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Faculté des sciences Année 2OO7

Département de Chimie

THESE

Présentée en vue de l’obtention du Diplôme de DOCTORAT

Option Chimie Appliquée

Par

SERIDI Achour

DIRECTEUR DE THESE : Mekki KADRI Professeur Université de Guelma

DEVANT LE JURY

PRESIDENT : Mohamed ABDAOUI Professeur Université de Guelma

EXAMINATEURS : Nourredine AOUF Professeur Université de Annaba Fayçal DJAZI Professeur Université de Skikda

Rachid DELIMI Professeur Université de Annaba

BADJI MOKHTAR-ANNABA UNIVERSITY ���ب�-� م���ر���م�� ب� UNIVERSITE BADJI MOKHTAR-ANNABA

Etude Cinétique de Décomposition des 2-Chloroéthylnitrososulfamides « CENS »

Nothing in life is to be feared . It is only to be understood.

Marie-curie (1867-1934)

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Abstract

Kinetics decomposition of 2-chloroethylnitrososulfamides was studied in the first time on

aqueous buffered solutions with pH ranging from 0 to 14. The study was monitored by RP-LC-MS

and conventional UV-spectrophotometry. The reaction acted via a pseudo first order kinetic with

significant correlation coefficient. The major decomposition product from CENS after incubation

in phosphate buffer were isolated and identified by NMR and mass spectrometry. The results

indicate that the mechanism pathway involves a denitrosation of the CENS and competitive

hydrolysis with nucleophilic attack on the sulfur atom and formation of sulfamate compounds.

As second approach, we study the decomposition in organic media , the kinetics has been

monitored by NMR spectroscopy of proton and isotopic labelled nitrogen . Our first observation

show that the kinetics is complex and acted very slowly comparatively to the aqueous and

biological media. The use of LC-MS as separative and analytical technique shows several product

which have been tentatively identified and a general mechanism has been proposed.

In addition, we have examined the kinetics decomposition of 2-chloroethylnitrososulfamides

in calf foetal serum. The study was monitored by on-line solid phase extraction linked to RP-LC-

MS. These results indicate that the in-vitro stability of CENS in calf fetal serum is less than in

aqueous buffer at pH=7.4 and 37°C. We have attribueted this to the catalysis by serum proteins and

enzymes. We have shown that partition coeficient of CENS can be coorelated to the kinetics

decomposition, so we observe that the stability is greater for more lipohilic CENS. The major

metabolites after decomposition have been tentatively identified by RP-HPLC-MS. The mechanism

pathway is more complex than in aqueous phosphate buffer ,our first observation indicate the

formation of severable metabolites .We have also observed that in this biological media we can

avoid the same two principals products leaded from the decomposition of CENS in aqueous

phosphate media.

Key- words : Kinetics; Decomposition; Chloroethylnitrososulfamides; LC-MS; On-line solid phase

extraction

Résumé

Dans ce travail de thèse, nous avons étudié la cinétique de décomposition des 2-

Chloroethylnitrososulfamides CENS dans divers milieux (aqueux, organique et biologique). Dans

un premier temps, la cinétique a été étudiée dans le milieu aqueux avec à des pH contrôlés

s'étendant de 0 à 14. L'étude a été menée par RP-LC-MS et spectrophotométrie UV

conventionnelle. La décomposition se fait selon une cinétique de pseudo premier ordre avec des

coefficients de corrélation significatifs. Les principaux produits issus de cette décomposition après

incubation dans la solution tampon de phosphate (pH=7.4 ; T=37°C) ont été isolés et parfaitement

identifiés par spectrométrie RMN et de masse. Les résultats indiquent que le mécanisme implique

une dénitrosation des CENS de départ et une hydrolyse concurrentielle du à l'attaque nucléophile

sur l'atome de soufre et la formation du sulfamate.

Nous nous sommes également intéressé au comportement cinétique des CENS dans le

milieu organique, la RMN du proton et de l’azote marqué ont été exploité pour élucidé le

mécanisme qui apparaît très complexe ; le suivie nous a montré qu’il s’agit d’une cinétique assez

lente donc nos interprétations été plutôt qualitative . En utilisant la LC-MS comme technique de

séparation et d’analyse nous avons pu détecter quelques fragments et un mécanisme général a été

proposé sur la base de ces observations.

D’autre part, nous avons examinés la cinétique de décomposition des CENS dans du sérum

de veaux foetal, L'étude a été menée par une technique d'extraction en ligne sur phase solide liée à

la RP-LC-MS. Ces résultats indiquent que la stabilité in- vitro des CENS dans le sérum est moins

importante que dans le milieu phosphate (pH=7.4 et à 37°C) et organique. Nous avons attribué

ceci à la catalyse par des protéines et des enzymes de sérum. Nous avons prouvé également que la

lipophilie des CENS peut être corrélée à la cinétique de décomposition, ainsi nous avons observés

que la stabilité est plus grande pour les CENS les plus lipophile. Les principaux métabolites après

décomposition ont été tentitativement identifiées par RP-HPLC-MS. Le mécanisme est plus

complexe que dans le milieu aqueux et organique, notre première observation indique la formation

de plusieurs métabolites. Nous avons également observé que dans ce milieu on peut avoir les

mêmes deux produits trouvés lors de la décomposition des CENS dans le milieu aqueux

phosphate.

Mots–Clé : Cinétique; Décomposition; CENS; LC-MS; extraction sur phase solide on-ligne.

REMERCIEMENTS

Cette thèse a été effectuée en partie au sein du Laboratoire de Chimie Biomoléculaire de

l’Université de Montpellier II sous la direction du Professeur : Jean-Louis Montero. Je le remercie

de m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et de m’avoir accordé sa confiance pendant ces dix

huit mois de formation. Je lui suis reconnaissant pour les conseils qu’il m’a prodigués et l’attention

constante qu’il a portée à ce travail. Qu’il trouve dans ces quelques mots l’expression de mes plus

sincères remerciements.

J’adresse tout particulièrement mes profonds remerciements au Professeur Mekki Kadri

de m’avoir encadré et supporté toutes ces années, pour la liberté d’action qu’il m’as laissé, et je le

remercie de m’avoir initié à la recherche et permis de mener à bien cette thèse. Ces conseils, sa

rigueur scientifique et les nombreux encouragements qu’il m’a prodigués ont été une aide précieuse

et indispensable.

J’exprime également mes vifs remerciements au Professeur Mohamed Abdaoui directeur du

Laboratoire de Chimie Appliqué de l’Université de Guelma. Je le remercie de m’avoir autoriser à

utiliser pour mon travail, les composés ayant faits l’objet de sa thèse. Je le remercie de m’avoir

initié et guidé mes premiers pas en synthèse qu’il trouve l’expression de ma parfaite

reconnaissance et ma profonde sympathie

Je tiens à remercier très vivement Monsieur Jean-Yves Winum Maître de Conférences à

l’université de Montpellier II chef d’équipe à laquelle j’ai été intégré pendant ma formation en

France, il été d’un enthousiasme exceptionnel ses précieux conseils ainsi que sa rigueur

scientifique et son efficacité m’ont permis de finaliser cette thèse.

Que Monsieur Nourredine Aouf Professeur à l’Université de Annaba, trouve l’expression

de ma profonde reconnaissance pour avoir accepter de juger ce travail et je n’oublierais pas ses

précieux conseils surtout à mon installation à Montpellier.

Que Monsieur Rachid Delimi, Professeur à l’université de Annaba qui a voulu examiner ce

travail, qu’il trouve ici l’expression ma parfaite considération.

Je suis très sensible à l’honneur que m’a fait le Professeur Fayçal Djazi en acceptant de

juger ce travail, de faire partie du jury de cette thèse et de l’intérêt qu’il manifeste à mon travail.

Je n’oublierai jamais son aide précieuse sans lui je n’aurai obtenu cette formation.

Evidemment, je n’oublie pas le Docteur Gilles Valettes, pour ses précieux conseils pour la

manipulation en HPLC-MS.

J’exprime également mes remerciements au ministère de l’enseignement supérieur et de la

recherche scientifique d’avoir financé tout mon séjour en France dans le cadre du programme

intergouvernemental (BAF)

Un grand merci à Madame Nicole Imparato du service accueil international de Montpellier

qui a facilité mon séjour à Montpellier et a géré mon dossier durant toute la période de formation

.

Je voudrais également exprimer toute ma sympathie à mes compagnons de thèse et de

travail que j’ai eu le plaisir de rencontrer au laboratoire, Nabila, Antoine, Marie-rose, Catalina,

Simon, Audrey, Hicham, Jean-Luc et tous les autres.

Je voudrais exprimer à toute ma famille, et plus particulièrement mes parents, ma profonde

reconnaissance pour le soutien qu’ils m’ont apporté en toute circonstance. Qu’ils trouvent dans ce

travail le témoignage de mon affection

A la mémoire de mon oncle : SERIDI A/Aziz

A la mémoire de mon grand père : BEHLOUL Brahim

A mes parents

A mes frères et sœurs

A mon épouse

A la petite Rayenne

Liste des annotations et des abréviations

• Abs : Absorbance

• ADN : Acide désoxyribonucléique

• ARN : Acide ribonucléique.

• ACN: Acétonitrile

• BCENU : Bis-chloroethyl nitrosourée

• BCGNO : 1-Nitroso-methyl-3-benzoylguanidine

• Boc : Tertiobutyloxycarbonyle

• CENU : 2-Chloroéthylnitrosourée

• CENS : 2-Chloroéthylnitrososulfamide

• CES : 2-Chloroethylsulfamides.

• C.C.M : Chromatographie sur couche mince.

• DiBn : Dibenzyle

• DEAD : Diéthylazodicarboxylate

• DIAD : Disopropylazodicarboxylate

• ESI: Electrospray ionisation

• HPLC : High performance liquid chromatography

• H.L.B : Hydrolipophyl balanced polymer

• ICS: Isocyanate de chlorosulfonyle

• kobs : Constante de vitesse observée

• Log P : Coefficient de partage

• LC-MS: Chromatographie liquide couplé à la spectrométrie de masse.

• MeOH : Methanol

• NADH: Nicotinamide adénine dinucléotide.

• NICE-Nu : Nitroimidazole chloroethylnitrosourées

• MNU : Methyl Nitrosourée

• MNTS : N-methyl-N-nitroso-p-toluene sulfonamide

• MNNG: N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine.

• MS: Mass spectroscopy

• Nd : Non déterminé.

• n.m : Nanométre

• Ph : Phényle

• PPh3 : Triphénylphosphine

• P.D.A: Photodiode array (détecteur à barrette de diode)

• p.p.m: Partie par million

• Rf : Rapport frontale

• RMN 1H : Résonance magnétique nucléaire du proton.

• RMN 15N : Résonance magnétique nucléaire de l’azote marqué.

• RP-LC-MS : Chromatographie en phase inverses couplée à la masse.

• S.P.E: Extraction sur phase solide.

• t-Bu : Tertiobutyl

• THF : Tétrahydrofuranne

• TEA : Triéthylamine

• TIC : Total ionic chromatogram

• t1/2 : Temps de demie vie (temps de demie réaction)

• TSGNO : N-nitrosoguanidine, 1-methyl-3-tolylsulfonylguanidine

• TFA : Acide trifluoroacétique

• UV-PDA : Détecteur ultraviolet à barretes de photodiode.

• Z : Amine (aromatiques et aliphatiques), aminoacide ou phénol

• λmax : Longueur d’onde correspondante au maximum d’absorption.

Listes des schémas

• Schéma (1) : Les CENS utilisé dans notre étude…………………………………. 3

• Schéma (2) : Mécanisme de la décomposition des CENU selon la voix A…….... 8

• Schéma (3) : Mécanisme de la décomposition des CENU selon la voix B……..... 9

• Schéma (4) : Mécanisme de décomposition des CENU selon la voix C…………. 10

• Schéma (5) : Hydrolyse et réduction de la BCENU… …...................................... 11

• Schéma (6) : Hydrolyse et réduction de la BCENU Bis-méthylé..……………… 11

• Schéma (7) : Hydrolyse et réduction de la BCENU Bis-méthylé marqué 18O……12

• Schéma (8) : Mécanisme de décomposition de l’oxadiazole…………………...... 12

• Schéma (9) : Modification de la décomposition des CENU……………………... 13

• Schéma (10): Dialkylation enzymatique des CENU…………………………….. 14

• Schéma (11) : Décomposition des Alkylnitrosourées……………………………. 14

• Schéma (12) : Décomposition des MNU…………………………………………. 15

• Schéma (13) : Décomposition des MNU en milieu basique ………………......... 16

• Schéma (14) : Décomposition des MNU via l’intermédiaire tetrahedral………… 16

• Schéma (15) : Mécanisme globale de la décomposition des NICE-Nu ………… 17

• Schéma (16) : Décomposition des NICE-Nu……………………………………. 17

• Schéma (17) : Décomposition des nitrososulfonamide selon le mécanisme 1…… 18

• Schéma (18) : Décomposition des nitrososulfonamide selon le mécanisme 2..….. 19

• Schéma (19) : Décomposition des nitrososulfamates en milieu aqueux………… 19

• Schéma (20) : Mécanisme de décomposition nitrososulfamates………………… 20

• Schéma (21) : Décomposition des Nitrophenylsulfonyl ethyl ether……………... 21

• Schéma (22) : Mécanisme de dégradation oxydative des sulfamides……………. 22

• Schéma (23) : Schéma de fragmentation en spectrométrie de masse……………..23

• Schéma (24) : Mécanisme d’oxydation des sulfamides………………………….. 24

• Schéma (25) : Mécanisme d’hydrolyse des N-(phénoxycarbonyl) sulfamate…… 25

• Schema (26) : Dégradation des 1,2-Bis (sulfonyl)-1-Alkylhydrazine…………… 26

• Schema (27) : Mécanisme de l’hydrolyse des MNTS…………………………… 27

• Schema (28) : Mécanisme de décomposition des MNNG………………………...28

• Schema (29) : Structure du TSGNO et BCGNO…………………………………. 28

• Schema (30) : Les trois voix de décomposition des MNTS…………………… 29

• Schema (31) : Schéma d’ouverture sulfamide N-substitué s cyclique…………. 29

• Schema (32) : Carbamoylation- sulfamoylation………………………………...... 33

• Schema (33) : Chloroethylation………………………………………………….. 33

• Schema (34) : Déprotection………………………………………………………. 34

• Schema (35) : Nitrosation………………………………………………………… 35

• Schema (36) : Carbamoylation-sulfamoylation-cyclisation…………………….. 36

• Schema (37) : Réouverture des oxazolidinone…………………………………… 37

• Schema (38) : Halogénation……………………………………………………… 37

• Schema (39) : Nitrosation………………………………………………………… 37

• Schema (40) : Synthèse selon la voix C………………………………………….. 38

• Schema (41) : Les éléments d’un système LC-MS………………………………. 41

• Schema (42) : Détecteur de masse type singulier quadripolaire………………... 42

• Schema (43) : Système d’analyse des substances actives par LC-MS…………… 45

• Schema (44) : Schema global pour l’analyse en SPE-LC-MS………………….. 46

• Schema (45) : Interaction protéine analyte avec la phase mobile…………………47

• Schema (46) : Système de vanne automatique utilisé en SPE-LC-MS…………... 50

• Schema (47) : Mécanisme de Décomposition des CENS à pH=7.4;T=37°C)…… 61

• Schema (48) : Mécanisme de dénitrosation des CENS………………..…………. 62

• Schema (49) : Mécanisme d’hydrolyse des CENS ……………………………… 63

• Schema (50) : Stabilisation de la chlorethyldiazoate ……………………………. 65

• Schema (51) : Marquage des CENS à l’azote 15………………………………… 66

• Schema (52) : Résonance des trois azote en RMN de l’azote 15………………… 69

• Schema (53) : Mécanisme de décomposition des CENS en milieu organique ….. 77

• Schema (54) : Mécanisme de décomposition des CENS dans le sérum ………… 83

• Schema (55) : Schéma hypothétique de l’interaction bio-chimique……………... 87

des CENS dans le sérum .

Liste des figures

• Figure (1) : Spectres UV lors de la décomposition en milieu basique…………… 53

• Figure (2) : Spectres UV lors de la décomposition en milieu acide……………… 53

• Figure (3) : Spectres UV lors de la décomposition en milieu neutre…………….. 54

• Figure (4) : Profil du pH des composés étudiés ………………….……………... 55

• Figure (5) : Evolution du chromatogramme du composé1 en fonction du temps... 56

• Figure (6) : Variation de la surface du pic en fonction du temps………………… 59

• Figure (7) : 1-Chromatogramme du composé 2 après 72h de réaction ………… 60

2-Chromatogramme du CES pur préparé par voie de synthèse.

• Figure (8) : Spectre RMN 15N du composé 1 dans ACN………………………… 67

• Figure (9) : Spectre RMN 15N du composé 1 dans MeOH……………………….. 68

• Figure (10) : Spectre RMN 15N du composé 2 dans ACN……………………….. 68

• Figure (11) : Spectres RMN1H montrant l’évolution cinétique………………….. 71

du composé 1 à T° ambiante.

• Figure (12) : Chromatogramme HPLC des différents composés………………... 75

dans l’acétonitile à température ambiante après 15 .

• Figure (13) : Evolution en fonction du temps du chromatogramme…………….. 81

de la décomposition du composé 2 incubé dans du sérum de vœu fœtale à 37°C

• Figure (14) : Evolution de la surface du pic en fonction du temps ........................ 87

pour le composé2

Table des matières

Introduction ……………………………………………………………………………... 2 Chapitre (1) : Rappels bibliographiques sur la décomposition des composés………. 6 apparentés aux CENS.

