faltando ensaios in vivo para

confirmação dessa atividade leishmanicida (Iwu et al., 1994).

A triagem de drogas com base na atividade leishmanicida para a forma promastigota

serve como um indicativo de ação da droga, e muitos pesquisadores utilizam-na, mas não

tem sido suficiente para determinar se essas substâncias serão ativas também contra as

formas intracelulares amastigotas. As formas amastigotas residem nos fagolisossomos de

macrófagos, o que significa que a droga deve ser capaz de atravessar as membranas da

célula hospedeira e atingir o interior do vacúolo fagolisossomal. Além disso, existem

evidências de diferenças metabólicas entre promastigotas e amastigotas. Por exemplo,

amastigotas consomem mais ácidos graxos do meio de cultura do que promastigotas em

fase logarítmica de crescimento (Berman, 1988). Diferenças como essa podem explicar o

fato de determinadas substâncias serem ativas contra uma forma e não contra a outra, como

é o caso dos antimoniais, que atuam sobre amastigotas, mas são muito pouco eficazes

N

46

contra promastigotas (Moreira et al., 1995; Callahan et al., 1997). Optamos por avaliar as

substâncias em estudo contra amastigotas intracelulares in vitro e, subsequentemente, testá-

las no modelo in vivo para confirmação do efeito leishmanicida.

Parasita intracelular estrito como a Leishmania compartilha muitas vias bioquímicas

com sua célula hospedeira, portanto, para testar se as drogas eram seletivas para lisar

apenas as amastigotas, sem causar danos à célula hospedeira, foi investigada a

citotoxicidade para macrófagos. Os resultados mostraram que o timol foi a mais tóxica das

drogas testadas. Esta marcante toxicidade do timol para macrófagos, em doses ≥

0,062mg/ml, possivelmente pode ser explicada pelo fato dessa droga ser um composto

fenólico. Sabe-se que alguns fenóis são substâncias bastante ativas quimicamente, podendo

ser muito irritantes (Alterthum, 1982). Entre os antimoniais, o estibogluconato de sódio

(Pentostam®) mostrou-se o mais tóxico. Saldanha (1997) encontrou que o estibogluconato

de sódio BP88®, fabricado na China e importado pelo Ministério da Saúde a partir de

1996, o mesmo utilizado neste trabalho, é mais tóxico que o antimoniato de meglumina

(Glucantime®), o que vem corroborar nossos achados.

As substâncias em estudo foram em seguida avaliadas contra amastigotas

intracelulares e, com exceção do timol, todas apresentaram efeito leishmanicida em

concentrações não tóxicas para macrófagos. Para o timol, este efeito só foi encontrado nas

concentrações acima de 0,25mg/ml, que também foram tóxicas para macrófagos. Portanto,

o percentual da atividade leishmanicida observado com o timol, nestas concentrações, pode

não representar necessariamente uma ação direta sobre o parasita, mas sim o somatório de

sua ação tóxica para macrófago e seu efeito leishmanicida. Esses resultados leishmanicidas

in vitro, do timol e lapachol, estão de acordo com os dados encontrados na literatura.

Classes de substâncias como os terpenos e as naftoquinonas, das quais fazem parte o timol

e o lapachol, respectivamente, são citadas na revisão de Iwu et al. (1994) como tendo

apresentado atividade sobre algumas espécies de Leishmania, indicando que pudessem ser

importantes classes de novos agentes terapêuticos para a leishmaniose.

Nos ensaios in vivo, demonstramos que, apesar do timol e do lapachol terem

apresentado importante efeito anti-amastigota in vitro, estas substâncias não foram capazes

de conter o desenvolvimento de lesões em hamsters infectados por L. (V.) braziliensis. Tais

47

resultados suscitam a hipótese de que, in vivo, possivelmente as drogas sejam convertidas

em metabólitos inativos ou sejam neutralizadas, perdendo sua ação leishmanicida.

