وزراة ا����� ا����� و ا�� ا�����
Faculté des sciences Année 2OO7
Département de Chimie
THESE
Présentée en vue de l’obtention du Diplôme de DOCTORAT
Option Chimie Appliquée
Par
SERIDI Achour
DIRECTEUR DE THESE : Mekki KADRI Professeur Université de Guelma
DEVANT LE JURY
PRESIDENT : Mohamed ABDAOUI Professeur Université de Guelma
EXAMINATEURS : Nourredine AOUF Professeur Université de Annaba Fayçal DJAZI Professeur Université de Skikda
Rachid DELIMI Professeur Université de Annaba
BADJI MOKHTAR-ANNABA UNIVERSITY ���ب�-� م���ر���م�� ب� UNIVERSITE BADJI MOKHTAR-ANNABA
Etude Cinétique de Décomposition des 2-Chloroéthylnitrososulfamides « CENS »
Nothing in life is to be feared . It is only to be understood.
Marie-curie (1867-1934)
����
��� �� ��ل ه�� ا��و�� ��را�� �آ�� ���� ل��� 0/ .�ة أو��ط ا� ا �ر*��( ه آ)!روإ&�% ن#وزو �! �����-2
. ا ����9، ا 67!ی� و ا �4! !3/ :���1
7��# ��( ] 14-0[ در�3 ��!ض� �>#)�� �B� /0ل �A@!ر ��� ذات ض!ا�: ���7#��ل0/ �� ی>; ا !�: ا ��9/ و ��
ا��0 ا 9�H)� ا #��.% �I!و��� ا P6: ا �7 / �!ص! � ����Mف ا �#)� و ذات!ا���0��M� �M ا��7L 0!ق ا ��BH��4 و ����J ا �
��� أ��دي ا #��� �� ن!ع أن���( ه�� ا �را�� � ��آ�4ت ا ����B .� ه�ا ��@% ا���س و �اح��� ����� �� , ا #��� ا #� ا
ی�J �1ا ا #��.%�,
و��ن �#���J ا #��� 0/ ا !�: ا 67!ي.)X �ذ ��7 ��اه#���رآWن� #� /H����P� �� و ��ت )4و�!ن و 15 ا ن�� ا
.� ا #��.% ��Z�M ن!.� �� ��Jرن� �� !�: �/9��آ�4ت 0/ ا !�: �4! !3/ ، وا � �� �13 أ�ى در��� �آ�� ���7% ه�� ا
و �� ���( ا �9�#\J4 رن� ا #��.% أن ��!ن أ���� �� �@% رض�[ ا�J� ]ی� 9��ی�J أن ��6A و ا 67!ي و /�� !�: ا �
��� �� ��ل ه�� , ا #��� ��4و ��J7ة ن!.� �� � ��آ�� �یM#� �J!ی �ا��و�و � �7��#� �!ا��M ا �4! !3/ 0/ ا !�: ا #��.%
���Jاج�ا��0 �!ص! � ا�!������ص)_- ��9%ا�#>I!و����((� �(9�H ا ذاتاP6:�(#� ف ا��M� ا �7 / و .
ال ���ت ال�ال�
آ)!روإ&�% ن#وزو �! �����-2 •
آ�� •�
ا #��� •
ا��0 •I!و��� ا �
• ��0��M� �(#� ا
Abstract
Kinetics decomposition of 2-chloroethylnitrososulfamides was studied in the first time on
aqueous buffered solutions with pH ranging from 0 to 14. The study was monitored by RP-LC-MS
and conventional UV-spectrophotometry. The reaction acted via a pseudo first order kinetic with
significant correlation coefficient. The major decomposition product from CENS after incubation
in phosphate buffer were isolated and identified by NMR and mass spectrometry. The results
indicate that the mechanism pathway involves a denitrosation of the CENS and competitive
hydrolysis with nucleophilic attack on the sulfur atom and formation of sulfamate compounds.
As second approach, we study the decomposition in organic media , the kinetics has been
monitored by NMR spectroscopy of proton and isotopic labelled nitrogen . Our first observation
show that the kinetics is complex and acted very slowly comparatively to the aqueous and
biological media. The use of LC-MS as separative and analytical technique shows several product
which have been tentatively identified and a general mechanism has been proposed.
In addition, we have examined the kinetics decomposition of 2-chloroethylnitrososulfamides
in calf foetal serum. The study was monitored by on-line solid phase extraction linked to RP-LC-
MS. These results indicate that the in-vitro stability of CENS in calf fetal serum is less than in
aqueous buffer at pH=7.4 and 37°C. We have attribueted this to the catalysis by serum proteins and
enzymes. We have shown that partition coeficient of CENS can be coorelated to the kinetics
decomposition, so we observe that the stability is greater for more lipohilic CENS. The major
metabolites after decomposition have been tentatively identified by RP-HPLC-MS. The mechanism
pathway is more complex than in aqueous phosphate buffer ,our first observation indicate the
formation of severable metabolites .We have also observed that in this biological media we can
avoid the same two principals products leaded from the decomposition of CENS in aqueous
phosphate media.
Key- words : Kinetics; Decomposition; Chloroethylnitrososulfamides; LC-MS; On-line solid phase
extraction
Résumé
Dans ce travail de thèse, nous avons étudié la cinétique de décomposition des 2-
Chloroethylnitrososulfamides CENS dans divers milieux (aqueux, organique et biologique). Dans
un premier temps, la cinétique a été étudiée dans le milieu aqueux avec à des pH contrôlés
s'étendant de 0 à 14. L'étude a été menée par RP-LC-MS et spectrophotométrie UV
conventionnelle. La décomposition se fait selon une cinétique de pseudo premier ordre avec des
coefficients de corrélation significatifs. Les principaux produits issus de cette décomposition après
incubation dans la solution tampon de phosphate (pH=7.4 ; T=37°C) ont été isolés et parfaitement
identifiés par spectrométrie RMN et de masse. Les résultats indiquent que le mécanisme implique
une dénitrosation des CENS de départ et une hydrolyse concurrentielle du à l'attaque nucléophile
sur l'atome de soufre et la formation du sulfamate.
Nous nous sommes également intéressé au comportement cinétique des CENS dans le
milieu organique, la RMN du proton et de l’azote marqué ont été exploité pour élucidé le
mécanisme qui apparaît très complexe ; le suivie nous a montré qu’il s’agit d’une cinétique assez
lente donc nos interprétations été plutôt qualitative . En utilisant la LC-MS comme technique de
séparation et d’analyse nous avons pu détecter quelques fragments et un mécanisme général a été
proposé sur la base de ces observations.
D’autre part, nous avons examinés la cinétique de décomposition des CENS dans du sérum
de veaux foetal, L'étude a été menée par une technique d'extraction en ligne sur phase solide liée à
la RP-LC-MS. Ces résultats indiquent que la stabilité in- vitro des CENS dans le sérum est moins
importante que dans le milieu phosphate (pH=7.4 et à 37°C) et organique. Nous avons attribué
ceci à la catalyse par des protéines et des enzymes de sérum. Nous avons prouvé également que la
lipophilie des CENS peut être corrélée à la cinétique de décomposition, ainsi nous avons observés
que la stabilité est plus grande pour les CENS les plus lipophile. Les principaux métabolites après
décomposition ont été tentitativement identifiées par RP-HPLC-MS. Le mécanisme est plus
complexe que dans le milieu aqueux et organique, notre première observation indique la formation
de plusieurs métabolites. Nous avons également observé que dans ce milieu on peut avoir les
mêmes deux produits trouvés lors de la décomposition des CENS dans le milieu aqueux
phosphate.
Mots–Clé : Cinétique; Décomposition; CENS; LC-MS; extraction sur phase solide on-ligne.
REMERCIEMENTS
Cette thèse a été effectuée en partie au sein du Laboratoire de Chimie Biomoléculaire de
l’Université de Montpellier II sous la direction du Professeur : Jean-Louis Montero. Je le remercie
de m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et de m’avoir accordé sa confiance pendant ces dix
huit mois de formation. Je lui suis reconnaissant pour les conseils qu’il m’a prodigués et l’attention
constante qu’il a portée à ce travail. Qu’il trouve dans ces quelques mots l’expression de mes plus
sincères remerciements.
J’adresse tout particulièrement mes profonds remerciements au Professeur Mekki Kadri
de m’avoir encadré et supporté toutes ces années, pour la liberté d’action qu’il m’as laissé, et je le
remercie de m’avoir initié à la recherche et permis de mener à bien cette thèse. Ces conseils, sa
rigueur scientifique et les nombreux encouragements qu’il m’a prodigués ont été une aide précieuse
et indispensable.
J’exprime également mes vifs remerciements au Professeur Mohamed Abdaoui directeur du
Laboratoire de Chimie Appliqué de l’Université de Guelma. Je le remercie de m’avoir autoriser à
utiliser pour mon travail, les composés ayant faits l’objet de sa thèse. Je le remercie de m’avoir
initié et guidé mes premiers pas en synthèse qu’il trouve l’expression de ma parfaite
reconnaissance et ma profonde sympathie
Je tiens à remercier très vivement Monsieur Jean-Yves Winum Maître de Conférences à
l’université de Montpellier II chef d’équipe à laquelle j’ai été intégré pendant ma formation en
France, il été d’un enthousiasme exceptionnel ses précieux conseils ainsi que sa rigueur
scientifique et son efficacité m’ont permis de finaliser cette thèse.
Que Monsieur Nourredine Aouf Professeur à l’Université de Annaba, trouve l’expression
de ma profonde reconnaissance pour avoir accepter de juger ce travail et je n’oublierais pas ses
précieux conseils surtout à mon installation à Montpellier.
Que Monsieur Rachid Delimi, Professeur à l’université de Annaba qui a voulu examiner ce
travail, qu’il trouve ici l’expression ma parfaite considération.
Je suis très sensible à l’honneur que m’a fait le Professeur Fayçal Djazi en acceptant de
juger ce travail, de faire partie du jury de cette thèse et de l’intérêt qu’il manifeste à mon travail.
Je n’oublierai jamais son aide précieuse sans lui je n’aurai obtenu cette formation.
Evidemment, je n’oublie pas le Docteur Gilles Valettes, pour ses précieux conseils pour la
manipulation en HPLC-MS.
J’exprime également mes remerciements au ministère de l’enseignement supérieur et de la
recherche scientifique d’avoir financé tout mon séjour en France dans le cadre du programme
intergouvernemental (BAF)
Un grand merci à Madame Nicole Imparato du service accueil international de Montpellier
qui a facilité mon séjour à Montpellier et a géré mon dossier durant toute la période de formation
.
Je voudrais également exprimer toute ma sympathie à mes compagnons de thèse et de
travail que j’ai eu le plaisir de rencontrer au laboratoire, Nabila, Antoine, Marie-rose, Catalina,
Simon, Audrey, Hicham, Jean-Luc et tous les autres.
Je voudrais exprimer à toute ma famille, et plus particulièrement mes parents, ma profonde
reconnaissance pour le soutien qu’ils m’ont apporté en toute circonstance. Qu’ils trouvent dans ce
travail le témoignage de mon affection
A la mémoire de mon oncle : SERIDI A/Aziz
A la mémoire de mon grand père : BEHLOUL Brahim
A mes parents
A mes frères et sœurs
A mon épouse
A la petite Rayenne
Liste des annotations et des abréviations
• Abs : Absorbance
• ADN : Acide désoxyribonucléique
• ARN : Acide ribonucléique.
• ACN: Acétonitrile
• BCENU : Bis-chloroethyl nitrosourée
• BCGNO : 1-Nitroso-methyl-3-benzoylguanidine
• Boc : Tertiobutyloxycarbonyle
• CENU : 2-Chloroéthylnitrosourée
• CENS : 2-Chloroéthylnitrososulfamide
• CES : 2-Chloroethylsulfamides.
• C.C.M : Chromatographie sur couche mince.
• DiBn : Dibenzyle
• DEAD : Diéthylazodicarboxylate
• DIAD : Disopropylazodicarboxylate
• ESI: Electrospray ionisation
• HPLC : High performance liquid chromatography
• H.L.B : Hydrolipophyl balanced polymer
• ICS: Isocyanate de chlorosulfonyle
• kobs : Constante de vitesse observée
• Log P : Coefficient de partage
• LC-MS: Chromatographie liquide couplé à la spectrométrie de masse.
• MeOH : Methanol
• NADH: Nicotinamide adénine dinucléotide.
• NICE-Nu : Nitroimidazole chloroethylnitrosourées
• MNU : Methyl Nitrosourée
• MNTS : N-methyl-N-nitroso-p-toluene sulfonamide
• MNNG: N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine.
• MS: Mass spectroscopy
• Nd : Non déterminé.
• n.m : Nanométre
• Ph : Phényle
• PPh3 : Triphénylphosphine
• P.D.A: Photodiode array (détecteur à barrette de diode)
• p.p.m: Partie par million
• Rf : Rapport frontale
• RMN 1H : Résonance magnétique nucléaire du proton.
• RMN 15N : Résonance magnétique nucléaire de l’azote marqué.
• RP-LC-MS : Chromatographie en phase inverses couplée à la masse.
• S.P.E: Extraction sur phase solide.
• t-Bu : Tertiobutyl
• THF : Tétrahydrofuranne
• TEA : Triéthylamine
• TIC : Total ionic chromatogram
• t1/2 : Temps de demie vie (temps de demie réaction)
• TSGNO : N-nitrosoguanidine, 1-methyl-3-tolylsulfonylguanidine
• TFA : Acide trifluoroacétique
• UV-PDA : Détecteur ultraviolet à barretes de photodiode.
• Z : Amine (aromatiques et aliphatiques), aminoacide ou phénol
• λmax : Longueur d’onde correspondante au maximum d’absorption.
Listes des schémas
• Schéma (1) : Les CENS utilisé dans notre étude…………………………………. 3
• Schéma (2) : Mécanisme de la décomposition des CENU selon la voix A…….... 8
• Schéma (3) : Mécanisme de la décomposition des CENU selon la voix B……..... 9
• Schéma (4) : Mécanisme de décomposition des CENU selon la voix C…………. 10
• Schéma (5) : Hydrolyse et réduction de la BCENU… …...................................... 11
• Schéma (6) : Hydrolyse et réduction de la BCENU Bis-méthylé..……………… 11
• Schéma (7) : Hydrolyse et réduction de la BCENU Bis-méthylé marqué 18O……12
• Schéma (8) : Mécanisme de décomposition de l’oxadiazole…………………...... 12
• Schéma (9) : Modification de la décomposition des CENU……………………... 13
• Schéma (10): Dialkylation enzymatique des CENU…………………………….. 14
• Schéma (11) : Décomposition des Alkylnitrosourées……………………………. 14
• Schéma (12) : Décomposition des MNU…………………………………………. 15
• Schéma (13) : Décomposition des MNU en milieu basique ………………......... 16
• Schéma (14) : Décomposition des MNU via l’intermédiaire tetrahedral………… 16
• Schéma (15) : Mécanisme globale de la décomposition des NICE-Nu ………… 17
• Schéma (16) : Décomposition des NICE-Nu……………………………………. 17
• Schéma (17) : Décomposition des nitrososulfonamide selon le mécanisme 1…… 18
• Schéma (18) : Décomposition des nitrososulfonamide selon le mécanisme 2..….. 19
• Schéma (19) : Décomposition des nitrososulfamates en milieu aqueux………… 19
• Schéma (20) : Mécanisme de décomposition nitrososulfamates………………… 20
• Schéma (21) : Décomposition des Nitrophenylsulfonyl ethyl ether……………... 21
• Schéma (22) : Mécanisme de dégradation oxydative des sulfamides……………. 22
• Schéma (23) : Schéma de fragmentation en spectrométrie de masse……………..23
• Schéma (24) : Mécanisme d’oxydation des sulfamides………………………….. 24
• Schéma (25) : Mécanisme d’hydrolyse des N-(phénoxycarbonyl) sulfamate…… 25
• Schema (26) : Dégradation des 1,2-Bis (sulfonyl)-1-Alkylhydrazine…………… 26
• Schema (27) : Mécanisme de l’hydrolyse des MNTS…………………………… 27
• Schema (28) : Mécanisme de décomposition des MNNG………………………...28
• Schema (29) : Structure du TSGNO et BCGNO…………………………………. 28
• Schema (30) : Les trois voix de décomposition des MNTS…………………… 29
• Schema (31) : Schéma d’ouverture sulfamide N-substitué s cyclique…………. 29
• Schema (32) : Carbamoylation- sulfamoylation………………………………...... 33
• Schema (33) : Chloroethylation………………………………………………….. 33
• Schema (34) : Déprotection………………………………………………………. 34
• Schema (35) : Nitrosation………………………………………………………… 35
• Schema (36) : Carbamoylation-sulfamoylation-cyclisation…………………….. 36
• Schema (37) : Réouverture des oxazolidinone…………………………………… 37
• Schema (38) : Halogénation……………………………………………………… 37
• Schema (39) : Nitrosation………………………………………………………… 37
• Schema (40) : Synthèse selon la voix C………………………………………….. 38
• Schema (41) : Les éléments d’un système LC-MS………………………………. 41
• Schema (42) : Détecteur de masse type singulier quadripolaire………………... 42
• Schema (43) : Système d’analyse des substances actives par LC-MS…………… 45
• Schema (44) : Schema global pour l’analyse en SPE-LC-MS………………….. 46
• Schema (45) : Interaction protéine analyte avec la phase mobile…………………47
• Schema (46) : Système de vanne automatique utilisé en SPE-LC-MS…………... 50
• Schema (47) : Mécanisme de Décomposition des CENS à pH=7.4;T=37°C)…… 61
• Schema (48) : Mécanisme de dénitrosation des CENS………………..…………. 62
• Schema (49) : Mécanisme d’hydrolyse des CENS ……………………………… 63
• Schema (50) : Stabilisation de la chlorethyldiazoate ……………………………. 65
• Schema (51) : Marquage des CENS à l’azote 15………………………………… 66
• Schema (52) : Résonance des trois azote en RMN de l’azote 15………………… 69
• Schema (53) : Mécanisme de décomposition des CENS en milieu organique ….. 77
• Schema (54) : Mécanisme de décomposition des CENS dans le sérum ………… 83
• Schema (55) : Schéma hypothétique de l’interaction bio-chimique……………... 87
des CENS dans le sérum .
Liste des figures
• Figure (1) : Spectres UV lors de la décomposition en milieu basique…………… 53
• Figure (2) : Spectres UV lors de la décomposition en milieu acide……………… 53
• Figure (3) : Spectres UV lors de la décomposition en milieu neutre…………….. 54
• Figure (4) : Profil du pH des composés étudiés ………………….……………... 55
• Figure (5) : Evolution du chromatogramme du composé1 en fonction du temps... 56
• Figure (6) : Variation de la surface du pic en fonction du temps………………… 59
• Figure (7) : 1-Chromatogramme du composé 2 après 72h de réaction ………… 60
2-Chromatogramme du CES pur préparé par voie de synthèse.
• Figure (8) : Spectre RMN 15N du composé 1 dans ACN………………………… 67
• Figure (9) : Spectre RMN 15N du composé 1 dans MeOH……………………….. 68
• Figure (10) : Spectre RMN 15N du composé 2 dans ACN……………………….. 68
• Figure (11) : Spectres RMN1H montrant l’évolution cinétique………………….. 71
du composé 1 à T° ambiante.
• Figure (12) : Chromatogramme HPLC des différents composés………………... 75
dans l’acétonitile à température ambiante après 15 .