1.1.Décompositions des Chloroéthylnitrosourées…………………………7 1.1.1. Mécanisme A………………………………………………. 8 1.1.2. Mécanisme B……………………………………………….. 9 1.1.3. Mécanisme C……………………………………………….. 10 1.1.4. Compétition des trois mécanismes……………………......... 10 1.1.5. Modifications de la décomposition des CENU….…………. 12 1.2. Décomposition des Alkylnitrosourées…………………………......... 14 1.3. Décomposition des nitroimidazoles chloroéthylnitrosourées……….. 16 1.4. Décomposition des nitrososulfonamides…………………………..... 18 1.5. Décomposition des nitrososulfamates………………………………. 19 1.6. Décomposition des Nitrophenylsulfonyl éthyl ether………………... 20 1.7. Décomposition oxydative des sulfamides.…………………………... 21 1.8. Décomposition des N-(phénoxycarbonyl) sulfamates.……………... 24 1.9. Décomposition des 1,2-Bis (sulfonyl)-1-Alkylhydrazine…………… 25

1.10.Décomposition des MNTS et MNNG………………………………..27 1.11.Décomposition des N-substitués sulfamides Cycliques.……............. 29

Chapitre (2) : Synthèse des CENS……………………………………………………... 31 2.1.Synthése selon la voix A…………………………………………….... 32 2.1.1.Carbamoylation sulfamoylation…………………………...... 32 2.1.2.Chloroethylation selon Mitsunobu………………………...... 33 2.1.3.Déprotection………………………………………………… 34 2.1.4.Nitrosation…………………………………………………... 35 2.2.Synthése selon la voix B……………………………………………… 35 2.2.1.C arbamoylation-sulfamoylation-cyclisation ……………….. 36 2.2.2.Réouverture des oxazolidinones……………………………. 36 2.2.3.Halogénation………………………………………………... 37 2.2.4.Nitrosation…………………………………………………... 37 2.3.Synthése selon la voie C……………………………………………… 38 Chapitre (3) : Les outils d’analyses…………………………………………………….. 40 3.1. Analyse par spectrophotométrie UV-visible…………………………. 41 3.2. Analyse par LC-MS des CENS……………………………………….41 3.2.1. Mise au point de la méthode……………………………….. 42 3.2.1.1. Choix de la colonne………………………………. 42 3.2.1.2. Choix de la phase mobile………………………… 42 3.2.1.3. Gradient d’élution................................................... 43 3.2.1.4. Choix du débit......................................................... 43 3.2.1.5. Choix de la température…………………….......... 43 3.3. Analyse par HPLC de la décomposition des CENS ………………… 44 en milieu biologique. 3.3.1. Le couplage on-line Cleaning LC/UV/ESI-MS……………. 44 3.3.2. Mise au point de la méthode d’analyse……………………. 47 3.3.3. Choix de la précolonne………………………………….… 48 3.3.4. Choix de la phase stationnaire……………………………... 49 3.3.5. Choix de la phase mobile…………………………………... 49 3.3.6. Gradient d’élution………………………………………….. 49

3.3.7. Choix de la température……………………………………. 50 3.3.8. Choix du débit……………………………………………… 50 3.3.9. Le système de vanne automatique…………………………. 51 3.4. Analyse de la décomposition par RMN……………………………………… 52 3.4.1. La RMN du proton ………………………………………………… 52 3.4.2. La RMN de l’azote marqué………………………………………… 52 Chapitre (4) : Décomposition des CENS dans le milieu aqueux …………………….. 53 4.1. Suivi cinétique par spectrophotométrie UV-visible…………………………. 54 4.1.2. Traitement des données cinétiques………………………………… 56 4.2. Suivi par LC-MS……………………………………………………………...57 4.3. Identifications des produits issus de la décomposition des CENS…………... 61 4.4. Mécanisme de décomposition proposé………………………………………. 62 Chapitre (5) : Décomposition des CENS en milieu organique……………………….. 64 5.1. Décomposition en présence du KOtbu………………………………………. 65 5.2. Décomposition en milieu acide organique…………………………………... 66 5.2.1. Marquage régiosélectif des CENS…………………………………. 66 5.2.2. Suivi par RMN de 15N………………………………………………66 5.3. Décomposition en milieu organique neutre …………………………………. 70 5.3.1. Suivi par RMN du proton………………………………………….. 70 5.3.2. Suivi par HPLC-ESI-MS…………………………………………... 74 Chapitre (6) : Décomposition des CENS dans le milieu biologique………………...... 80 6.1. Suivi par SPE-LC-MS ………………………………………………………. 80 6.2. Cinétique et lipophilie ………………………………………………………. 84 Conclusion Générale…………………………………………………………………… 89 Parie expérimentale …………………………………………………………………….. 91 Références Bibliographiques………………………………………………………….... 99 Annexe…………………………………………………………………………………… 108

INTRODUCTION GENERALE

Introduction

Les 2-Chloroéthylnitrosourées (CENU) sont des agents alkylants bi fonctionnels

présentant une activité sur un large spectre de tumeurs. Plusieurs d’entre elles sont

couramment utilisées en clinique dans le traitement des mélanomes malins, lymphomes,

adénocarcinomes métastasiques, cancers du système gastro-intestinaux, et quelques autres

tumeurs solides [11-27].

Malheureusement, les CENU n’ont pas seulement une activité antinéoplastique

mais également muta génique et cancérogène. D'ailleurs, leur efficacité thérapeutique est

associée lors de leur décomposition à la génération de deux espèces chimiques

électrophiles. Une première espèce (ion éthylchloronium) qui va alkyler l’ADN et former

des ponts inter et intracaténaires, contribue à l’activité antitumorale. La deuxième espèce

(isocynatate) est responsable quant à elle de la carbamoylation des protéines,

essentiellement les enzymes de réparation.

Cette réaction de carbamoylation n’intervient pas dans l’activité antitumorale, mais

a été largement mise en cause dans la toxicité associée à ces composés (myélotoxicité)

empêchant ainsi les poursuites de traitements

Sur la base de ces observations, une nouvelle famille d’agents alkylants

structurellement analogues aux 2 chloroethylnitrosourées (CENU) mais exempte de toute

activité carbamoylante, a été développée. Il s’agit en l’occurrence des 2-

chloroéthylnitrososulfamides (CENS) [6-7].

Leur synthèse a été largement décrite, et leur évaluation in-vitro s’est avérée très

encourageante comparés à des CENU utilisés en clinique [6-10].

Pour apporter une meilleure évaluation clinique et prévoir le mode d'action des

CENS, des études cinétiques sur leur décomposition dans différentes conditions sont

nécessaires.

18

Les trois CENS ayant fait l’objet de notre travail sont choisis (schéma 1) en raison

de leur meilleur activité in-vitro sur les variétés de cellules mammaires A549 et

pulmonaire MCF7, comparés aux CENU [7]. Il s’agit de composés suivants :

• Composé (1): N-nitroso , N-(2-chloroethyl) , N’-sulfamoyl pipéridine

• Composé (2): N-nitroso , N-(2-chloroéthyl),N’,N’-dibenzylsulfamide

• Composé (3): N-nitroso , N-(2-chloroéthyl),N’,N’-dicyclohexylsulfamide

Schéma (1) : CENS utilisés dans notre étude

Le travail présenté commence d’abord par une étude de décomposition en milieux

aqueux acide, neutre et basique. Le suivi cinétique par spectrophotométrie directe montre

qu’à l’instar de leurs analogues [11,22,23,25,39], les CENS subissent une catalyse acido-

basique généralisée. A cet effet, il a été également instructif de mettre en évidence le

comportement du nouveau motif introduit en chimie =NSO2N(NO)- .

La difficulté de la détermination des différentes espèces formées a été surmontée en faisant

recours au couplage de la chromatographie liquide de haute performance (HPLC) à la

spectrométrie de masse (MS).

En milieu organique, la décomposition des CENS été suivie en combinant une

variété d’outils d’analyse, il s’agit en l’occurrence de la RMN de l’azote marqué, la RMN

du proton et la chromatographie liquide couplée à la masse (LC-MS).

N NClS

O O

NO

N NClS

O

NO

O

N NClS

O

NO

O

1 2

3

19

D’autre part, pour nous rapprocher davantage du milieu biologique et avoir une

idée sur les interactions qui pourraient y avoir lieu, nous avons identifié les espèces

formées suite à la décomposition des CENS dans le sérum de veau fœtal. A cet effet, nous

avons développé une méthode d’extraction en ligne reliée automatiquement à la

chromatographie liquide à phase inverse couplée à la spectrométrie de masse (RP-LC-MS-

ESI).

La thèse est composée de six chapitres :

• Rappels bibliographiques sur la décomposition des composés apparentés aux CENS.

• Synthèse des CENS.

• Outils d’analyses

• Décomposition des CENS dans le milieu aqueux

• Décomposition des CENS en milieu organique

• Décomposition des CENS dans le milieu biologique

Le premier chapitre de cette thèse rassemble une recherche bibliographique sur la

décomposition des analogues structuro fonctionnels aux CENS. Une attention particulière

a été accordée aux chloroéthylnitrosourées, en raison de leur forte parenté structuro

fonctionnelle aux CENS. Nous nous sommes également intéressés aux nitrososulfamates ,

et aux nitrososulfonamides ainsi que d’autres sulfamides qui nous ont orientés dans les

interprétations mécanistiques et cinétiques.

Le second chapitre comporte une description des trois voies d’accès aux CENS et

une comparaison entre elles.

Le troisième chapitre est une présentation de divers outils analytiques utilisés il

s’agit de la spectrophotométrie UV-Vis , la HPLC et de sa mise au point ( choix de la

colonne , phase mobile etc ..) , la HPLC couplée à la masse (LC-MS), et la technique

d’extraction en ligne sur phase solide utilisée lors de la décomposition des CENS en

milieu biologique.

20

Le quatrième chapitre comporte l’étude de la décomposition des CENS en milieu

aqueux à des pH contrôlés .Il rassemble tous les résultats et les discussions nécessaires.

La décomposition dans le milieu organique a fait l'objet du cinquième chapitre. La

combinaison de la RMN de l’azote marqué et la RMN du proton ont été les outils de

choix pour notre investigation. La combinaison de ces méthodes avec la LC-MS nous a

permis d’établir un mécanisme de décomposition dans ce milieu.

Dans le dernier chapitre, nous avons décrit l’étude cinétique de décomposition en

milieu physiologique. A cet effet nous avons adapté la technique HPLC basée sur le

nettoyage en ligne couplée à la chaîne LC-MS pour les études cinétiques.

Enfin, la dernière partie de cette thèse comporte une conclusion générale et une

partie expérimentale où sont rassemblés tous les protocoles expérimentaux.

21

CHAPITRE (I)

Rappels bibliographiques sur la décomposition des

composés apparentés aux CENS.

22

Dans ce chapitre nous allons exposer les différents travaux décrits dans la littérature

liés à la décomposition des analogues structuro fonctionnels des CENS.

Il est important de signaler qu’aucune indication n’a été donnée dans la bibliographie

concernant la cinétique de décomposition des CENS.

Certains composés étudiés comportent le motif nitrososulfonyl , d’autres par

contre contiennent dans leur structure les deux motifs chloroéthyl, et nitroso à la fois. Les

activités biologiques de ces composés et leurs mécanismes de décomposition ont été

décrites.

I.1.Décomposition des Chloroéthylnitrosourées:

Les Chloroéthylnitrosourées (CENU) présentent une grande analogie structuro

fonctionnelle avec les CENS. On peut escompter une analogie entre leurs mécanismes de

décomposition et entre leurs modes d’action. Les études de décomposition des CENU

nous servirons de balises pour le comportement des CENS

Depuis les travaux de Montgomery et coll. 1967, [25] sur la synthèse et la

décomposition des CENU , Brundett et Colvin [21] ont complété et exploré d’autres

modes de décomposition probables. Par la suite l’équipe dirigée par Lown [11, 12, 14, 35]

s’est largement intéressée à la décomposition des CENU par l’emploi des techniques

instrumentales modernes notamment la RMN de l’azote 15, le carbone 13 et l’oxygène 18.

Le marquage isotopique spécifique s’est avéré un outil puissant pour suivre et

comprendre les phénomènes souvent complexes en solution.

Par ailleurs, l’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse couplée à la masse pour

les produits volatiles, a permis de proposer un autre mécanisme plausible. Les auteurs ont

discuté les possibilités de chacun des mécanismes compétitifs [11].

Les études entreprises, dans leur majorité, ont montré d’une manière générale que

la décomposition dépend de la nature du milieu, de la température et aussi du pH des

solutions aqueuses. En effet, il a été établi que la stabilité des CENU en milieu aqueux est

fortement dépendante du pH. Ainsi, par exemple la Bis-Chloroéthylnitrosourées (BCENU)

est relativement stable à pH=4.5 avec un temps de demie vie supérieure à 500 min, par

contre à pH=7.4 et 8 les temps de demie vie sont respectivement de 50 et 5 min.. A des

pH fortement acides (pH < 2) la BCENU se décompose en quelques secondes.

Pour mieux cerner et expliquer leur mode d’action in-vivo une attention

particulière a été accordée aux mécanismes de décomposition dans des conditions

physiologiques de température et de pH (T=37°C, pH=7.4).

23

Divers mécanismes ont été proposés permettant de comprendre leur mode

d’action et leur réactivité avec les bases de l’ADN en l’occurrence la purine et la

pyrimidine.

Pour pH > 5, trois mécanismes de décomposition ont été proposés (A-C) schéma (2, 3, 4)

[11].

1.1.1. Mécanisme (A) :

Ce mécanisme est caractérisé par une décomposition initiale pour donner le

diazohydroxyde et l’isocyanate. Il est considéré comme étant le mécanisme le plus

probable sous les conditions physiologiques (schéma 2). L’entité isocyanate est une

espèce carbamoylante qui peut réagir avec les acides aminés et l’ARN in- vivo.

Par contre, le diazohydroxyde est l’espèce alkylante considérée comme étant le

précurseur de l’ion chloronium responsable de l’activité anticancéreuse des CENU.

O

C NCH2CH2Cl

O

N

NR

H

NR C O ClCH2CH2N N OH2 ClCH2CH2 ClCH2CH2OH

ClCH2=C + H3O

ClCH2CH2ClClCHCH3

H2O -HCl

H2O

-H

Cl

CH3CH O

H2O

-N2

-H2O

Isocyanate Chloroéthyldiazohydroxyde

Schéma (2) : Mécanisme de la décomposition des CENU selon la voix A

24

1.1.2. Mécanisme (B) :

Ce deuxième mode de décomposition minoritaire, proposé par Brundret et Colvin

[21]. Le groupement nitroso subit une réaction de déplacement intramoléculaire pour

donner 1,2,3-oxadiazolidine.

La suite de la fragmentation donne le 4,5-dihydro-1,2,3- oxadiazole comme

intermédiaire réactif qui se décompose en milieu aqueux pour donner le 2-

hydroxyéthyldiazohydroxyde (OHCH2CH2OH). Le dernier intermédiaire peut se dégrader

via le carbocation (2-Hydroxyethyl) pour donner l’oxyde d’éthylène, l’éthylène glycol et

l’acétaldéhyde qui ont été détectés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la

masse [11].

C N

O

NR

H

ON

Cl

N

ON

NR C OClCH2CH2

N NOH2

OHCH2CH2OH

H2O

-N2-H2O

O

C NCH2CH2Cl

O

N

NR

H

Oxadiazolidine

Schéma (3) : Mécanisme de la décomposition des CENU selon la voix B

25

1.1.3. Mécanisme (C)

Le troisième mode de décomposition passe par une cyclisation intramoléculaire de

l’oxygène du carbonyle et un déplacement de l’halogène pour produire les 2-

(alkylimino)nitrosooxazolidines [11].

O

N

NR

N

NR C O ClCH2CH2N N

OH2

H2C CH

-N2-H2O

CH3CH O

O

O

C NCH2CH2Cl

O

N

NR

H

Schéma (4) : Mécanisme de décomposition des CENU selon la voix C

1.1.4. Compétition des trois mécanismes :

Des expériences intéressantes ont été conduites pour déterminer l’importance relative

des mécanismes A, C et leur compétition avec le mécanisme B, en prenant comme

exemple le cas de la BCENU.

Cette expérience consiste à hydrolyser le composé BCNU-β-β’-D4 deutéré dans

l’H 218O à pH 7.1 et T=25°C. L’hydrolyse est à 99% et l’acétaldéhyde formé a été

immédiatement réduit en éthanol en présence de la déhydrogénase d'alcool de foie et du

NADH dans le but d’éviter tout échange entre les atomes 18O-16O du groupement carbonyl,

(schéma 5).

26

ClCD2CH2N C NCH2CD2Cl

O

HN

O

H218O

pH 7.2

Dehydrogénase d'alcool

NADHCH2D CDHOH + CH3D CDHOH

A+C B

=7921

18O 16O79% 21%

Schéma (5)

Les analyses par chromatographie en phase gazeuse couplé la masse (GC-MS) des

composés dont les atomes sont marqués au deutérium et à l’oxygène 18O , ont révélé que

les deux types d’éthanols formés par la suite de la décomposition de la BCENU, en

l’occurrence le CH3DCDHOH et le CH3CDHOH , contiennent 79±10% d’18O et

seulement 21±10% pour l’16O. Cela peut être expliqué par le fait que l’incorporation de

l’oxygène 18O externe (H218O) passe par le mécanisme A ou C, le passage par le

mécanisme B étant peu probable. Ainsi, la proportion relative des trois mécanismes

est de : A+C/B= 79:21.

D’autre part, la décomposition d’un dérivé substitué ( BCENU bis méthylée ) sous

les mêmes conditions, donne du propanol contenant 11% d’18O et 89% 16O (schéma 6)

ClCH2CHN C NCHCH2Cl

O

HN

O

H218O

pH 7.2

Dehydrogénase d'alcool

NADH

CH3 CH3 A+C B

=1189

18O 16O 11% 89%CH3CH2CH2OH +

Schéma (6)

Ce résultat indique que le mécanisme B est favorisé à : B/A+C = 89/11. Dans ce

cas, la cyclisation intramoléculaire et le passage par l’intermédiaire 1,2,3-oxadiazole est

fortement concerté compte tenu de l’effet stérique.

