HAL Id: tel-00168863https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00168863
Submitted on 30 Aug 2007
HAL is a multi-disciplinary open accessarchive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come fromteaching and research institutions in France orabroad, or from public or private research centers.
L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, estdestinée au dépôt et à la diffusion de documentsscientifiques de niveau recherche, publiés ou non,émanant des établissements d’enseignement et derecherche français ou étrangers, des laboratoirespublics ou privés.
Développement de vecteurs lentiviraux regulables pourle transfert de gène dans le système nerveux central.
Lahouari Amar
To cite this version:Lahouari Amar. Développement de vecteurs lentiviraux regulables pour le transfert de gène dans lesystème nerveux central.. Neurosciences [q-bio.NC]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2007.Français. �tel-00168863�
THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
Spécialité : Neurosciences
Présentée par :
Lahouari AMAR
Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Paris VI
DEVELOPPEMENT DE VECTEURS LENTIVIRAUX REGULABLES POUR LE TRANSFERT DE GENE
DANS LE SYSTEME NERVEUX CENTRAL
Soutenue le 26 février 2007 devant le jury composé de : Mr. Jean MARIANI Président Mme. Nicole DEGLON Rapporteur Mr. André VERDEL Rapporteur Mr. Daniel SCHERMAN Examinateur Mr. Jacques MALLET Directeur de thèse
Alors que la rédaction de ce manuscrit s’achève, j’adresse ma profonde reconnaissance à tous ceux ou celles qui ont permis de concrétiser ce travail. Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Jacques Mallet pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et permis d’effectuer ce travail dans les meilleures conditions possibles. Je voudrais adresser mes remerciements aux membres du jury :
à Mr Jean Mariani, qui a bien voulu présider cette thèse à Mr Daniel Scherman pour avoir accepté de porter un jugement sur ce travail à Mme Nicole Déglon et Mr André Verdel d’avoir pris la charge supplémentaire d’être rapporteur de ce travail. Je remercie Roland Vogel pour ses conseils avisés qui ont contribué à l’aboutissement de ce travail. Un grand Merci à tous les membres du LGN qui ont contribué à ce que ces quatre années de thèse soient enrichissantes et passionnantes. Je tiens à remercier les membres du labo 3, Jeannette, Cédric, Krzysztof pour les passionnantes discussions que nous avons eu. Merci aux membres du labo 5 (en particulier Yasmine, et Philippe) et du labo 6 (Guilane, Sylvie, Marie-Jo) pour leur gentillesse et leurs conseils. Ce travail de thèse n’aurait pas été aussi agréable sans Mathieu, Angeline, Stéphanie P., Stéphanie M., Nicolas, Cécile et Olfa. Merci pour vos encouragements, votre aide et votre bonne humeur. Merci à Ahn et Paulette pour vos précieux conseils. Un grand Merci à Chamsy pour son aide et nos nombreux débats animés. Je souhaite adresser ma gratitude à Delphine et Hamid pour la lecture critique de ce manuscrit et les discussions qui en découlèrent. Mes remerciements vont également vers tous ceux que j’aime et qui ont fait que cette thèse se déroule dans de bonnes conditions. En particulier, un grand MERCI à Laure qui m’a facilité le quotidien et qui m’a soutenu durant les moments les plus difficiles. Désolé d’avoir été si souvent absent. A ma famille, qui a cru en moi et qui a contribué à leur manière à ce travail. Enfin, je remercie très sincèrement la Délégation Générale pour l’Armement ainsi que l’Association Française contre les Myopathies de m’avoir financé au cours de ma thèse.
À mes Parents
L’homme qui possède la connaissance est capable d’une ligne de conduite qui en découle afin de récolter les avantages de ses acquis ; et celui qui ne fait pas bon usage de ce qu’il connaît est comme l’homme qui, en voyageant, choisit une route dans laquelle il est conscient de s’exposer au danger.