A relação estrutura-atividade do lapachol e de vários de seus análogos foi revisada

por Discroll et al., em 1974. Estes autores demonstraram que a remoção do grupo hidroxila

ou do isopentanila reduzia para 50% a atividade antitumor, enquanto que a remoção do

anel aromático originava um produto inativo. Redução, oxidação ou isomerização de uma

das cadeias também suprimia a atividade, assim como a adição de água para a ligação

dupla de carbonos ou a troca da hidroxila por um grupamento amino ou metilamino (Sieber

et al.,1976). Não podemos descartar a possibilidade do lapachol, uma vez absorvido, ter

sido transformado em um metabólito inativo, podendo ser esta uma das prováveis

explicações para sua fraca atuação in vivo. Outro ponto que merece destaque é a

concentração plasmática do lapachol. Block et al. (1974) relataram que, apesar da

concentração plasmática ideal para a eficácia da atividade antitumor ter sido determinada

como sendo de 30-35µg/ml, esta concentração nunca pôde ser alcançada em pacientes

cancerosos que receberam o lapachol, sem que não apresentassem efeitos colaterais graves

como anemia e diminuição do tempo de protombina. É possível que isso também tenha

acontecido no nosso ensaio e o lapachol não apresente efeito leishmanicida in vivo pela

impossibilidade de atingir um ótimo nível plasmático na concentração utilizada

(300mg/kg/dia).

Drogas administradas por via oral, bem absorvidas no trato gastrointestinal, assim

como drogas aplicadas por via intravenosa, atingem o sítio alvo apropriado através da

corrente sanguínea, sendo carreadas pelo sangue em um estado livre ou ligadas à proteínas

plasmáticas. Uma vez que uma droga se liga a uma proteína ela pode ser

farmacologicamente inativada e isto parece acontecer com β-lapachona e outras

naftoquinonas derivadas do lapachol, cujos efeitos tripanosomatida in vivo não

correspondem aos encontrados in vitro, quando na presença de sangue ou soro. Estas

naftoquinonas derivadas, na presença de oxihemoglobina, induzem a formação de

metahemoglobina com suas concomitantes transformações em substâncias inativas (Lopes

et al., 1978), o que sugere que o lapachol, uma naftoquinona, provavelmente também possa

ser inativado pela redução ou interação com proteínas do soro.

48

As substâncias ativas contra amastigotas de Leishmania podem atuar direta e

seletivamente contra o parasita ou indiretamente, através da ativação de mecanismos

microbicidas do macrófago, como o aumento da produção de radicais livres do oxigênio e

óxido nítrico (NO), provavelmente o mecanismo mais importante de destruição de

Leishmania empregado por essas células (Liew et al., 1990; Stenger et al., 1994). Recentes

estudos, in vitro, utilizando neurônios de ratos, apontam para o fato de que lapachol e

outras quinonas são inibidores da produção de NO, podendo possivelmente afetar, in vivo,

as ações fisiológicas e, ou fisiopatológicas dependentes deste mecanismo oxidativo

(Kumagai et al., 1998). No modelo in vitro, usou-se macrófago infectado por L. (V.)

braziliensis e nele, o lapachol mostrou-se muito ativo; portanto, seria interessante avaliar a

produção de NO neste sistema. É possível que o lapachol possa inibir seletivamente

determinadas funções dos macrófagos, ou seja, como os sinais que estimulam os

mecanismos oxidativos são independentes, não se pode descartar a possibilidade de que o

lapachol possa, ao mesmo tempo, inibir a NO sintetase e aumentar a produção de peróxido

de hidrogênio e outros intermediários reativos do oxigênio. Outra hipótese seria a de que a

droga poderia estar agindo indiretamente sobre o parasita e não necessariamente através da

ativação do macrófago.

Alguns terpenóides extraídos de plantas, como o ácido tormêntico, inibem o

crescimento de promastigotas, mas não têm efeito sobre amastigotas intracelulares (Santos,

1997) e apresentam o mesmo esqueleto básico do ácido ursólico, outro terpenóide descrito

como um potente inibidor do crescimento de promastigotas e amastigotas de L.