Les auteurs se sont intéressés également à la décomposition des CENU marqués au

niveau du motif N=O18 et la cinétique a été menée dans l’H216O (schéma 7). Les produits

de décomposition sont CH3CDHCDHOH et CH3CH2CDHOH contenant 88±10% d’18O et

27

seulement 12%±10% d’16O ce qui implique une prédominance du mécanisme B avec une

proportion de 88/12.

ClCD2CHNH C NCHCD2Cl

O

HN

18O

H216O

pH 7.2

Dehydrogénase d'alcool

NADHCH3D CDHOH +

CH3 CH3

CH3CH2CDHOH

A+C B

=1288

18O 16O88% 12%

Schéma (7)

Ces observations faites pour le CH2DCDHOH éthanol et le CH3CH2CDHOH

propanol indiquent que l’intermédiaire 1, 2,3–oxadiazole peut se décomposer

partiellement selon (le schéma 8).

O

N

N

D

H

HD

O

N

N

D

H

DH

H2O

HO N NHC

HC OH

D D

CH2D-CHD-OH-N2

-H2O

Schéma (8)

1.1.5. Modifications de la décomposition des CENU :

Une attention particulière a été accordée à la décomposition des CENU via le

passage par l’intermédiaire alkanediazohydroxyde selon la voie A, sans exclure pour

autant les voies B et C [11].

28

D’après les mécanismes proposés , seule la voie A donne naissance à l’alcane

diazohydroxyde qui contient la chaîne 2-haloéthyl , l’ultime responsable du pontage de

l’ADN , expliquant ainsi l’origine de l’activité anticancéreuse de cette classe de composés .

En revanche, les intermédiaires 1, 2, 3, oxazodiazoline et 2-imino-nitrosooxazolidinone

provenant des voies B et C ne génèrent pas l’entité alkylante.

Le pontage de l’ADN in-vivo engendré principalement par l’éthyle N-(2-

chloroethyl)-N-nitrosocarbamate donne seulement 12% de pontage , par contre 28% en

présence des thiols.

En effet, d’après le mécanisme (schéma 9), la présence des thiols augmente

l’attaque nucléophile sur le groupement carbonyle du carbamate, et donne ainsi une

fragmentation plus importante qui produit l’entité diazohydroxyde ce qui implique une

augmentation du pourcentage de pontage.

N CR OEt

ON

O N CR OEt

OHN

O

N CR OEt

OHN

O

N

N

HO

R

N

N

HO

R

C

O

OH

OEt

C

O

SR'

OEt

SR'

OH

R'SH

28%de pontage de l'ADN

H2O

12% de pontage de L'ADN

Schéma (9)

En introduisant un radical R en position N3, la décomposition sera affectée de telle

sorte que les intermédiaires diazohydroxyde et l’isocyanate ne sont pas observés. De tels

composés, exigent une dealkylation enzymatique avant l’action anticancéreuse (schéma

10).

29

R1

N NR3

NOR2

O

R2

N NR3

NH

OR1

H2OOH

O

H

R2

N O

O

N

N

OH

R3

H H

R2

N NR3

NOH

O

R2NH2 +CO2

i=Dealkylation enzymatique

i

Schéma (10)

I.2. Décomposition des Alkylnitrosourées en milieu aqueux:

J. K. Snyder et L. M. Stock [22,23] ont montré que la décomposition des

alkylnitrosourées est catalysée en milieux acide et basique. La cinétique de

décomposition des N, methyl-, N, N’-dimethyl-, et N, N’, N’’- trimethyl-N-nitrosourea a

été étudiée en solution aqueuse.

A des pH < 2, les composés N-methyl subissent deux phénomènes : une dénitrosation et

une hydrolyse. La dénitrosation donne la methylurée et l’acide nitreux ; par contre

l’hydrolyse donne principalement la methylamine, de l’azote et du dioxyde de carbone

(schéma 11).

N

N O

C

O

NH2

H3C

CH3NCO + HNO2

CH3NH2 + N2 + CO2

+ H3O+

MNU

Dénitrosation

Hydrolyse

Schéma (11)

Il a été constaté également que la catalyse acide de décomposition de la trimethyl

nitrosourée est plus rapide que pour la N-methyl-N-nitrosourée et que la dénitrosation de

ce composé donne la triméthylamine et de l’acide nitreux. Par ailleurs l’hydrolyse donne

le méthanol, la dimethylamine , l’azote et le dioxyde de carbone [22-23].

En milieu basique en présence de l’ion hydroxyde, la cinétique du mono, di et triméthyl

nitrosourées est de premier ordre. L’hydrolyse donne du méthanol et des dérivés de l’acide

carbamique.

30

Les auteurs se sont également intéressés à l’effet de sels sur la décomposition des

alkylnitrosourées. Les résultats obtenus montrent que leur influence est négligeable

excepté pour le sel de lithium. La vitesse de l’hydrolyse des alkylnitrosourées dépend de

la concentration du sel à pH=9.5.

Par ailleurs, l’effet isotopique du solvant sur la catalyse basique [21] montre qu’il y

ait un échange isotopique entre l’oxygène 18O de l’eau sur le groupement carbonyle de

l’urée (schéma 12)

MnUMNU-18O produits d'hydrolyse

Schéma (12)

Dans un autre travail [22], les mêmes auteurs ont décrit l’influence du groupement

alkyle sur la décomposition en milieu basique de deux N-nitrosourées : N-isopropyl- et N-

tertiobutyl-N-nitosourées . A pH 9.75 les composés subissent une hydrolyse très rapide et

présentent une constante de vitesse kobs > 1s-1. Ces produits se décomposent également en

milieu de chloroforme anhydre. Les groupements alkyles secondaires accélèrent la

réaction de décomposition des N-nitrosourées contrairement aux groupements benzyles ou

allyles pour lesquels les interactions stériques sont très significatives.

Même pour les composés alkylés les dérivés dialkyl sont moins réactifs que le monoalkylé

kobs(DMNU)/ kobs(MNU)= 3.0.10-3

Les N-méthyl-N-nitrosourées (MNU) provoquent la méthylation de l'ADN ; pour

élucider leur mode d'action, la décomposition de ces composés a été étudié en milieu

aqueux. L'hydrolyse suit une cinétique d'une réaction du pseudo -premier ordre [27].

La RMN des atomes marqués a été utilisée pour le suivi cinétique in situ des

intermédiaires réactionnels et des produits formés issus de la décomposition des [13CO]

MNU, [15NH2] MNU et [13CH3] MNU.

La décomposition des MNU est initiée par une déprotonation du groupement carbonyle

suivie d'une hydrolyse catalysée par le milieu basique. Les deux principales espèces

réactives formées sont l'ion methyldiazonium (Me-N2+) et le cyanate (NCO-) (schéma

13).L’incorporation de l’atome deutérium dans le groupement méthyle du MNU a été faite

dans le D2O à des pH très élevés. La méthylation des oligonucléotides dans D2O par la

MNU montre une deutération partielle du N7 du groupe méthyle guanine

31

H2N

N

O

N

CH3

O HN

N

O

N

CH3

ON

N

O

CH3

HOCN

H OCN

Me-N2 + OHCH2N2H

-H+

échange dans D2O

MNU

Schéma (13) : Mécanisme de décomposition des MNU dans l'eau catalysée en milieu basique

H

Par ailleurs, un autre chemin réactionnel passant par un intermédiaire tétraédrique a

été proposé. L’intermédiaire se décompose à son tour en diazoate de méthyle et en

carbamate (schéma 14).

H2N

N

O

N

CH3

O H2N

N

O

N

CH3

ON

N

O

CH3

Me-N2 + OHCH2N2H

MNU H

OH

NH2CO2H

NH3 + CO2

OH

Schéma (14): Décomposition de la MNU induite en milieu basique via l'intermédiaire tetrahedral

1.3. Décomposition des nitroimidazole chloroethylnitrosourées (NICE-Nu) :

La décomposition des NICE-Nu en milieu aqueux donne principalement le

nitroimidazole et l’isocyanate responsable de l’activité carbamoylante [24,82].

Les auteurs ont exploité cette constatation pour évaluer expérimentalement cette activité.

32

L’étude de la décomposition menée par la HPLC a permis de proposer le mécanisme

global suivant (schéma 15).

N

N

CH2

NH

C N

O

NO

N

N

CH2

NH

O ON

N

OH

CH2CH2Cl

+

CH3CHO

ClCH2CH2OH

HOCH2CH2OH

CH2CHClClRR

H2O H2O

Schéma (15)

Il a été prouvé que la formation de l’isocyanate lors de la décomposition des

NICE-Nu est corroborée par la formation de l’urée (schéma 16).

N

N

CH2

HN C N

O

NO

ClN

N

H2C N C

O

N

N

CH2

NH2

N

N

HN

C O

HN

N

N

R R

R

R

R

Schéma (16)

D'une part , l’urée ne peut se former qu’en présence d’une amine et d’une

isocyanate, et d’autre part, les paramètres cinétiques calculés montrent que les NICE-Nu

présentent des temps de demie vie comparables à ceux de la BCNU, CCNU et de la

Chlorozotocine (CZT). Il a été remarqué également la position groupement NO2 sur le

cycle imidazole n'a pas une influence sensible sur la cinétique de décomposition [24,82].

33

1.4. Decomposition des nitrososulfonamides :

La méthode de synthèse des agents alkylants [29-32] très réactifs (carbonium,

nitrilium et oxonium), utilise les produits de la déamination qui donnent des ions

carbonium via la décomposition des N-nitrososulfonamides.

Il a été trouvé que la N-benzyl N-nitrosotrifluorométhane sulfonamide (2) se

décompose à 30°C dans CDCl 3 avec un temps de demie vie ~10-20 minutes , en raison de

cette instabilité ce composé devrait être préparé fraîchement avant toute étude [29-31].

Pour la N-benzyl N-nitroso dinitrobenzenesulfonamide (2’B) le temps de demie vie

(schéma18) dans CDCl 3 à 25 °C est de 6 heures .La nitrosoamide , obtenue suite à cette

décomposition a été isolée sous sa forme cristalline avec un rendement de 90% .

D’autre part, les composés 2A-C présentent presque les mêmes vitesses de

décomposition (temps de demi-vie 13, 11 et 10 min, respectivement à 30°C dans CDCl3).

Ce qui est en faveur du mécanisme suivant:

N SO2R1

N

+R

ON

NR S

R1

OO

O

R+N2-O3SR1

52

Schéma (17)

Et non le mécanisme (schéma18) qui met en évidence l’influence de la nature des

substituants sur le noyau phénylique: [29-32]

34

N

NR S

R1

OO

O

RNHSO2R1 N2R OSO2R1

+NR N-O3SR1R+N2

-O3SR1R-solv

ROSO2R1

a, b 20-30°C

1

2

3

457

6

solv

A, R= C6H5CH2B, R= 4-NO2C6H4CH2-C, R= 3-NO2C6H4CH2-D, R= CH3-

série 1-6 , R1= -CF3

1'-6', R1=

O2N

NO2

a = NaOH et évaporation

b = N2O4 +NaOAC/ CH2Cl2 à -10°C

Schéma (18)

1.5. Décomposition des nitrososulfamates :

L’étude cinétique de décomposition des N-Nitrososulfamates en milieu aqueux est

fonction du pH [30]. Les phénomènes mis en jeu en solution sont complexes notamment

quant à la mise en évidence de la catalyse acide et de la formation de l'alcool.Le

mécanisme de décomposition proposé en milieu acide se résume comme suit le (schéma

19) :

RNHSO2H R N

NO

SO3, K

ROH + N2 + ROSO3,KNO H2O, pH= 2

25°C

R= CH3 ; C6H5CH2; C6H5CH2CH2; C6H5

Schéma (19)

35

Les nitrososulfamates se décomposent rapidement aux pH faibles, les temps de

demi-vie s’étalent de 1 minute à 1 heure. La rapidité de la décomposition de la

cyclohexyl est attribuée au facteur stérique . Les observations expérimentales cinétiques et

la nature des espèces formées sont en faveur du mécanisme du (schéma 20).

NR SO3

NO

N

NRNR SO3

NOH

OH

SO3

H2SO4-H2O RN2 + HSO4

-+H2O

H+

H-

Etape lente

N

NR

OH

ROH + H+

R+ N2 HSO4- -N2

+ H

H2O+ HSO4

H+ + SO4-2

NR SO3

NO

ROSO3

Schéma (20)

1.6-Décomposition des nitrophenylsulfonyl ethyl ethers :

Le mécanisme de décomposition de ces composés [33], comporte deux réactions

réversibles. La première est une hydrolyse de l’éther formant le 3 -vinyl-sulfonyl

nitrobenzene et 3-(β-hydroxy-ethylsulfonyl) nitrobenzène. La deuxième étape est une

hydrolyse du 3 -vinyl-sulfonyl nitrobenzene produisant le 3-(β-hydroxy-ethylsulfonyl)

nitrobenzène.

36

O2N

SO2CH2CH2OCH2CH2O2S

NO2

O2N

S

O

O

CH=CH2

O2N

S

O

O

CH2CH2OH

O2N

S

O

O

CH=CH2 + H2O

O2N

S

O

O

CH2CH2OH

E

V

H

HV

(1)

(2)

k1

k-1

k2

k-2

Schéma (21)

Les paramètres cinétiques sont déterminés par HPLC avec détection UV. La

fragilité de ces composés est due à l’effet électroattracteur du groupement nitro qui

augmente la réactivité de l’atome d’hydrogène sur le carbone α adjacent au groupement

sulfonyl. Ceci explique la facilité d’hydrolyse du composé E pour former les produits H

et V . Ce dernier s’hydrolyse lui-même en milieu basique pour former le composé pour

former le H (schéma 21).

1.7-Décomposition oxydative des sulfamides :

La décomposition oxydative de sulfamides antibactériens (sulfanilamide,

sulfamétoxazole et sulfadoxine ) a été décrite par A.De Souza [96]. L’étude a été menée

à température ambiante en milieu acide et en présence du peroxyde d’hydrogène. Les

produits d’oxydation formés ont été isolés par chromatographie classique sur colonne et

après purification, leur pureté est déterminée par HPLC. Ces produits ont été identifiés à

37

l’aide des méthodes spectrales usuelles. La cinétique de décomposition a été établie et un

mécanisme de dégradation a été proposé (schéma 22).

HO N SO2NH2

H

N NH2O2NS SO2NH2

OH

OH

H2N SO2NH2

Sulfanilamide

B

CSchéma (22)

Les produits issus de cette décomposition sont essentiellement l’hydroxylamino-4-

Amino-benzénesulfonamide (B), N,N’-dihydroxylhydraobenzénedisulfonamide-4-4’(C) .

L’analyse systématique des spectres de masse a mis en évidence les pics des fragments les

plus importants, comme l’indiquent les schémas (23) et (24), et les auteurs ont pu identifier

sans ambiguïté les espèces B et C.

Les résultats de l’étude montrent qu’il s’agit d’une condensation ionique entre le

nitroso-4-benzénesulfonamide et l’hydroxylamino-4-benzéne sulfonamides en milieu

acide.

38

HO N SO2NH2

H

-H

-NH2

-SO2

HO N SO2NH2

HO N SO2

H

HO N

H

NH2

-NO

SO2

H

H

NH2

H

H

O N

-2H

NH2

-NO

O N SO2

-2H

-SO2

B

Schéma (23)

39

N NH2O2NS SO2NH2

OH

OH

N NH2O2NS SO2NH2

O

N NH2O2NS SO2NH2

H2O2NS N2 SO2NH2

-O

-H2O

C

Schéma (24)

1.8-Décomposition N-(phénoxycarbonyl) sulfamate :

Blans et Vigroux [28] ont présenté une étude sur l’hydrolyse du N-

(phénoxycarbonyl) sulfamate de phényle à 50°C entre pH 0 et 14. Les résultats montrent

que entre pH 1,6 et 4,1 ne sont pas du premier ordre, ce qui indique l’accumulation d’un

intermédiaire réactionnel qui, par ailleurs a été identifié au sulfamate de phényle

(schéma25). Ce résultat associé au fait que l’on observe en milieu acide une catalyse acide

générale par les tampons, indique que la réaction d’hydrolyse s’effectue quel que soit le

pH, uniquement sur la forme anionique du substrat avec rupture de la liaison carbone -

oxygène.

40

PhO

S

N

O O

C

O

OPhPhO

S

NH

O O

C

O

OPhka

CO

CO

Produit de cléavage

Produit de cléavage

CO

Produit de cléavage

pH neutre

KOH

Kh[H]

Schéma (25)

1.9-Décomposition des 1,2-Bis (sulfonyl)-1-alkylhydrazines :

Les 1,2-Bis (sulfonyl)-1-alkylhydrazines sont des agents anticancéreux très actifs,

qui se décomposent en milieu aqueux neutre selon des cinétiques de pseudo premier ordre.

Ces agents génèrent approximativement 2 moles de sulfinate, 1 mole de d’azote et 1 mole

d’alcool approprié, issus de l’alkylation de l’eau [93].

La présence du motif sulfonyl sur la position N-1 confère à la molécule une

certaine instabilité et par conséquent des temps de demi-vie très courts ; contrairement à la

position N-2 où il a été remarqué des temps de demie vie plus longs.

Les 1,2-Bis (sulfonyl)-1-alkylhydrazines se décomposent pour donner des espèces actives

selon le (schéma 26).

L’hydrolyse de la liaison S-N favorise la formation de l’acide sulfonique alors

que la présence l’acide sulfinique est peu probable.

Les composés de la classe sulfonylhydrazine manifestent une bonne efficacité

vis-à-vis d’une variété de tumeurs solides humaines transplantées, y compris celles

résistantes à d'autres agents d'alkylants tels que le cyclophosphamide, 1,3-bis(2-

chloroethyl)-1-nitrosourea, et melphalan [93].

41

Les composés subissent une hydrolyse catalytique basique à des pH spécifiques et

donnent ainsi de l’ isocyanate méthylique responsable de l’activité carbamoylante (schéma

26).