• Figure (13) : Evolution en fonction du temps du chromatogramme…………….. 81
de la décomposition du composé 2 incubé dans du sérum de vœu fœtale à 37°C
• Figure (14) : Evolution de la surface du pic en fonction du temps ........................ 87
pour le composé2
Table des matières
Introduction ……………………………………………………………………………... 2 Chapitre (1) : Rappels bibliographiques sur la décomposition des composés………. 6 apparentés aux CENS.
1.1.Décompositions des Chloroéthylnitrosourées…………………………7 1.1.1. Mécanisme A………………………………………………. 8 1.1.2. Mécanisme B……………………………………………….. 9 1.1.3. Mécanisme C……………………………………………….. 10 1.1.4. Compétition des trois mécanismes……………………......... 10 1.1.5. Modifications de la décomposition des CENU….…………. 12 1.2. Décomposition des Alkylnitrosourées…………………………......... 14 1.3. Décomposition des nitroimidazoles chloroéthylnitrosourées……….. 16 1.4. Décomposition des nitrososulfonamides…………………………..... 18 1.5. Décomposition des nitrososulfamates………………………………. 19 1.6. Décomposition des Nitrophenylsulfonyl éthyl ether………………... 20 1.7. Décomposition oxydative des sulfamides.…………………………... 21 1.8. Décomposition des N-(phénoxycarbonyl) sulfamates.……………... 24 1.9. Décomposition des 1,2-Bis (sulfonyl)-1-Alkylhydrazine…………… 25
1.10.Décomposition des MNTS et MNNG………………………………..27 1.11.Décomposition des N-substitués sulfamides Cycliques.……............. 29
Chapitre (2) : Synthèse des CENS……………………………………………………... 31 2.1.Synthése selon la voix A…………………………………………….... 32 2.1.1.Carbamoylation sulfamoylation…………………………...... 32 2.1.2.Chloroethylation selon Mitsunobu………………………...... 33 2.1.3.Déprotection………………………………………………… 34 2.1.4.Nitrosation…………………………………………………... 35 2.2.Synthése selon la voix B……………………………………………… 35 2.2.1.C arbamoylation-sulfamoylation-cyclisation ……………….. 36 2.2.2.Réouverture des oxazolidinones……………………………. 36 2.2.3.Halogénation………………………………………………... 37 2.2.4.Nitrosation…………………………………………………... 37 2.3.Synthése selon la voie C……………………………………………… 38 Chapitre (3) : Les outils d’analyses…………………………………………………….. 40 3.1. Analyse par spectrophotométrie UV-visible…………………………. 41 3.2. Analyse par LC-MS des CENS……………………………………….41 3.2.1. Mise au point de la méthode……………………………….. 42 3.2.1.1. Choix de la colonne………………………………. 42 3.2.1.2. Choix de la phase mobile………………………… 42 3.2.1.3. Gradient d’élution................................................... 43 3.2.1.4. Choix du débit......................................................... 43 3.2.1.5. Choix de la température…………………….......... 43 3.3. Analyse par HPLC de la décomposition des CENS ………………… 44 en milieu biologique. 3.3.1. Le couplage on-line Cleaning LC/UV/ESI-MS……………. 44 3.3.2. Mise au point de la méthode d’analyse……………………. 47 3.3.3. Choix de la précolonne………………………………….… 48 3.3.4. Choix de la phase stationnaire……………………………... 49 3.3.5. Choix de la phase mobile…………………………………... 49 3.3.6. Gradient d’élution………………………………………….. 49
3.3.7. Choix de la température……………………………………. 50 3.3.8. Choix du débit……………………………………………… 50 3.3.9. Le système de vanne automatique…………………………. 51 3.4. Analyse de la décomposition par RMN……………………………………… 52 3.4.1. La RMN du proton ………………………………………………… 52 3.4.2. La RMN de l’azote marqué………………………………………… 52 Chapitre (4) : Décomposition des CENS dans le milieu aqueux …………………….. 53 4.1. Suivi cinétique par spectrophotométrie UV-visible…………………………. 54 4.1.2. Traitement des données cinétiques………………………………… 56 4.2. Suivi par LC-MS……………………………………………………………...57 4.3. Identifications des produits issus de la décomposition des CENS…………... 61 4.4. Mécanisme de décomposition proposé………………………………………. 62 Chapitre (5) : Décomposition des CENS en milieu organique……………………….. 64 5.1. Décomposition en présence du KOtbu………………………………………. 65 5.2. Décomposition en milieu acide organique…………………………………... 66 5.2.1. Marquage régiosélectif des CENS…………………………………. 66 5.2.2. Suivi par RMN de 15N………………………………………………66 5.3. Décomposition en milieu organique neutre …………………………………. 70 5.3.1. Suivi par RMN du proton………………………………………….. 70 5.3.2. Suivi par HPLC-ESI-MS…………………………………………... 74 Chapitre (6) : Décomposition des CENS dans le milieu biologique………………...... 80 6.1. Suivi par SPE-LC-MS ………………………………………………………. 80 6.2. Cinétique et lipophilie ………………………………………………………. 84 Conclusion Générale…………………………………………………………………… 89 Parie expérimentale …………………………………………………………………….. 91 Références Bibliographiques………………………………………………………….... 99 Annexe…………………………………………………………………………………… 108
INTRODUCTION GENERALE
Introduction
Les 2-Chloroéthylnitrosourées (CENU) sont des agents alkylants bi fonctionnels
présentant une activité sur un large spectre de tumeurs. Plusieurs d’entre elles sont
couramment utilisées en clinique dans le traitement des mélanomes malins, lymphomes,
adénocarcinomes métastasiques, cancers du système gastro-intestinaux, et quelques autres
tumeurs solides [11-27].
Malheureusement, les CENU n’ont pas seulement une activité antinéoplastique
mais également muta génique et cancérogène. D'ailleurs, leur efficacité thérapeutique est
associée lors de leur décomposition à la génération de deux espèces chimiques
électrophiles. Une première espèce (ion éthylchloronium) qui va alkyler l’ADN et former
des ponts inter et intracaténaires, contribue à l’activité antitumorale. La deuxième espèce
(isocynatate) est responsable quant à elle de la carbamoylation des protéines,
essentiellement les enzymes de réparation.
Cette réaction de carbamoylation n’intervient pas dans l’activité antitumorale, mais
a été largement mise en cause dans la toxicité associée à ces composés (myélotoxicité)
empêchant ainsi les poursuites de traitements
Sur la base de ces observations, une nouvelle famille d’agents alkylants
structurellement analogues aux 2 chloroethylnitrosourées (CENU) mais exempte de toute
activité carbamoylante, a été développée. Il s’agit en l’occurrence des 2-
chloroéthylnitrososulfamides (CENS) [6-7].
Leur synthèse a été largement décrite, et leur évaluation in-vitro s’est avérée très
encourageante comparés à des CENU utilisés en clinique [6-10].
Pour apporter une meilleure évaluation clinique et prévoir le mode d'action des
CENS, des études cinétiques sur leur décomposition dans différentes conditions sont
nécessaires.
18
Les trois CENS ayant fait l’objet de notre travail sont choisis (schéma 1) en raison
de leur meilleur activité in-vitro sur les variétés de cellules mammaires A549 et
pulmonaire MCF7, comparés aux CENU [7]. Il s’agit de composés suivants :
• Composé (1): N-nitroso , N-(2-chloroethyl) , N’-sulfamoyl pipéridine
• Composé (2): N-nitroso , N-(2-chloroéthyl),N’,N’-dibenzylsulfamide
• Composé (3): N-nitroso , N-(2-chloroéthyl),N’,N’-dicyclohexylsulfamide
Schéma (1) : CENS utilisés dans notre étude
Le travail présenté commence d’abord par une étude de décomposition en milieux
aqueux acide, neutre et basique. Le suivi cinétique par spectrophotométrie directe montre
qu’à l’instar de leurs analogues [11,22,23,25,39], les CENS subissent une catalyse acido-
basique généralisée. A cet effet, il a été également instructif de mettre en évidence le
comportement du nouveau motif introduit en chimie =NSO2N(NO)- .
La difficulté de la détermination des différentes espèces formées a été surmontée en faisant
recours au couplage de la chromatographie liquide de haute performance (HPLC) à la
spectrométrie de masse (MS).
En milieu organique, la décomposition des CENS été suivie en combinant une
variété d’outils d’analyse, il s’agit en l’occurrence de la RMN de l’azote marqué, la RMN
du proton et la chromatographie liquide couplée à la masse (LC-MS).
N NClS
O O
NO
N NClS
O
NO
O
N NClS
O
NO
O
1 2
3
19
D’autre part, pour nous rapprocher davantage du milieu biologique et avoir une
idée sur les interactions qui pourraient y avoir lieu, nous avons identifié les espèces
formées suite à la décomposition des CENS dans le sérum de veau fœtal. A cet effet, nous
avons développé une méthode d’extraction en ligne reliée automatiquement à la
chromatographie liquide à phase inverse couplée à la spectrométrie de masse (RP-LC-MS-
ESI).
La thèse est composée de six chapitres :
• Rappels bibliographiques sur la décomposition des composés apparentés aux CENS.
• Synthèse des CENS.
• Outils d’analyses
• Décomposition des CENS dans le milieu aqueux
• Décomposition des CENS en milieu organique
• Décomposition des CENS dans le milieu biologique
Le premier chapitre de cette thèse rassemble une recherche bibliographique sur la
décomposition des analogues structuro fonctionnels aux CENS. Une attention particulière
a été accordée aux chloroéthylnitrosourées, en raison de leur forte parenté structuro
fonctionnelle aux CENS. Nous nous sommes également intéressés aux nitrososulfamates ,
et aux nitrososulfonamides ainsi que d’autres sulfamides qui nous ont orientés dans les
interprétations mécanistiques et cinétiques.
Le second chapitre comporte une description des trois voies d’accès aux CENS et
une comparaison entre elles.
Le troisième chapitre est une présentation de divers outils analytiques utilisés il
s’agit de la spectrophotométrie UV-Vis , la HPLC et de sa mise au point ( choix de la
colonne , phase mobile etc ..) , la HPLC couplée à la masse (LC-MS), et la technique
d’extraction en ligne sur phase solide utilisée lors de la décomposition des CENS en
milieu biologique.
20
Le quatrième chapitre comporte l’étude de la décomposition des CENS en milieu
aqueux à des pH contrôlés .Il rassemble tous les résultats et les discussions nécessaires.
La décomposition dans le milieu organique a fait l'objet du cinquième chapitre. La
combinaison de la RMN de l’azote marqué et la RMN du proton ont été les outils de
choix pour notre investigation. La combinaison de ces méthodes avec la LC-MS nous a
permis d’établir un mécanisme de décomposition dans ce milieu.
Dans le dernier chapitre, nous avons décrit l’étude cinétique de décomposition en
milieu physiologique. A cet effet nous avons adapté la technique HPLC basée sur le
nettoyage en ligne couplée à la chaîne LC-MS pour les études cinétiques.
Enfin, la dernière partie de cette thèse comporte une conclusion générale et une
partie expérimentale où sont rassemblés tous les protocoles expérimentaux.
21
CHAPITRE (I)
Rappels bibliographiques sur la décomposition des
composés apparentés aux CENS.
22
Dans ce chapitre nous allons exposer les différents travaux décrits dans la littérature
liés à la décomposition des analogues structuro fonctionnels des CENS.
Il est important de signaler qu’aucune indication n’a été donnée dans la bibliographie
concernant la cinétique de décomposition des CENS.
Certains composés étudiés comportent le motif nitrososulfonyl , d’autres par
contre contiennent dans leur structure les deux motifs chloroéthyl, et nitroso à la fois. Les
activités biologiques de ces composés et leurs mécanismes de décomposition ont été
décrites.
I.1.Décomposition des Chloroéthylnitrosourées:
Les Chloroéthylnitrosourées (CENU) présentent une grande analogie structuro
fonctionnelle avec les CENS. On peut escompter une analogie entre leurs mécanismes de
décomposition et entre leurs modes d’action. Les études de décomposition des CENU
nous servirons de balises pour le comportement des CENS
Depuis les travaux de Montgomery et coll. 1967, [25] sur la synthèse et la
décomposition des CENU , Brundett et Colvin [21] ont complété et exploré d’autres
modes de décomposition probables. Par la suite l’équipe dirigée par Lown [11, 12, 14, 35]
s’est largement intéressée à la décomposition des CENU par l’emploi des techniques
instrumentales modernes notamment la RMN de l’azote 15, le carbone 13 et l’oxygène 18.
Le marquage isotopique spécifique s’est avéré un outil puissant pour suivre et
comprendre les phénomènes souvent complexes en solution.
Par ailleurs, l’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse couplée à la masse pour
les produits volatiles, a permis de proposer un autre mécanisme plausible. Les auteurs ont
discuté les possibilités de chacun des mécanismes compétitifs [11].
Les études entreprises, dans leur majorité, ont montré d’une manière générale que
la décomposition dépend de la nature du milieu, de la température et aussi du pH des
solutions aqueuses. En effet, il a été établi que la stabilité des CENU en milieu aqueux est
fortement dépendante du pH. Ainsi, par exemple la Bis-Chloroéthylnitrosourées (BCENU)
est relativement stable à pH=4.5 avec un temps de demie vie supérieure à 500 min, par
contre à pH=7.4 et 8 les temps de demie vie sont respectivement de 50 et 5 min.. A des
pH fortement acides (pH < 2) la BCENU se décompose en quelques secondes.
Pour mieux cerner et expliquer leur mode d’action in-vivo une attention
particulière a été accordée aux mécanismes de décomposition dans des conditions
physiologiques de température et de pH (T=37°C, pH=7.4).
23
Divers mécanismes ont été proposés permettant de comprendre leur mode
d’action et leur réactivité avec les bases de l’ADN en l’occurrence la purine et la
pyrimidine.
Pour pH > 5, trois mécanismes de décomposition ont été proposés (A-C) schéma (2, 3, 4)
[11].
1.1.1. Mécanisme (A) :
Ce mécanisme est caractérisé par une décomposition initiale pour donner le
diazohydroxyde et l’isocyanate. Il est considéré comme étant le mécanisme le plus
probable sous les conditions physiologiques (schéma 2). L’entité isocyanate est une
espèce carbamoylante qui peut réagir avec les acides aminés et l’ARN in- vivo.
Par contre, le diazohydroxyde est l’espèce alkylante considérée comme étant le
précurseur de l’ion chloronium responsable de l’activité anticancéreuse des CENU.
O
C NCH2CH2Cl
O
N
NR
H
NR C O ClCH2CH2N N OH2 ClCH2CH2 ClCH2CH2OH
ClCH2=C + H3O
ClCH2CH2ClClCHCH3
H2O -HCl
H2O
-H
Cl
CH3CH O
H2O
-N2
-H2O
Isocyanate Chloroéthyldiazohydroxyde
Schéma (2) : Mécanisme de la décomposition des CENU selon la voix A
24
1.1.2. Mécanisme (B) :
Ce deuxième mode de décomposition minoritaire, proposé par Brundret et Colvin
[21]. Le groupement nitroso subit une réaction de déplacement intramoléculaire pour
donner 1,2,3-oxadiazolidine.
La suite de la fragmentation donne le 4,5-dihydro-1,2,3- oxadiazole comme
intermédiaire réactif qui se décompose en milieu aqueux pour donner le 2-
hydroxyéthyldiazohydroxyde (OHCH2CH2OH). Le dernier intermédiaire peut se dégrader
via le carbocation (2-Hydroxyethyl) pour donner l’oxyde d’éthylène, l’éthylène glycol et
l’acétaldéhyde qui ont été détectés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la
masse [11].
C N
O
NR
H
ON
Cl
N
ON
NR C OClCH2CH2
N NOH2
OHCH2CH2OH
H2O
-N2-H2O
O
C NCH2CH2Cl
O
N
NR
H
Oxadiazolidine
Schéma (3) : Mécanisme de la décomposition des CENU selon la voix B
25
1.1.3. Mécanisme (C)
Le troisième mode de décomposition passe par une cyclisation intramoléculaire de
l’oxygène du carbonyle et un déplacement de l’halogène pour produire les 2-
(alkylimino)nitrosooxazolidines [11].
O
N
NR
N
NR C O ClCH2CH2N N
OH2
H2C CH
-N2-H2O
CH3CH O
O
O
C NCH2CH2Cl
O
N
NR
H
Schéma (4) : Mécanisme de décomposition des CENU selon la voix C
1.1.4. Compétition des trois mécanismes :
Des expériences intéressantes ont été conduites pour déterminer l’importance relative
des mécanismes A, C et leur compétition avec le mécanisme B, en prenant comme
exemple le cas de la BCENU.
Cette expérience consiste à hydrolyser le composé BCNU-β-β’-D4 deutéré dans
l’H 218O à pH 7.1 et T=25°C. L’hydrolyse est à 99% et l’acétaldéhyde formé a été
immédiatement réduit en éthanol en présence de la déhydrogénase d'alcool de foie et du
NADH dans le but d’éviter tout échange entre les atomes 18O-16O du groupement carbonyl,
(schéma 5).
26
ClCD2CH2N C NCH2CD2Cl
O
HN
O
H218O
pH 7.2
Dehydrogénase d'alcool
NADHCH2D CDHOH + CH3D CDHOH
A+C B
=7921
18O 16O79% 21%
Schéma (5)
Les analyses par chromatographie en phase gazeuse couplé la masse (GC-MS) des
composés dont les atomes sont marqués au deutérium et à l’oxygène 18O , ont révélé que
les deux types d’éthanols formés par la suite de la décomposition de la BCENU, en
l’occurrence le CH3DCDHOH et le CH3CDHOH , contiennent 79±10% d’18O et
seulement 21±10% pour l’16O. Cela peut être expliqué par le fait que l’incorporation de
l’oxygène 18O externe (H218O) passe par le mécanisme A ou C, le passage par le
mécanisme B étant peu probable. Ainsi, la proportion relative des trois mécanismes
est de : A+C/B= 79:21.
D’autre part, la décomposition d’un dérivé substitué ( BCENU bis méthylée ) sous
les mêmes conditions, donne du propanol contenant 11% d’18O et 89% 16O (schéma 6)
ClCH2CHN C NCHCH2Cl
O
HN
O
H218O
pH 7.2
Dehydrogénase d'alcool
NADH
CH3 CH3 A+C B
=1189
18O 16O 11% 89%CH3CH2CH2OH +
Schéma (6)
Ce résultat indique que le mécanisme B est favorisé à : B/A+C = 89/11. Dans ce
cas, la cyclisation intramoléculaire et le passage par l’intermédiaire 1,2,3-oxadiazole est
fortement concerté compte tenu de l’effet stérique.
Les auteurs se sont intéressés également à la décomposition des CENU marqués au
niveau du motif N=O18 et la cinétique a été menée dans l’H216O (schéma 7). Les produits
de décomposition sont CH3CDHCDHOH et CH3CH2CDHOH contenant 88±10% d’18O et
27
seulement 12%±10% d’16O ce qui implique une prédominance du mécanisme B avec une
proportion de 88/12.
ClCD2CHNH C NCHCD2Cl
O
HN
18O
H216O
pH 7.2
Dehydrogénase d'alcool
NADHCH3D CDHOH +
CH3 CH3
CH3CH2CDHOH
A+C B
=1288
18O 16O88% 12%
Schéma (7)
Ces observations faites pour le CH2DCDHOH éthanol et le CH3CH2CDHOH
propanol indiquent que l’intermédiaire 1, 2,3–oxadiazole peut se décomposer
partiellement selon (le schéma 8).
O
N
N
D
H
HD
O
N
N
D
H
DH
H2O
HO N NHC
HC OH
D D
CH2D-CHD-OH-N2
-H2O
Schéma (8)
1.1.5. Modifications de la décomposition des CENU :
Une attention particulière a été accordée à la décomposition des CENU via le
passage par l’intermédiaire alkanediazohydroxyde selon la voie A, sans exclure pour
autant les voies B et C [11].