Kalila et Dimna
4
SOMMAIRE
LISTES DES ABREVIATIONS .......................................................................................................................... 6
LISTE DES FIGURES ET TABLEAU............................................................................................................... 8
AVANT PROPOS ............................................................................................................................................... 10
INTRODUCTION ........................................................................................................................................ 12 I. LA THERAPIE GENIQUE DANS LE SYSTEME NERVEUX CENTRAL............................................. 13
I.1. LE CONCEPT DE THERAPIE GENIQUE ET SES ORIGINES ................................................................................. 13 I.2. LES OUTILS DE TRANSFERT DE GENES ......................................................................................................... 16
I.2.1. Les vecteurs non-viraux ou vecteurs synthétiques ................................................................................. 16 I.2.2. Les vecteurs viraux .............................................................................................................................. 18
I.2.2.1. Les Herpès virus (HSV)............................................................................................................................... 19 I.2.2.2. Les Virus Associés aux Adénovirus (AAV) ................................................................................................ 20 I.2.2.3. Les adénovirus ............................................................................................................................................. 22 I.2.2.4. Les lentivirus................................................................................................................................................ 23
I.2.2.4.1. structure............................................................................................................................................... 23 I.2.2.4.2. Cycle réplicatif des lentivirus : cas du VIH-1 ..................................................................................... 26
I.3. OBTENTION DES VECTEURS LENTIVIRAUX DERIVES DU HIV-1.................................................................... 30 I.3.1. Caractéristiques et production ............................................................................................................. 30 I.3.2. Pseudotypage des vecteurs lentiviraux .................................................................................................. 32 I.3.3. Améliorations des vecteurs lentiviraux................................................................................................ 33
I.3.3.1. Amélioration de l’efficacité des vecteurs..................................................................................................... 33 I.3.3.2. Amélioration de la biosécurité .................................................................................................................... 34
I.3.3.2.1. Des productions améliorées ................................................................................................................ 34 I.3.3.2.2. Les vecteurs non intégratifs................................................................................................................. 35 I.3.3.2.3. Les vecteurs à intégrations ciblées....................................................................................................... 36
I.4. VECTEURS LENTIVIRAUX ET TRANSFERT DE GENE DANS LE SYSTEME NERVEUX CENTRAL.......................... 37 I.5. THERAPIE GENIQUE DES MALADIES NEURODEGENERATIVES ....................................................................... 39
II. L’ARN INTERFERENCE ............................................................................................................................ 42
II.1. HISTORIQUE ET DECOUVERTE .................................................................................................................... 42 II.2. MECANISME .............................................................................................................................................. 43
II.2.1. Etape d’initiation ............................................................................................................................... 44 II.2.2. Etape effectrice ................................................................................................................................... 44
II.3. LES MICROARN........................................................................................................................................ 45 II.4. ARNI ET REGULATION DE LA TRANSCRIPTION ........................................................................................... 47 II.5. EXPRESSION DES SIARN............................................................................................................................ 47 II.6. APPLICATIONS THERAPEUTIQUES .............................................................................................................. 48