L’isocyanate méthylique formé réagit à son tour avec de l'eau et se décompose

ultérieurement pour former l'azote gazeux, l'acide sulfinique , le chloroéthanol, la

méthylamine, et l'anhydride carbonique. Le chloroethyldiazomethylsulfonyl formé

également au cours de cette dégradation agit principalement comme produit d’alkylation

de l’ADN et par conséquent il est considéré comme étant l’ultime espèce responsable de

l’activité anticancéreuse.

O2SH3C N

CH2CH2Cl

N SO2CH3

H

O2SH3C N

CH2CH2Cl

N SO2CH3

C O

NH CH3

O2SH3C N N CH2CH2Cl

+ CH3NCO CH3NH2 +CO2

Nucléophile

ROH, RNH2 , RSH

Base H2O

+ CH3SO2- + H +

Produits d'alkylation

Produits de carbamoylation

Schéma (26)

42

1.10- Décomposition des MNTS et MNNG:

Ces composés sont doués d’une activité anticancéreuse importante. Ils sont

analogues aux CENU du fait de la présence du motif N-nitroso-N-alkyl. En subissant

l’hydrolyse en milieu basique , les N-methyl-N-nitroso-p-toluene sulfonamides (MNTS) et

le N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) donnent essentiellement le diazomethane

considéré comme un agent puissant d’alkylation de l’ADN.

Dans le mécanisme de décomposition des MNTS en milieu basique , l’attaque nucléophile

se fait sur groupement sulfonyl (schéma 27). Les deux composés MNTS et MNNG

possèdent le même groupement partant CH3N_NO au cours de leur hydrolyse.

MNNG

NNO2

H2N NCH3

N O

SN

O OCH3

N O

H3C H3C S

O

O

OH + H3C N N O

OH

MNTS

Schéma (27)

Trois voies de décomposition ont été proposées pour le cas de la MNNG en milieu

basique (schéma 28) : décomposition spontanée de l’espèce neutre, du mono anion, et du di

anion.

43

MNNG

NNO2

H2N NCH3

N O

NNO2

H2N NCH3

N O

NNO2

N NCH3

N O

N C N NO2

H3C N N O

OH- OH-

Schéma (28)

D’autre part, il a été observé que la N-nitrosoguanidine, la 1-nitroso-1-methyl-3-

tolylsulfonylguanidine (TSGNO) et la 1-nitroso-methyl-3-benzoylguanidine (BCGNO)

sont des agents efficaces de transnitrosation pour les nucléophiles.

SN

O O

H3C

TSGNO BCGNO

H

CN

CH3

N O

NH

CNH3C

H

CN

CH3

N O

NHO

Schéma (29)

A l’instar de leurs homologues (MNNG, MNTS) ces composés possèdent le même

groupe partant CH3N_NO au cours de leur hydrolyse, entraînant la formation du

diazométhane, ce qui est en faveur de leur utilisation comme agents alkylants.

La réactivité MNTS a été étudiée en milieux acide, basique et en présence d’une

amine. En présence d’un nucléophile comme OH-, on assiste à une attaque sur le

groupement sulfonyle, suivie d’une décomposition donnant le diazométhane. En revanche,

en milieu acide on observe une denitrosation avec formation de l’acide nitreux et le produit

dénitrosé .

En présence d’une amine on assiste à une attaque nucléophile sur le groupement

nitroso pour former les nitrosamines correspondantes (schéma 30).

44

SN

O OCH3

N O

H3C

SN

O OCH3

H

H3C

SN

O OCH3

N O

H3C

SO-

O O

H3C

+ R2NNO

HNO2 +H++

+ CH2N2 + H2OOH-

H+

R2NH

Schéma (30)

1.11- Décomposition des N-substitués sulfamides Cycliques:

Il a été constaté que cette classe de composés s’hydrolyse en solution aqueuse. Les

constantes de vitesse sont indépendantes du pH dans un intervalle de 1-4. Cependant pour

des pH supérieurs les kobs augmentent. Les produits issus de la décomposition ont été

identifiés comme étant la 2-amino-2-[(-N-substitué-sulfamoyl)imino] sel d’acide acétique

(schéma 31).

NNS

OO

NH2O

R N

CHN

S

OO

NH2O

R

HO

R= phenethylR=cyclohexylR=benzyl

H2O

I II

Schéma (31)

La liaison C=N s’hydrolyse selon une réaction lente pour donner un sulfamide et

des dérivés de l’acide oxalique. Il a été constaté également que la vitesse de

45

décomposition du substituant N-phenylethyl est plus grande que celle du dérivé de la 2-

cyclohexyl.

La décomposition du composé (II) peut se produire suite à l’hydrolyse de la liaison

C=N pour donner l’oxalamide et des sulfamides N-substitués , suivie de la formation des

sels d’acide oxalique et des sulfamates .

Les bandes attribués aux groupements –SO3- et –C(O)N ont été observés en spectrométrie

infra rouge après avoir laissé la réaction jusqu’à des temps suffisamment prolongés à des

pH basiques .

46

CHAPITRE (2)

Synthèse des CENS.

47

Il est important de mentionner que pour des structures analogues on devrait

s'attendre non seulement aux propriétés similaires, mais également des voies de synthèse

similaires.

En effet, la différence entre les CENU et les CENS réside uniquement dans le

remplacement du groupement carbonyle par un motif sulfonyl. Cette orientation a été mise

à profit pour accéder aux CENS [6] dont le mécanisme de décomposition ne comporte pas

la formation de l'isocyanate responsable des effets toxiques des CENU [6-10].

La synthèse des CENS est plus délicate que la synthèse des CENU et

sommairement trois voix d’accès, que nous allons décrire dans cette partie, ont été

développées et appliquées d’une façon concurrente pour la synthèse des CENS issus

d’amines primaires, secondaires et d’aminoacides [6-9].

La stratégie globale de la synthèse selon les voies A,B et C repose essentiellement

sur l’aménagement polyfonctionnel du chlorosulfonyl d’isocyanate qui a été exploité pour

fournir le motif sulfone inséré à la place du carbonyle décrit pour les analogues CENU.

2.1. Synthèse selon la voie A :

Cette voie de synthèse est scindée principalement en quatre étapes consécutives à

savoir :

• Carbamoylation sulfamoylation .

• Chloroethylation selon Mitsonubu.

• Déprotection .

• Nitrosation.

2.1.1. Carbamoylation sulfamoylation :

La carbamoylation est conduite par addition du tertiobutanol sur l’isocyanate

de chlorosulfonyle (ICS) dans le dichlorométhane anhydre à 0°C suivie d’une

sulfamoylation in-situ par une amine en présence d’une base tertiaire la triéthylamine

(schéma 32).

48

ClSO2N=C=OtBuOH

CH2Cl2 , O°C

HN

SCl

OO O

O

Et3N

Z-HHN

S

OO O

OZ

Schéma (32)

Ces composés se présentent sous forme de solides incolores, recristallisables dans

le mélange dichlorométhane / éther. Ils sont révélés à la ninhydrine et bien solubles dans

les solvants polaires, et insolubles dans l’éther et l’hexane.

En IR les bandes caractéristiques au groupement N-H apparaissent entre 3300 et

3200 cm-1.

L’absorption du carbonyle apparaît à 1710-1700 cm-1, les élongations symétriques

et asymétriques du groupement SO2 à 1350 et 1150 cm-1.

2.1.2. Chloroethylation selon Mitsnobu :

Les carboxyl sulfamides présentent sur l’azote carbamique un proton labile et une

charge anionique non délocalisée ce qui lui confère un excellent pouvoir nucléophile.

HN

S

OO O

OZ NS

OO O

OZ

Cl

ClCH2CH2OH

PPh3/ DIADTHF

Schéma (33)

49

Le groupement Boc substituant l’azote comme groupement protecteur, exerce

également un effet éléctro-attracteur qui augmente, de façon remarquable, la mobilité du

proton associé par rapport à l’autre azote.

La différence du caractère nucléophile est très marquée et permet une

chloroéthylation régiospécifique dans des conditions de la réaction de Mitsunobu (schéma

33).

Ces produits d’alkylation sont obtenus après une purification sur colonne de gel de

silice qui donne successivement le PPh3 en excès, le produit de substitution et le PPh3O

qui reste après une précipitation à l’éther.

Tous ces composés sont des solides dont le point de fusion est plus bas que leurs

précurseurs. Ils sont révélés aussi à la ninhydrine et cristallisent dans le mélange éther /

éther de pétrole.

En IR un faible déplacement hypsochrome de 5 à 10 cm-1 est observé pour les absorptions

d’élongation du groupement C=O.

2.1.3. Déprotection

Le groupement Boc qui a joué un rôle ambivalent, protecteur dans les composés

chloroéthylés, et activateur de l’azote carbamique est facilement éliminé par un traitement

à l’acide trifluoroacétique –dichlorométhane (25 –75) (Schéma 34)

NS

OO O

OZ

Cl

NHS

OO

Z

Cl

TFA/CH2Cl2

0°C

Schéma (34)

Ces composés sont plus polaires que leurs précurseurs (CCM). La déprotection est

traduite en IR par la disparition de la bande de vibration OC=ν et apparition d’une

nouvelle bande caractéristiques des N-H à 3300 cm-1.

50

2.1.4. Nitrosation :

La nitrosation des chloroéthylsulfamides est réalisée à froid (O°C) au moyen du

nitrite de sodium en présence de l’acide formique. Après filtration de la suspension formée,

la solution est lavée à l’eau et le solvant est ensuite évaporé sous vide.

NHS

OO

Z

Cl

0°C

NaNO2 / HCOOH NS

OO

Z

Cl

N O

Schéma (35)

Les produits nitrosés sont moins polaires que leurs précurseurs, possédant des bons

chromophores en UV, et bien révélés à la ninhydrine. Ils se présentent sous forme de

solides à point de fusion très bas. Ils sont instables en solution.

En IR ils sont caractérisés par une bande de vibration ON=ν à 1580 cm-1.

En RMN du proton ils sont facilement identifiés par l’absence des protons

échangeables, et la présence de deux triplets sous forme de deux systèmes A2X2 pour les

(CH2NNO ) et (CH2Cl) , il est à noter que les CH2Cl ( triplet) qui étaient moins blindés

que les CH2N ( quadriplet) dans leurs précurseurs respectifs sont devenus plus blindés dans

les composés nitrosés, et apparaissent tous les deux sous forme de triplets uniquement [81].

2.2. Synthèse selon la voie B

Cette voie se résume en une cyclisation et une N-methylation (pour les amines

primaires), et une réouverture des N-sulfamoyoxazolidinones [8].

Cette méthode a été conçue afin d’éviter les purifications rencontrées dans le cas de la

réaction de Mitsonubu et de favoriser nettement la régiospécificité de la nitrosation.

Cette voie est scindée comme la première en quatre étapes à savoir :

• Carbamoylation –Sulfamoylation –Cyclisation (en une seule étape)

• Réouverture décarboxylative de l’oxazolidinone après méthylation pour les amines

primaires.

• Halogénation.

• Nitrosation régiospécifique .

51

2.2.1. Carbamoylation- sulfamoylation-cyclisation :

ClSO2N=C=OCl

S

HN

OOO

O

BrBrEtOH N

S

HN

OOO

O

Br

R1

R2

NS

N

OO

R1

R2

O

O

Et3N-HBr

O°C

R1R2NH

Schéma (36)

2.2.2. Réouverture des oxazolidinones :

NS

N

OO

R1

R2

O

O

NS

HN

OO

R1

R2

HO

NaOHEtOH,H2O

-CO2

Schéma (37)

Cette réaction est conduite en milieu basique qui donne lieu à une décarboxylation

et de ce fait obtenir l’ouverture du cycle de l’oxazolidinone .

Les produits obtenus sont plus polaires que leur précurseurs cyclisé et ils sont très

bien révélés à la ninihydrine .

2.2.3. Halogénation :

52

NS

HN

OO

R1

R2

HO NS

HN

OO

R1

R2

ClPPh3 ;CCl4

Schéma (38)

L’halogénation peut se faire en présence de la triphénylphosphine, tétrachlorure de

carbone, la substitution se fait dans des conditions de température ambiante, la réaction est

suivie par CCM qui montre que ces produits halogénés sont moins polaires que leurs

précurseurs.

2.2.4. Nitrosation :

NS

HN

OO

R1

R2

ClNaNO2

HCOOHN

SN

OO

R1

R2

Cl

N

O

O°C

Schéma (39)

La nitrosation des produits halogénés se fait selon les mêmes conditions décrites

précédemment dans la voie A.

2.3. Synthèse selon la voie C

53

Cette voie se caractérise par trois étapes : formation du sulfamide activé,

transulfalmoylation et nitrosation [9]. Le schéma réactionnel est représenté dans schéma

(40) suivant :

ClSO2N=C=O

Z S NH

O

O

BOC

Z S N

O

O

BOC

Cl

Z S N

O

O

H

Cl

N S N

O

O

H

Cl

R1

R2

N S N

O

O

N

Cl

R1

R2

O

CarbamoylationSulfamoylation

1-tBUOH

2-Z= N

O

O

OH

Chloroethylation

ClCH2CH2OHPPh3

Déprotection TFA à 50%

Nitrosation NaNO2 / HCOOH

Transulfamoylation

R1R2NH

TEA, ACN

Schéma (40)

54

Cette voix de synthèse se base la voix A pour former le sulfamide activé et ensuite

l’échange se fait dans des conditions douces avec des rendements acceptables.

Plusieurs produits d’échange ont été proposés, cependant la N-hydroxy -

succinimide parait préférable en raison de sa facilité d’élimination.

Les produits issus de cette échange vont subir une nitrosation comme décrit

précédemment dans les voies A et B.

Il faut noter également que cette voie a été développée afin de minimiser le

nombre d’étapes dans la voie A et d’éviter les pertes de rendement signalées dans la voie B

dues à la saponification des produits ouverts par suite de la décarboxylation.

Dans notre travail la voix de synthèse adoptée est la voix A, pour laquelle les

rendements sont satisfaisants. Mais rien n'empêche de faire recours aux autres voies en cas

de nécessité notamment pour éviter les nombreuses opérations de purification qui sont

délicates surtout dans l’étape d’alkylation selon la réaction Mitsonubu [13].

55

Chapitre (3)

Les outils d’analyses

56

3.1. Analyse par spectrophotométrie UV des CENS :

La présence des groupements chromophoriques met de la spectrophotométrie UV

une méthode de choix pour les suivis cinétiques lors de la décomposition des CENS en

milieu aqueux et à pH contrôlé.

Le spectrophotomètre à double faisceau utilisé est menu d'un thermostat et d’un

microordinateur gérant un logiciel qui permet d'enregistrer des cycles de spectres de l’ordre

de 2 minutes, ce qui nous a permis de mieux suivre même les réactions de décomposition

les plus rapides.

3.2. Analyse par LC-MS des CENS :

L’étude menée précédemment par UV a montré sa limite quant à la détermination

de la nature des espèces formées. Pour palier ce problème, on a fait recours à l’usage de la

technique la chromatographie en phase liquide couplée à la masse (LC-MS), pour la

décomposition des CENS en milieu aqueux à pH=7 .4 .

Ce couplage est largement utilisé [58-60] et se compose essentiellement des

éléments suivants :

Schéma (41) : Les éléments d’un système LC - MS

Les éléments de ce système d’analyse comprend : (a) un échantillonneur

automatique permettant l’injection automatique de l’analyte ; (b) un chromatographe de

haute performance ; (c) une source d’ionisation (interface LC-MS) et (d) un spectromètre

de masse.

Plusieurs modes d’ionisation peuvent être choisis dans les systèmes de couplage.

Dans notre étude, la source d’ionisation du spectromètre se base sur l’electrospray

57

ionisation (ESI). Cette technique est largement utilisée lorsque les molécules en question

présentent une stabilité limitée.

Schéma (42) : Détecteur singulier quadripolaire

2.1. Mise au point de la méthode :

2.1.1. Choix de la colonne

Après plusieurs essais préliminaires et tenant compte que les CENS sont apolaires,

la colonne qui répond à notre besoin est la colonne C18-ODB dont la phase se caractérise

par une bonne résistance et une bonne stabilité en milieux aqueux.

2.1.2. Choix de la phase mobile :

Le choix de la phase mobile dépend de la phase stationnaire (et réciproquement).

La phase stationnaire utilisée est une phase inverse C18 , il serait alors convenable d’utiliser

comme éluant le mélange mixte eau-acétonitrile, d’autant plus qu’il solubilise bien les

composés apolaires étudiés.

2.1.3. Gradient d’élution :

Le gradient d’élution linéaire utilisé présente une bonne efficacité de séparation. Il

commence par un mélange à eau - acétonitrile = 40/60 , la proportion de l’acétonitrile

augmente progressivement jusqu’à 100% acétonitrile , ce qui permet r de procéder à un

lavage de la colonne. La dernière étape de ce programme d’élution, consiste au retour

progressif vers la composition initiale 40 /60, pour rééquilibrer la colonne et la

conditionner pour une nouvelle utilisation.

58

Tableau (1) : Gradients d’élution utilisés dans l’analyse LC-MS dans le milieu aqueux

2.1.4. Choix du débit:

Le débit de la phase mobile influe directement sur la résolution de la séparation en

chromatographie. Son choix dépend des dimensions de la colonne et des tailles des

particules de son remplissage.

En plus, La viscosité des solvants influe considérablement sur le choix du débit de

la phase mobile. Ainsi des solvants plus visqueux exige un débit plus fort pour éviter les

pertes de pression. Après de nombreux essais nous avons opté pour un débit de 0.25ml/min

qui nous a permis d’avoir une bonne séparation et des pressions normales.

2.1.5. Choix de la température :

Les CENS sont des composés fragiles et thermosensibles, il nous a été donc

nécessaire de travailler des conditions douces de 25°C

3.3. Analyse par HPLC de la décomposition des CENS en milieu biologique :

L’analyse par chromatographie liquide des substances actives et leurs métabolites

en milieu biologique exige un traitement préalable de l’échantillon avant toute séparation

chromatographique. En effet, les constituants du milieu (en particulier les protéines) sont

en nombre et en quantités considérables par rapport aux solutés à doser (de 104à106 de fois

en poids). Il est indispensable de les éliminer en quasi-totalité, à défaut les protéines

dénaturées colmatent la colonne d’analyse et la rendent très rapidement inutilisable.