28
D’après les mécanismes proposés , seule la voie A donne naissance à l’alcane
diazohydroxyde qui contient la chaîne 2-haloéthyl , l’ultime responsable du pontage de
l’ADN , expliquant ainsi l’origine de l’activité anticancéreuse de cette classe de composés .
En revanche, les intermédiaires 1, 2, 3, oxazodiazoline et 2-imino-nitrosooxazolidinone
provenant des voies B et C ne génèrent pas l’entité alkylante.
Le pontage de l’ADN in-vivo engendré principalement par l’éthyle N-(2-
chloroethyl)-N-nitrosocarbamate donne seulement 12% de pontage , par contre 28% en
présence des thiols.
En effet, d’après le mécanisme (schéma 9), la présence des thiols augmente
l’attaque nucléophile sur le groupement carbonyle du carbamate, et donne ainsi une
fragmentation plus importante qui produit l’entité diazohydroxyde ce qui implique une
augmentation du pourcentage de pontage.
N CR OEt
ON
O N CR OEt
OHN
O
N CR OEt
OHN
O
N
N
HO
R
N
N
HO
R
C
O
OH
OEt
C
O
SR'
OEt
SR'
OH
R'SH
28%de pontage de l'ADN
H2O
12% de pontage de L'ADN
Schéma (9)
En introduisant un radical R en position N3, la décomposition sera affectée de telle
sorte que les intermédiaires diazohydroxyde et l’isocyanate ne sont pas observés. De tels
composés, exigent une dealkylation enzymatique avant l’action anticancéreuse (schéma
10).
29
R1
N NR3
NOR2
O
R2
N NR3
NH
OR1
H2OOH
O
H
R2
N O
O
N
N
OH
R3
H H
R2
N NR3
NOH
O
R2NH2 +CO2
i=Dealkylation enzymatique
i
Schéma (10)
I.2. Décomposition des Alkylnitrosourées en milieu aqueux:
J. K. Snyder et L. M. Stock [22,23] ont montré que la décomposition des
alkylnitrosourées est catalysée en milieux acide et basique. La cinétique de
décomposition des N, methyl-, N, N’-dimethyl-, et N, N’, N’’- trimethyl-N-nitrosourea a
été étudiée en solution aqueuse.
A des pH < 2, les composés N-methyl subissent deux phénomènes : une dénitrosation et
une hydrolyse. La dénitrosation donne la methylurée et l’acide nitreux ; par contre
l’hydrolyse donne principalement la methylamine, de l’azote et du dioxyde de carbone
(schéma 11).
N
N O
C
O
NH2
H3C
CH3NCO + HNO2
CH3NH2 + N2 + CO2
+ H3O+
MNU
Dénitrosation
Hydrolyse
Schéma (11)
Il a été constaté également que la catalyse acide de décomposition de la trimethyl
nitrosourée est plus rapide que pour la N-methyl-N-nitrosourée et que la dénitrosation de
ce composé donne la triméthylamine et de l’acide nitreux. Par ailleurs l’hydrolyse donne
le méthanol, la dimethylamine , l’azote et le dioxyde de carbone [22-23].
En milieu basique en présence de l’ion hydroxyde, la cinétique du mono, di et triméthyl
nitrosourées est de premier ordre. L’hydrolyse donne du méthanol et des dérivés de l’acide
carbamique.
30
Les auteurs se sont également intéressés à l’effet de sels sur la décomposition des
alkylnitrosourées. Les résultats obtenus montrent que leur influence est négligeable
excepté pour le sel de lithium. La vitesse de l’hydrolyse des alkylnitrosourées dépend de
la concentration du sel à pH=9.5.
Par ailleurs, l’effet isotopique du solvant sur la catalyse basique [21] montre qu’il y
ait un échange isotopique entre l’oxygène 18O de l’eau sur le groupement carbonyle de
l’urée (schéma 12)
MnUMNU-18O produits d'hydrolyse
Schéma (12)
Dans un autre travail [22], les mêmes auteurs ont décrit l’influence du groupement
alkyle sur la décomposition en milieu basique de deux N-nitrosourées : N-isopropyl- et N-
tertiobutyl-N-nitosourées . A pH 9.75 les composés subissent une hydrolyse très rapide et
présentent une constante de vitesse kobs > 1s-1. Ces produits se décomposent également en
milieu de chloroforme anhydre. Les groupements alkyles secondaires accélèrent la
réaction de décomposition des N-nitrosourées contrairement aux groupements benzyles ou
allyles pour lesquels les interactions stériques sont très significatives.
Même pour les composés alkylés les dérivés dialkyl sont moins réactifs que le monoalkylé
kobs(DMNU)/ kobs(MNU)= 3.0.10-3
Les N-méthyl-N-nitrosourées (MNU) provoquent la méthylation de l'ADN ; pour
élucider leur mode d'action, la décomposition de ces composés a été étudié en milieu
aqueux. L'hydrolyse suit une cinétique d'une réaction du pseudo -premier ordre [27].
La RMN des atomes marqués a été utilisée pour le suivi cinétique in situ des
intermédiaires réactionnels et des produits formés issus de la décomposition des [13CO]
MNU, [15NH2] MNU et [13CH3] MNU.
La décomposition des MNU est initiée par une déprotonation du groupement carbonyle
suivie d'une hydrolyse catalysée par le milieu basique. Les deux principales espèces
réactives formées sont l'ion methyldiazonium (Me-N2+) et le cyanate (NCO-) (schéma
13).L’incorporation de l’atome deutérium dans le groupement méthyle du MNU a été faite
dans le D2O à des pH très élevés. La méthylation des oligonucléotides dans D2O par la
MNU montre une deutération partielle du N7 du groupe méthyle guanine
31
H2N
N
O
N
CH3
O HN
N
O
N
CH3
ON
N
O
CH3
HOCN
H OCN
Me-N2 + OHCH2N2H
-H+
échange dans D2O
MNU
Schéma (13) : Mécanisme de décomposition des MNU dans l'eau catalysée en milieu basique
H
Par ailleurs, un autre chemin réactionnel passant par un intermédiaire tétraédrique a
été proposé. L’intermédiaire se décompose à son tour en diazoate de méthyle et en
carbamate (schéma 14).
H2N
N
O
N
CH3
O H2N
N
O
N
CH3
ON
N
O
CH3
Me-N2 + OHCH2N2H
MNU H
OH
NH2CO2H
NH3 + CO2
OH
Schéma (14): Décomposition de la MNU induite en milieu basique via l'intermédiaire tetrahedral
1.3. Décomposition des nitroimidazole chloroethylnitrosourées (NICE-Nu) :
La décomposition des NICE-Nu en milieu aqueux donne principalement le
nitroimidazole et l’isocyanate responsable de l’activité carbamoylante [24,82].
Les auteurs ont exploité cette constatation pour évaluer expérimentalement cette activité.
32
L’étude de la décomposition menée par la HPLC a permis de proposer le mécanisme
global suivant (schéma 15).
N
N
CH2
NH
C N
O
NO
N
N
CH2
NH
O ON
N
OH
CH2CH2Cl
+
CH3CHO
ClCH2CH2OH
HOCH2CH2OH
CH2CHClClRR
H2O H2O
Schéma (15)
Il a été prouvé que la formation de l’isocyanate lors de la décomposition des
NICE-Nu est corroborée par la formation de l’urée (schéma 16).
N
N
CH2
HN C N
O
NO
ClN
N
H2C N C
O
N
N
CH2
NH2
N
N
HN
C O
HN
N
N
R R
R
R
R
Schéma (16)
D'une part , l’urée ne peut se former qu’en présence d’une amine et d’une
isocyanate, et d’autre part, les paramètres cinétiques calculés montrent que les NICE-Nu
présentent des temps de demie vie comparables à ceux de la BCNU, CCNU et de la
Chlorozotocine (CZT). Il a été remarqué également la position groupement NO2 sur le
cycle imidazole n'a pas une influence sensible sur la cinétique de décomposition [24,82].
33
1.4. Decomposition des nitrososulfonamides :
La méthode de synthèse des agents alkylants [29-32] très réactifs (carbonium,
nitrilium et oxonium), utilise les produits de la déamination qui donnent des ions
carbonium via la décomposition des N-nitrososulfonamides.
Il a été trouvé que la N-benzyl N-nitrosotrifluorométhane sulfonamide (2) se
décompose à 30°C dans CDCl 3 avec un temps de demie vie ~10-20 minutes , en raison de
cette instabilité ce composé devrait être préparé fraîchement avant toute étude [29-31].
Pour la N-benzyl N-nitroso dinitrobenzenesulfonamide (2’B) le temps de demie vie
(schéma18) dans CDCl 3 à 25 °C est de 6 heures .La nitrosoamide , obtenue suite à cette
décomposition a été isolée sous sa forme cristalline avec un rendement de 90% .
D’autre part, les composés 2A-C présentent presque les mêmes vitesses de
décomposition (temps de demi-vie 13, 11 et 10 min, respectivement à 30°C dans CDCl3).
Ce qui est en faveur du mécanisme suivant:
N SO2R1
N
+R
ON
NR S
R1
OO
O
R+N2-O3SR1
52
Schéma (17)
Et non le mécanisme (schéma18) qui met en évidence l’influence de la nature des
substituants sur le noyau phénylique: [29-32]
34
N
NR S
R1
OO
O
RNHSO2R1 N2R OSO2R1
+NR N-O3SR1R+N2
-O3SR1R-solv
ROSO2R1
a, b 20-30°C
1
2
3
457
6
solv
A, R= C6H5CH2B, R= 4-NO2C6H4CH2-C, R= 3-NO2C6H4CH2-D, R= CH3-
série 1-6 , R1= -CF3
1'-6', R1=
O2N
NO2
a = NaOH et évaporation
b = N2O4 +NaOAC/ CH2Cl2 à -10°C
Schéma (18)
1.5. Décomposition des nitrososulfamates :
L’étude cinétique de décomposition des N-Nitrososulfamates en milieu aqueux est
fonction du pH [30]. Les phénomènes mis en jeu en solution sont complexes notamment
quant à la mise en évidence de la catalyse acide et de la formation de l'alcool.Le
mécanisme de décomposition proposé en milieu acide se résume comme suit le (schéma
19) :
RNHSO2H R N
NO
SO3, K
ROH + N2 + ROSO3,KNO H2O, pH= 2
25°C
R= CH3 ; C6H5CH2; C6H5CH2CH2; C6H5
Schéma (19)
35
Les nitrososulfamates se décomposent rapidement aux pH faibles, les temps de
demi-vie s’étalent de 1 minute à 1 heure. La rapidité de la décomposition de la
cyclohexyl est attribuée au facteur stérique . Les observations expérimentales cinétiques et
la nature des espèces formées sont en faveur du mécanisme du (schéma 20).
NR SO3
NO
N
NRNR SO3
NOH
OH
SO3
H2SO4-H2O RN2 + HSO4
-+H2O
H+
H-
Etape lente
N
NR
OH
ROH + H+
R+ N2 HSO4- -N2
+ H
H2O+ HSO4
H+ + SO4-2
NR SO3
NO
ROSO3
Schéma (20)
1.6-Décomposition des nitrophenylsulfonyl ethyl ethers :
Le mécanisme de décomposition de ces composés [33], comporte deux réactions
réversibles. La première est une hydrolyse de l’éther formant le 3 -vinyl-sulfonyl
nitrobenzene et 3-(β-hydroxy-ethylsulfonyl) nitrobenzène. La deuxième étape est une
hydrolyse du 3 -vinyl-sulfonyl nitrobenzene produisant le 3-(β-hydroxy-ethylsulfonyl)
nitrobenzène.
36
O2N
SO2CH2CH2OCH2CH2O2S
NO2
O2N
S
O
O
CH=CH2
O2N
S
O
O
CH2CH2OH
O2N
S
O
O
CH=CH2 + H2O
O2N
S
O
O
CH2CH2OH
E
V
H
HV
(1)
(2)
k1
k-1
k2
k-2
Schéma (21)
Les paramètres cinétiques sont déterminés par HPLC avec détection UV. La
fragilité de ces composés est due à l’effet électroattracteur du groupement nitro qui
augmente la réactivité de l’atome d’hydrogène sur le carbone α adjacent au groupement
sulfonyl. Ceci explique la facilité d’hydrolyse du composé E pour former les produits H
et V . Ce dernier s’hydrolyse lui-même en milieu basique pour former le composé pour
former le H (schéma 21).
1.7-Décomposition oxydative des sulfamides :
La décomposition oxydative de sulfamides antibactériens (sulfanilamide,
sulfamétoxazole et sulfadoxine ) a été décrite par A.De Souza [96]. L’étude a été menée
à température ambiante en milieu acide et en présence du peroxyde d’hydrogène. Les
produits d’oxydation formés ont été isolés par chromatographie classique sur colonne et
après purification, leur pureté est déterminée par HPLC. Ces produits ont été identifiés à
37
l’aide des méthodes spectrales usuelles. La cinétique de décomposition a été établie et un
mécanisme de dégradation a été proposé (schéma 22).
HO N SO2NH2
H
N NH2O2NS SO2NH2
OH
OH
H2N SO2NH2
Sulfanilamide
B
CSchéma (22)
Les produits issus de cette décomposition sont essentiellement l’hydroxylamino-4-
Amino-benzénesulfonamide (B), N,N’-dihydroxylhydraobenzénedisulfonamide-4-4’(C) .
L’analyse systématique des spectres de masse a mis en évidence les pics des fragments les
plus importants, comme l’indiquent les schémas (23) et (24), et les auteurs ont pu identifier
sans ambiguïté les espèces B et C.
Les résultats de l’étude montrent qu’il s’agit d’une condensation ionique entre le
nitroso-4-benzénesulfonamide et l’hydroxylamino-4-benzéne sulfonamides en milieu
acide.
38
HO N SO2NH2
H
-H
-NH2
-SO2
HO N SO2NH2
HO N SO2
H
HO N
H
NH2
-NO
SO2
H
H
NH2
H
H
O N
-2H
NH2
-NO
O N SO2
-2H
-SO2
B
Schéma (23)
39
N NH2O2NS SO2NH2
OH
OH
N NH2O2NS SO2NH2
O
N NH2O2NS SO2NH2
H2O2NS N2 SO2NH2
-O
-H2O
C
Schéma (24)
1.8-Décomposition N-(phénoxycarbonyl) sulfamate :
Blans et Vigroux [28] ont présenté une étude sur l’hydrolyse du N-
(phénoxycarbonyl) sulfamate de phényle à 50°C entre pH 0 et 14. Les résultats montrent
que entre pH 1,6 et 4,1 ne sont pas du premier ordre, ce qui indique l’accumulation d’un
intermédiaire réactionnel qui, par ailleurs a été identifié au sulfamate de phényle
(schéma25). Ce résultat associé au fait que l’on observe en milieu acide une catalyse acide
générale par les tampons, indique que la réaction d’hydrolyse s’effectue quel que soit le
pH, uniquement sur la forme anionique du substrat avec rupture de la liaison carbone -
oxygène.
40
PhO
S
N
O O
C
O
OPhPhO
S
NH
O O
C
O
OPhka
CO
CO
Produit de cléavage
Produit de cléavage
CO
Produit de cléavage
pH neutre
KOH
Kh[H]
Schéma (25)
1.9-Décomposition des 1,2-Bis (sulfonyl)-1-alkylhydrazines :
Les 1,2-Bis (sulfonyl)-1-alkylhydrazines sont des agents anticancéreux très actifs,
qui se décomposent en milieu aqueux neutre selon des cinétiques de pseudo premier ordre.
Ces agents génèrent approximativement 2 moles de sulfinate, 1 mole de d’azote et 1 mole
d’alcool approprié, issus de l’alkylation de l’eau [93].
La présence du motif sulfonyl sur la position N-1 confère à la molécule une
certaine instabilité et par conséquent des temps de demi-vie très courts ; contrairement à la
position N-2 où il a été remarqué des temps de demie vie plus longs.
Les 1,2-Bis (sulfonyl)-1-alkylhydrazines se décomposent pour donner des espèces actives
selon le (schéma 26).
L’hydrolyse de la liaison S-N favorise la formation de l’acide sulfonique alors
que la présence l’acide sulfinique est peu probable.
Les composés de la classe sulfonylhydrazine manifestent une bonne efficacité
vis-à-vis d’une variété de tumeurs solides humaines transplantées, y compris celles
résistantes à d'autres agents d'alkylants tels que le cyclophosphamide, 1,3-bis(2-
chloroethyl)-1-nitrosourea, et melphalan [93].
41
Les composés subissent une hydrolyse catalytique basique à des pH spécifiques et
donnent ainsi de l’ isocyanate méthylique responsable de l’activité carbamoylante (schéma
26).
L’isocyanate méthylique formé réagit à son tour avec de l'eau et se décompose
ultérieurement pour former l'azote gazeux, l'acide sulfinique , le chloroéthanol, la
méthylamine, et l'anhydride carbonique. Le chloroethyldiazomethylsulfonyl formé
également au cours de cette dégradation agit principalement comme produit d’alkylation
de l’ADN et par conséquent il est considéré comme étant l’ultime espèce responsable de
l’activité anticancéreuse.
O2SH3C N
CH2CH2Cl
N SO2CH3
H
O2SH3C N
CH2CH2Cl
N SO2CH3
C O
NH CH3
O2SH3C N N CH2CH2Cl
+ CH3NCO CH3NH2 +CO2
Nucléophile
ROH, RNH2 , RSH
Base H2O
+ CH3SO2- + H +
Produits d'alkylation
Produits de carbamoylation
Schéma (26)
42
1.10- Décomposition des MNTS et MNNG:
Ces composés sont doués d’une activité anticancéreuse importante. Ils sont
analogues aux CENU du fait de la présence du motif N-nitroso-N-alkyl. En subissant
l’hydrolyse en milieu basique , les N-methyl-N-nitroso-p-toluene sulfonamides (MNTS) et
le N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) donnent essentiellement le diazomethane
considéré comme un agent puissant d’alkylation de l’ADN.
Dans le mécanisme de décomposition des MNTS en milieu basique , l’attaque nucléophile
se fait sur groupement sulfonyl (schéma 27). Les deux composés MNTS et MNNG
possèdent le même groupement partant CH3N_NO au cours de leur hydrolyse.
MNNG
NNO2
H2N NCH3
N O
SN
O OCH3
N O
H3C H3C S
O
O
OH + H3C N N O
OH
MNTS
Schéma (27)
Trois voies de décomposition ont été proposées pour le cas de la MNNG en milieu
basique (schéma 28) : décomposition spontanée de l’espèce neutre, du mono anion, et du di
anion.
43
MNNG
NNO2
H2N NCH3
N O
NNO2
H2N NCH3
N O
NNO2
N NCH3
N O
N C N NO2
H3C N N O
OH- OH-
Schéma (28)
D’autre part, il a été observé que la N-nitrosoguanidine, la 1-nitroso-1-methyl-3-
tolylsulfonylguanidine (TSGNO) et la 1-nitroso-methyl-3-benzoylguanidine (BCGNO)
sont des agents efficaces de transnitrosation pour les nucléophiles.
SN
O O
H3C
TSGNO BCGNO
H
CN
CH3
N O
NH
CNH3C
H
CN
CH3
N O
NHO
Schéma (29)
A l’instar de leurs homologues (MNNG, MNTS) ces composés possèdent le même
groupe partant CH3N_NO au cours de leur hydrolyse, entraînant la formation du
diazométhane, ce qui est en faveur de leur utilisation comme agents alkylants.