III. STRATEGIES DE REGULATION DE L’EXPRESSION D’UN GENE................................................ 52
III.1. PRE-REQUIS DES SYSTEMES DE REGULATION............................................................................................ 52 III.2. LES SYSTEMES DE REGULATION DE L’EXPRESSION D’UN TRANSGENE....................................................... 53
III.2.1. Régulation des promoteurs d’ARN polymérase II.............................................................................. 53 III.2.1.1. Le système de régulation par la tétracycline............................................................................................. 53 III.2.1.2. Le système de régulation par l’ecdysone .................................................................................................. 56 III.2.1.3. Le système de régulation par le mifépristone ou RU486 ......................................................................... 59 III.2.1.4. Le système de régulation par le tamoxifène ............................................................................................. 60 III.2.1.5. Le système de régulation par la rapamycine............................................................................................. 61
III.2. 2. Régulation des promoteurs d’ARN polymérase III............................................................................ 63 III.2.2.1. Description des promoteurs d’ARN polymérase III ............................................................................... 63 III.2.2.2. Le promoteur U6 humain ........................................................................................................................ 64 III.2.2.3.Développement de promoteurs d’ARN polymérase III régulables .......................................................... 65
5
IV. OBJECTIFS DE NOTRE ETUDE.............................................................................................................. 68
RESULTATS ET COMMENTAIRES................................................................................................. 70 I- CONSTRUCTION D’UN VECTEUR LENTIVIRAL POUR PERMETTRE L’EXPRESSION REGULEE D’UN TRANSGENE DANS LE CERVEAU................................................................................ 71
II- DEVELOPPEMENT D’UN SYSTEME DE REGULATION DE L’EXPRESSION DE PETITS ARN INTERFERENTS : CONSTRUCTION D’UN VECTEUR LENTIVIRAL POUR LE CONTROLE D’UN GENE ENDOGENE PAR ARN INTERFERENCE. ....................................................................................... 83
DISCUSSION ................................................................................................................................................. 94 I. CONTRAINTES ET LIMITATIONS DU SYSTEME TETRACYCLINE ............................................... 95
I.1. CONTRAINTES POUR LA CONSTRUCTION D’UN VECTEUR UNIQUE CONTENANT LE SYSTEME TETRACYCLINE 95 I.1.1. Contrainte de taille ............................................................................................................................. 95 I.1.2. Risque d’interférence entre les promoteurs ........................................................................................... 96
I.2. CONTRAINTES DU SYSTEME TETRACYCLINE POUR UNE APPLICATION CLINIQUE.......................................... 97 I.2.1. Contraintes liées à la dose de doxycycline............................................................................................. 97 I.2.2. Risque de réponse immunitaire contre le transactivateur .................................................................. 101
II. ALTERNATIVES AU SYSTEME TETRACYCLINE ............................................................................ 102
II.1. SYSTEME DE REGULATION PAR LA RAPAMYCINE ..................................................................................... 102 II.2. REGULATION PHYSIOLOGIQUE................................................................................................................. 102 II.3. REGULATION PAR LES PROTEINES EN DOIGT DE ZINC ............................................................................... 104
III. CONTRAINTES ET LIMITATIONS DE L’EXPRESSION DES SHARN.......................................... 106
III.1. RISQUE DE SATURATION DE L’ARNI ...................................................................................................... 106 III.2. RISQUE DE REPONSE IMMUNITAIRE ........................................................................................................ 106 III.3. RISQUE DE TOXICITE .............................................................................................................................. 107
IV. CONTRAINTES LIEES A L’UTILISATION DES VECTEURS LENTIVIRAUX EN VUE D’UNE APPLICATION CLINIQUE............................................................................................................................ 107
V. CONSIDERATIONS ETHIQUES ET AVENIR DE LA THERAPIE GENIQUE ................................ 109