De plus, si le nettoyage est insuffisant des signaux de composés endogènes

interférent avec ceux des solutés dans le chromatogramme. Il est courant que des solutés

soient liés de façon non covalente à des protéines « protein-binding » et soient éliminés

avec celles-ci pendant le nettoyage.

Une variante de la chromatographie liquide haute performance (HPLC) connue

sous le nom de on-line cleaning ou bien on-line solid phase extraction a été introduite

récemment pour analyser les métabolites dans les liquides biologiques [51,73].

Temps A% B% C% D% débit 0.00 40.0 60.0 0.0 0.0 0.250 10.00 0.00 100.0 0.0 0.0 0.250 20.00 0.0 100.0 0.0 0.0 0.250 20.10 40.0 60.0 0.0 0.0 0.250 30.00 40.0 60.0 0.0 0.0 0.250

59

3.3.1. Le couplage « On-line cleaning HPLC/UV/ESI-MS

L’analyse par HPLC classique des substances actives dans un milieu biologique se

heurte à une difficulté fondamentale liée à la présence des substances qui provoquent la

détérioration de la colonne.

Pour surmonter cette difficulté, de nombreux protocoles ont été mis au point pour

doser des médicaments dans les fluides biologiques après déprotéinisation de l’échantillon.

Ces traitements s’effectuent généralement hors-ligne. Les techniques anciennes

d’extraction en phase liquide consistent à précipiter les protéines par un solvant acide ou

organique, filtrer centrifuger, extraire le surnageant par solvant, concentrer, redissoudre le

résidu dans la phase mobile, et enfin injecter l’échantillon purifié dans le chromatographe.

Dans les années 80 on a commencé à développer les techniques d’extraction en

phase solide, « solid phase extraction » (dépôt sur un matériau chromatographique à usage

unique, élution différentielle des composés endogènes et des solutés à analyser,

concentration etc.) [40].

Cependant, tous ces procédés de préparation d’échantillon biologique « hors-ligne »

sont fastidieux et coûteux. Leur principal inconvénient est que, du fait de nombreuses

manipulations, des pertes aléatoires sont inévitables, même si le processus est automatisé.

Une quantité précise des solutés à doser nécessite l'ajout à l'échantillon initial un composé

de référence .Le choix de celui-ci est délicat puisqu’il doit être stable dans le milieu

d’incubation, et se comporter exactement comme les solutés d’intérêt durant les diverses

phases d’extraction. Cependant son comportement chromatographique doit être différent

des autres solutés.

L’analyse des substances actives et de leurs métabolites dans les matrices

biologiques est compliquée par la présence des niveaux élevés des protéines et d'autres

molécules endogènes. On fait recours alors à la technique d'extraction en ligne sur phase

solide" [50-55] dont l'avantage principal par rapport à l'extraction sur phase solide off line

ou l'extraction de liquide-liquide , est l'injection directe de l'échantillon demandant ainsi

un minimum de manipulation, améliore l’élution d'échantillon et la reproductibilité.

L'extraction en ligne ou nettoyage en ligne est une extraction in-situ sur phase

solide, qui inclut le chargement de l'échantillon, exclusion des macromolécules tout en

maintenant les analytes sur la précolonne, suivie de l'élution de l'analyte.

60

Le processus chromatographique se compose alors de trois étapes: le nettoyage

(purification), l'élution d'analyte et l'équilibration de système. Dans l'étape de purification,

les protéines et d'autres grosses biomolécules dans l'échantillon de sérum sont rincées de la

colonne vers l’égout, laissant les petites molécules de l'analyte et de son métabolite

maintenus sur la précolonne.

Schéma (43) : Système d’analyse des substances actives par LC-MS

Pour la décomposition des CENS, l’analyse s’effectue en deux temps (schéma 44).

L’échantillon brut est injecté sous éluant A (100% eau).

Lorsque les éléments de la matrice biologique sont éliminés (environ 2min), la

vanne est automatiquement commutée. La teneur en éluant organique est augmentée dans

la phase mobile, ce qui provoque un transfert progressif des solutés de la pré colonne

(H.L.B OASIS) vers la colonne RP C18.

61

Colonne Analytique

Garde à colonne

Cartouche d'extraction sur phase solide

PompeEchantiollonneurautomatique

Spectrométrede masse

Détecteur UV

Egout

H.L.B

RP C18

A

B

Schéma (44) : Schéma global pour l’analyse en SPE-LC-MS :

-Position A (ligne en pointillés), pour le processus d’extraction et le nettoyage en ligne.

-Position (B) ligne en continu, pour le processus pour l’analyse en LC-ESI-MS

3.2. Mise au point de la méthode d’analyse :

Le principe du nettoyage en ligne de l'échantillon biologique repose sur la

compréhension des équilibres subtils entre les solutés (CENS et ses métabolites), les

protéines du milieu, la phase stationnaire et la phase mobile. Toutes ces interactions étant

non covalentes, il s’agit bien d’une chimie supramoléculaire en plusieurs dimensions. Les

différentes interactions intervenant dans le mécanisme de rétention sont schématisées.

62

Proteines

Analytes

Phase mobileAqueuse

Phase stationnaire

Schéma (45) : Interactions protéine-analyte et phase mobile

Toute notre étude se base sur cette « infernale complexité ». Il s’agit de jouer

simultanément sur la nature de la phase stationnaire et la composition de la phase mobile

pour :

• Rompre une éventuelle interaction des protéines,

• Eliminer très rapidement de la phase mobile la totalité des protéines et d’autres

contaminants, ou au moins la très grande majorité d’entre eux.

• Retenir sur la phase stationnaire tous les solutés pendant le temps nécessaire au

nettoyage, et ceci de façon quantitative.

3.3. Choix de la précolonne :

Après de nombreux essais et en se basant sur les données bibliographiques , nous

avons opté pour une précolonne OASIS H.L.B; cette phase a été choisie parce qu'elle ne

maintient pas des protéines dans des milieux aqueux, contrairement à d'autres précolonnes

à phase inverse [55-72]. En outre la phase stationnaire H.L.B excluent des protéines du

sérum et d'autres constituants de la matrice biologique, tout en maintenant l'analyte

d'intérêt et ses métabolites.

3.4. Choix de la phase stationnaire

Le même remplissage utilisé pour le suivie cinétique par LC-MS dans le milieu

aqueux a été également employé pour les séparations lors de la décomposition en milieu

biologique

63

3.5. Choix de la phase mobile :

Le choix de la phase mobile dépend essentiellement de la phase stationnaire

employé et manifestement de l'analyte.

La phase mobile dépend de la nature des processus chromatographiques:extraction, élution,

équilibrage de la colonne, lavage, et rééquilibrage de la colonne et de la précolonne.

Pour l’étape de nettoyage, la phase mobile utilisée est de l’eau à 100% ce qui

permet d’éliminer toutes les protéines et les molécules endogènes présentes dans le sérum

ainsi que tous les sels pouvant colmater la colonne analytique.

Pour l’étape d’élution, on a opté pour un gradient lignaire mélange eau / acétonitrile

(tableau 2) cela permis d’éluer notre analyte de la précolonne et de le transférer vers la

colonne analytiques

3.6. Gradient d’élution :

Le gradient d’élution adopté dépend de toutes les étapes du processus

chromatographique y compris les étape de lavage et rééquilibrage qui sont incluses dans

ce programme d’élution.

Tableau (2) : Programme d’élution lors de l’analyse dans le sérum

Les paramètres statistiques de curve sont recommandés par le constructeur pour

avoir des meilleures séparations, donc ils ont été tirés du Manuel Waters2695.

Opération temps A% B% C% D% Débit curve 0.00 100.0 0.0 0.0 0.0 4.000 1 0.80 100.0 0.0 0.0 0.0 4.000 1

Extraction

2.00 0.0 0.0 0.0 0.0 0.2 1 2.20 90.0 10.0 0.0 0.0 0.2 6 10.00 70.0 30.0 0.0 0.0 0.2 6 12.00 30.0 70.0 0.0 0.0 0.2 6

Elution

15.00 30.0 70.0 0.0 0.0 0.2 6 15.20 100.0 0.00 0.0 0.0 0.2 1 Equilibrage

colonne 20.00 100.0 0.00 0.0 0.0 0.2 6 20.20 5.00 95.00 0.0 0.0 2.0 1 21.20 5.00 95.00 0.0 0.0 2.0 6 21.40 100.0 0.0 0.0 0.0 2.0 1

Lavage et rééquilibrage de la précolonne 24.00 100.0 0.0 0.0 0.0 2.0 11

64

3.7. Choix de la température :

La température influe considération sur les séparations en HPLC. Dans, la

littérature il a été reporté que les bonnes séparations sont faites à des températures qui

peuvent atteindre 60°C.

Dans notre étude, la température est maintenue à 37°C, température à laquelle

habituellement les cinétiques des composés bioactifs sont étudiées.

3.8. Choix du débit :

Le débit en HPLC influe directement sur la séparation chromatographique. Dans ce

programme d’élution trois débits ont été utilisés à savoir :

• Un débit à 4ml /min utilisé dans le cas de l’étape de nettoyage ( extraction sur la

phase solide). En créant une certaine turbulence, les grosses molécule du sérum ne

seront pas retenues sur la précolonne .

• Un débit de 0.2 ml/min utilisé au cours de l’étape d’élution et la séparation de

l’analyte de ces métabolites formés. Ce débit permet d’avoir des bonnes

résolutions.

• Un débit à 2ml /min utilisé en dernière étape du processus chromatographique

permettant ainsi un lavage rapide de la précolonne et son rééquilibrage et de ce fait

la pré colonne sera prête immédiatement pour une nouvelle analyse sans perte de

temps

3.9. Le système de vanne automatique :

Le système de vanne automatique a été adopté pour automatiser la technique

d’extraction et gagner du temps d’autant plus qu’on est devant un problème cinétique. Les

deux configurations les plus utilisées sont représentés sur le schéma (a) on-on : injection

sur la précolonne, nettoyage, élimination à l’égout (b) off-off inversion du flux de la pré

colonne d’extraction vers colonne analytique et puis le spectromètre de masse (schéma 46).

65

Schéma (46) : Système de vanne automatique utilisé dans LC-MS-SPE

4-Suivi de la décomposition par RMN :

La mesure de la fréquence de résonance donne des renseignements sur

l’environnement électronique des noyaux.

Cette mesure peut être également exploitée efficacement pour suivre le comportement et

les stabilités de certaines molécules en solution.

4-1-La RMN du proton :

66

Les spectres RMN proton, (sonde QNP 5 mm) ont été enregistrés sur un

spectromètre BRUKER 250 MHz.

Les déplacements chimiques, δ, sont exprimés en ppm par rapport au

tétraméthylsilane TMS (δ = 0 ppm) en utilisant comme référence les signaux résiduels des

solvants deutériés Les constantes de couplage, J, (en valeurs absolues) sont exprimées en

Hz. Pour la multiplicité des signaux, les abréviations suivantes ont été utilisées : s pour

singulet, sl pour singulet large, d pour doublet, dd pour doublet dédoublé, t pour triplet, td

pour triplet dédoublé, q pour quadruplet, quint

4-2-La RMN de l’azote marqué :

Les spectres RMN de l’azote marqué ont été réalisés en utilisant une sonde QNP 5

mm. Les spectres ont été enregistrés sur un spectromètre BRUKER Avance DPX 400.

Les déplacements chimique, δ, sont exprimés en ppm par rapport au nitrométhane

(δ = 0 ppm) en utilisant comme référence les signaux résiduels des solvants deutériés

telles que le CD3CN et le CD3OD .

67

CHAPITRE (4)

Décomposition des CENS en milieu aqueux

68

Dans un premier temps, le suivi cinétique de décomposition en milieu aqueux a été

visualisé par chromatographie sur couche mince. Ces observations préliminaires indiquent

que les CENS se dégradent pour donner deux composés avec des Rf différents. Cela peut

être attribué à priori à la perte du groupement nitroso et la formation d’autres produits.

4.1. Suivi cinétique par spectrophotométrie UV visible :

Les spectres enregistrés correspondent à des solutions fraîchement préparées de

concentrations 10 - 4 à 10 - 5 M de CENS. Le pH est ajusté immédiatement avec des

solutions tampon s'étalant de 0 à 14. Les réactions ont été suivies à T= 18 °C, la force

ionique étant ajustée par addition du 0.02 M de KCl.

Trois types distincts de comportements peuvent être observés. Tout d’abord à des

pH basiques, la décomposition des composés 1, 2 et 3 a lieu en une seul étape avec le

déplacement hypsochromic et apparition d'un point isobestic (figure 1)

Figure (1) : Spectres UV montrant l’évolution cinétique du composé 1 en milieu basique

Pour tous les composés étudiés en milieu acide la décomposition des CENS se produit

selon une seule .La diminution de l'absorbance en fonction du temps peut être attribuée à

la perte du groupement nitroso responsable du bon caractère chromophorique des CENS.

0

0.8

0.4

0.6

220 300 240 260 280

Abs

W a v e l e n g t h [nm]

0.2

0 h

4 h

3 h

2 h

1 h

6 h

7 h

5 h

Wavelengh (nm)

0

0.8

0.2

0.4

0.6

220 400 250 300 350

t=0mn

t=2mn t=4mn

t=6mn t=8mn

t=10mn

t=14mn t=16mn

t=12mn

t=24h

Wavelenght[nm]

Abs

Figure (2) : Evolution cinétique du composé 1 en milieu acide

69

La manière de la décomposition des trois composés dans l'intervalle de pH neutre

est un peu différente. D'abord nous avons observé une diminution lente d'absorbance avec

un déplacement hypsochromique et l'apparition d’une nouvelle bande qui augmente en

fonction du temps. Le premier phénomène peut être attribué à la denitrosation qui

correspond aux mêmes réactions constatées dans les milieux acides (figure 2).

L'augmentation de l'absorbance et le déplacement hypsochromique accompagné de

l'apparition du point isobestic près de 254 nm est similaire au phénomène observé pour la

décomposition en milieu basique (figure1).

4.1.1 Traitement des données cinétiques :

Pour les décompositions ayant lieu en une seul étape, les valeurs des constantes de

vitesse observés (kobs) ont été déterminées graphiquement en utilisant la fonction :ln [(A-

A∞)/(A0-A∞)] = f (t) pour le milieu acide et lnA = f (t) pour le milieu basique. La

linéarisation des données expérimentales affirment que ces réactions suivent des cinétiques

des réactions du pseudo première d'ordre. Les coefficients de régression linéaire sont

supérieurs à 0.98 pour tous les composés. Les valeurs absolues des pentes représentent la

constante de vitesse de la réaction du pseudo premier ordre.

Pour le pH neutre, les décompositions des composés 1, 2 et 3 sont consécutives du

pseudo premier ordre. Pour augmenter la précision des calculs des constantes de vitesse,

un nombre suffisant de points expérimentaux, situés dans la première moitié de la réaction

de chaque processus, ont été relevés.

Pour le début de la cinétique 20 cycles de 90s ont été enregistrés et 25 cycles de 900s pour

la suite de la cinétique. Les résultats du traitement cinétique sont rassemblés dans le

tableau suivant :

t=0

t=196h

t=30h

t=20jour

Wavelengh (nm)

Abs

300 280 260 240 220

0

0.2

0.4

0.8

0.6

Figure (3) : Evolution cinétique du composé 1 en milieu neutre

70

Tableau (3) : Variation des divers paramètres cinétique en fonction des pH

pH 0.1 2.1 4.1 6.2 7.0 8.6 9.25 10.0 11.5 13.0

6.114 0.876 0.137 0.057 0.058 0.125 0.183 0.350 0.858 2.185

1

K(obs). 104,s-1

t(1/2) ,min 19 132 868 2003 1978 917 632 329 134 53

14.00 1.960 0.420 0.150 0.140 0.142 0.163 0.200 0.355 0.865

2

K(obs). 104,s-1

t(1/2), min 8 59 273 750 823 817 705 576 325 133

1.857 0.521 0.218 0.145 0.214 0.419 0.537 1.002 2.433 5.480

3

K(obs). 103,s-1

t(1/2) ,min 62 221 530 786 540 275 215 115 48 21

La relation entre les logarithmes des constantes de vitesses observés et le pH est

représentée ci-dessous (figure 4) :

Ce profil en forme de U est l’une des caractéristiques de la réaction catalysée dans le

milieu acide ou basique comme déjà notés pour des composés d’analogues [24-38].

Pour chaque composé on remarque trois régions distinctes. Pour les trois composés,

on observe le maximum de stabilité dans l'intervalle de pH s'étendant de 5 à 8.La présence

de H3O+ ou l'OH- catalyse l'hydrolyse de ces composés. Pour les composés étudiés et pour

un pH donné, la nature des radicaux R1 et R2 ont des influences modérées sur les valeurs

des constantes de vitesses.

Figure (4) : Profil du pH des composés étudiés

pH

71

4.2. Suivi Cinétique par LC-MS :

Les solutions des CENS à étudier sont ajustées à un pH=7.4 et T=37°C pour se

rapprocher des conditions physiologiques. Les résultats obtenus par la technique de

chromatographie à phase inverse couplée à la masse. Les évolutions des

chromatogrammes des composés sont représentées sur la figure suivante:

Figure (5) : Evolution du chromatogramme du composé 2 à T=37°C ; pH=7.4

72

Les premiers signaux enregistrés à t=0 représentés par des pics uniques

correspondent aux produits de départ. Après décomposition il y a apparition de deux pics

correspondants aux composés élués respectivement t à 2 et 3 minutes.

Des tentatives d’identification des produits issus de la décomposition ont été

effectuées par LC-MS et les données sont regroupées dans le tableau 4.