La réactivité MNTS a été étudiée en milieux acide, basique et en présence d’une
amine. En présence d’un nucléophile comme OH-, on assiste à une attaque sur le
groupement sulfonyle, suivie d’une décomposition donnant le diazométhane. En revanche,
en milieu acide on observe une denitrosation avec formation de l’acide nitreux et le produit
dénitrosé .
En présence d’une amine on assiste à une attaque nucléophile sur le groupement
nitroso pour former les nitrosamines correspondantes (schéma 30).
44
SN
O OCH3
N O
H3C
SN
O OCH3
H
H3C
SN
O OCH3
N O
H3C
SO-
O O
H3C
+ R2NNO
HNO2 +H++
+ CH2N2 + H2OOH-
H+
R2NH
Schéma (30)
1.11- Décomposition des N-substitués sulfamides Cycliques:
Il a été constaté que cette classe de composés s’hydrolyse en solution aqueuse. Les
constantes de vitesse sont indépendantes du pH dans un intervalle de 1-4. Cependant pour
des pH supérieurs les kobs augmentent. Les produits issus de la décomposition ont été
identifiés comme étant la 2-amino-2-[(-N-substitué-sulfamoyl)imino] sel d’acide acétique
(schéma 31).
NNS
OO
NH2O
R N
CHN
S
OO
NH2O
R
HO
R= phenethylR=cyclohexylR=benzyl
H2O
I II
Schéma (31)
La liaison C=N s’hydrolyse selon une réaction lente pour donner un sulfamide et
des dérivés de l’acide oxalique. Il a été constaté également que la vitesse de
45
décomposition du substituant N-phenylethyl est plus grande que celle du dérivé de la 2-
cyclohexyl.
La décomposition du composé (II) peut se produire suite à l’hydrolyse de la liaison
C=N pour donner l’oxalamide et des sulfamides N-substitués , suivie de la formation des
sels d’acide oxalique et des sulfamates .
Les bandes attribués aux groupements –SO3- et –C(O)N ont été observés en spectrométrie
infra rouge après avoir laissé la réaction jusqu’à des temps suffisamment prolongés à des
pH basiques .
46
CHAPITRE (2)
Synthèse des CENS.
47
Il est important de mentionner que pour des structures analogues on devrait
s'attendre non seulement aux propriétés similaires, mais également des voies de synthèse
similaires.
En effet, la différence entre les CENU et les CENS réside uniquement dans le
remplacement du groupement carbonyle par un motif sulfonyl. Cette orientation a été mise
à profit pour accéder aux CENS [6] dont le mécanisme de décomposition ne comporte pas
la formation de l'isocyanate responsable des effets toxiques des CENU [6-10].
La synthèse des CENS est plus délicate que la synthèse des CENU et
sommairement trois voix d’accès, que nous allons décrire dans cette partie, ont été
développées et appliquées d’une façon concurrente pour la synthèse des CENS issus
d’amines primaires, secondaires et d’aminoacides [6-9].
La stratégie globale de la synthèse selon les voies A,B et C repose essentiellement
sur l’aménagement polyfonctionnel du chlorosulfonyl d’isocyanate qui a été exploité pour
fournir le motif sulfone inséré à la place du carbonyle décrit pour les analogues CENU.
2.1. Synthèse selon la voie A :
Cette voie de synthèse est scindée principalement en quatre étapes consécutives à
savoir :
• Carbamoylation sulfamoylation .
• Chloroethylation selon Mitsonubu.
• Déprotection .
• Nitrosation.
2.1.1. Carbamoylation sulfamoylation :
La carbamoylation est conduite par addition du tertiobutanol sur l’isocyanate
de chlorosulfonyle (ICS) dans le dichlorométhane anhydre à 0°C suivie d’une
sulfamoylation in-situ par une amine en présence d’une base tertiaire la triéthylamine
(schéma 32).
48
ClSO2N=C=OtBuOH
CH2Cl2 , O°C
HN
SCl
OO O
O
Et3N
Z-HHN
S
OO O
OZ
Schéma (32)
Ces composés se présentent sous forme de solides incolores, recristallisables dans
le mélange dichlorométhane / éther. Ils sont révélés à la ninhydrine et bien solubles dans
les solvants polaires, et insolubles dans l’éther et l’hexane.
En IR les bandes caractéristiques au groupement N-H apparaissent entre 3300 et
3200 cm-1.
L’absorption du carbonyle apparaît à 1710-1700 cm-1, les élongations symétriques
et asymétriques du groupement SO2 à 1350 et 1150 cm-1.
2.1.2. Chloroethylation selon Mitsnobu :
Les carboxyl sulfamides présentent sur l’azote carbamique un proton labile et une
charge anionique non délocalisée ce qui lui confère un excellent pouvoir nucléophile.
HN
S
OO O
OZ NS
OO O
OZ
Cl
ClCH2CH2OH
PPh3/ DIADTHF
Schéma (33)
49
Le groupement Boc substituant l’azote comme groupement protecteur, exerce
également un effet éléctro-attracteur qui augmente, de façon remarquable, la mobilité du
proton associé par rapport à l’autre azote.
La différence du caractère nucléophile est très marquée et permet une
chloroéthylation régiospécifique dans des conditions de la réaction de Mitsunobu (schéma
33).
Ces produits d’alkylation sont obtenus après une purification sur colonne de gel de
silice qui donne successivement le PPh3 en excès, le produit de substitution et le PPh3O
qui reste après une précipitation à l’éther.
Tous ces composés sont des solides dont le point de fusion est plus bas que leurs
précurseurs. Ils sont révélés aussi à la ninhydrine et cristallisent dans le mélange éther /
éther de pétrole.
En IR un faible déplacement hypsochrome de 5 à 10 cm-1 est observé pour les absorptions
d’élongation du groupement C=O.
2.1.3. Déprotection
Le groupement Boc qui a joué un rôle ambivalent, protecteur dans les composés
chloroéthylés, et activateur de l’azote carbamique est facilement éliminé par un traitement
à l’acide trifluoroacétique –dichlorométhane (25 –75) (Schéma 34)
NS
OO O
OZ
Cl
NHS
OO
Z
Cl
TFA/CH2Cl2
0°C
Schéma (34)
Ces composés sont plus polaires que leurs précurseurs (CCM). La déprotection est
traduite en IR par la disparition de la bande de vibration OC=ν et apparition d’une
nouvelle bande caractéristiques des N-H à 3300 cm-1.
50
2.1.4. Nitrosation :
La nitrosation des chloroéthylsulfamides est réalisée à froid (O°C) au moyen du
nitrite de sodium en présence de l’acide formique. Après filtration de la suspension formée,
la solution est lavée à l’eau et le solvant est ensuite évaporé sous vide.
NHS
OO
Z
Cl
0°C
NaNO2 / HCOOH NS
OO
Z
Cl
N O
Schéma (35)
Les produits nitrosés sont moins polaires que leurs précurseurs, possédant des bons
chromophores en UV, et bien révélés à la ninhydrine. Ils se présentent sous forme de
solides à point de fusion très bas. Ils sont instables en solution.
En IR ils sont caractérisés par une bande de vibration ON=ν à 1580 cm-1.
En RMN du proton ils sont facilement identifiés par l’absence des protons
échangeables, et la présence de deux triplets sous forme de deux systèmes A2X2 pour les
(CH2NNO ) et (CH2Cl) , il est à noter que les CH2Cl ( triplet) qui étaient moins blindés
que les CH2N ( quadriplet) dans leurs précurseurs respectifs sont devenus plus blindés dans
les composés nitrosés, et apparaissent tous les deux sous forme de triplets uniquement [81].
2.2. Synthèse selon la voie B
Cette voie se résume en une cyclisation et une N-methylation (pour les amines
primaires), et une réouverture des N-sulfamoyoxazolidinones [8].
Cette méthode a été conçue afin d’éviter les purifications rencontrées dans le cas de la
réaction de Mitsonubu et de favoriser nettement la régiospécificité de la nitrosation.
Cette voie est scindée comme la première en quatre étapes à savoir :
• Carbamoylation –Sulfamoylation –Cyclisation (en une seule étape)
• Réouverture décarboxylative de l’oxazolidinone après méthylation pour les amines
primaires.
• Halogénation.
• Nitrosation régiospécifique .
51
2.2.1. Carbamoylation- sulfamoylation-cyclisation :
ClSO2N=C=OCl
S
HN
OOO
O
BrBrEtOH N
S
HN
OOO
O
Br
R1
R2
NS
N
OO
R1
R2
O
O
Et3N-HBr
O°C
R1R2NH
Schéma (36)
2.2.2. Réouverture des oxazolidinones :
NS
N
OO
R1
R2
O
O
NS
HN
OO
R1
R2
HO
NaOHEtOH,H2O
-CO2
Schéma (37)
Cette réaction est conduite en milieu basique qui donne lieu à une décarboxylation
et de ce fait obtenir l’ouverture du cycle de l’oxazolidinone .
Les produits obtenus sont plus polaires que leur précurseurs cyclisé et ils sont très
bien révélés à la ninihydrine .
2.2.3. Halogénation :
52
NS
HN
OO
R1
R2
HO NS
HN
OO
R1
R2
ClPPh3 ;CCl4
Schéma (38)
L’halogénation peut se faire en présence de la triphénylphosphine, tétrachlorure de
carbone, la substitution se fait dans des conditions de température ambiante, la réaction est
suivie par CCM qui montre que ces produits halogénés sont moins polaires que leurs
précurseurs.
2.2.4. Nitrosation :
NS
HN
OO
R1
R2
ClNaNO2
HCOOHN
SN
OO
R1
R2
Cl
N
O
O°C
Schéma (39)
La nitrosation des produits halogénés se fait selon les mêmes conditions décrites
précédemment dans la voie A.
2.3. Synthèse selon la voie C
53
Cette voie se caractérise par trois étapes : formation du sulfamide activé,
transulfalmoylation et nitrosation [9]. Le schéma réactionnel est représenté dans schéma
(40) suivant :
ClSO2N=C=O
Z S NH
O
O
BOC
Z S N
O
O
BOC
Cl
Z S N
O
O
H
Cl
N S N
O
O
H
Cl
R1
R2
N S N
O
O
N
Cl
R1
R2
O
CarbamoylationSulfamoylation
1-tBUOH
2-Z= N
O
O
OH
Chloroethylation
ClCH2CH2OHPPh3
Déprotection TFA à 50%
Nitrosation NaNO2 / HCOOH
Transulfamoylation
R1R2NH
TEA, ACN
Schéma (40)
54
Cette voix de synthèse se base la voix A pour former le sulfamide activé et ensuite
l’échange se fait dans des conditions douces avec des rendements acceptables.
Plusieurs produits d’échange ont été proposés, cependant la N-hydroxy -
succinimide parait préférable en raison de sa facilité d’élimination.
Les produits issus de cette échange vont subir une nitrosation comme décrit
précédemment dans les voies A et B.
Il faut noter également que cette voie a été développée afin de minimiser le
nombre d’étapes dans la voie A et d’éviter les pertes de rendement signalées dans la voie B
dues à la saponification des produits ouverts par suite de la décarboxylation.
Dans notre travail la voix de synthèse adoptée est la voix A, pour laquelle les
rendements sont satisfaisants. Mais rien n'empêche de faire recours aux autres voies en cas
de nécessité notamment pour éviter les nombreuses opérations de purification qui sont
délicates surtout dans l’étape d’alkylation selon la réaction Mitsonubu [13].
55
Chapitre (3)
Les outils d’analyses
56
3.1. Analyse par spectrophotométrie UV des CENS :
La présence des groupements chromophoriques met de la spectrophotométrie UV
une méthode de choix pour les suivis cinétiques lors de la décomposition des CENS en
milieu aqueux et à pH contrôlé.
Le spectrophotomètre à double faisceau utilisé est menu d'un thermostat et d’un
microordinateur gérant un logiciel qui permet d'enregistrer des cycles de spectres de l’ordre
de 2 minutes, ce qui nous a permis de mieux suivre même les réactions de décomposition
les plus rapides.
3.2. Analyse par LC-MS des CENS :
L’étude menée précédemment par UV a montré sa limite quant à la détermination
de la nature des espèces formées. Pour palier ce problème, on a fait recours à l’usage de la
technique la chromatographie en phase liquide couplée à la masse (LC-MS), pour la
décomposition des CENS en milieu aqueux à pH=7 .4 .
Ce couplage est largement utilisé [58-60] et se compose essentiellement des
éléments suivants :
Schéma (41) : Les éléments d’un système LC - MS
Les éléments de ce système d’analyse comprend : (a) un échantillonneur
automatique permettant l’injection automatique de l’analyte ; (b) un chromatographe de
haute performance ; (c) une source d’ionisation (interface LC-MS) et (d) un spectromètre
de masse.
Plusieurs modes d’ionisation peuvent être choisis dans les systèmes de couplage.
Dans notre étude, la source d’ionisation du spectromètre se base sur l’electrospray
57
ionisation (ESI). Cette technique est largement utilisée lorsque les molécules en question
présentent une stabilité limitée.
Schéma (42) : Détecteur singulier quadripolaire
2.1. Mise au point de la méthode :
2.1.1. Choix de la colonne
Après plusieurs essais préliminaires et tenant compte que les CENS sont apolaires,
la colonne qui répond à notre besoin est la colonne C18-ODB dont la phase se caractérise
par une bonne résistance et une bonne stabilité en milieux aqueux.
2.1.2. Choix de la phase mobile :
Le choix de la phase mobile dépend de la phase stationnaire (et réciproquement).
La phase stationnaire utilisée est une phase inverse C18 , il serait alors convenable d’utiliser
comme éluant le mélange mixte eau-acétonitrile, d’autant plus qu’il solubilise bien les
composés apolaires étudiés.
2.1.3. Gradient d’élution :
Le gradient d’élution linéaire utilisé présente une bonne efficacité de séparation. Il
commence par un mélange à eau - acétonitrile = 40/60 , la proportion de l’acétonitrile
augmente progressivement jusqu’à 100% acétonitrile , ce qui permet r de procéder à un
lavage de la colonne. La dernière étape de ce programme d’élution, consiste au retour
progressif vers la composition initiale 40 /60, pour rééquilibrer la colonne et la
conditionner pour une nouvelle utilisation.
58
Tableau (1) : Gradients d’élution utilisés dans l’analyse LC-MS dans le milieu aqueux
2.1.4. Choix du débit:
Le débit de la phase mobile influe directement sur la résolution de la séparation en
chromatographie. Son choix dépend des dimensions de la colonne et des tailles des
particules de son remplissage.
En plus, La viscosité des solvants influe considérablement sur le choix du débit de
la phase mobile. Ainsi des solvants plus visqueux exige un débit plus fort pour éviter les
pertes de pression. Après de nombreux essais nous avons opté pour un débit de 0.25ml/min
qui nous a permis d’avoir une bonne séparation et des pressions normales.
2.1.5. Choix de la température :
Les CENS sont des composés fragiles et thermosensibles, il nous a été donc
nécessaire de travailler des conditions douces de 25°C
3.3. Analyse par HPLC de la décomposition des CENS en milieu biologique :
L’analyse par chromatographie liquide des substances actives et leurs métabolites
en milieu biologique exige un traitement préalable de l’échantillon avant toute séparation
chromatographique. En effet, les constituants du milieu (en particulier les protéines) sont
en nombre et en quantités considérables par rapport aux solutés à doser (de 104à106 de fois
en poids). Il est indispensable de les éliminer en quasi-totalité, à défaut les protéines
dénaturées colmatent la colonne d’analyse et la rendent très rapidement inutilisable.
De plus, si le nettoyage est insuffisant des signaux de composés endogènes
interférent avec ceux des solutés dans le chromatogramme. Il est courant que des solutés
soient liés de façon non covalente à des protéines « protein-binding » et soient éliminés
avec celles-ci pendant le nettoyage.
Une variante de la chromatographie liquide haute performance (HPLC) connue
sous le nom de on-line cleaning ou bien on-line solid phase extraction a été introduite
récemment pour analyser les métabolites dans les liquides biologiques [51,73].
Temps A% B% C% D% débit 0.00 40.0 60.0 0.0 0.0 0.250 10.00 0.00 100.0 0.0 0.0 0.250 20.00 0.0 100.0 0.0 0.0 0.250 20.10 40.0 60.0 0.0 0.0 0.250 30.00 40.0 60.0 0.0 0.0 0.250
59
3.3.1. Le couplage « On-line cleaning HPLC/UV/ESI-MS
L’analyse par HPLC classique des substances actives dans un milieu biologique se
heurte à une difficulté fondamentale liée à la présence des substances qui provoquent la
détérioration de la colonne.
Pour surmonter cette difficulté, de nombreux protocoles ont été mis au point pour
doser des médicaments dans les fluides biologiques après déprotéinisation de l’échantillon.
Ces traitements s’effectuent généralement hors-ligne. Les techniques anciennes
d’extraction en phase liquide consistent à précipiter les protéines par un solvant acide ou
organique, filtrer centrifuger, extraire le surnageant par solvant, concentrer, redissoudre le
résidu dans la phase mobile, et enfin injecter l’échantillon purifié dans le chromatographe.
Dans les années 80 on a commencé à développer les techniques d’extraction en
phase solide, « solid phase extraction » (dépôt sur un matériau chromatographique à usage
unique, élution différentielle des composés endogènes et des solutés à analyser,
concentration etc.) [40].
Cependant, tous ces procédés de préparation d’échantillon biologique « hors-ligne »
sont fastidieux et coûteux. Leur principal inconvénient est que, du fait de nombreuses
manipulations, des pertes aléatoires sont inévitables, même si le processus est automatisé.
Une quantité précise des solutés à doser nécessite l'ajout à l'échantillon initial un composé
de référence .Le choix de celui-ci est délicat puisqu’il doit être stable dans le milieu
d’incubation, et se comporter exactement comme les solutés d’intérêt durant les diverses
phases d’extraction. Cependant son comportement chromatographique doit être différent
des autres solutés.
L’analyse des substances actives et de leurs métabolites dans les matrices
biologiques est compliquée par la présence des niveaux élevés des protéines et d'autres
molécules endogènes. On fait recours alors à la technique d'extraction en ligne sur phase
solide" [50-55] dont l'avantage principal par rapport à l'extraction sur phase solide off line
ou l'extraction de liquide-liquide , est l'injection directe de l'échantillon demandant ainsi
un minimum de manipulation, améliore l’élution d'échantillon et la reproductibilité.
L'extraction en ligne ou nettoyage en ligne est une extraction in-situ sur phase
solide, qui inclut le chargement de l'échantillon, exclusion des macromolécules tout en
maintenant les analytes sur la précolonne, suivie de l'élution de l'analyte.
60
Le processus chromatographique se compose alors de trois étapes: le nettoyage
(purification), l'élution d'analyte et l'équilibration de système. Dans l'étape de purification,
les protéines et d'autres grosses biomolécules dans l'échantillon de sérum sont rincées de la
colonne vers l’égout, laissant les petites molécules de l'analyte et de son métabolite
maintenus sur la précolonne.
Schéma (43) : Système d’analyse des substances actives par LC-MS
Pour la décomposition des CENS, l’analyse s’effectue en deux temps (schéma 44).
L’échantillon brut est injecté sous éluant A (100% eau).
Lorsque les éléments de la matrice biologique sont éliminés (environ 2min), la
vanne est automatiquement commutée. La teneur en éluant organique est augmentée dans
la phase mobile, ce qui provoque un transfert progressif des solutés de la pré colonne
(H.L.B OASIS) vers la colonne RP C18.
61
Colonne Analytique
Garde à colonne
Cartouche d'extraction sur phase solide
PompeEchantiollonneurautomatique
Spectrométrede masse
Détecteur UV
Egout
H.L.B
RP C18
A
B
Schéma (44) : Schéma global pour l’analyse en SPE-LC-MS :
-Position A (ligne en pointillés), pour le processus d’extraction et le nettoyage en ligne.