amazonensis (Sauvain et al., 1993). Entretanto, o ácido tormêntico possui duas hidroxilas a

mais e este nível de oxidação mais alto provoca uma maior polaridade, consequentemente,

tem menor capacidade de transpor membranas biológicas, o que pode explicar sua

inatividade contra amastigotas intracelulares. No entanto, essa parece não ser a explicação

para a fraca atividade leishmanicida do timol in vivo, que assim como as substâncias

citadas acima, é também um terpenóide, uma vez que sua estrutura química é relativamente

mais simples e apresenta apenas uma hidroxila. Não temos conhecimento de nenhum

estudo mostrando que o timol possa ter dificuldades de atravessar membranas biológicas,

ao contrário, sendo uma substância lipofílica, seus efeitos antimicrobianos são usualmente

atribuídos ao seu tropismo por membranas (Shapiro & Guggenheim, 1995). Portanto, uma

vez que o timol não apresentou efeito terapêutico no modelo in vivo utilizado neste

trabalho, podemos considerar a possibilidade da inativação e, ou neutralização desta droga

49

in vivo. Podemos ainda conjecturar que provavelmente a dose que usamos (14mg/kg/dia)

tenha sido insuficiente para causar alguma atividade leishmanicida in vivo, entretanto,

doses maiores seriam tóxicas para os animais.

Nos experimentos realizados, o efeito curativo dos antimoniais já pôde ser observado

a partir da segunda semana de tratamento, quando os animais que receberam estas drogas

apresentaram uma redução significativa das lesões em relação aos animais do controle não

tratados. No entanto, apesar destas drogas terem sido capazes de conter o desenvolvimento

das lesões no hamster infectado e da aparente cura clínica, ainda foi possível encontrar

parasitas viáveis nos linfonodos após 42 dias de tratamento (104/linfonodo). Bjorvatn &

Neva (1979), trabalhando com camundongos BALB/c infectados com L. tropica e tratados

com Pentostam® (400mg/kg/dia), relataram que parasitas viáveis ainda foram visualizados

no fígado dos animais ao final de 41 e 83 dias de infecção. Inchausti et al. (1997),

quantificando a carga parasitária das patas lesionadas de camundongos BALB/c infectados

com L. amazonensis e tratados com Glucantime® (28mg/kg/15dias), encontraram 105

parasitas/pata. Diante de tais achados, tem sido postulado que os antimoniais não são

capazes de erradicar completamente os parasitas dos tecidos de animais infectados por

Leishmania, mesmo diante de uma aparente cura clínica, o que explicaria o ressurgimento

das lesões em pacientes imunosuprimidos e que já foram tratados anteriormente para

leishmaniose. Os resultados encontrados são, portanto, compatíveis com estes descritos na

literatura.

Os animais que receberam a associação lapachol+Pentostam® apresentaram o

mesmo comportamento que os tratados apenas com o Pentostam®, indicando que a ação

terapêutica observada deve ser creditada ao efeito do antimonial. Apesar do lapachol não

ter apresentado efeito terapêutico na leishmaniose experimental, vale salientar que as

úlceras desenvolvidas nos animais tratados com esta droga mostraram-se menos úmidas e

aparentemente sem contaminação bacteriana, o que pode ser explicado pelos comprovados

efeitos antiinflamatório e antimicrobiano desta substância (Lima et al., 1956; De Almeida

et al., 1990).

Alguns achados nos animais tratados com lapachol merecem comentários, como por

exemplo, a cor castanha-avermelhada da urina e a neurotoxicidade. Morrison et al. (1970)

50

descreveram, em seus estudos de toxicidade do lapachol, o aparecimento de urina

castanha-avermelhada nos animais submetidos ao tratamento com variadas doses da droga,

explicando este sinal pela combinação do lapachol livre com a bilirrubina. Sabe-se que

soluções de lapachol são amarelas em pH abaixo de 6 e vermelhas acima deste patamar.

Para excluir a possível ocorrência iatrogênica de fenômenos hemorrágicos do sistema

urinário, como cistite hemorrágica ou necrose, os rins e bexigas dos animais foram

examinados e nenhuma alteração foi observada. Entretanto, em relação aos achados de

neurotoxicidade, não encontramos referências na literatura consultada, sendo este o

primeiro trabalho, em nosso conhecimento, que descreve este efeito colateral em hamsters

tratados com esta substância.