Tableau (4) : Données chromatographiques et détection en UV et ESI-MS suite à la

décomposition des CENS (à pH=7.4 ; T=37°C)

Préalablement avant de lancer les cinétiques, les composés 1, 2 et 3 ont été

identifiés par leurs pics uniques en HPLC-MS. La détection est effectuée par le détecteur

UV –PDA (Photodiode Detector Array) à λ =253.46, 251.44 et 244.64 nm. Les temps de

rétention des composés sont respectivement égaux à 9.26, 12.44 et 5.5 min. Leurs spectres

Détection UV Detection en Masse : ESI

m/z (mode positif) Composés

Tr(min) Donnés UV

(nm) Tr (min) Masse

1

3.33

2.58

253.26

236.47

3.32

2.59

279.15

227.15

2

9.33

3.14

2.17

251.46

265.46; 226.46

268.26

9.26

3.02

2.09

390.01

279.06; 301.02

101.79

339.12

3

3.25

1,74

265.44

256.46

3.15

2.07

279.15; 301.09

345.29

73

de masse ont montré des pics moléculaires à 278.12 [M+Na]+ pour le composé 1, 390.01

[ M+Na]+ pour le composé 2 et de 352.44 [M+H]+ pour le composé 3.

L'examen des différents chromatogrammes montre la formation de plusieurs

produits de décomposition parmi lesquelles deux espèces caractéristiques y sont toujours

présentes indépendamment du CENS initial.

Pour les composés 1,2 et 3, les données LC-ESI-MS regroupées au tableau 4

montrent que les deux espèces détectées par le détecteur en ligne d'UV-PDA à λ = 236.4,

λ=268.26 et λ =256.44 nm respectivement, sont éluées aux alentours de 2 minutes. Leurs

spectres de masse ont montré respectivement des pics moléculaires à m/z 227 [M+H] +,

m/z=339.12 (M+H)+ et m/z = 345.29 [M+Na]+.

Sur la base de ces constatations ces espèces ne peuvent être que le produit dénitrosé

c'est-à-dire le chloroéthylsulfamides (CES).

La situation du deuxième produit B est légèrement plus compliquée, les données de

détection d'ESI-MS ont montré la même valeur pour les trois composés avec m/z = 279

[M+H] + et m/z = 301 [ M+Na]+. Le problème maintenant et d'identifier cette espèce

commune qui est éluée près de 3 minutes. Sachant que le produit est très stable, nous avons

alors procédé à sa purification et son identification par la RMN et la masse.

Les paramètres de cinétiques de la décomposition du CENS dans le milieu aqueux

ont été déterminés en suivant la disparition du pic de HPLC-UV du composé de départ en

traçant la surface de chaque pic en fonction du temps (figure6). Les données

expérimentales ont été lissées en utilisant un modèle exponentiel.

74

Figure (6) : Variation de la surface du pic en fonction du temps pour le composé 2 à

T=37°C ; pH=7.4

Les paramètres cinétiques ont été calculés sur la base du modèle mathématique

illustrant une cinétique de pseudo première d'ordre : C=C0 exp(- kt) où : C0 représente la

concentration initiale du CENS, C la concentration à l’instant t, temps d'incubation. Les

constantes de vitesses et les temps de demie-vie sont reportés dans le tableau 5.

Tableau (5) : Paramètres cinétiques de décomposition des CENS à pH=7.4

r :étant le coefficient de corrélation

Les CENS 1 et 2 étudiés sont plus stables et présentent des valeurs de temps de

demie-vie plus grandes comparées à celles des CENU de référence. En revanche, le

composé 3 possède une stabilité proche de celle des CENU.

Composé kobs min-1. r2 t1/2, mina

1 0,0060 0,997 115,0 2 0,0016 0,983 424,5 3 0,0339 0,989 20,40

BCENU 0,0133 - 52,00 33 CCNU 0,0144 - 48,00 14

75

4.3. Identifications des produits issus de la décomposition :

L'analyse LC-MS du résidu obtenu après décomposition totale des CENS a révélé

la formation de deux produits de dégradation, les produits B et C (figure 7)

Il a été constaté par ailleurs que ces deux produits présentent une stabilité

importante, ce qui nous a orienté à lancer des réactions de décomposition pour des

quantités plus importantes et tenter d’isoler et purifier ces deux produits par

chromatographie sur colonne classique.

Figure (7) : 1- Chromatogramme du composé 2 après 72h de réaction

2- Chromatogramme du CES pur préparé par voie de synthèse

76

Cette démarche nous a permis de dégager les constatations suivantes :

• Le produit (C) a été identifié en comparant ses propriétés chromatographiques

(figure 7) par co-injection du produit authentique obtenu par voie de synthèse, par

comparaison des grandeurs chromatographiques respectives et des spectres de la

RMN et de la masse , il ressort que le composé en question n'est autre que le

chloroethyl sulfamide (CES) précurseur du CENS.

• Sur la base des résultats des spectres ESI-MS et de la RMN de proton , le produit

(B) a été identifié comme étant un sulfamate. Ce dernier a été isolé, et la

comparaison de son comportement chromatographique avec celui du produit B du

mélange montre qu’il s’agit effectivement du même composé.

4.4. Mécanisme de décomposition

Sur la base des constatations expérimentales précédentes, et les phénomènes

décrits dans la littérature [21-36] nous pouvons proposer le mécanisme décomposition

suivant (schéma 47).

En milieu aqueux tamponné phosphate (pH=7.4 à T= 37°C), le schéma mécanistique

proposé comportent deux réactions compétitives.

N

SN

OO

R1

R2

Cl

NO

N

SO

O

R1

R2

O NOH

NCl

N

SNH

OO

R1

R2

Cl

C

B D

+ HNO2 + H+

pH=7.4

T=37°C

Schéma (47) : Mécanisme de décomposition des CENS à (pH=7.4 ; T=37°C)

La formation des produits C et B est le résultat d’une dénitrosation et d’une

hydrolyse compétitive des CENS. Le composé D n'a pas pu être détecté en raison de sa

77

très grande instabilité dans telles conditions expérimentales, néanmoins nous l'identifions

au chloroethyldiazohydroxyde en se référant au travail de Lown [14] qui a suggéré la

formation de cette espèce dans la décomposition des chloethylnitrosourées analogues des

CENS.

Le mécanisme de dénitrosation des CENS s'effectue probablement par une

protonation initiale des N-chloroethylnitrososulfamides suivie d’une attaque nucléophile

sur l’oxygène protoné (schéma 48). L'étape d'hydrolyse alcaline se produit par attaque

nucléophile de l’ion hydroxyde OH- sur l'atome de soufre pour former l'espèce sulfamate B

et le chloroethyldiazohydroxyde D. Le même processus a été noté pour des analogues

nitroso des composés tels que le de MNTS ( N-methyl-N-nitroso-p-toluene sulfonamide )

et de la MNNG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)[31].

N

SN

OO

R1

R2

Cl

NO

N

SN

OO

R1

R2

Cl

NOH

N

SN

OO

R1

R2

Cl

NOH

N

SNH

OO

R1

R2

Cl

+ H3O+

H2O + HNO2 + H+

Schéma (48) : Mécanisme de dénitrosation des CENS

D'autre part, l'étude spectrophotométrique indique qu'en milieux acides la

décomposition se produit en une seule étape qui correspond au phénomène de dénitrosation.

Par contre dans les pH basiques les composés subissent une hydrolyse mais pas de

dénitrosation.

78

N

SN

OO

R1

R2

Cl

NO

N

SO O

R1

R2

O NOH

NCl

B D CENS

OH

Schéma (49) : Mécanisme de l’hydrolyse des CENS

79

CHAPITRE (5)

Décomposition des CENS en milieu organique

80

5-1-Décomposition en présence de KOtBu :

Dans des essais préliminaires, les CENS se décomposent lentement en présence du

tertiobutoxyde de potassium. En chromatographie sur couche mince (CCM) plusieurs

taches se forment. Une des ces taches disparaît aussitôt de sa formation, et pour la

conserver le milieu réactionnel a été maintenu dans un bain d’azote à une température de -

40°C. Pour isoler et éventuellement identifier cette entité, nous avons ajouté l’éther

couronne 18C6. Le mécanisme réactionnel suit les étapes suivantes :

−+ +→ OtBuKKOtBu

( )18 618 6 18 6CC K C K OtBu+++ →

CBAKNONCHClCHKOtBuCENS +++=→+ +−22

ClCHNCHNOKCKNONCHClCHOtBuKC 2222 )618()618( =→=+ −++−−+

Schéma (50) : Mécanisme de stabilisation de chloroéthyldiazoate

par formation de paire d'ions

L’espèce chloroéthyldiazohydroxyde est stabilisée sous forme d'une paire d'ions

suite à l'addition de l'éther couronne 18C6 qui :

� Améliore la réactivité de KOtBu en augmentant la nucléophilicité [94],

� Forme un complexe d'inclusion avec le potassium,

� Favorise la formation de la paire d'ions entre K+ et l'entité

chloroéthyldiazoate et son extraction dans le dichlorométhane.

Le chloroéthyldiazoate stabilisé à -40°C est par la suite extrait sous forme de paire

d'ions dans le dichlorométhane.

Le suivi de l'évolution de la réaction effectué par la CCM , montre qu'en présence du

tertiobutoxide le CENS se décompose , mais en ajoutant l'éther couronne la vitesse de la

décomposition a augmentée considérablement. Un changement brusque de la couleur jaune

vers le rouge.

Il est intéressant de souligner qu’en raison de la basse température (– 40°C) de la

stabilisation de l'espèce chloroéthyldiazoate dans le dichlorométhane, aucune technique

analytique disponible ne se prête à son identification.

81

5-2- Décomposition en milieu acide organique :

La décomposition en milieu acide organique a été menée dans deux milieux mixtes

TFA-acétonitrile, et TFA-methanol.

Le suivi a été fait à l’aide de la RMN de l’azote marqué au niveau du groupement nitroso

du CENS par voix de synthèse.

5-2-1-Marquage régiosélective des 2-chloethylnirososulfamides :

Le marquage régiosélectif à l’azote 15 des CENS sur le groupement nitrosé a été

effectué par voie de synthèse selon le schéma suivant :

ClSO2N=C=O

1- tBuOH, CH2Cl2 à 0°C

3- PH3/DIAD,ClCH2CH2OH

NHS

N

OO

ClR1

R2

2- R1R2N

NS

N

OO

ClR1

R2 15NO

4-TFA

Na15NO2 / HCOOH, CH2Cl2Enrichi à 98%

Nitrosation régiosélective

R1R2=pipéridinyleR1R2=benzyl

(1)(2)

Schéma (51) : Synthèse des CENS marqué à l’azote 15N

L’incorporation de l’azote enrichi à plus de 98% au niveau du groupement nitroso

a été vérifiée par spectrométrie de masse.

5-2-2- Suivi par RMN de 15N

Les spectres RNM ont été enregistrés sur un appareil à 400 Mhz en présence du

nitrométhane comme référence interne Deux CENS (schéma 51) issus d’amines

secondaires ont été étudiés. Le suivi a été mené dans deux milieux organiques mixtes

82

(acétonitrile +TFA), (méthanol+TFA) . Le TFA étant ajouté pour accélérer la

décomposition des CENS.

-

Figure (8) : Spectres RMN 15N du composé (1) dans l’acétonitrile

83

Figure (9) : Spectres RMN 15N du composé 1 dans le méthanol

Figure (10) : Spectres RMN 15N du composé (2) dans le CD3CN

84

En RMN 15N, les trois noyaux non marqués résonnent différemment [81] ; ce qui

conduit à des déplacements chimiques différents (schéma 52).

Le suivi de ces trois signaux en cinétique rend leur attribution très délicate et les

résultats seront peu exploitables.

N3

SN1

Cl

N2O

OO

167

-104.25

-299.40

Schéma (52)

En revanche, le choix du marquage isotopique spécifique au niveau de l’azote du

groupement nitrosé permet de faire un suivi cinétique très sélectif de l’avancement de la

réaction de décomposition du CENS en solution.

Et sachant en plus que la fragilité des molécules des CENS est localisée au autour

de cet azote marqué, cette technique pourrait donc nous conduire à des informations

importantes sur le schéma mécanistique de décomposition..

Le composé 1 dans CD3CN présente un pic singulier avec un déplacement de

188.109 ppm. Ce signal correspond à la résonance de l’azote marqué.

Après addition du TFA on constate qu’il y a disparition du pic de départ et

apparition d’un nouveau signal vers les champs forts à –72 ppm. Ce fort blindage du

noyau marqué peut être attribué à un réarrangement au sein de la molécule .

Par la suite, un autre pic apparaît à 127.746 ppm et l’autre persiste à - 71ppm.

Ces deux pics sont en faveur d’une décomposition du CENS avec formation de deux

produits. Le signal à 127 ppm augmente par rapport à celui de -71 ppm en fonction du

temps.

Dans le méthanol le composé 1 présente un seul pic au niveau de 186.916 ppm.

Après addition du TFA et de l’eau on observe une apparition d’un pic à 145 ppm et un

autre à 181 ppm plus large.

85

Le pic initial spécifique au produit de départ reste après décomposition avec une

diminution de son intensité.

Pour le composé 2 dans l’acétonitrile, l’azote résonne à 188 ppm sans apparition de

nouveaux pics. Cependant, on observe une augmentation du rapport signal bruit ce qui peut

être expliqué par le dégagement de NO gazeux. Il y a donc décomposition sans apparition

de nouveaux pics.

En conclusion, l’étude cinétique via le marquage à l’azote 15 a donné des

indications très intéressantes sur la décomposition des CENS. Néanmoins l’étude aurait été

davantage concluante si le marquage concernait également l’azote adjacent central.

5-3-Décomposition en milieu organique neutre:

5-3-1-Suivi en RMN 1H :

Les spectres RMN ont été enregistrés sur un appareil Bruker 250Mhz, dans deux

types de solvants deutériés de l’acétonitrile et du méthanol.

Les mesures ont été enregistrées pour des temps suffisamment éloignés (figure 11).

L’étude structurale par RMN du proton mené par Abdaoui [81] a montré que les

protons portés par les groupements CH2Cl et CH2N des CENS forment un système de spin

du type A2X2. Les déplacements chimiques des différents protons de ce système ont été

décrits en détail pour les différentes étapes de la synthèse des CENS [81].

Cette étude a permis d’établir également une relation entre la structure des produits

et les déplacements chimiques des groupements méthylènes qui se sont avérés une

caractéristique importante des CENS en RMN du proton

Cette propriété spectroscopique intéressante pourrait être exploitée à des fins

cinétiques et mécanistiques. A cet effet, un suivi des déplacements chimiques de ce

système a été effectué en fonction du temps.

La figure ci après (figure 11) présente les résultats de la RMN 1H. Les cinétiques des

réactions étant lentes, nous supposerons des équilibres lents entre les espèces.

86

Figure (11): Spectres RMN1H au cours de l’évolution du composé 1 à

température ambiante.

ppm (f1)1.02.03.04.05.0

-100

0

100

200

300

400

500

600

700

4.173

4.147

4.122

3.657

3.651

3.625

3.425

3.405

3.382

3.139

3.116

2.635

2.631

2.628

2.622

2.619

2.617

2.614

2.611

2.608

2.605

2.603

2.599

2.596

2.594

2.590

2.587

2.585

2.582

2.578

2.572

2.568

2.563

2.560

2.552

2.547

2.543

2.536

2.525

2.522

2.517

2.505

2.479

1.00

1.05

2.12

0.15

0.54

0.03

0.75

3.67

PIPERIDINE t=4h

ppm (t1)1.02.03.04.05.0

0

100

200

300

400

500

600

4.200

4.144

4.121

3.647

3.623

3.599

3.423

3.402

3.381

2.231

2.120

1.994

1.984

1.974

1.964

1.955

1.735

1.691

1.671

1.650

1.622

1.608

1.604

1.589

1.578

1.558

1.547

1.538

1.00

ppm (t1)1.02.03.04.05.0

0

100

200

300

400

500

5.481

4.172

4.146

4.121

3.657

3.649

3.632

3.624

3.403

3.115

2.901

2.896

2.895

2.892

2.890

2.888

2.120

1.974

1.691

1.671

0.93

1.09

1.91

0.38

1.02

0.94

3.29

pipéridine dans acn t=28h

Composé 1 dans CD 3CN à t=0

Composé 1 dans CD 3CN à t=4h

Composé 1 dans CD3CN t= 28h

87

ppm (f1)0.01.02.03.04.05.06.0

0

100

200

300

400

4.177

3.841

3.835

3.655

3.422

3.402

3.379

3.359

3.335

3.310

3.157

3.137

3.114

1.993

1.983

1.973

1.963

1.954

1.785

1.774

1.763

1.671

1.650

1.646

1.630

1.619

1.607

1.585

1.572

1.559

1.539

1.00

5.34

3.61

0.69

1.00

1.36

1.53

PIPERIDINE T=8 jours

t = 8 jour

ppm (f1)1.02.03.04.05.0

0

50

100

150

200

250

3004.1

75

4.1

52

3.7

89

3.7

65

3.7

60

3.7

56

3.7

52

3.7

49

3.7

41

3.7

30

3.6

80

3.6

67

3.6

56

3.6

48

3.6

46

3.6

39

3.6

32

3.3

35

3.1

35

3.1

15

1.9

74

1.9

64

1.7

71

1.7

60

1.6

18

1.6

06

1.5

85

1.5

73

1.5

59

1.5

55

1.0

0

13.0

2

2.0

6

2.9

3

1.2

8

0.8

8

5.5

7

PIPERIDINE t=15 jour t =15 jour

ppm (f1)1.02.03.04.05.06.0

0

100

200

300

400

500

600

700

5.480

4.173

4.151

4.123

3.764

3.740

3.656

3.632

3.381

3.336

3.139

3.116

2.121

1.994

1.984

1.974

1.964

1.954

1.692

1.681

1.672

1.648

1.632

1.627

1.622

1.609

1.588

1.00

1.70

5.72

0.02

1.15

3.92

PIPERIDINE DANS ACN T=48Ht = 48h

88

L’une des observations frappantes lors de la superposition de spectres, est la

disparition du système A2X2 après 48h de réaction, avec apparition de multiplet à des

champs plus faibles.