-Position (B) ligne en continu, pour le processus pour l’analyse en LC-ESI-MS
3.2. Mise au point de la méthode d’analyse :
Le principe du nettoyage en ligne de l'échantillon biologique repose sur la
compréhension des équilibres subtils entre les solutés (CENS et ses métabolites), les
protéines du milieu, la phase stationnaire et la phase mobile. Toutes ces interactions étant
non covalentes, il s’agit bien d’une chimie supramoléculaire en plusieurs dimensions. Les
différentes interactions intervenant dans le mécanisme de rétention sont schématisées.
62
Proteines
Analytes
Phase mobileAqueuse
Phase stationnaire
Schéma (45) : Interactions protéine-analyte et phase mobile
Toute notre étude se base sur cette « infernale complexité ». Il s’agit de jouer
simultanément sur la nature de la phase stationnaire et la composition de la phase mobile
pour :
• Rompre une éventuelle interaction des protéines,
• Eliminer très rapidement de la phase mobile la totalité des protéines et d’autres
contaminants, ou au moins la très grande majorité d’entre eux.
• Retenir sur la phase stationnaire tous les solutés pendant le temps nécessaire au
nettoyage, et ceci de façon quantitative.
3.3. Choix de la précolonne :
Après de nombreux essais et en se basant sur les données bibliographiques , nous
avons opté pour une précolonne OASIS H.L.B; cette phase a été choisie parce qu'elle ne
maintient pas des protéines dans des milieux aqueux, contrairement à d'autres précolonnes
à phase inverse [55-72]. En outre la phase stationnaire H.L.B excluent des protéines du
sérum et d'autres constituants de la matrice biologique, tout en maintenant l'analyte
d'intérêt et ses métabolites.
3.4. Choix de la phase stationnaire
Le même remplissage utilisé pour le suivie cinétique par LC-MS dans le milieu
aqueux a été également employé pour les séparations lors de la décomposition en milieu
biologique
63
3.5. Choix de la phase mobile :
Le choix de la phase mobile dépend essentiellement de la phase stationnaire
employé et manifestement de l'analyte.
La phase mobile dépend de la nature des processus chromatographiques:extraction, élution,
équilibrage de la colonne, lavage, et rééquilibrage de la colonne et de la précolonne.
Pour l’étape de nettoyage, la phase mobile utilisée est de l’eau à 100% ce qui
permet d’éliminer toutes les protéines et les molécules endogènes présentes dans le sérum
ainsi que tous les sels pouvant colmater la colonne analytique.
Pour l’étape d’élution, on a opté pour un gradient lignaire mélange eau / acétonitrile
(tableau 2) cela permis d’éluer notre analyte de la précolonne et de le transférer vers la
colonne analytiques
3.6. Gradient d’élution :
Le gradient d’élution adopté dépend de toutes les étapes du processus
chromatographique y compris les étape de lavage et rééquilibrage qui sont incluses dans
ce programme d’élution.
Tableau (2) : Programme d’élution lors de l’analyse dans le sérum
Les paramètres statistiques de curve sont recommandés par le constructeur pour
avoir des meilleures séparations, donc ils ont été tirés du Manuel Waters2695.
Opération temps A% B% C% D% Débit curve 0.00 100.0 0.0 0.0 0.0 4.000 1 0.80 100.0 0.0 0.0 0.0 4.000 1
Extraction
2.00 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 1 2.20 90.0 10.0 0.0 0.0 0.2 6 10.00 70.0 30.0 0.0 0.0 0.2 6 12.00 30.0 70.0 0.0 0.0 0.2 6
Elution
15.00 30.0 70.0 0.0 0.0 0.2 6 15.20 100.0 0.00 0.0 0.0 0.2 1 Equilibrage
colonne 20.00 100.0 0.00 0.0 0.0 0.2 6 20.20 5.00 95.00 0.0 0.0 2.0 1 21.20 5.00 95.00 0.0 0.0 2.0 6 21.40 100.0 0.0 0.0 0.0 2.0 1
Lavage et rééquilibrage de la précolonne 24.00 100.0 0.0 0.0 0.0 2.0 11
64
3.7. Choix de la température :
La température influe considération sur les séparations en HPLC. Dans, la
littérature il a été reporté que les bonnes séparations sont faites à des températures qui
peuvent atteindre 60°C.
Dans notre étude, la température est maintenue à 37°C, température à laquelle
habituellement les cinétiques des composés bioactifs sont étudiées.
3.8. Choix du débit :
Le débit en HPLC influe directement sur la séparation chromatographique. Dans ce
programme d’élution trois débits ont été utilisés à savoir :
• Un débit à 4ml /min utilisé dans le cas de l’étape de nettoyage ( extraction sur la
phase solide). En créant une certaine turbulence, les grosses molécule du sérum ne
seront pas retenues sur la précolonne .
• Un débit de 0.2 ml/min utilisé au cours de l’étape d’élution et la séparation de
l’analyte de ces métabolites formés. Ce débit permet d’avoir des bonnes
résolutions.
• Un débit à 2ml /min utilisé en dernière étape du processus chromatographique
permettant ainsi un lavage rapide de la précolonne et son rééquilibrage et de ce fait
la pré colonne sera prête immédiatement pour une nouvelle analyse sans perte de
temps
3.9. Le système de vanne automatique :
Le système de vanne automatique a été adopté pour automatiser la technique
d’extraction et gagner du temps d’autant plus qu’on est devant un problème cinétique. Les
deux configurations les plus utilisées sont représentés sur le schéma (a) on-on : injection
sur la précolonne, nettoyage, élimination à l’égout (b) off-off inversion du flux de la pré
colonne d’extraction vers colonne analytique et puis le spectromètre de masse (schéma 46).
65
Schéma (46) : Système de vanne automatique utilisé dans LC-MS-SPE
4-Suivi de la décomposition par RMN :
La mesure de la fréquence de résonance donne des renseignements sur
l’environnement électronique des noyaux.
Cette mesure peut être également exploitée efficacement pour suivre le comportement et
les stabilités de certaines molécules en solution.
4-1-La RMN du proton :
66
Les spectres RMN proton, (sonde QNP 5 mm) ont été enregistrés sur un
spectromètre BRUKER 250 MHz.
Les déplacements chimiques, δ, sont exprimés en ppm par rapport au
tétraméthylsilane TMS (δ = 0 ppm) en utilisant comme référence les signaux résiduels des
solvants deutériés Les constantes de couplage, J, (en valeurs absolues) sont exprimées en
Hz. Pour la multiplicité des signaux, les abréviations suivantes ont été utilisées : s pour
singulet, sl pour singulet large, d pour doublet, dd pour doublet dédoublé, t pour triplet, td
pour triplet dédoublé, q pour quadruplet, quint
4-2-La RMN de l’azote marqué :
Les spectres RMN de l’azote marqué ont été réalisés en utilisant une sonde QNP 5
mm. Les spectres ont été enregistrés sur un spectromètre BRUKER Avance DPX 400.
Les déplacements chimique, δ, sont exprimés en ppm par rapport au nitrométhane
(δ = 0 ppm) en utilisant comme référence les signaux résiduels des solvants deutériés
telles que le CD3CN et le CD3OD .
67
CHAPITRE (4)
Décomposition des CENS en milieu aqueux
68
Dans un premier temps, le suivi cinétique de décomposition en milieu aqueux a été
visualisé par chromatographie sur couche mince. Ces observations préliminaires indiquent
que les CENS se dégradent pour donner deux composés avec des Rf différents. Cela peut
être attribué à priori à la perte du groupement nitroso et la formation d’autres produits.
4.1. Suivi cinétique par spectrophotométrie UV visible :
Les spectres enregistrés correspondent à des solutions fraîchement préparées de
concentrations 10 - 4 à 10 - 5 M de CENS. Le pH est ajusté immédiatement avec des
solutions tampon s'étalant de 0 à 14. Les réactions ont été suivies à T= 18 °C, la force
ionique étant ajustée par addition du 0.02 M de KCl.
Trois types distincts de comportements peuvent être observés. Tout d’abord à des
pH basiques, la décomposition des composés 1, 2 et 3 a lieu en une seul étape avec le
déplacement hypsochromic et apparition d'un point isobestic (figure 1)
Figure (1) : Spectres UV montrant l’évolution cinétique du composé 1 en milieu basique
Pour tous les composés étudiés en milieu acide la décomposition des CENS se produit
selon une seule .La diminution de l'absorbance en fonction du temps peut être attribuée à
la perte du groupement nitroso responsable du bon caractère chromophorique des CENS.
0
0.8
0.4
0.6
220 300 240 260 280
Abs
W a v e l e n g t h [nm]
0.2
0 h
4 h
3 h
2 h
1 h
6 h
7 h
5 h
Wavelengh (nm)
0
0.8
0.2
0.4
0.6
220 400 250 300 350
t=0mn
t=2mn t=4mn
t=6mn t=8mn
t=10mn
t=14mn t=16mn
t=12mn
t=24h
Wavelenght[nm]
Abs
Figure (2) : Evolution cinétique du composé 1 en milieu acide
69
La manière de la décomposition des trois composés dans l'intervalle de pH neutre
est un peu différente. D'abord nous avons observé une diminution lente d'absorbance avec
un déplacement hypsochromique et l'apparition d’une nouvelle bande qui augmente en
fonction du temps. Le premier phénomène peut être attribué à la denitrosation qui
correspond aux mêmes réactions constatées dans les milieux acides (figure 2).
L'augmentation de l'absorbance et le déplacement hypsochromique accompagné de
l'apparition du point isobestic près de 254 nm est similaire au phénomène observé pour la
décomposition en milieu basique (figure1).
4.1.1 Traitement des données cinétiques :
Pour les décompositions ayant lieu en une seul étape, les valeurs des constantes de
vitesse observés (kobs) ont été déterminées graphiquement en utilisant la fonction :ln [(A-
A∞)/(A0-A∞)] = f (t) pour le milieu acide et lnA = f (t) pour le milieu basique. La
linéarisation des données expérimentales affirment que ces réactions suivent des cinétiques
des réactions du pseudo première d'ordre. Les coefficients de régression linéaire sont
supérieurs à 0.98 pour tous les composés. Les valeurs absolues des pentes représentent la
constante de vitesse de la réaction du pseudo premier ordre.
Pour le pH neutre, les décompositions des composés 1, 2 et 3 sont consécutives du
pseudo premier ordre. Pour augmenter la précision des calculs des constantes de vitesse,
un nombre suffisant de points expérimentaux, situés dans la première moitié de la réaction
de chaque processus, ont été relevés.
Pour le début de la cinétique 20 cycles de 90s ont été enregistrés et 25 cycles de 900s pour
la suite de la cinétique. Les résultats du traitement cinétique sont rassemblés dans le
tableau suivant :
t=0
t=196h
t=30h
t=20jour
Wavelengh (nm)
Abs
300 280 260 240 220
0
0.2
0.4
0.8
0.6
Figure (3) : Evolution cinétique du composé 1 en milieu neutre
70
Tableau (3) : Variation des divers paramètres cinétique en fonction des pH
pH 0.1 2.1 4.1 6.2 7.0 8.6 9.25 10.0 11.5 13.0
6.114 0.876 0.137 0.057 0.058 0.125 0.183 0.350 0.858 2.185
1
K(obs). 104,s-1
t(1/2) ,min 19 132 868 2003 1978 917 632 329 134 53
14.00 1.960 0.420 0.150 0.140 0.142 0.163 0.200 0.355 0.865
2
K(obs). 104,s-1
t(1/2), min 8 59 273 750 823 817 705 576 325 133
1.857 0.521 0.218 0.145 0.214 0.419 0.537 1.002 2.433 5.480
3
K(obs). 103,s-1
t(1/2) ,min 62 221 530 786 540 275 215 115 48 21
La relation entre les logarithmes des constantes de vitesses observés et le pH est
représentée ci-dessous (figure 4) :
Ce profil en forme de U est l’une des caractéristiques de la réaction catalysée dans le
milieu acide ou basique comme déjà notés pour des composés d’analogues [24-38].
Pour chaque composé on remarque trois régions distinctes. Pour les trois composés,
on observe le maximum de stabilité dans l'intervalle de pH s'étendant de 5 à 8.La présence
de H3O+ ou l'OH- catalyse l'hydrolyse de ces composés. Pour les composés étudiés et pour
un pH donné, la nature des radicaux R1 et R2 ont des influences modérées sur les valeurs
des constantes de vitesses.
Figure (4) : Profil du pH des composés étudiés
pH
71
4.2. Suivi Cinétique par LC-MS :
Les solutions des CENS à étudier sont ajustées à un pH=7.4 et T=37°C pour se
rapprocher des conditions physiologiques. Les résultats obtenus par la technique de
chromatographie à phase inverse couplée à la masse. Les évolutions des
chromatogrammes des composés sont représentées sur la figure suivante:
Figure (5) : Evolution du chromatogramme du composé 2 à T=37°C ; pH=7.4
72
Les premiers signaux enregistrés à t=0 représentés par des pics uniques
correspondent aux produits de départ. Après décomposition il y a apparition de deux pics
correspondants aux composés élués respectivement t à 2 et 3 minutes.
Des tentatives d’identification des produits issus de la décomposition ont été
effectuées par LC-MS et les données sont regroupées dans le tableau 4.
Tableau (4) : Données chromatographiques et détection en UV et ESI-MS suite à la
décomposition des CENS (à pH=7.4 ; T=37°C)
Préalablement avant de lancer les cinétiques, les composés 1, 2 et 3 ont été
identifiés par leurs pics uniques en HPLC-MS. La détection est effectuée par le détecteur
UV –PDA (Photodiode Detector Array) à λ =253.46, 251.44 et 244.64 nm. Les temps de
rétention des composés sont respectivement égaux à 9.26, 12.44 et 5.5 min. Leurs spectres
Détection UV Detection en Masse : ESI
m/z (mode positif) Composés
Tr(min) Donnés UV
(nm) Tr (min) Masse
1
3.33
2.58
253.26
236.47
3.32
2.59
279.15
227.15
2
9.33
3.14
2.17
251.46
265.46; 226.46
268.26
9.26
3.02
2.09
390.01
279.06; 301.02
101.79
339.12
3
3.25
1,74
265.44
256.46
3.15
2.07
279.15; 301.09
345.29
73
de masse ont montré des pics moléculaires à 278.12 [M+Na]+ pour le composé 1, 390.01
[ M+Na]+ pour le composé 2 et de 352.44 [M+H]+ pour le composé 3.
L'examen des différents chromatogrammes montre la formation de plusieurs
produits de décomposition parmi lesquelles deux espèces caractéristiques y sont toujours
présentes indépendamment du CENS initial.
Pour les composés 1,2 et 3, les données LC-ESI-MS regroupées au tableau 4
montrent que les deux espèces détectées par le détecteur en ligne d'UV-PDA à λ = 236.4,
λ=268.26 et λ =256.44 nm respectivement, sont éluées aux alentours de 2 minutes. Leurs
spectres de masse ont montré respectivement des pics moléculaires à m/z 227 [M+H] +,
m/z=339.12 (M+H)+ et m/z = 345.29 [M+Na]+.
Sur la base de ces constatations ces espèces ne peuvent être que le produit dénitrosé
c'est-à-dire le chloroéthylsulfamides (CES).
La situation du deuxième produit B est légèrement plus compliquée, les données de
détection d'ESI-MS ont montré la même valeur pour les trois composés avec m/z = 279
[M+H] + et m/z = 301 [ M+Na]+. Le problème maintenant et d'identifier cette espèce
commune qui est éluée près de 3 minutes. Sachant que le produit est très stable, nous avons
alors procédé à sa purification et son identification par la RMN et la masse.
Les paramètres de cinétiques de la décomposition du CENS dans le milieu aqueux
ont été déterminés en suivant la disparition du pic de HPLC-UV du composé de départ en
traçant la surface de chaque pic en fonction du temps (figure6). Les données
expérimentales ont été lissées en utilisant un modèle exponentiel.
74
Figure (6) : Variation de la surface du pic en fonction du temps pour le composé 2 à
T=37°C ; pH=7.4
Les paramètres cinétiques ont été calculés sur la base du modèle mathématique
illustrant une cinétique de pseudo première d'ordre : C=C0 exp(- kt) où : C0 représente la
concentration initiale du CENS, C la concentration à l’instant t, temps d'incubation. Les
constantes de vitesses et les temps de demie-vie sont reportés dans le tableau 5.
Tableau (5) : Paramètres cinétiques de décomposition des CENS à pH=7.4
r :étant le coefficient de corrélation
Les CENS 1 et 2 étudiés sont plus stables et présentent des valeurs de temps de
demie-vie plus grandes comparées à celles des CENU de référence. En revanche, le
composé 3 possède une stabilité proche de celle des CENU.
Composé kobs min-1. r2 t1/2, mina
1 0,0060 0,997 115,0 2 0,0016 0,983 424,5 3 0,0339 0,989 20,40
BCENU 0,0133 - 52,00 33 CCNU 0,0144 - 48,00 14
75
4.3. Identifications des produits issus de la décomposition :
L'analyse LC-MS du résidu obtenu après décomposition totale des CENS a révélé
la formation de deux produits de dégradation, les produits B et C (figure 7)
Il a été constaté par ailleurs que ces deux produits présentent une stabilité
importante, ce qui nous a orienté à lancer des réactions de décomposition pour des
quantités plus importantes et tenter d’isoler et purifier ces deux produits par
chromatographie sur colonne classique.
Figure (7) : 1- Chromatogramme du composé 2 après 72h de réaction
2- Chromatogramme du CES pur préparé par voie de synthèse
76
Cette démarche nous a permis de dégager les constatations suivantes :
• Le produit (C) a été identifié en comparant ses propriétés chromatographiques
(figure 7) par co-injection du produit authentique obtenu par voie de synthèse, par
comparaison des grandeurs chromatographiques respectives et des spectres de la
RMN et de la masse , il ressort que le composé en question n'est autre que le
chloroethyl sulfamide (CES) précurseur du CENS.
• Sur la base des résultats des spectres ESI-MS et de la RMN de proton , le produit
(B) a été identifié comme étant un sulfamate. Ce dernier a été isolé, et la
comparaison de son comportement chromatographique avec celui du produit B du
mélange montre qu’il s’agit effectivement du même composé.
4.4. Mécanisme de décomposition
Sur la base des constatations expérimentales précédentes, et les phénomènes
décrits dans la littérature [21-36] nous pouvons proposer le mécanisme décomposition
suivant (schéma 47).
En milieu aqueux tamponné phosphate (pH=7.4 à T= 37°C), le schéma mécanistique
proposé comportent deux réactions compétitives.
N
SN
OO
R1
R2
Cl
NO
N
SO
O
R1
R2
O NOH
NCl
N
SNH
OO
R1
R2
Cl
C
B D
+ HNO2 + H+
pH=7.4
T=37°C
Schéma (47) : Mécanisme de décomposition des CENS à (pH=7.4 ; T=37°C)
La formation des produits C et B est le résultat d’une dénitrosation et d’une
hydrolyse compétitive des CENS. Le composé D n'a pas pu être détecté en raison de sa
77
très grande instabilité dans telles conditions expérimentales, néanmoins nous l'identifions
au chloroethyldiazohydroxyde en se référant au travail de Lown [14] qui a suggéré la
formation de cette espèce dans la décomposition des chloethylnitrosourées analogues des
CENS.
Le mécanisme de dénitrosation des CENS s'effectue probablement par une
protonation initiale des N-chloroethylnitrososulfamides suivie d’une attaque nucléophile
sur l’oxygène protoné (schéma 48). L'étape d'hydrolyse alcaline se produit par attaque
nucléophile de l’ion hydroxyde OH- sur l'atome de soufre pour former l'espèce sulfamate B
et le chloroethyldiazohydroxyde D. Le même processus a été noté pour des analogues
nitroso des composés tels que le de MNTS ( N-methyl-N-nitroso-p-toluene sulfonamide )
et de la MNNG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)[31].