Na tentativa de avaliar melhor a neurotoxicidade do lapachol, animais sadios e

animais infectados por L. (V.) braziliensis foram submetidos ao tratamento com a mesma

dose de lapachol (300mg/kg/dia) e pelo mesmo período de tempo (42 dias) que os animais

do ensaio e somente os animais infectados apresentaram sinais neurotóxicos (dados não

apresentados). Esse fato sugere que, possivelmente, substâncias liberadas no processo

inflamatório induzido por L. (V.) braziliensis possam potencializar um efeito tóxico da

droga na concentração utilizada no experimento. Entretanto, este é um ponto que merece

ser esclarecido através de estudos futuros.

Os percentuais de mortalidade de 37,5% e 25% encontrados nos grupos tratados com

o lapachol e com a associação lapachol+Pentostam®, respectivamente, não podem ser

atribuídos exclusivamente à droga, uma vez que ocorreram mortes também no grupo

controle infectado (25%). Infelizmente, foi impossível fazer a histologia do pulmão dos

dois animais do grupo controle mortos, uma vez que já estavam em estado avançado de

decomposição. Entretanto, no estudo histopatológico dos demais animais que morreram ao

longo do tratamento, foi detectado pneumonite. Não foi possível determinar se esta

pneumonite foi causada por aspiração durante a administração da droga ou por

microrganismos oportunistas na vigência de uma imunosupressão induzida pela infecção

leishmaniótica ou pelo lapachol, visto que é uma substância anti-mitótica. Nos estudos de

Morrison et al. (1970), os principais indicativos de toxicidade pelo lapachol, quando

administrado por via oral em altas doses, foram a anemia, nas primeiras duas semanas de

administração da droga, e uma elevação no tempo de protrombina, que podia ser corrigida

ou controlada com uma simples aplicação de Vitamina K. Dos animais testados no estudo

51

de Morrison et al. (1970), tais como camundongos BALB/c, ratos albinos Charles River

CD e cães da raça beagle, todos apresentaram uma transitória leucocitose, e apenas em

macacos foi detectado leucopenia. Para esclarecer nossos achados, submetemos um grupo

de hamsters sadios ao tratamento com o lapachol na mesma dose utilizada em nossos

ensaios e avaliamos o leucograma antes de iniciar o tratamento, com 15, 30 e 40 dias.

Constatamos uma completa ausência de leucopenia (dados não apresentados), sugerindo

que o lapachol, por si só, na dose utilizada nesse trabalho (300mg/kg/dia), não induz

leucopenia em hamster, a despeito de sua ação anti-mitótica.

Um grande número de roedores e primatas são susceptíveis à infecção por

Leishmania sp. e, entre eles, estão os hamsters. Estudos comparativos de susceptibilidade à

infecção por cepas patogênicas do Novo Mundo, utilizando camundongos BALB/c,

CBA/H, CDI e hamsters, puderam mostrar que este último é o hospedeiro mais susceptível

para a L. braziliensis (Neal & Hale, 1983). A ocorrência de disseminação para o linfonodo

regional, baço e fígado do hamster infectado com diferentes espécies de Leishmania

dermotrópicas tem sido bem documentada na literatura (Lainson & Shaw, 1979; Wilson &

Lollini, 1980; Cuba Cuba et al., 1985; Kahl et al., 1990, 1991; Almeida et al., 1996;

Sinagra et al., 1997). Outros estudos têm correlacionado essa disseminação para baço e

linfonodo com a gravidade da doença (Scott & Farrel, 1982).

Os achados histopatológicos do baço dos animais do presente estudo, corroboram

aqueles de Kahl et al. (1991), os quais também encontraram alterações tais como

hipoplasia da polpa branca, congestão sinusoidal e mielopoiese aumentada em hamsters

infectados por L. (V.) braziliensis. Chamou-nos atenção o baixo parasitismo no baço,

inclusive dos animais do grupo controle infectado. Em hamsters, pode ocorrer

visceralização pelo parasita ainda nas primeiras 4 semanas de infecção (Travi et al., 1988;

Sinagra et al., 1997), entretanto, a presença de amastigotas no baço de animais infectados

por espécies dermotrópicas de Leishmania não tem sido descrita com frequência (Kahl et

al., 1991). Tem sido relatada raramente (Wilson & Lollini, 1980; Almeida et al., 1996), ou

parasitas são detectados em baixo número (Sinagra et al., 1997). A presença de L.