L’examen des spectres enregistrés en fonction du temps nous permet de dégager les

constatations suivantes :

• Apparition de nouveaux signaux plus larges vers les champs faibles après

décomposition.

• Formation d’un ensemble de multiplets.

• Variation des déplacements chimiques en fonction du temps.

Tableau (6) : Variation des déplacements chimiques en fonction du temps

δ en ppm dans CD3CN δ en ppm dans CD3OD Composé Temps

CH2Cl CH2N CH2Cl CH2N

0 4.12(t) 3.62 (t) 4.145(t) 3.59(t)

48h 4.14 (t) 3.79 (t) 4.175(t) 3.61(t)

72h 4.15 (m) 3.62 (m) 4.19 (m) 3.62 (m)

8 4.16 (m) 3.82 (m) 4.23 (m) 3.65 (m)

Composé 1

15 j 4.18 (m) 3.84 (m) 4.24 (m) 3.69 (m)

0 4.03(t) 3.59 (t) 4.145(t) 3.59(t)

48h 4.33(t) 3.60 (t) 4.145(t) 3.59(t)

72h 4.33 (m) 4.03 (m) 4.15 (m) 3.62 (m)

8 4.61 (m) 4.04 (m) 3.84 (m) 3.65 (m)

Composé 2

15 j 4.33 (m) 3.63 (m) 3.78 (m) 3.63 (m)

0 4.099(t) 3.53 (t) 4.145(t) 3.59(t)

48h 4.12(t) 3.62 (t) 4.145(t) 3.59(t)

72h 4.15 (m) 3.62 (m) 4.15 (m) 3.62 (m)

8j 4.15 (m) 3.65 (m) 4.17 (m) 3.65 (m)

Composé 3

15 j 4.16 (m) 3.64 (m) 3.78 (m) 3.66(m)

89

Bien que ces informations sont fort importantes, le mécanisme demeure encore

complexe et les phénomènes mis en jeu sont loin d’être cernés , encore moins par un suivi

des déplacements chimiques qui reste essentiellement qualitatif.

Par ailleurs, le problème est rendu davantage compliqué lorsque les produits de

décomposition s’accumulent dans le milieu réactionnel, il est alors difficile d’en tirer profit

de la RMN du mélange.

Ces constatations nous ont incitées à faire recours à la troisième approche, il s’agit

en fait de la chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de

masse (LC-ESI-MS).

5-3-2-Suivi par HPLC-ESI-MS :

Les temps de rétention des solutions fraîchement préparées de CENS 1, 2 et 3 sont

respectivement égaux à 9.56, 12.63 et 5.27 minutes. A chaque composé correspond un seul

pic. La détection en UV s’est effectuée par un détecteur à barrette de photodiode (UV-

PDA) à λ =244.46, 246.24 et 243.46 nm.

Les pics moléculaires en spectrométrie de masse sont à 278.21 [M+Na]+ pour le composé 1,

390.05 [ M+Na]+ pour le composé 2 et de 352.12 [M+H]+ pour le composé 3.

Les injections dans la chaîne HPLC couplée à la masse ont été faites après 15 jours

d’incubation dans les deux milieux organiques à température ambiante. Ce temps a été

choisi sur la base des spectres RMN selon lesquels aucune évolution n'est encore possible

après 15 jours de décomposition des 3 CENS.

L’examen des chromatogrammes (figure12) montre qu’il y a formation de plusieurs

produits après 15 jours d’incubation avec diminution considérable de la surface du pic du

CENS de départ. Les produits formés après décomposition possèdent des temps de

rétention inférieurs aux composés initiaux, autrement ils sont plus polaires que les produits

départs.

90

Figure (12) : Chromatogrammes HPLC des différent composés dans l’acétonitrile à

température ambiante après 15 jours

Composé 1

Composé 3

Composé 2

91

Tableau (7): Grandeurs chromatographiques détectées en UV et en masse des CENS

injectés en LC-MS à t=15 jours incubés dans l’acétonitrile à température ambiante.

Tableau (8): Grandeurs chromatographiques détectées en UV et en masse des CENS injectés en LC-MS à t=15 jours incubés dans du méthanol à température ambiante.

Détection en UV Détection en ESI-MS Composés

Tr(min) Donnés UV (nm) Tr (min) Masse

1

1.56 2.57 5.76

229.26 246.46 243.46

1.89 2.41 5.675

85.94 .177.10

115.02 299.05

2

3.02 6.08 6.82 9.53

246.46 241.51

258.46 244.46

3.056 5.986 6.612 9.111

63.98 90.93 339.04 397.02

3

1.58 2.29 3.19 8.64 12.46

229.23 230.46 239.46 241.46 246.46

1.399 2.176 3.129 8.47

12.506

182.20 145.11; 102.1

102.04 211.20 ; 82.85

369.04

Détection en UV Détection en ESI-MS

Composés Tr (min) Donnés UV (nm) Tr (min) Masse

1

1.52 2.21 2.49 4.11 5.27

225

269.46 238.46 261.46 244.46

1.62 2.30 2.49 4.11 5.27

85.94 121.91 115.04 227.05

321.02; 299.04

2

2.11 2.98 5.18 6.86 9.56

256.47 269.46 238.15 258.46 247.46

1.433 3.092 5.19 6.762 9.87

198.13 68.90; 90.92

374.96 339.03

337.02; 389.95

3 2.13

12.62

269.46

236.46

68.95

12.545

68.95; 125.96

323.12; 374.04

92

Sur la base de ces constatations expérimentales faite en RMN de l’azote marqué et

la RMN du proton , on peut dire que le comportement des CENS dans le milieu organique

et quelque peu différent de celui en milieu aqueux. Pour les CENS étudiés, la stabilité en

milieux organiques est plus prononcée que celle en milieu aqueux et à pH contrôlé.

Bien qu’il soit quelque peu difficile d’affirmer avec certitude le mécanisme de

décomposition en milieu organique, néanmoins la nature des fragments détectés par LC-

MS, nous permet de proposer le (schéma 53) suivant :

N N

Cl

NO

R1

R2 S

OO

N NCl

NO

R1

R2 SOO

NN

Cl

R1

R2

S

OO

NO N

OCl

R1

R2

S

OO

NN

-N2

ClOH

N

R1

R2

S

OO

Cl + H2O

NClN

HO

ClOH

ClClCl

N

R1

R2

S

OO

OHNH

R1

R2

N NCl

NR1

R2 SOO

O

Schéma (53) : Mécanisme de décomposition des CENS en milieu organique

Ce mécanisme passe par deux voies probables, l’une implique la formation du

diazohydroxyde qui a été décrit également comme étant l’ultime intermédiaire lors de la

93

décomposition CENU [96] ; l’autre possibilité, est le passage par la formation du

chloroéthanol en tant que produit principal issu de cette dégradation.

.

94

CHAPITRE (6)

Décomposition des CENS dans le milieu biologique.

95

Pour nous rapprocher davantage des conditions physiologique réels, nous nous

sommes proposés d’étudier le comportement des CENS dans du sérum de vœu fœtal non

décomplementé. Ce choix est motivé par le faite que ce type de sérum se rapproche

étroitement du sérum humain ; en plus il est très recommandé pour les cultures cellulaires

lors des tests in-vitro.

Par ailleurs, la non décomplémentarité de celui-ci le garde riche par sa composante

enzymatique simulable à des conditions in-vivo.

La complexité de ce milieu biologique dans lequel va se trouver le CENS rend toute

analyse immédiate impossible. Il est donc nécessaire de procéder préalablement à

l’élimination de toute molécule endogène présente dans la matrice biologique.

De telles molécules pourraient interférer lors des analyses chromatographiques avec les

pics des CENS et leurs éventuels métabolites.

Nous avons adapté une méthode d’extraction sur phase solide en ligne (on-line

SPE), offrant l’avantage de remédier à ce gros problème analytique et permet en outre de

protéger tout notre système chromatographique des centaines de molécules qui pourraient

être une source de colmatage de la colonne .

Les détails sur cette méthode ont été évoqués dans le chapitre 3.

6-1- Suivi cinétique par SPE-LC-MS :

Après incubation des composés dans le sérum de veau fœtal non décomplémenté dans

les conditions (T=37°C, concentration initiale 20µM), des aliquotes ont été prélevées à des

temps appropriés et immédiatement analysées par injection directe sur le système HPLC-

SPE-MS en utilisant "l'extraction en ligne sur phase solide "sans aucune préparation

préalable. On observe plusieurs signaux dans le chromatogramme représenté sur la figure

13.

96

Figure (13) : Evolution en fonction du temps du chromatogramme de la

décomposition du composé 2 incubé dans le sérum de vœu fœtal à 37°C

Les CENS se décomposent rapidement dans le milieu d'incubation, et aucun

produit de départ n’est détectable dans l'échantillon après 60 minutes d'incubation. Tous

les pics détectés en UV par un détecteur PDA en ligne de tR=2 minute à tR=18 minute ont

été notés comme substances A à G (figure 13).

97

Le composé noté comme A détecté à λ=265 nm (TR = 11,60 minutes) et

présentant en spectrométrie de masse un pic moléculaires à m/z=368.08, [M+H ]+ a été

attribué au CENS de départ. Le composé élué à un tR=2.45 min (λ =281 nm) noté B

(figure13) détecté en spectrométrie masse selon son pic moléculaire à m/z =496.

Le métabolite D détecté à λ=268 nm (TR = 5,16 minutes) dont le pic moléculaires est de :

m/z=92, [M+2H] + a été attribué au 2-hydroxyéthyldiazohydroxyde. Les composés E

(tR=15.48 minute) et F (tR= 18 minutes) présentant des ions moléculaires respectifs à

m/z=214.08, et m/z = 143,38 n'ont pas été identifiés. D’autre part, il a été remarqué que le

métabolite E est totalement disparu en 30 minutes.

Sur la base de l’étude en milieu aqueux (T=37°C ; tampon phosphate)

précédemment décrite et celle menée par HPLC-SPE-MS en milieu biologique , on peut

dégager les constatations suivantes :

• Le produit référé comme C (figure13) détecté à λ =279 nm (tR=3.48 minute)

possède le même temps de rétention que celui du sulfamate issu de la

décomposition aqueuse des CENS.

• Le pic détecté à tR = 10 minutes ; λ = 237,46 nm est attribué à G a été

identifié comme étant le chloroethylsulfamide (CES) par comparaison avec le

temps de rétention du produit pure synthétisé. Nous avons précédemment

montré que dans la décomposition en milieu aqueux, dans des conditions

proches du milieu physiologiques, (solution tampon de phosphate pH=7.4;

T=37°C) la voie principale de décomposition comporte une dénitrosation des

nitrososulfamides de départ menant aux chloroethylsulfamides (CES), et une

hydrolyse concurrentielle pour produire l'espèce sulfamate .

D’après ces résultats et en se référant aux données de la littérature [11,38,39]

il est possible de proposer un mécanisme (schéma 56) qui comporte trois

phénomènes concurrentiels. Le premier noté (i) implique la dénitrosation chimique

du CENS pour produire le composé de G. Le deuxièmes (ii) correspond à la

métabolisation du CENS pour donner le métabolite D identifié comme étant le 2-

hydroxyéthyldiazohydroxyde. La troisième possibilité (iii) représente l'hydrolyse

du CENS pour former le produit C et le chloroethyldiazohydroxyde.

98

N

S

N

OO

R1

R2

Cl

NO

N

SNH

OO

R1

R2

Cl

N

S N

OO

R1

R2

Cl

NOH

O

-N2

Cl

N

S

N

OO

R1

R2

Cl

NO

N

S N

OO

R1

R2

Cl

NOH

O

Cl

Adduit-d'ADN

HO N N OH

+ HNO2 + H+

G

D

C

1-R1 = R2 = Piperidinyl

2- R1 = R2 = Benzyl

3- R1 = R2 = Cyclohexyl

H

A

CENS

i

ii

iii

Schéma (54) : Mécanisme de décomposition des CENS dans du sérum de vœu

feotal

Les paramètres cinétiques de la décomposition des CENS dans les

conditions physiologiques indiquées ci-dessus ont été déterminés en suivant la

disparition du pic HPLC-UV du composé de départ et en traçant la surface du pic

de chaque CENS en fonction du temps (figure 14). Les données expérimentales

ont été ajustées en utilisant le modèle exponentiel.

99

Les valeurs des temps de demi vie ont été calculées par le modèle

mathématique illustrant une cinétique de pseudo première d'ordre: C=C0exp (-kt)

où C0 représente la concentration initiale du CENS, le C la concentration à un

instant t, et t le temps d'incubation (en minutes)

Figure (14) : Evolution de la surface du pic en fonction du temps pour le CENS 2

6-2-Cinétique et lipophilie

La lipophilie des molécules étudiées conditionne en partie leurs propriétés

biologiques telles que le transport, le passage à travers la membrane et la biodisponibilité

(distribution et accumulation).

Dans les études QSAR (Quantitative Stucture-Activity Relationsheep) la cinétique

de décomposition des substances actives dans des milieux biologiques pourrait être

corrélée avec leurs cofficients de partage [75-76]. La corrélation joue un rôle déterminant

dans la variation interindividuelle des paramètres pharmacocinétiques et de la réponse

thérapeutique des molécules anticancéreuses comme les chloroethylnitrosourées [36].

Les coefficients de partage des CENS ont été déterminés expérimentalement par la

méthode dites des flacons agités (Schake –flask) [75-76]. Le coefficient de partage

100

octanol-eau est définie comme étant le rapport de concentration du composé étudié dans la

phase d'octanol à sa concentration dans la phase aqueuse. Le logarithme P est désigné le

plus souvent comme étant le facteur de Hansh ou bien le plus communément

« lipophilie ». A cette fin, dans une série de tube de volume 2.5 ml de 10-4 M de la

solution aqueuse de chaque CENS respectivement mélangée au même volume d'octanol à

la température ambiante. Le système a été agité vigoureusement sous les ultrasons jusqu'à

l'équilibre. Après centrifugation les 2 phases ont été séparées et les absorbances ont été

mesurées aux longueurs d’onde appropriées. Les résultats de mesure de la lipophilie sont

regroupés dans le tableau 9..

Tableau (9): Paramètres cinétiques de la décomposition des CENS.

a : Dans le sérum de vœu fœtal à T=37°C.

b : Dans du sérum humain à T=37°C

c : Dans le milieu tampon phosphate à T=37°C.

Il en ressort que la lipophilie dépend de la nature du CENS et diminue dans l'ordre

suivant : 3 > 1> 2.

En faisant intervenir les constantes de vitesses de décomposition, il en ressort que plus

le composé est lipophile plus il est stable. La diminution de la stabilité chimique est dans

l'ordre: 3 < 1 < 2.

Le tableau 9 comportant, à titre comparatif, les caractéristiques cinétiques de

décomposition des CENS et des CENU, montrent que les valeurs des constantes de vitesse

kobsmin-1. R2 t1/2min

Composé

a c a c a C

Log P

1 0.1110 0.0060 0.999 0.997 6.24 115.00 [1] 1.03 2 0.0450 0.0016 0.973 0.983 15.22 424.50 [1] 1.32 3 Nd 0.0339 Nd 0.989 Nd 20.40 [1] 0.86

BCNU b 0.0460 0.972 17.50 [36] 1.56 CCNU b 0.0230 0.984 15.06 [36] 2.82 MeCCNU b 0.0240 0.998 28.88 [36] 3.30

101

de décomposition des CENS sont comparables à celles de la décomposition des CENU

dans le sérum humain

L'interaction du CENS avec le cône non polaire de la lipoprotéine du sérum tend à le

stabiliser [36-38]. En revanche, l’action catalytique des enzymes et des protéines présentes

dans le sérum favorise sa décomposition. Les CENS pourraient s'associer aux protéines

pour former un complexe CENS-protéine qui se décompose à son tour pour donner

l'albumine, le 2-chloroethyldiazohydroxide et l’isocyanate [38-39].

Tenant compte des tous les résultats obtenus, le schéma le plus plausible des

phénomènes mis en jeu lors de la décomposition des CENS dans le sérum est représenté

par la figure 57.

102

LIPIDE

+

CENS + Protéine CENS PROTEINERéaction

en milieu aqueux

CENSMétabolisme

Alkylation

Réaction en milieu aqueux

Macromolécule

Dénitrosation

Hydrolyse

ClCH2CH2N=NOH

+

R1R2SO3-

ClCH2CH2N=NOH

+R1R2SO3

-

CES

CES

CES

EXCRETION

Schéma( 55) : Schéma hypothétique de l'intéraction bio-chimique des CENS dans le serum

MEMBRANE DISTRIBUTION

CENS

CENS-LIPIDE

-

103

.

CONCLUSION GENERALE

104

CONCLUSION

Ce travail s’est proposé pour étudier la cinétique de décomposition des CENS dans les

milieux variés. En milieu aqueux, les CENS subissent une hydrolyse suivant une catalyse acido-

basique généralisée.

Les réactions de décomposition dans l’acétonitrile, le méthanol, et dans le milieu mixte

( acétonitrile + TFA, méthanol +TFA ) sont relativement lentes.

En faisant recours aux diverses techniques analytiques telles que la spectrophotométrie UV-Vis,

la spectrométrie de masse, les RMN 1H et RMN 15N, la chromatographie liquide de haute

performance et son couplage LC-ESI-MS , des mécanismes de décomposition ont été proposés

pour les milieux aqueux , organique et biologique.

En milieu aqueux, le chemin réactionnel de décomposition comporte deux phénomènes

concurrentiels : l'hydrolyse et la dénitrosation. En revanche, les milieux organiques se

caractérisent par des réarrangements et formation de nombreux produits dont deux plus

remarquables qui sont le sulfamate et le chloroéthyldiazohydroxyde responsable de l’action

alkylante de ADN.

En milieu biologique la situation semble être plus complexe. Un nettoyage en ligne (on-

line solid phase extraction) pour éliminer les protéines doit précéder toute analyse cinétique

faisant usage de la chromatographie liquide haute de haute performance.