N
SN
OO
R1
R2
Cl
NO
N
SN
OO
R1
R2
Cl
NOH
N
SN
OO
R1
R2
Cl
NOH
N
SNH
OO
R1
R2
Cl
+ H3O+
H2O + HNO2 + H+
Schéma (48) : Mécanisme de dénitrosation des CENS
D'autre part, l'étude spectrophotométrique indique qu'en milieux acides la
décomposition se produit en une seule étape qui correspond au phénomène de dénitrosation.
Par contre dans les pH basiques les composés subissent une hydrolyse mais pas de
dénitrosation.
78
N
SN
OO
R1
R2
Cl
NO
N
SO O
R1
R2
O NOH
NCl
B D CENS
OH
Schéma (49) : Mécanisme de l’hydrolyse des CENS
79
CHAPITRE (5)
Décomposition des CENS en milieu organique
80
5-1-Décomposition en présence de KOtBu :
Dans des essais préliminaires, les CENS se décomposent lentement en présence du
tertiobutoxyde de potassium. En chromatographie sur couche mince (CCM) plusieurs
taches se forment. Une des ces taches disparaît aussitôt de sa formation, et pour la
conserver le milieu réactionnel a été maintenu dans un bain d’azote à une température de -
40°C. Pour isoler et éventuellement identifier cette entité, nous avons ajouté l’éther
couronne 18C6. Le mécanisme réactionnel suit les étapes suivantes :
−+ +→ OtBuKKOtBu
( )18 618 6 18 6CC K C K OtBu+++ →
CBAKNONCHClCHKOtBuCENS +++=→+ +−22
ClCHNCHNOKCKNONCHClCHOtBuKC 2222 )618()618( =→=+ −++−−+
Schéma (50) : Mécanisme de stabilisation de chloroéthyldiazoate
par formation de paire d'ions
L’espèce chloroéthyldiazohydroxyde est stabilisée sous forme d'une paire d'ions
suite à l'addition de l'éther couronne 18C6 qui :
� Améliore la réactivité de KOtBu en augmentant la nucléophilicité [94],
� Forme un complexe d'inclusion avec le potassium,
� Favorise la formation de la paire d'ions entre K+ et l'entité
chloroéthyldiazoate et son extraction dans le dichlorométhane.
Le chloroéthyldiazoate stabilisé à -40°C est par la suite extrait sous forme de paire
d'ions dans le dichlorométhane.
Le suivi de l'évolution de la réaction effectué par la CCM , montre qu'en présence du
tertiobutoxide le CENS se décompose , mais en ajoutant l'éther couronne la vitesse de la
décomposition a augmentée considérablement. Un changement brusque de la couleur jaune
vers le rouge.
Il est intéressant de souligner qu’en raison de la basse température (– 40°C) de la
stabilisation de l'espèce chloroéthyldiazoate dans le dichlorométhane, aucune technique
analytique disponible ne se prête à son identification.
81
5-2- Décomposition en milieu acide organique :
La décomposition en milieu acide organique a été menée dans deux milieux mixtes
TFA-acétonitrile, et TFA-methanol.
Le suivi a été fait à l’aide de la RMN de l’azote marqué au niveau du groupement nitroso
du CENS par voix de synthèse.
5-2-1-Marquage régiosélective des 2-chloethylnirososulfamides :
Le marquage régiosélectif à l’azote 15 des CENS sur le groupement nitrosé a été
effectué par voie de synthèse selon le schéma suivant :
ClSO2N=C=O
1- tBuOH, CH2Cl2 à 0°C
3- PH3/DIAD,ClCH2CH2OH
NHS
N
OO
ClR1
R2
2- R1R2N
NS
N
OO
ClR1
R2 15NO
4-TFA
Na15NO2 / HCOOH, CH2Cl2Enrichi à 98%
Nitrosation régiosélective
R1R2=pipéridinyleR1R2=benzyl
(1)(2)
Schéma (51) : Synthèse des CENS marqué à l’azote 15N
L’incorporation de l’azote enrichi à plus de 98% au niveau du groupement nitroso
a été vérifiée par spectrométrie de masse.
5-2-2- Suivi par RMN de 15N
Les spectres RNM ont été enregistrés sur un appareil à 400 Mhz en présence du
nitrométhane comme référence interne Deux CENS (schéma 51) issus d’amines
secondaires ont été étudiés. Le suivi a été mené dans deux milieux organiques mixtes
82
(acétonitrile +TFA), (méthanol+TFA) . Le TFA étant ajouté pour accélérer la
décomposition des CENS.
-
Figure (8) : Spectres RMN 15N du composé (1) dans l’acétonitrile
83
Figure (9) : Spectres RMN 15N du composé 1 dans le méthanol
Figure (10) : Spectres RMN 15N du composé (2) dans le CD3CN
84
En RMN 15N, les trois noyaux non marqués résonnent différemment [81] ; ce qui
conduit à des déplacements chimiques différents (schéma 52).
Le suivi de ces trois signaux en cinétique rend leur attribution très délicate et les
résultats seront peu exploitables.
N3
SN1
Cl
N2O
OO
167
-104.25
-299.40
Schéma (52)
En revanche, le choix du marquage isotopique spécifique au niveau de l’azote du
groupement nitrosé permet de faire un suivi cinétique très sélectif de l’avancement de la
réaction de décomposition du CENS en solution.
Et sachant en plus que la fragilité des molécules des CENS est localisée au autour
de cet azote marqué, cette technique pourrait donc nous conduire à des informations
importantes sur le schéma mécanistique de décomposition..
Le composé 1 dans CD3CN présente un pic singulier avec un déplacement de
188.109 ppm. Ce signal correspond à la résonance de l’azote marqué.
Après addition du TFA on constate qu’il y a disparition du pic de départ et
apparition d’un nouveau signal vers les champs forts à –72 ppm. Ce fort blindage du
noyau marqué peut être attribué à un réarrangement au sein de la molécule .
Par la suite, un autre pic apparaît à 127.746 ppm et l’autre persiste à - 71ppm.
Ces deux pics sont en faveur d’une décomposition du CENS avec formation de deux
produits. Le signal à 127 ppm augmente par rapport à celui de -71 ppm en fonction du
temps.
Dans le méthanol le composé 1 présente un seul pic au niveau de 186.916 ppm.
Après addition du TFA et de l’eau on observe une apparition d’un pic à 145 ppm et un
autre à 181 ppm plus large.
85
Le pic initial spécifique au produit de départ reste après décomposition avec une
diminution de son intensité.
Pour le composé 2 dans l’acétonitrile, l’azote résonne à 188 ppm sans apparition de
nouveaux pics. Cependant, on observe une augmentation du rapport signal bruit ce qui peut
être expliqué par le dégagement de NO gazeux. Il y a donc décomposition sans apparition
de nouveaux pics.
En conclusion, l’étude cinétique via le marquage à l’azote 15 a donné des
indications très intéressantes sur la décomposition des CENS. Néanmoins l’étude aurait été
davantage concluante si le marquage concernait également l’azote adjacent central.
5-3-Décomposition en milieu organique neutre:
5-3-1-Suivi en RMN 1H :
Les spectres RMN ont été enregistrés sur un appareil Bruker 250Mhz, dans deux
types de solvants deutériés de l’acétonitrile et du méthanol.
Les mesures ont été enregistrées pour des temps suffisamment éloignés (figure 11).
L’étude structurale par RMN du proton mené par Abdaoui [81] a montré que les
protons portés par les groupements CH2Cl et CH2N des CENS forment un système de spin
du type A2X2. Les déplacements chimiques des différents protons de ce système ont été
décrits en détail pour les différentes étapes de la synthèse des CENS [81].
Cette étude a permis d’établir également une relation entre la structure des produits
et les déplacements chimiques des groupements méthylènes qui se sont avérés une
caractéristique importante des CENS en RMN du proton
Cette propriété spectroscopique intéressante pourrait être exploitée à des fins
cinétiques et mécanistiques. A cet effet, un suivi des déplacements chimiques de ce
système a été effectué en fonction du temps.
La figure ci après (figure 11) présente les résultats de la RMN 1H. Les cinétiques des
réactions étant lentes, nous supposerons des équilibres lents entre les espèces.
86
Figure (11): Spectres RMN1H au cours de l’évolution du composé 1 à
température ambiante.
ppm (f1)1.02.03.04.05.0
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
4.173
4.147
4.122
3.657
3.651
3.625
3.425
3.405
3.382
3.139
3.116
2.635
2.631
2.628
2.622
2.619
2.617
2.614
2.611
2.608
2.605
2.603
2.599
2.596
2.594
2.590
2.587
2.585
2.582
2.578
2.572
2.568
2.563
2.560
2.552
2.547
2.543
2.536
2.525
2.522
2.517
2.505
2.479
1.00
1.05
2.12
0.15
0.54
0.03
0.75
3.67
PIPERIDINE t=4h
ppm (t1)1.02.03.04.05.0
0
100
200
300
400
500
600
4.200
4.144
4.121
3.647
3.623
3.599
3.423
3.402
3.381
2.231
2.120
1.994
1.984
1.974
1.964
1.955
1.735
1.691
1.671
1.650
1.622
1.608
1.604
1.589
1.578
1.558
1.547
1.538
1.00
ppm (t1)1.02.03.04.05.0
0
100
200
300
400
500
5.481
4.172
4.146
4.121
3.657
3.649
3.632
3.624
3.403
3.115
2.901
2.896
2.895
2.892
2.890
2.888
2.120
1.974
1.691
1.671
0.93
1.09
1.91
0.38
1.02
0.94
3.29
pipéridine dans acn t=28h
Composé 1 dans CD 3CN à t=0
Composé 1 dans CD 3CN à t=4h
Composé 1 dans CD3CN t= 28h
87
ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.0
0
100
200
300
400
4.177
3.841
3.835
3.655
3.422
3.402
3.379
3.359
3.335
3.310
3.157
3.137
3.114
1.993
1.983
1.973
1.963
1.954
1.785
1.774
1.763
1.671
1.650
1.646
1.630
1.619
1.607
1.585
1.572
1.559
1.539
1.00
5.34
3.61
0.69
1.00
1.36
1.53
PIPERIDINE T=8 jours
t = 8 jour
ppm (f1)1.02.03.04.05.0
0
50
100
150
200
250
3004.1
75
4.1
52
3.7
89
3.7
65
3.7
60
3.7
56
3.7
52
3.7
49
3.7
41
3.7
30
3.6
80
3.6
67
3.6
56
3.6
48
3.6
46
3.6
39
3.6
32
3.3
35
3.1
35
3.1
15
1.9
74
1.9
64
1.7
71
1.7
60
1.6
18
1.6
06
1.5
85
1.5
73
1.5
59
1.5
55
1.0
0
13.0
2
2.0
6
2.9
3
1.2
8
0.8
8
5.5
7
PIPERIDINE t=15 jour t =15 jour
ppm (f1)1.02.03.04.05.06.0
0
100
200
300
400
500
600
700
5.480
4.173
4.151
4.123
3.764
3.740
3.656
3.632
3.381
3.336
3.139
3.116
2.121
1.994
1.984
1.974
1.964
1.954
1.692
1.681
1.672
1.648
1.632
1.627
1.622
1.609
1.588
1.00
1.70
5.72
0.02
1.15
3.92
PIPERIDINE DANS ACN T=48Ht = 48h
88
L’une des observations frappantes lors de la superposition de spectres, est la
disparition du système A2X2 après 48h de réaction, avec apparition de multiplet à des
champs plus faibles.
L’examen des spectres enregistrés en fonction du temps nous permet de dégager les
constatations suivantes :
• Apparition de nouveaux signaux plus larges vers les champs faibles après
décomposition.
• Formation d’un ensemble de multiplets.
• Variation des déplacements chimiques en fonction du temps.
Tableau (6) : Variation des déplacements chimiques en fonction du temps
δ en ppm dans CD3CN δ en ppm dans CD3OD Composé Temps
CH2Cl CH2N CH2Cl CH2N
0 4.12(t) 3.62 (t) 4.145(t) 3.59(t)
48h 4.14 (t) 3.79 (t) 4.175(t) 3.61(t)
72h 4.15 (m) 3.62 (m) 4.19 (m) 3.62 (m)
8 4.16 (m) 3.82 (m) 4.23 (m) 3.65 (m)
Composé 1
15 j 4.18 (m) 3.84 (m) 4.24 (m) 3.69 (m)
0 4.03(t) 3.59 (t) 4.145(t) 3.59(t)
48h 4.33(t) 3.60 (t) 4.145(t) 3.59(t)
72h 4.33 (m) 4.03 (m) 4.15 (m) 3.62 (m)
8 4.61 (m) 4.04 (m) 3.84 (m) 3.65 (m)
Composé 2
15 j 4.33 (m) 3.63 (m) 3.78 (m) 3.63 (m)
0 4.099(t) 3.53 (t) 4.145(t) 3.59(t)
48h 4.12(t) 3.62 (t) 4.145(t) 3.59(t)
72h 4.15 (m) 3.62 (m) 4.15 (m) 3.62 (m)
8j 4.15 (m) 3.65 (m) 4.17 (m) 3.65 (m)
Composé 3
15 j 4.16 (m) 3.64 (m) 3.78 (m) 3.66(m)
89
Bien que ces informations sont fort importantes, le mécanisme demeure encore
complexe et les phénomènes mis en jeu sont loin d’être cernés , encore moins par un suivi
des déplacements chimiques qui reste essentiellement qualitatif.
Par ailleurs, le problème est rendu davantage compliqué lorsque les produits de
décomposition s’accumulent dans le milieu réactionnel, il est alors difficile d’en tirer profit
de la RMN du mélange.
Ces constatations nous ont incitées à faire recours à la troisième approche, il s’agit
en fait de la chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de
masse (LC-ESI-MS).
5-3-2-Suivi par HPLC-ESI-MS :
Les temps de rétention des solutions fraîchement préparées de CENS 1, 2 et 3 sont
respectivement égaux à 9.56, 12.63 et 5.27 minutes. A chaque composé correspond un seul
pic. La détection en UV s’est effectuée par un détecteur à barrette de photodiode (UV-
PDA) à λ =244.46, 246.24 et 243.46 nm.
Les pics moléculaires en spectrométrie de masse sont à 278.21 [M+Na]+ pour le composé 1,
390.05 [ M+Na]+ pour le composé 2 et de 352.12 [M+H]+ pour le composé 3.
Les injections dans la chaîne HPLC couplée à la masse ont été faites après 15 jours
d’incubation dans les deux milieux organiques à température ambiante. Ce temps a été
choisi sur la base des spectres RMN selon lesquels aucune évolution n'est encore possible
après 15 jours de décomposition des 3 CENS.
L’examen des chromatogrammes (figure12) montre qu’il y a formation de plusieurs
produits après 15 jours d’incubation avec diminution considérable de la surface du pic du
CENS de départ. Les produits formés après décomposition possèdent des temps de
rétention inférieurs aux composés initiaux, autrement ils sont plus polaires que les produits
départs.
90
Figure (12) : Chromatogrammes HPLC des différent composés dans l’acétonitrile à
température ambiante après 15 jours
Composé 1
Composé 3
Composé 2
91
Tableau (7): Grandeurs chromatographiques détectées en UV et en masse des CENS
injectés en LC-MS à t=15 jours incubés dans l’acétonitrile à température ambiante.
Tableau (8): Grandeurs chromatographiques détectées en UV et en masse des CENS injectés en LC-MS à t=15 jours incubés dans du méthanol à température ambiante.
Détection en UV Détection en ESI-MS Composés
Tr(min) Donnés UV (nm) Tr (min) Masse
1
1.56 2.57 5.76
229.26 246.46 243.46
1.89 2.41 5.675
85.94 .177.10
115.02 299.05
2
3.02 6.08 6.82 9.53
246.46 241.51
258.46 244.46
3.056 5.986 6.612 9.111
63.98 90.93 339.04 397.02
3
1.58 2.29 3.19 8.64 12.46
229.23 230.46 239.46 241.46 246.46
1.399 2.176 3.129 8.47
12.506
182.20 145.11; 102.1
102.04 211.20 ; 82.85
369.04
Détection en UV Détection en ESI-MS
Composés Tr (min) Donnés UV (nm) Tr (min) Masse
1
1.52 2.21 2.49 4.11 5.27
225
269.46 238.46 261.46 244.46
1.62 2.30 2.49 4.11 5.27
85.94 121.91 115.04 227.05
321.02; 299.04
2
2.11 2.98 5.18 6.86 9.56
256.47 269.46 238.15 258.46 247.46
1.433 3.092 5.19 6.762 9.87
198.13 68.90; 90.92
374.96 339.03
337.02; 389.95
3 2.13
12.62
269.46
236.46
68.95
12.545
68.95; 125.96
323.12; 374.04
92
Sur la base de ces constatations expérimentales faite en RMN de l’azote marqué et
la RMN du proton , on peut dire que le comportement des CENS dans le milieu organique
et quelque peu différent de celui en milieu aqueux. Pour les CENS étudiés, la stabilité en
milieux organiques est plus prononcée que celle en milieu aqueux et à pH contrôlé.
Bien qu’il soit quelque peu difficile d’affirmer avec certitude le mécanisme de
décomposition en milieu organique, néanmoins la nature des fragments détectés par LC-
MS, nous permet de proposer le (schéma 53) suivant :
N N
Cl
NO
R1
R2 S
OO
N NCl
NO
R1
R2 SOO
NN
Cl
R1
R2
S
OO
NO N
OCl
R1
R2
S
OO
NN
-N2
ClOH
N
R1
R2
S
OO
Cl + H2O
NClN
HO
ClOH
ClClCl
N
R1
R2
S
OO
OHNH
R1
R2
N NCl
NR1
R2 SOO
O
Schéma (53) : Mécanisme de décomposition des CENS en milieu organique
Ce mécanisme passe par deux voies probables, l’une implique la formation du
diazohydroxyde qui a été décrit également comme étant l’ultime intermédiaire lors de la
93
décomposition CENU [96] ; l’autre possibilité, est le passage par la formation du
chloroéthanol en tant que produit principal issu de cette dégradation.
.
94
CHAPITRE (6)
Décomposition des CENS dans le milieu biologique.
95
Pour nous rapprocher davantage des conditions physiologique réels, nous nous
sommes proposés d’étudier le comportement des CENS dans du sérum de vœu fœtal non
décomplementé. Ce choix est motivé par le faite que ce type de sérum se rapproche
étroitement du sérum humain ; en plus il est très recommandé pour les cultures cellulaires
lors des tests in-vitro.
Par ailleurs, la non décomplémentarité de celui-ci le garde riche par sa composante
enzymatique simulable à des conditions in-vivo.
La complexité de ce milieu biologique dans lequel va se trouver le CENS rend toute
analyse immédiate impossible. Il est donc nécessaire de procéder préalablement à
l’élimination de toute molécule endogène présente dans la matrice biologique.
De telles molécules pourraient interférer lors des analyses chromatographiques avec les
pics des CENS et leurs éventuels métabolites.
Nous avons adapté une méthode d’extraction sur phase solide en ligne (on-line
SPE), offrant l’avantage de remédier à ce gros problème analytique et permet en outre de
protéger tout notre système chromatographique des centaines de molécules qui pourraient
être une source de colmatage de la colonne .
Les détails sur cette méthode ont été évoqués dans le chapitre 3.