braziliensis é mais abundante no sítio cutâneo do que nas vísceras, refletindo o crescimento

diferencial de cepas viscerotrópicas e dermotrópicas em temperaturas acima de 340C

(Almeida et al., 1996). Outra alteração encontrada e digna de comentário é o achado da

marcante hipoplasia de polpa branca nos animais de todos os grupos, embora menos

52

frequente nos animais tratados com antimonial (Glucantime® ou Pentostam®) ou com a

associação lapachol+Pentostam®. Esta alteração indica provavelmente um quadro de

imunosupressão e tem sido descrita em outros estudos com hamsters infectados por

Leishmania, tais como L. braziliensis, L. mexicana e L. donovani, sugerindo que a

hipoplasia esplênica possa ser a base da disseminação do parasita para as vísceras e outros

sítios, bem como, a responsável pelo agravamento das lesões (Wilson & Lollini, 1980;

Veress et al., 1983; Sehgal & Arora, 1985; O’Daly & Cabrera, 1986).

Os achados histopatológicos nos linfonodos satélites dos animais do grupo controle

infectado, consistindo predominantemente de uma intensa histiocitose com magrófagos

vacuolados e volumosos e contendo muitas amastigotas, não diferiram daqueles

encontrados na literatura (Kahl et al., 1991; Almeida et al., 1996). Uma exceção foi a

ausência de granulomas nos linfonodos de todos os grupos, com exceção de dois animais

do grupo controle infectado. Tem sido postulado que na LT a formação de granuloma

maduro ou imune, com a participação de linfócitos T CD4+, fenótipo TH1, e com ativação

de macrófagos por citocinas, provavelmente representam o fator chave na destruição

parasitária, com controle da infecção (Ridley, 1979; Grimaldi, 1982; Magalhães et al.,

1986). A ausência de granulomas nos animais do ensaio pode representar, portanto, um

padrão de infecção não resolutivo.

O quadro histopatológico dos linfonodos nos animais tratados com o lapachol

chamou atenção pela presença de extensas áreas de necrose e apoptose. Esta necrose tanto

pode indicar um importante fator no controle da infecção por mecanismo adquirido de

imunidade celular efetiva, como pode representar um elemento na patogênese da LT ou

ambos. Rocha (1998), estudando linfonodos de pacientes com a forma bubônica de LT,

pôde detectar níveis elevados de TNF-α (fator de necrose tumoral-α) bem como extensa

necrose, principalmente quando o tempo de evolução excedia 7 semanas. Esta citocina

funciona como um importante mediador pró-inflamatório, e em níveis elevados, promove

extensa necrose tumoral e, eventualmente, de tecidos normais. Além disso, pode induzir

apoptose e, ou necrose isquêmica por coagulação intravascular que afeta a microcirculação

local (Abbas et al., 1991). A apoptose deve desempenhar papel significativo na contenção

da replicação da Leishmania, bem como, na regulação da resposta inflamatória, uma vez

que inibe a secreção de citocinas quimiotáticas, como a IL-8 (interleucina-8), diminuindo,

53

desta maneira, o recrutamento de células fagócitas (Savill, 1997). É possível que o quadro

histopatológico encontrado nos linfonodos dos animais tratados com o lapachol, possa

representar mais um fator na patogênese da doença, dado que, apesar da necrose e apoptose

observados, não houve redução significante na carga parasitária.

Diferentemente dos achados histopatológicos dos baços, nos linfonodos dos animais

do grupo controle infectado foram encontradas marcantes hiperplasia folicular e

plasmocitose, com ausência de hiperplasia paracortical (área de linfócitos T), sugestivo de

uma resposta imunológica tipo TH2. Tais resultados suscitam a hipótes de que,

possivelmente, em hamsters, estes dois compartimentos, baço e linfonodo, respondam de

maneira diferente à infecção por Leishmania.