La décomposition des CENS dans le sérum non décomplémenté du veau fœtal est plus rapide

que dans les deux autres milieux. Ce phénomène a été interprété par l'action catalytique des

enzymes et des protéines présentes dans le milieu d'incubation.

La corrélation vitesse de décomposition- lipophilie montre que moins le composé est lipophile

plus il est instable.

Le mécanisme de décomposition est quelque peu complexe en raison des nombreuses interactions

mises en jeu dans ce milieu.

105

Les principales espèces détectées on cite le 2-hydroxyéthyldiazohydroxyde, le sulfamate et le

chloroethylsulfamide (CES). Il est instructif de remarquer que ces deux dernières espèces ont été

également observées en milieu aqueux phosphaté.

Bien que ce travail ait été couronné par des résultas intéressants, le sujet est loin d'être

complètement cerné. Plusieurs points méritent d'être développés; à savoir :

� Marquage de l'azote adjacent au groupement nitroso et établissement d'un suivi par RMN

pour mieux élucider le mécanisme de décomposition ;

� Etude quantitative de l'influence des protéines et des enzymes sur la vitesse de

décomposition des CENS;

� Etude de décomposition dans des extraits cellulaires d'origine cancéreuse notamment

celles issues de cultures mammifères MCF7 et pulmonaires A549 ;

� Procéder à une identification des espèces volatiles provenant de la décomposition des

CENS.

106

Partie Expérimentale

107

CONDITIONS GENERALES

1. Produits chimiques utilisés :

• Les CENS sont synthétisés et purifiés selon la procédure décrite dans la littérature.

• L’eau est purifiée sur un système Milli Q (millipore ).

• L’acétonitrile et le méthanol sont de qualité HPLC.

• Les phosphates de potassium mono et di basiques sont de qualité Sigma « ACS

reagent ».

• L’acide acétique, ainsi que les acétates utilisés sont de qualité pure pour analyse.

• L’éther couronne dibn 18- crown 6 est de qualité Sigma

2. Milieux d’étude utilisés :

• Milieux aqueux à pH contrôlé sont préparés selon les procédures décrites dans la

littérature et les sels utilisés pour les divers systèmes tampons sont des sels de

qualité pure pour analyse.

• Le sérum de vœu fœtal de qualité stérile A est fourni par GIBCO BRL.

• Les milieux organiques utilisés sont constitués de solvants purs pour HPLC.

• Les solvants utilisés pour le suivi en RMN du proton et de l’azote marqué sont des

solvants deutériés fourni par Eurisotope.

• Le tertiobutoxyde de potassium et le TFA sont de qualité sigma.

108

3. Décomposition des CENS en milieu aqueux :

3.1. Système RP-LC-MS:

Le système HPLC (Waters) est composé de :

• Un contrôleur 600S.

• Une pompe basse pression 616.

• Un injecteur automatique 717+

• Un détecteur UV à barrette d’iodes modèle 996.

• Une colonne, thermostatisée à 25°C

L’équipement HPLC utilisé lors du suivi cinétique en milieu aqueux est constitué

par un une chaîne « Waters » utilisant un module de séparations type 2695 doté d’un

échantillonneur automatique ( Autosampler) et un détecteur à barette photodiode de 996

de PDA . Le balayage est de 220nm à 400nm). L'appareil chromatographique est

commandé par le logiciel masslynx version 3.5 . La séparation des produits a été réalisée

sur la colonne RP-C18-ODB Interchrom ( 150*2mm, 5µm), protégée par la colonne de

garde avec le même remplissage. La température de colonne a été maintenue à 25°C. La

phase mobile se compose de deux solvants : A (acide de l'eau 0.1% acide formique) et le

solvant B (acide formique, Acétonitrile 0.1%). Le débit était fixé à 0.25ml/min. Une

élution de gradient linéaire a été effectuée comme suit : 0 minutes, 40%A, 60%B ; 10 à 20

minutes, 100%B ; 20.10 minutes, 40%A, 60% ; 20.10 à 30 minutes, 40%A, 60%B. Le

volume de l'injection en colonne était de 50µl, et la seringue d'injecteur a été lavée avec un

mélange 50/50 de méthanol/eau avant chaque injection.

109

3.2. Spectrométrie de masse :

Les composés ont été détectés à l'aide du spectromètre de masse simple quadripole

de Waters (Micromass ZQ) équipé de la source electrospray ionisation (ESI). La détection

a été faite en mode d'ion positif. La tension de jet d'ion était 3500V et 2V comme tension

d'orifice. La température de source a été fixée à 250°C. L’intervalle utilisée de m/z 50 :

400 a été balayé pour l'identification des produits inconnus lors de la décomposition des

CENS, employant un pas de 0.10 uma avec des temps d'angle de saturation de 0.2s.

L'écoulement de gaz d'azote pour le dessolvatation était 400.7 (l/h) et 275 (l/h) pour le

cône.

3.3. Procédé général pour l'analyse des produits de la décomposition aqueuse des

CENS :

Une solution 2.10-5mol.dm-3 des Chloroéthylnitrososulfamides ( CENS ) dans la

solution tampon de phosphate de sodium de 100 ml (pH=7.4) a été incubée à 37°C dans

des tubes fermés avec des septum en teflon. Chacun des composés (1, 2, 3) a été dissous

dans un minimum d'acétonitrile et ajusté avec une solution tampon de phosphate. Le

mélange est agité rapidement sur vortex (10 secondes) puis une aliquote est prélevé

immédiatement pour être injecté directement pour analyse chromatographique par la suite

et à des intervalles réguliers des aliquotes sont prélevées pour le suivi cinétique.

3.4. Isolement des produits résultant de la décomposition du CENS :

Le CENS (200mg) est incubé dans un mélange tampon phosphate à pH=7.4 peu

d'acétonitrile 2%, a été mis sous agitation magnétique à 37°C dans des ballons équipés

de septum en téflon. La réaction a été suivie par chromatographie sur couche mince qui

a montré l'apparition de deux nouvelles taches de Rf différents. La réaction a été laissée

jusqu'à la disparition totale du produit de départ. Le mélange a été alors dilué avec du

dichlorométhane ; et lavé avec une solution saturée du NaCl. La phase organique a été

séchée sur le sulfate de sodium anhydre et évaporée à pression réduite qui donne une

110

huile concentrée jaune. Les produits de la décomposition ont été alors séparés sur une

colonne de gel de silice et éluée avec du dichlorométhane comme éluant.

3.5. Identification des produits :

Pour identifier les produits issus de la décomposition aqueuse des CENS à pH=7.4,

37°C ; les fractions séparées de la colonne ont été évaporées à pression réduite puis

recristallisées dans le mélange éther / éther pétrole et analysées par spectrométrie RMN 1H et de masse ESI.

Composé 1B : RMN -1H (250MHz, CDCl3) : δ 1.55 (m, 6H, CH2 Cycl) ; 2.74 (q, 2H, N-

CH2) ; MS. ESI+ 25eV m/z = 187.29 [M+Na] + (100%).

Composé 1C : RMN -1H (250MHz, CDCl3) : δ 4.62 (t, 1H, NH) ; 3.64 (t, 2H, Cl-CH2) ;

3.40 (q, 2H, N-CH2) ; 3.32 (t, 4H, N-CH2Cycl) ; 1.62-1.50 (m, 6H, CH2Cycl) ; MS. ESI+

20eV : m/z = 227.24 [M+H] + (85%).

Composé 2B : RMN -1H (250MHz, CDCl3) : δ 3.86 (s, 4H, 2CH2Bn) ; 7.26 (m, 10H,

2ArH) ; SM. ESI+ 25eV : m/z = 300.08 [M+Na] + (65%).

Composé 2C : RMN- 1H (250MHz, CDCl3) : δ 7.45 (m, 10H, 2ArH), 4.35 (t, 1H, NH) ;

4.35 (s, 4H, 2CH2Bn) ; 3.60 (t, 2H, ClCH2) ; 3.25 (q, 2H, N-CH2) ; SM. ESI- 20eV : m/z =

337.99 [MH] - (100%).

Composé 3B: NMR -1H (250MHz, CDCl3) : δ 2.57 (q, 2H, N-CH2) ; 1.44 (m, 20H, CH2

Cycl.) SM. ESI+ 40eV : m/z = 283.18 [M+Na] + (100%).

Composé 3C: NMR -1H (250MHz, CDCl3) : δ 4.45 (t, 1H, NH) ; 3.70 (t, 2H, ClNH2) ; 3.35

(q, 2H, N-CH2) ; 3.25 (m, 2H, 2N-CH) ; 1.75-1.00 (m, 20H, CH2Cycl.) ; SM. ESI+ 40eV :

m/z = 345.29 [M+Na] + (100%).

111

4. Décomposition en milieu biologique :

4.1. Instrumentation de l’extraction on Ligne sur phase solide RP-LC-MS-ESI :

L'instrumentation de HPLC est constituée par un module de séparation Waters LC

2695 (l'échantillonneur automatique modèle 717+, une pompe 616 avec un réchauffeur de

colonne et le contrôleur modèle 600S, le détecteur modele 996 à barette de photodiodes)

couplé à la chromatographie .

Le logiciel masslynx, (version 3.5) commande les deux vannes automatiques

(six sortie 7000 Rheodyne). La cartouche d« OASIS » H.L.B d'extraction sur phase

solide 2.1mm x 20 millimètres (Waters, France) liés à la colonne analytique Modulocart

C18 QS UPTISPHERE 5 HD 150 le millimètre X 2.0 millimètres (Interchrom, France)

protégée avec une garde à colonne de même remplissage.

Le système de vanne automatique a été électriquement relié au commutateur 1 et 2

du connecteur de signal d'entrée-sortie dans le panneau arrière du module de séparation de

Waters. À la première position (off-off), l'éluant de la pompe pousse l'échantillon

provenant de l'échantillonneur automatique à la colonne d'extraction et la matrice

biologique est éluée à l’égout. À la deuxième position (on-on), le flux est inversé et un

transfert du solvant de la précolonne vers la colonne analytique.

Un gradient linéaire d’élution est utilisé pour éluer progressivement notre analyte

et leurs métabolites de la précolonne d'extraction et les transférer vers la colonne C18

analytique. A la sortie de cette colonne est placé un détecteur à barrette de diode PDA et

un détecteur en ligne d'ESI-MS.

112

Pendant l'étape de purification (0-2min) l'effluent de colonne est détourné à l’égout

pour protéger la colonne analytique et le spectromètre de masse. À ce stade, la phase

mobile est exempte de tout solvant organique pour éviter la précipitation des protéines de

sérum dans le système de HPLC .

À l'étape d'élution les analytes maintenues sur la precolonne ont été transférées à la

colonne analytique en utilisant le gradient linéaire d'acétonitrile-eau pour atteindre 70-30%

et le débit a été réduit de 4ml/min à 0.2ml/min. La température de colonne est de 30°C. La

phase mobile se compose de deux solvants : A (Eau : 0.1% d’acide formique) et le solvant

B (Acétonitrile : 0.1% d’acide formique). L'échantillon brut à analyser a été injecté

directement dans précolonne et est élué avec 100% du solvant (A) pendant 2 minutes

avec un débit de 4 ml/min. L e système de vanne a été activée pour relier la précolonne à

la colonne analytique. Une élution avec gradient linéaire a été effectuée alors avec un

débit de 0.2 ml/min : 2 minutes, 90%A, 10%B ; 2.2 à 10 minutes, 70%A, 30%B ; 10 à 15

minutes, 30%A, 70%B ; 15 à 20 100%A minimum ; 20.2 à 21.2 minutes, 5%A, 95%B ;

21.4 à 24 minutes, 100%A.

Vingt minutes après injection , le système de vanne a été changé pour détourner

l'éluant à l’égout , et la précolonne d'extraction a été alors lavée avec (5%A, 95%B) et

équilibré avec 100%A. Le volume de l'injection dans le systeme HPLC était de 20µl, et

la seringue d'injecteur a été lavée avec un mélange méthanol/eau de qualité HPLC à 50/50

avant chaque injection.

4.2. Incubation CENS- sérum :

Une solution de 5 ml du milieu d'incubation a été scellée dans un tube de 10ml

fermé hermétiquement avec un septum en téflon. Le milieu d'incubation est constitué du

sérum de veau foetal non décomplementé . La solution de CENS est dissoute dans peu d’

acétonitrile puis ajoutée aux milieux pour atteindre une concentration finale de 20µM. Le

mélange a été agité rapidement sur vortex et immédiatement incubé à 37°C. Des

aliquotes ont été prises périodiquement et analysées sur le système RP-LC-MS en utilisant

l'injection directe (extraction en ligne de phase solide) sans aucune purification préalable.

113

5. Mesure de Lipophilie :

2.5 ml de 10-5M du soluté de chaque CENS ont été respectivement mélangés au

même volume d'octanol à la température ambiante. Le système a été secoué

vigoureusement sous la sonication jusqu'à l'équilibre. Après centrifugation, les deux phases

ont été séparées et l'absorbance a été mesurée à la longueur d'onde appropriée.

6. Spectroscopie RMN

Appareil à transformée de Fourier BRUKER AC 250 (250 MHz pour le proton, 400

MHz pour la RMN de l’azote 15). Les solvant utilisé pour l'enregistrement des spectres de

RMN 'H, est le CD3CN . Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en partie par

million (ppm) par rapport au tétraméthylsilane (TMS) utilisé comme référence interne .

Les constantes de couplage sont exprimées en Hertz. Les notations suivantes sont utilisées

s : singulet ; d : doublet ; t : triplet ; q : quadruplet ; m : multiplet ou massif non analysable ;

dq : double quadruplet , tt : triplet de triplet ; etc...

7. Mesure des points de fusion

Les points de fusion sont déterminés en tube capillaire à l'aide d'un appareil Büchi.

8. Chromatographies sur couche mince

Silice MERCK Art 5554 DC Alufolen Kieselgel 60 F

9. Chromatographies sur colonne

Les chromatographies sur colonne ont été effectuées sur du gel de silice 9385

MERCK Kieselgel 60 de granulométrie comprise entre 0,040 et 0,063 µm.

114

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68. Valette. G.; Pompon, A.; Lefebvre, I.; Périgaud, C.; Aubertin, A. M. ; Girardet, J-

L;kirn, A.; Gosselin, G.; Imbach, J-L. J. Med. Chem. 1996, 38, 3941-3950.

69. Egron, D. ; Lefebvre, I.; Périgaud, C.; Beltran, T.; Pompon, A.; Gosselin, G.;

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78. Winum, J-Y.; Scozzafava, A.; Montero, J-L ; Supuran, C. T.; Med. Res. Rev. 2005,

25, 186-228

79. LEYDET, A.; Thèse de doctorat en science Université de Montpellier II Science et

technique, Juillet 1983.

80. MAGGIO. A –F ; Thèse de doctorat en chimie organique Université de Montpellier

II Science et technique, Juillet 1987

81. Dewynter. G. F ; Thèse de doctorat en science Université Montpellier II, Science et

Technique, 1984.

82. Abdaoui. M ; Thèse de doctorat Chimie Moléculaire Université Montpellier II,

Science et Technique, 1997.

83. Aouf, N.; Thèse de Doctorat, Chimie Moléculaire Université Montpellier II, Science

et Technique, Juin 1994.

84. Carminati, A. ; Thése de Doctorat, Chimie Organique Université Montpellier II,

Science et Technique, 1988.

85. Valette. G.; Thèse de doctorat Université Montpellier II, Science et Technique, 1998.

86. Carpenter, B. K.; Determination of organic reaction mechanism; Wiley.1984.

87. Kromidas, S.; More Pratical problem Solving in HPLC; Wiley-VCH . 2000.

88. Meyer, V. R.; Pratical High-Performance Chromatography;Wiley. 2005.

89. Lunn. G; HPLC of Recently Approved Phramaceutical, Wiley. 2005.

90. Ardrey. B; Liquid Chromatography Mass Spectrometry an Introduction, Wiley.

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91. Lee. M. S. Integrated Strategies for drug Discovery Using Mass Spectroscopy,Wiley.

2005.

92. Patai. S. The Chemistry of Amino, Nitroso, Nitro, and related group; Wiley. 1996.

93. Martin Smith. R. Understanding Mass spectra. Wiley. 2004.

94. Krishra, G.; Hodnick, W. F.; Lang, W.; Lin, Xu.; Karra, S.; Mao, J.; Almassian, B.;

AAPS. Pharmsci. Tech .2001, 3, article 14.

95. Dibiase, S. A.; Gokel, G. W.; J. Org. Chem. 1978, 43, 447-452.

96. Lown, J.W.; Koganty, R.R.; Bhat, U. G. ; Chauhan, S. M. S.; Sapse, A. M. ; Allen,

E. B. ; Biochem . Pharmacol. 1985, 34, 1015-1024.

97. De Souza, A. ; Baylocq, D . ; Pellerin, F. ;Talanta. 1988, 35, 875-878.

122

ANNEXE

123

Publications résultantes de ces travaux

Les résultats des travaux de recherche présentés dans cette thèse ont fait l’objet de

deux publications de renommer internationales et une communication dans un séminaire

internationale dont la liste est donnée ci-dessous :

• Kinetic Investigation on Aqueous Decomposition of 2-Chloroethylnitrosulfamides

Seridi, A.; Kadri, M.; Abdaoui, M.; Winum, J-Y.; Montero, J-L.; Bioorg. Med.

Chem. Lett 2006, 16, 1021-1027.

• Study on the decomposition of 2-Chloroethylnitrososulfamides (CENS )

in serum using HPLC on-line solid phase extraction

Seridi, A.; Winum, J –Y.; Kadri, M.; Abdaoui, M.; Montero, J-L.; Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2006, 339, 521 – 526.

• Etude de la cinétique de décomposition des 2-chloroéthylnitrososulfamides dans le milieu aqueux.

Seridi, A.; Winum, J –Y.; Kadri, M.; Abdaoui, M.; Montero,

la 15éme journée de Chimie du Grand Sud-Ouest organisée le 25 novembre 2005 à Montpellier par la Société Française de Chimie

124