6-1- Suivi cinétique par SPE-LC-MS :
Après incubation des composés dans le sérum de veau fœtal non décomplémenté dans
les conditions (T=37°C, concentration initiale 20µM), des aliquotes ont été prélevées à des
temps appropriés et immédiatement analysées par injection directe sur le système HPLC-
SPE-MS en utilisant "l'extraction en ligne sur phase solide "sans aucune préparation
préalable. On observe plusieurs signaux dans le chromatogramme représenté sur la figure
13.
96
Figure (13) : Evolution en fonction du temps du chromatogramme de la
décomposition du composé 2 incubé dans le sérum de vœu fœtal à 37°C
Les CENS se décomposent rapidement dans le milieu d'incubation, et aucun
produit de départ n’est détectable dans l'échantillon après 60 minutes d'incubation. Tous
les pics détectés en UV par un détecteur PDA en ligne de tR=2 minute à tR=18 minute ont
été notés comme substances A à G (figure 13).
97
Le composé noté comme A détecté à λ=265 nm (TR = 11,60 minutes) et
présentant en spectrométrie de masse un pic moléculaires à m/z=368.08, [M+H ]+ a été
attribué au CENS de départ. Le composé élué à un tR=2.45 min (λ =281 nm) noté B
(figure13) détecté en spectrométrie masse selon son pic moléculaire à m/z =496.
Le métabolite D détecté à λ=268 nm (TR = 5,16 minutes) dont le pic moléculaires est de :
m/z=92, [M+2H] + a été attribué au 2-hydroxyéthyldiazohydroxyde. Les composés E
(tR=15.48 minute) et F (tR= 18 minutes) présentant des ions moléculaires respectifs à
m/z=214.08, et m/z = 143,38 n'ont pas été identifiés. D’autre part, il a été remarqué que le
métabolite E est totalement disparu en 30 minutes.
Sur la base de l’étude en milieu aqueux (T=37°C ; tampon phosphate)
précédemment décrite et celle menée par HPLC-SPE-MS en milieu biologique , on peut
dégager les constatations suivantes :
• Le produit référé comme C (figure13) détecté à λ =279 nm (tR=3.48 minute)
possède le même temps de rétention que celui du sulfamate issu de la
décomposition aqueuse des CENS.
• Le pic détecté à tR = 10 minutes ; λ = 237,46 nm est attribué à G a été
identifié comme étant le chloroethylsulfamide (CES) par comparaison avec le
temps de rétention du produit pure synthétisé. Nous avons précédemment
montré que dans la décomposition en milieu aqueux, dans des conditions
proches du milieu physiologiques, (solution tampon de phosphate pH=7.4;
T=37°C) la voie principale de décomposition comporte une dénitrosation des
nitrososulfamides de départ menant aux chloroethylsulfamides (CES), et une
hydrolyse concurrentielle pour produire l'espèce sulfamate .
D’après ces résultats et en se référant aux données de la littérature [11,38,39]
il est possible de proposer un mécanisme (schéma 56) qui comporte trois
phénomènes concurrentiels. Le premier noté (i) implique la dénitrosation chimique
du CENS pour produire le composé de G. Le deuxièmes (ii) correspond à la
métabolisation du CENS pour donner le métabolite D identifié comme étant le 2-
hydroxyéthyldiazohydroxyde. La troisième possibilité (iii) représente l'hydrolyse
du CENS pour former le produit C et le chloroethyldiazohydroxyde.
98
N
S
N
OO
R1
R2
Cl
NO
N
SNH
OO
R1
R2
Cl
N
S N
OO
R1
R2
Cl
NOH
O
-N2
Cl
N
S
N
OO
R1
R2
Cl
NO
N
S N
OO
R1
R2
Cl
NOH
O
Cl
Adduit-d'ADN
HO N N OH
+ HNO2 + H+
G
D
C
1-R1 = R2 = Piperidinyl
2- R1 = R2 = Benzyl
3- R1 = R2 = Cyclohexyl
H
A
CENS
i
ii
iii
Schéma (54) : Mécanisme de décomposition des CENS dans du sérum de vœu
feotal
Les paramètres cinétiques de la décomposition des CENS dans les
conditions physiologiques indiquées ci-dessus ont été déterminés en suivant la
disparition du pic HPLC-UV du composé de départ et en traçant la surface du pic
de chaque CENS en fonction du temps (figure 14). Les données expérimentales
ont été ajustées en utilisant le modèle exponentiel.
99
Les valeurs des temps de demi vie ont été calculées par le modèle
mathématique illustrant une cinétique de pseudo première d'ordre: C=C0exp (-kt)
où C0 représente la concentration initiale du CENS, le C la concentration à un
instant t, et t le temps d'incubation (en minutes)
Figure (14) : Evolution de la surface du pic en fonction du temps pour le CENS 2
6-2-Cinétique et lipophilie
La lipophilie des molécules étudiées conditionne en partie leurs propriétés
biologiques telles que le transport, le passage à travers la membrane et la biodisponibilité
(distribution et accumulation).
Dans les études QSAR (Quantitative Stucture-Activity Relationsheep) la cinétique
de décomposition des substances actives dans des milieux biologiques pourrait être
corrélée avec leurs cofficients de partage [75-76]. La corrélation joue un rôle déterminant
dans la variation interindividuelle des paramètres pharmacocinétiques et de la réponse
thérapeutique des molécules anticancéreuses comme les chloroethylnitrosourées [36].
Les coefficients de partage des CENS ont été déterminés expérimentalement par la
méthode dites des flacons agités (Schake –flask) [75-76]. Le coefficient de partage
100
octanol-eau est définie comme étant le rapport de concentration du composé étudié dans la
phase d'octanol à sa concentration dans la phase aqueuse. Le logarithme P est désigné le
plus souvent comme étant le facteur de Hansh ou bien le plus communément
« lipophilie ». A cette fin, dans une série de tube de volume 2.5 ml de 10-4 M de la
solution aqueuse de chaque CENS respectivement mélangée au même volume d'octanol à
la température ambiante. Le système a été agité vigoureusement sous les ultrasons jusqu'à
l'équilibre. Après centrifugation les 2 phases ont été séparées et les absorbances ont été
mesurées aux longueurs d’onde appropriées. Les résultats de mesure de la lipophilie sont
regroupés dans le tableau 9..
Tableau (9): Paramètres cinétiques de la décomposition des CENS.
a : Dans le sérum de vœu fœtal à T=37°C.
b : Dans du sérum humain à T=37°C
c : Dans le milieu tampon phosphate à T=37°C.
Il en ressort que la lipophilie dépend de la nature du CENS et diminue dans l'ordre
suivant : 3 > 1> 2.
En faisant intervenir les constantes de vitesses de décomposition, il en ressort que plus
le composé est lipophile plus il est stable. La diminution de la stabilité chimique est dans
l'ordre: 3 < 1 < 2.
Le tableau 9 comportant, à titre comparatif, les caractéristiques cinétiques de
décomposition des CENS et des CENU, montrent que les valeurs des constantes de vitesse
kobsmin-1. R2 t1/2min
Composé
a c a c a C
Log P
1 0.1110 0.0060 0.999 0.997 6.24 115.00 [1] 1.03 2 0.0450 0.0016 0.973 0.983 15.22 424.50 [1] 1.32 3 Nd 0.0339 Nd 0.989 Nd 20.40 [1] 0.86
BCNU b 0.0460 0.972 17.50 [36] 1.56 CCNU b 0.0230 0.984 15.06 [36] 2.82 MeCCNU b 0.0240 0.998 28.88 [36] 3.30
101
de décomposition des CENS sont comparables à celles de la décomposition des CENU
dans le sérum humain
L'interaction du CENS avec le cône non polaire de la lipoprotéine du sérum tend à le
stabiliser [36-38]. En revanche, l’action catalytique des enzymes et des protéines présentes
dans le sérum favorise sa décomposition. Les CENS pourraient s'associer aux protéines
pour former un complexe CENS-protéine qui se décompose à son tour pour donner
l'albumine, le 2-chloroethyldiazohydroxide et l’isocyanate [38-39].
Tenant compte des tous les résultats obtenus, le schéma le plus plausible des
phénomènes mis en jeu lors de la décomposition des CENS dans le sérum est représenté
par la figure 57.
102
LIPIDE
+
CENS + Protéine CENS PROTEINERéaction
en milieu aqueux
CENSMétabolisme
Alkylation
Réaction en milieu aqueux
Macromolécule
Dénitrosation
Hydrolyse
ClCH2CH2N=NOH
+
R1R2SO3-
ClCH2CH2N=NOH
+R1R2SO3
-
CES
CES
CES
EXCRETION
Schéma( 55) : Schéma hypothétique de l'intéraction bio-chimique des CENS dans le serum
MEMBRANE DISTRIBUTION
CENS
CENS-LIPIDE
-
103
.
CONCLUSION GENERALE
104
CONCLUSION
Ce travail s’est proposé pour étudier la cinétique de décomposition des CENS dans les
milieux variés. En milieu aqueux, les CENS subissent une hydrolyse suivant une catalyse acido-
basique généralisée.
Les réactions de décomposition dans l’acétonitrile, le méthanol, et dans le milieu mixte
( acétonitrile + TFA, méthanol +TFA ) sont relativement lentes.
En faisant recours aux diverses techniques analytiques telles que la spectrophotométrie UV-Vis,
la spectrométrie de masse, les RMN 1H et RMN 15N, la chromatographie liquide de haute
performance et son couplage LC-ESI-MS , des mécanismes de décomposition ont été proposés
pour les milieux aqueux , organique et biologique.
En milieu aqueux, le chemin réactionnel de décomposition comporte deux phénomènes
concurrentiels : l'hydrolyse et la dénitrosation. En revanche, les milieux organiques se
caractérisent par des réarrangements et formation de nombreux produits dont deux plus
remarquables qui sont le sulfamate et le chloroéthyldiazohydroxyde responsable de l’action
alkylante de ADN.
En milieu biologique la situation semble être plus complexe. Un nettoyage en ligne (on-
line solid phase extraction) pour éliminer les protéines doit précéder toute analyse cinétique
faisant usage de la chromatographie liquide haute de haute performance.
La décomposition des CENS dans le sérum non décomplémenté du veau fœtal est plus rapide
que dans les deux autres milieux. Ce phénomène a été interprété par l'action catalytique des
enzymes et des protéines présentes dans le milieu d'incubation.
La corrélation vitesse de décomposition- lipophilie montre que moins le composé est lipophile
plus il est instable.
Le mécanisme de décomposition est quelque peu complexe en raison des nombreuses interactions
mises en jeu dans ce milieu.
105
Les principales espèces détectées on cite le 2-hydroxyéthyldiazohydroxyde, le sulfamate et le
chloroethylsulfamide (CES). Il est instructif de remarquer que ces deux dernières espèces ont été
également observées en milieu aqueux phosphaté.
Bien que ce travail ait été couronné par des résultas intéressants, le sujet est loin d'être
complètement cerné. Plusieurs points méritent d'être développés; à savoir :
� Marquage de l'azote adjacent au groupement nitroso et établissement d'un suivi par RMN
pour mieux élucider le mécanisme de décomposition ;
� Etude quantitative de l'influence des protéines et des enzymes sur la vitesse de
décomposition des CENS;
� Etude de décomposition dans des extraits cellulaires d'origine cancéreuse notamment
celles issues de cultures mammifères MCF7 et pulmonaires A549 ;
� Procéder à une identification des espèces volatiles provenant de la décomposition des
CENS.
106
Partie Expérimentale
107
CONDITIONS GENERALES
1. Produits chimiques utilisés :
• Les CENS sont synthétisés et purifiés selon la procédure décrite dans la littérature.
• L’eau est purifiée sur un système Milli Q (millipore ).
• L’acétonitrile et le méthanol sont de qualité HPLC.
• Les phosphates de potassium mono et di basiques sont de qualité Sigma « ACS
reagent ».
• L’acide acétique, ainsi que les acétates utilisés sont de qualité pure pour analyse.
• L’éther couronne dibn 18- crown 6 est de qualité Sigma
2. Milieux d’étude utilisés :
• Milieux aqueux à pH contrôlé sont préparés selon les procédures décrites dans la
littérature et les sels utilisés pour les divers systèmes tampons sont des sels de
qualité pure pour analyse.
• Le sérum de vœu fœtal de qualité stérile A est fourni par GIBCO BRL.
• Les milieux organiques utilisés sont constitués de solvants purs pour HPLC.
• Les solvants utilisés pour le suivi en RMN du proton et de l’azote marqué sont des
solvants deutériés fourni par Eurisotope.
• Le tertiobutoxyde de potassium et le TFA sont de qualité sigma.
108
3. Décomposition des CENS en milieu aqueux :
3.1. Système RP-LC-MS:
Le système HPLC (Waters) est composé de :
• Un contrôleur 600S.
• Une pompe basse pression 616.
• Un injecteur automatique 717+
• Un détecteur UV à barrette d’iodes modèle 996.
• Une colonne, thermostatisée à 25°C
L’équipement HPLC utilisé lors du suivi cinétique en milieu aqueux est constitué
par un une chaîne « Waters » utilisant un module de séparations type 2695 doté d’un
échantillonneur automatique ( Autosampler) et un détecteur à barette photodiode de 996
de PDA . Le balayage est de 220nm à 400nm). L'appareil chromatographique est
commandé par le logiciel masslynx version 3.5 . La séparation des produits a été réalisée
sur la colonne RP-C18-ODB Interchrom ( 150*2mm, 5µm), protégée par la colonne de
garde avec le même remplissage. La température de colonne a été maintenue à 25°C. La
phase mobile se compose de deux solvants : A (acide de l'eau 0.1% acide formique) et le
solvant B (acide formique, Acétonitrile 0.1%). Le débit était fixé à 0.25ml/min. Une
élution de gradient linéaire a été effectuée comme suit : 0 minutes, 40%A, 60%B ; 10 à 20
minutes, 100%B ; 20.10 minutes, 40%A, 60% ; 20.10 à 30 minutes, 40%A, 60%B. Le
volume de l'injection en colonne était de 50µl, et la seringue d'injecteur a été lavée avec un
mélange 50/50 de méthanol/eau avant chaque injection.
109
3.2. Spectrométrie de masse :
Les composés ont été détectés à l'aide du spectromètre de masse simple quadripole
de Waters (Micromass ZQ) équipé de la source electrospray ionisation (ESI). La détection
a été faite en mode d'ion positif. La tension de jet d'ion était 3500V et 2V comme tension
d'orifice. La température de source a été fixée à 250°C. L’intervalle utilisée de m/z 50 :
400 a été balayé pour l'identification des produits inconnus lors de la décomposition des
CENS, employant un pas de 0.10 uma avec des temps d'angle de saturation de 0.2s.
L'écoulement de gaz d'azote pour le dessolvatation était 400.7 (l/h) et 275 (l/h) pour le
cône.
3.3. Procédé général pour l'analyse des produits de la décomposition aqueuse des
CENS :
Une solution 2.10-5mol.dm-3 des Chloroéthylnitrososulfamides ( CENS ) dans la
solution tampon de phosphate de sodium de 100 ml (pH=7.4) a été incubée à 37°C dans
des tubes fermés avec des septum en teflon. Chacun des composés (1, 2, 3) a été dissous
dans un minimum d'acétonitrile et ajusté avec une solution tampon de phosphate. Le
mélange est agité rapidement sur vortex (10 secondes) puis une aliquote est prélevé
immédiatement pour être injecté directement pour analyse chromatographique par la suite
et à des intervalles réguliers des aliquotes sont prélevées pour le suivi cinétique.
3.4. Isolement des produits résultant de la décomposition du CENS :
Le CENS (200mg) est incubé dans un mélange tampon phosphate à pH=7.4 peu
d'acétonitrile 2%, a été mis sous agitation magnétique à 37°C dans des ballons équipés
de septum en téflon. La réaction a été suivie par chromatographie sur couche mince qui
a montré l'apparition de deux nouvelles taches de Rf différents. La réaction a été laissée
jusqu'à la disparition totale du produit de départ. Le mélange a été alors dilué avec du
dichlorométhane ; et lavé avec une solution saturée du NaCl. La phase organique a été
séchée sur le sulfate de sodium anhydre et évaporée à pression réduite qui donne une
110
huile concentrée jaune. Les produits de la décomposition ont été alors séparés sur une
colonne de gel de silice et éluée avec du dichlorométhane comme éluant.
3.5. Identification des produits :
Pour identifier les produits issus de la décomposition aqueuse des CENS à pH=7.4,
37°C ; les fractions séparées de la colonne ont été évaporées à pression réduite puis
recristallisées dans le mélange éther / éther pétrole et analysées par spectrométrie RMN 1H et de masse ESI.
Composé 1B : RMN -1H (250MHz, CDCl3) : δ 1.55 (m, 6H, CH2 Cycl) ; 2.74 (q, 2H, N-
CH2) ; MS. ESI+ 25eV m/z = 187.29 [M+Na] + (100%).
Composé 1C : RMN -1H (250MHz, CDCl3) : δ 4.62 (t, 1H, NH) ; 3.64 (t, 2H, Cl-CH2) ;
3.40 (q, 2H, N-CH2) ; 3.32 (t, 4H, N-CH2Cycl) ; 1.62-1.50 (m, 6H, CH2Cycl) ; MS. ESI+
20eV : m/z = 227.24 [M+H] + (85%).
Composé 2B : RMN -1H (250MHz, CDCl3) : δ 3.86 (s, 4H, 2CH2Bn) ; 7.26 (m, 10H,
2ArH) ; SM. ESI+ 25eV : m/z = 300.08 [M+Na] + (65%).
Composé 2C : RMN- 1H (250MHz, CDCl3) : δ 7.45 (m, 10H, 2ArH), 4.35 (t, 1H, NH) ;
4.35 (s, 4H, 2CH2Bn) ; 3.60 (t, 2H, ClCH2) ; 3.25 (q, 2H, N-CH2) ; SM. ESI- 20eV : m/z =
337.99 [MH] - (100%).
Composé 3B: NMR -1H (250MHz, CDCl3) : δ 2.57 (q, 2H, N-CH2) ; 1.44 (m, 20H, CH2
Cycl.) SM. ESI+ 40eV : m/z = 283.18 [M+Na] + (100%).
Composé 3C: NMR -1H (250MHz, CDCl3) : δ 4.45 (t, 1H, NH) ; 3.70 (t, 2H, ClNH2) ; 3.35
(q, 2H, N-CH2) ; 3.25 (m, 2H, 2N-CH) ; 1.75-1.00 (m, 20H, CH2Cycl.) ; SM. ESI+ 40eV :
m/z = 345.29 [M+Na] + (100%).
111
4. Décomposition en milieu biologique :
4.1. Instrumentation de l’extraction on Ligne sur phase solide RP-LC-MS-ESI :
L'instrumentation de HPLC est constituée par un module de séparation Waters LC
2695 (l'échantillonneur automatique modèle 717+, une pompe 616 avec un réchauffeur de
colonne et le contrôleur modèle 600S, le détecteur modele 996 à barette de photodiodes)
couplé à la chromatographie .
Le logiciel masslynx, (version 3.5) commande les deux vannes automatiques
(six sortie 7000 Rheodyne). La cartouche d« OASIS » H.L.B d'extraction sur phase
solide 2.1mm x 20 millimètres (Waters, France) liés à la colonne analytique Modulocart
C18 QS UPTISPHERE 5 HD 150 le millimètre X 2.0 millimètres (Interchrom, France)
protégée avec une garde à colonne de même remplissage.
Le système de vanne automatique a été électriquement relié au commutateur 1 et 2
du connecteur de signal d'entrée-sortie dans le panneau arrière du module de séparation de
Waters. À la première position (off-off), l'éluant de la pompe pousse l'échantillon
provenant de l'échantillonneur automatique à la colonne d'extraction et la matrice
biologique est éluée à l’égout. À la deuxième position (on-on), le flux est inversé et un
transfert du solvant de la précolonne vers la colonne analytique.