Sousa et al. (1995) encontraram em pacientes com LT um quadro de doença

sistêmica, caracterizado por perda de peso, linfadenopatia e discreta hepatoesplenomegalia,

sugerindo uma disseminação linfo-hematogênica da L. braziliensis ainda no período inicial

da infecção. Os nossos achados indicam que, em muitos aspectos, a doença experimental

causada por L. braziliensis no hamster, se assemelha àquela encontrada no homem. Nos

animais de todos os grupos, já era possível detectar linfonodos palpáveis e lesões ulceradas

a partir da primeira e terceira semanas de infecção, respectivamente, assim também como

perda de peso. Entretanto, apenas os animais do grupo controle infectado apresentaram

uma significativa perda de peso (p = 0,0160), perdendo em média 18% (20,1g) do seu peso

inicial. A excessiva perda de peso na leishmaniose visceral por L. chagasi ou L. donovani,

tem sido relatada tanto em humanos quanto experimentalmente (Shukina & Gorbunova,

1987; Pearson et al., 1990; Pearson et al., 1992), entretanto, este trabalho é, de acordo com

o nosso conhecimento, o primeiro a demonstrar esta característica em hamsters infectados

por L. brazilensis. Possivelmente, citocinas como TNF-α, IL-1β e IL-6 podem estar

envolvidas na perda de peso encontradas nos animais deste trabalho, uma vez que já são

conhecidas como algumas das citocinas que contribuem para a intensa caquexia que

acompanha as doenças parasitárias crônicas (como leishmaniose visceral), infecções virais

e neoplasias (Tracey & Cerami, 1989; Pearson et al., 1990; Tilg et al., 1991; Emilie et al.,

1994; Tisdale, 1999). Estudos posteriores serão necessários para melhor esclarecer estes

achados.

54

Como a ação dos constituintes químicos estudados não foi semelhante nos dois

modelos utilizados, in vitro e in vivo, o modelo de infecção in vivo parece refletir melhor o

potencial terapêutico das drogas, uma vez que as substâncias ficam sujeitas a influência do

sistema imunológico do organismo e as suas propriedades farmacodinâmicas e

farmacocinéticas podem ser melhor visualizadas, sendo, portanto, um modelo mais

adequado à triagem de novas substâncias para o tratamento da leishmaniose.

55

5. CONCLUSÕES

Timol apresentou marcante toxicidade in vitro para macrófagos em doses ≥

0,062mg/ml e efeito anti-amastigota, nas concentrações acima de 0,25mg/ml, que

também foram tóxicas para macrófagos.

Lapachol, Pentostam® e Glucantime® demonstraram, in vitro, significante efeito

anti-amastigota para Leishmania (Viannia) braziliensis, em concentrações não

tóxicas para macrófagos, entretanto, Pentostam® mostrou-se mais tóxico para

macrófagos do que Glucantime®.

Timol e lapachol não mostraram ação terapêutica na infecção experimental por L.

(V.) braziliensis, nas concentrações avaliadas, 14mg/kg/dia e 300mg/kg/dia,

respectivamente, e no modelo in vivo utilizado.

Observou-se toxicidade para o sistema nervoso somente nos animais infectados por

L. (V.) braziliensis e tratados com lapachol, indicando que o estado patológico possa

potencializar essa ação da droga, na concentração utilizada neste trabalho.

Baço e linfonodo parecem responder de maneira diferente à infecção por

Leishmania, enquanto no baço ocorreu intensa hipoplasia da polpa branca, o

linfonodo apresentou marcante hiperplasia folicular.

Lapachol induziu intensa necrose e apoptose no linfonodo, no entanto, não foi capaz

de reduzir a carga parasitária neste sítio.

A leishmaniose tegumentar por L. (V.) braziliensis, no hamster, apresentou-se com

um quadro de linfadenopatia, hepatoesplenomegalia, significativa perda de peso e

ausência de granulomas no linfonodo e baço, mostrando um padrão de infecção não

resolutivo.

56

Não houve correlação entre os modelos in vitro e in vivo para a avaliação do efeito

leishmanicida das substâncias estudadas.

O modelo de infecção in vivo parece refletir melhor o potencial terapêutico das

drogas, uma vez que as substâncias ficam sujeitas a influência do sistema

imunológico do organismo e as suas propriedades farmacodinâmicas e

farmacocinéticas podem ser melhor visualizadas, sendo, portanto, um modelo mais

adequado à triagem de novos constituintes químicos para o tratamento da

leishmaniose.

57

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABBAS, A.K., LICHTMAN, A.H., POBER, J.S. Cellular and Molecular Immunology.

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