Un gradient linéaire d’élution est utilisé pour éluer progressivement notre analyte
et leurs métabolites de la précolonne d'extraction et les transférer vers la colonne C18
analytique. A la sortie de cette colonne est placé un détecteur à barrette de diode PDA et
un détecteur en ligne d'ESI-MS.
112
Pendant l'étape de purification (0-2min) l'effluent de colonne est détourné à l’égout
pour protéger la colonne analytique et le spectromètre de masse. À ce stade, la phase
mobile est exempte de tout solvant organique pour éviter la précipitation des protéines de
sérum dans le système de HPLC .
À l'étape d'élution les analytes maintenues sur la precolonne ont été transférées à la
colonne analytique en utilisant le gradient linéaire d'acétonitrile-eau pour atteindre 70-30%
et le débit a été réduit de 4ml/min à 0.2ml/min. La température de colonne est de 30°C. La
phase mobile se compose de deux solvants : A (Eau : 0.1% d’acide formique) et le solvant
B (Acétonitrile : 0.1% d’acide formique). L'échantillon brut à analyser a été injecté
directement dans précolonne et est élué avec 100% du solvant (A) pendant 2 minutes
avec un débit de 4 ml/min. L e système de vanne a été activée pour relier la précolonne à
la colonne analytique. Une élution avec gradient linéaire a été effectuée alors avec un
débit de 0.2 ml/min : 2 minutes, 90%A, 10%B ; 2.2 à 10 minutes, 70%A, 30%B ; 10 à 15
minutes, 30%A, 70%B ; 15 à 20 100%A minimum ; 20.2 à 21.2 minutes, 5%A, 95%B ;
21.4 à 24 minutes, 100%A.
Vingt minutes après injection , le système de vanne a été changé pour détourner
l'éluant à l’égout , et la précolonne d'extraction a été alors lavée avec (5%A, 95%B) et
équilibré avec 100%A. Le volume de l'injection dans le systeme HPLC était de 20µl, et
la seringue d'injecteur a été lavée avec un mélange méthanol/eau de qualité HPLC à 50/50
avant chaque injection.
4.2. Incubation CENS- sérum :
Une solution de 5 ml du milieu d'incubation a été scellée dans un tube de 10ml
fermé hermétiquement avec un septum en téflon. Le milieu d'incubation est constitué du
sérum de veau foetal non décomplementé . La solution de CENS est dissoute dans peu d’
acétonitrile puis ajoutée aux milieux pour atteindre une concentration finale de 20µM. Le
mélange a été agité rapidement sur vortex et immédiatement incubé à 37°C. Des
aliquotes ont été prises périodiquement et analysées sur le système RP-LC-MS en utilisant
l'injection directe (extraction en ligne de phase solide) sans aucune purification préalable.
113
5. Mesure de Lipophilie :
2.5 ml de 10-5M du soluté de chaque CENS ont été respectivement mélangés au
même volume d'octanol à la température ambiante. Le système a été secoué
vigoureusement sous la sonication jusqu'à l'équilibre. Après centrifugation, les deux phases
ont été séparées et l'absorbance a été mesurée à la longueur d'onde appropriée.
6. Spectroscopie RMN
Appareil à transformée de Fourier BRUKER AC 250 (250 MHz pour le proton, 400
MHz pour la RMN de l’azote 15). Les solvant utilisé pour l'enregistrement des spectres de
RMN 'H, est le CD3CN . Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en partie par
million (ppm) par rapport au tétraméthylsilane (TMS) utilisé comme référence interne .
Les constantes de couplage sont exprimées en Hertz. Les notations suivantes sont utilisées
s : singulet ; d : doublet ; t : triplet ; q : quadruplet ; m : multiplet ou massif non analysable ;
dq : double quadruplet , tt : triplet de triplet ; etc...
7. Mesure des points de fusion
Les points de fusion sont déterminés en tube capillaire à l'aide d'un appareil Büchi.
8. Chromatographies sur couche mince
Silice MERCK Art 5554 DC Alufolen Kieselgel 60 F
9. Chromatographies sur colonne
Les chromatographies sur colonne ont été effectuées sur du gel de silice 9385
MERCK Kieselgel 60 de granulométrie comprise entre 0,040 et 0,063 µm.
114
Références bibliographiques
1. Seridi, A.; Kadri, M.; Abdaoui, M.; Winum, J-Y.; Montero, J-L.; Bioorg. Med.
Chem. Lett 2006, 16, 1021-1027.
2. Seridi, A.; Winum, J –Y.; Kadri, M.; Abdaoui, M.; Montero, J-L.; Arch. Pharm.
Chem. Life Sci. 2006, 339, 521 – 526.
3. Kadri, M; Dahoui, N.; Abdaoui, M.; Winum, JY.; Montero, J-L . Eur. J. Med. Chem.
2004, 39, 79.
4. Winum, J-Y.; Bouissière, J-L. ; Passagne, I. ; Evrard, A. ; Montero, V. ; Cuq, P. ;
Montero, J-L. Eur. J. Med. Chem. 2003, 38, 319-324.
5. Passagne, I.; Evrard, A.; Winum, J-Y.; Depeille, P.; Cuq, P.; Montero, J-L.; Cupissol,
D.; Vian, L. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 307, 816-823 .
6. Abdaoui, M.; Dewynter, G.; Toupet, L.; Montero, J-L. Tetrahedron 2000, 56, 2427-
2435.
7. Abdaoui, M.; Dewynter, G.; Aouf, N.E.; Favre, G.; Morere, A.; Montero, J-L. Bioorg.
Med. Chem. 1996, 4, 1227-1235.
8. Abdaoui, M.; Dewynter, G.; Montero, J-L. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 5695-5698.
9. Abdaoui, M.; Dewynter, G. ; Aouf, N. E.; Montero, J-L. Phosphorus, Sulfur and
Silicon 1996, 118, 39-47.
10. Dewynter, G.; Abdaoui, M.; Regainia, Z.; Montero, J-L. Tetrahedron Lett. 1996, 52,
14217-14224.
11. Gnewuch, C.T.; Sosnovsky, G. Chem. Rev. 1997, 97, 829-1013.
115
12. Lown, J.W.; Chauhan, S.M.S. J. Org. Chem. 1981, 46, 5309-5321.
13. Mitsunobu, O.; Synthesis.1981, 1-28.
14. Naghipor, A.; Ikonomou, M.G.; Kebarle, P.; Lown, J.W.; J. Am. Chem. Soc. 1990,
112, 3178-3187.
15. Lown, J.W.; McLaughlin, L.W.; Plambeck, J.A.; Biochem. Pharmacol. 1978 , 28,
2115-2122.
16. Colvin, M.; Brundertt, R.; In Nitrosoureas: Current status and New Developments,
A.W.Prestayko, S.T. Crooke, L.H. Baker, S.K. Carter, P.S. Schein. Eds, Academic
Press: New-York, 1981, p43.
17. Sariban. E; Erickson, L.C; Kohn, K.W. Cancer. Res. 1984, 44, 1352-1357.
18. Lasker, P.A.; Ayres, J.W. J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1072-1076.
19. Garret, E.R. J. Am. Pharm. Assoc. Sci. Ed. 1960, 49, 767-771.
20. Den-Brok, M.W.J.; Nuijen, B.; Hillebrand, M.J.X.; Lutz, C.; Optiz, H.G.; Beijnen.
J.H. J. Pharm. Biomed. Analysis. 2005, 38, 686-694.
21. Garret, E.R.; Goto, S. Chem. Pharm. Bull. 1973, 21, 1811-1817.
22. Brundrett, R.B.; Cowens, J.W.; Colvin, M.; Jardine, L. J. Med. Chem. 1976, 19, 958-
961.
23. Snyder, J.K; Stock, L.M. J. Org. Chem. 1980, 45, 4494-4496.
24. Snyder, J.K; Stock, L.M. J. Org. Chem. 1980, 45, 1990-1999.
25. Carminati, A; Barascut, J.L; Naghipour. A;Lown, J.W.; Imbach, J.L. Biochem.
Pharmacol. 1989, 38, 2253-2258.
116
26. Montgomery, J.A.; James, R.A.; McCaleb. G. S; Kirk, M.C; Johnstan. T.P; J. Med.
Chem. 1967, 10, 668-674.
27. Montgomery, JA.; James, R.A.; McCaleb, G.S.; Kirk, M.C.; Johnstan , T.P. J. Med.
Chem. 1975, 18, 568-571.
28. Golding, B.T.; Bleasdale, C. ; McGinnis, J; Muller S.; Rees, H.T.; Rees, N.; Farmer,
P.B.; Watson , W.P. Tetrahedron 1997, 53, 4063-4082.
29. Blans, P.; Vigroux, A. Chem. Eur. J. 1999, 5, 1526-1532.
30. White, E.H.; Ryan, T. J.; Hahn, B .S.; Erikson, R.H. J. Org .Chem. 1984, 49, 4860-
4866.
31. White, E.H.; Reefer, J.; Erikson, R.H.; Dzadsik, P. M. J. Org .Chem. 1984, 49, 4872-
4876.
32. White, E.H.; Depinto, J.T.; Polito, A. J.; Bauer, I.; Rooswell, D.F. J. Am. Chem .
Soc. 1988, 110, 3708-3709.
33. White, E.H.; Li, M.; Lu, S. J. Org .Chem. 1992, 57, 1252-1258.
34. Zwang, W.; Zhentang, D.;Zhengxu, C. Deys and pigements. 2005, 65, 83-87.
35. Morrica, P.; Fidente, P.; Seccia, S. Biomed. Chromatography 2004, 18, 450-456.
36. GarciaRio, L.; Leis, J.R.; Moreira, J.A.; Araujo, E.; Norberto, F.; Ribeiro, L. J. Org
.Chem. 2003, 68, 4330-4337.
37. Lown, J.W.; Koganty, R.R. ; TewK.D. ; Imbach, J.L. Biochem . Pharmacol. 1985,
34, 1015-1024.
38. Weinkam, R. J.; Liu, T.J.; Lin, H.S. Chem-Biol.Interactions, 1980, 31, 167-177.
117
39. Lin, H. S; Weinkam, R. J. J. Med.Chem 1981, 24, 761-763 .
40. Weinkam, R. J.; Finn. A; Levin. V. A; Kane, J. P, J. Pharmacol. Exp. Ther. 214
1980, 318-323.
41. Yeager, R. L. Journal. Chromatography. 1984, 305, 496-501.
42. Maggio, A. F. ; Pompon, A. ; Lucas, M.; Barascut, J-L.; Imbach, J-L. Journal.
Chromatography. 1988, 436, 23-30.
43. Lien .S; Larsson.A-K; Mannervik. B; Biochem. Pharmacol 2002, 63,191-197.
44. Ueada-Kawamistu, H.; Lawson, T. A.; Gwilt, P. R. Biochem. Pharmacol . 2002, 63,
1209-1218.
45. Bodell,W. J.; Mutat. Research. 2003, 522, 85-92.
46. Naghipor, M.; Ikonomou, G.; Kebarle, P.; Lown, J.W. J. Am. Chem. Soc .1990 112
3178-3187.
47. Niessen, W. W. A. Encyclopydia of spectroscopy spectrometry. 2000. 1-3, 293-300.
48. Supko, J. G.; Philips, L. R.; Malspeis, L. J. Chromatogr. B , 1996, 667, 351-362.
49. Ayrton, J.; Dear, G. J.; Leavens, W. J.; Malllett, D. N.; Plumb, R. S. J. Chromatogr.
B , 1998, 709, 243-254.
50. Beumer, J. H.; Rosing, H.; Hillbrand, J. X.; Nan-Offeringa, L. G. A. H.; Foley, K.;
Murray –Yule, S.; Heck, J. R. A.; Schellens, J. H. M.; Beijnen, J. H. Rapid. Commun.
Mass. Spectrom. 2004, 18, 2839-2848.
51. Sanghvi, N; Ni.T; Yalkowsky, S. H.; Int. J. Pharm. 2002, 249, 257-264.
118
52. Korfmacher, W. A. Drug. Discov. Today.2005, 10,1357-1367.
53. Hsieh, S.; Tobien, T.; Koch, k.; Dunn, J. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 2004, 18,
285-292.
54. Jemal, M.; Qing, Y.; Whigan, D. B.; Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 1998, 12,
1389-1399.
55. Mestplet, N.; Saito, Y.; Morin, P.; Agrofoglio, L. A. Bioorganic. Chemistry. 2003, 31,
237-247.
56. Frankmoelle, W. P.; Medina, J. C. ; Schan, B.; Narbut, R. M.; Beckmann, H. Drug.
Meta. Disp. 2000, 28, 951-958.
57. Hayen, H.; Karst, U. J. Chromatogr. A. 2003, 1000, 549-565.
58. Xu, Y.; Grem, J.; J.Chromatogr. B. 2003, 783, 273-285.
59. Gika, H. G.; Samanidou, V. F.; Papadoyannis, I. N. J.Chromatogr. B, 2005, 814,
163-172.
60. Karrman. A; Bavel. B.V; Jarnberg.U; Hardell. L; Lindsrtom. G; Anal. Chem. 2005,
77, 864-870.
61. Kuklenyik. Z; Needham. L; Calafat. A. M; Anal. Chem. 2005, 77, 6085-6091.
62. Lim, H. K.; Chan, K.W.; Sisenwine, S.; Scatina, J. A.; Anal. Chem. 2001, 73, 2140-
2146.
63. Janiszewski, J. S.; Rogers, J. K.; Whalen, K. M., Cole, M. J.; Liston, T. E.;
Duchoslav, E.; Fouda, H. F. Anal. Chem. 2001, 73, 1495-1501.
64. Brés, J.C.; Morvan, F.; Lefevre, I.; Vasseur, J. J. ; Pompon, A. ; Imbach, J-L.
J.Chromatogr. B. 2001, 753, 123-130.
119
65. Pompon, A.; Lefebvre, I.; Imbach, J-L.; Biochem. Pharmacol . 1992, 43, 1769-1775.
66. Pompon, A.; Lefebvre, I.; Imbach, J-L.; Kahn, I. S.; Farquhar.D; Antiviral. Chem.
Chemothe. 1994, 5, 91-98.
67. Lefebvre, I.; Périgaud, C.; Pompon, A.; Aubertin, A. M. ; Girardet, J-L, kirn, A.;
Gosselin, G.; Imbach, J-L. J. Med. Chem. 1995, 38, 3941-3950.
68. Valette. G.; Pompon, A.; Lefebvre, I.; Périgaud, C.; Aubertin, A. M. ; Girardet, J-
L;kirn, A.; Gosselin, G.; Imbach, J-L. J. Med. Chem. 1996, 38, 3941-3950.
69. Egron, D. ; Lefebvre, I.; Périgaud, C.; Beltran, T.; Pompon, A.; Gosselin, G.;
Aubertin, A. M. ; Imbach, J-L. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 1045-1050.
70. Gika, H. G.; Samanidou, V. F.; Papadoyannis, I. N. J.Chromatogr. B, 2005, 814,
163-172.
71. Rajendran, V.; Pu, Y. S.; Chen, B. H. J.Chromatogr. B, 2005, 82, 99-106.
72. Holleran, J. L. ; Egorin, J.M. ; Zuhowski, E. G; Parise, R. A.; Musser, M. S.; Pan, S.
S.; Analytical. Biochemistry. 2003, 325, 19-25.
73. Abou-dounia, M.; Abu-Qare, A. W. Biomed. Chromatography 2001, 15, 464-470.
74. Naidong, W. ; Eerkes, A. Biomed. Chromatography 2004, 18, 28-36.
75. Goodwin, J. T.; Mao, B.; Vidmar, T.J.; Conradi, R. A.; Burton, P. S.; J. Peptide.
Res. 1999, 53, 355-369.
76. Hansch, C.; Leo, A.; Exploring QSRA: Fundamentals and Application in Chemistry
and biology, Americain. Chemical. Society, Washington, 1995.
77. Leo, A.; Hansch, C.; Elkins, D.; Chem. Rev. 1971, 71, 525-616.
120
78. Winum, J-Y.; Scozzafava, A.; Montero, J-L ; Supuran, C. T.; Med. Res. Rev. 2005,
25, 186-228
79. LEYDET, A.; Thèse de doctorat en science Université de Montpellier II Science et
technique, Juillet 1983.
80. MAGGIO. A –F ; Thèse de doctorat en chimie organique Université de Montpellier
II Science et technique, Juillet 1987
81. Dewynter. G. F ; Thèse de doctorat en science Université Montpellier II, Science et
Technique, 1984.
82. Abdaoui. M ; Thèse de doctorat Chimie Moléculaire Université Montpellier II,
Science et Technique, 1997.
83. Aouf, N.; Thèse de Doctorat, Chimie Moléculaire Université Montpellier II, Science
et Technique, Juin 1994.
84. Carminati, A. ; Thése de Doctorat, Chimie Organique Université Montpellier II,
Science et Technique, 1988.
85. Valette. G.; Thèse de doctorat Université Montpellier II, Science et Technique, 1998.
86. Carpenter, B. K.; Determination of organic reaction mechanism; Wiley.1984.
87. Kromidas, S.; More Pratical problem Solving in HPLC; Wiley-VCH . 2000.
88. Meyer, V. R.; Pratical High-Performance Chromatography;Wiley. 2005.
89. Lunn. G; HPLC of Recently Approved Phramaceutical, Wiley. 2005.
90. Ardrey. B; Liquid Chromatography Mass Spectrometry an Introduction, Wiley.
2003.
121
91. Lee. M. S. Integrated Strategies for drug Discovery Using Mass Spectroscopy,Wiley.
2005.
92. Patai. S. The Chemistry of Amino, Nitroso, Nitro, and related group; Wiley. 1996.
93. Martin Smith. R. Understanding Mass spectra. Wiley. 2004.
94. Krishra, G.; Hodnick, W. F.; Lang, W.; Lin, Xu.; Karra, S.; Mao, J.; Almassian, B.;
AAPS. Pharmsci. Tech .2001, 3, article 14.
95. Dibiase, S. A.; Gokel, G. W.; J. Org. Chem. 1978, 43, 447-452.
96. Lown, J.W.; Koganty, R.R.; Bhat, U. G. ; Chauhan, S. M. S.; Sapse, A. M. ; Allen,
E. B. ; Biochem . Pharmacol. 1985, 34, 1015-1024.
97. De Souza, A. ; Baylocq, D . ; Pellerin, F. ;Talanta. 1988, 35, 875-878.
122
ANNEXE
123
Publications résultantes de ces travaux
Les résultats des travaux de recherche présentés dans cette thèse ont fait l’objet de
deux publications de renommer internationales et une communication dans un séminaire
internationale dont la liste est donnée ci-dessous :
• Kinetic Investigation on Aqueous Decomposition of 2-Chloroethylnitrosulfamides
Seridi, A.; Kadri, M.; Abdaoui, M.; Winum, J-Y.; Montero, J-L.; Bioorg. Med.
Chem. Lett 2006, 16, 1021-1027.
• Study on the decomposition of 2-Chloroethylnitrososulfamides (CENS )
in serum using HPLC on-line solid phase extraction
Seridi, A.; Winum, J –Y.; Kadri, M.; Abdaoui, M.; Montero, J-L.; Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2006, 339, 521 – 526.
• Etude de la cinétique de décomposition des 2-chloroéthylnitrososulfamides dans le milieu aqueux.
Seridi, A.; Winum, J –Y.; Kadri, M.; Abdaoui, M.; Montero,
la 15éme journée de Chimie du Grand Sud-Ouest organisée le 25 novembre 2005 à Montpellier par la Société Française de Chimie
124
Top Related