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .......................................................................................... 112
6
LISTES DES ABREVIATIONS
Ψ séquence d’encapsidation
6-OHDA 6-hydroxydopamine
AAV adeno-associated virus
ADA adénosine déaminase
ADN acide désoxyribonucléique
ARN acide ribonucléique
ARNdb ARN double brin
ARNi ARN interférence
BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor
CA capside
CMV cytomégalovirus
CNTF Ciliary Neurotrophic Factor
CPI Complexe de Préintégration
cPPT central Polypurine Tract
DICS Déficit Immunitaire Combiné Sévère
DICS-X1 Déficit Immunitaire Combiné Sévère lié au chromosome X
EcR récepteur de l’ecdysone
ESD Elément de Séquence Distal
ESP Elément de Séquence Proximal
GDNF Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor
GFAP Glial neurofibrillary Acidic Protein
GFP Green Fluorescent Protein
GPx Glutathione Peroxydase
HSV Herpes Simplex Virus
IN intégrase
ITR Inverted Terminal repeat
LTR Long Terminal Repeat
MA matrice
MAlz maladie d’Alzheimer
MH maladie de Huntington
miARN microARN
7
MLV ou Mo-MLV Moloney Murine Leukeamia Virus
MP maladie de Parkinson
NC nucléocapside
NGF Nerve Growth Factor
NLS Nuclear Localisation Sequence (séquence de localisation nucléaire)
PBS primer binding site (amorce de transcription inverse)
PEI polyéthylénimine
PGK Phosphoglycérate Kinase
PPT polypurine tract
PTGS Posttranscriptional Gene Silencing
RISC RNA induced silencing complex
RT rétrotranscriptase
rtTA reverse tetracycline Transactivator
RXRα Récepteur alpha au Rétinoïde X
shARN short hairpin RNA (ARN en épingle à chevux)
siARN small interfering RNA (petit ARN interférent)
SIDA Syndrôme de l’Immunodéficience Acquise
SLA Sclérose Latérale Amyotrophique
SNC Système Nerveux Central
SOD Superoxyde Dismutase
TetO opéron tétracycline
tetR répresseur dépendant de la tétracycline
TGS Transcriptional Gene Silencing
TH Tyrosine Hydroxylase
tTA tetracycline Transactivator
UTR Untranslated Region (région non traduite)
VIH-1 Virus de l’Immunodéficience Humaine de type 1
VSV Vesicular Stomatitis Virus
VSV-G glycoprotéine G de l’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire
WPRE Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptinal Regulatory Elemen
8
Liste des Figures et tableau
Figure 1 : Stratégies de thérapie génique
Figure 2 : a) Structure de l’Herpès simplex Virus de type 1 (HSV1)
b) Représentation schématique du génome de l’Herpès Simplex Virus de type 1
Figure 3 : Structure du génome de l’AAV
Figure 4 : a) Représentation schématique de la structure d’un adénovirus.
b) Structure du génome d’un adénovirus de sérotype 5
Figure 5 : Structure d’un lentivirus : exemple du VIH-1
Figure 6 : Structure du génome du VIH-1
Figure 7 : Phase pré-intégrative du cycle réplicatif du HIV-1
Figure 8 : Mécanisme de rétrotranscription de l’ARN génomique du VIH-1.
Figure 9 : Import nucléaire du provirus, formation du complexe de pré-intégration (CPI)
Figure 10 : Intégration du provirus dans le génome de la cellule hôte
Figure 11 : Plasmides de production des vecteurs lentiviraux pseudotypés avec VSV-G.
Figure 12 : Mécanisme d’intégration site spécifique catalysée par l’intégrase de phage
phiC31
Figure 13 : Schéma du mécanisme de l’ARN interférence
Figure 14 : Structure de la protéine Dicer humaine
Figure 15 : Structure des protéines Argonautes
Figure 16 : a) Structure des pré-miARN lin-4 et let-7
b) Mécanisme d’action des miARN lin-4 et let-7
Figure 17 : Biosynthèse des microARN
Figure 18 : Stratégie d’expression des siARN
Figure 19 : a) Système de régulation suppressible par la tétracycline, “Tet-off”
b) Système de régulation inductible par la tétracycline, “Tet-on”
Figure 20 : Système de régulation par l’ecdysone
Figure 21 : Système de régulation par la mifépristone ou RU486
Figure 22 : Système de régulation par le tamoxifène
Figure 23 : Système de régulation par la rapamycine
Figure 24 : Description des différents types de promoteurs d’ARN polymérase III.
Figure 25 : Structure du promoteur U6 humain
9
Figure 26 : Mécanisme simplifié de transcription à partir d’un promoteur d’ARN
polymérase III
Tableau I : Comparaison des principaux vecteurs de transfert de gène.
Avant Propos
10
AVANT PROPOS
Au cours des vingt dernières années, les progrès conjoints de la biologie moléculaire,
de la biologie cellulaire et de la virologie ont permis la mise au point du transfert de gène,
ouvrant ainsi la voie à une nouvelle stratégie thérapeutique : la thérapie génique. Celle-ci
repose sur le transfert d’un gène thérapeutique dans une cellule ou un tissu cible et peut
avoir différents objectifs : compenser l’absence ou le dysfonctionnement d’un gène, coder
une protéine thérapeutique, ou inhiber un gène par le biais du mécanisme d’ARN
interférence. La thérapie génique peut s’appliquer à des maladies génétiques, mais également
à des pathologies acquises.
D’un point de vue pratique, le gène thérapeutique peut être transféré dans les
cellules sous forme d’ADN nu, associé à des molécules chimiques ou incorporé au sein de
vecteurs dérivés de virus. Des efforts constants sont fournis afin de développer et sécuriser
ce type de vecteurs. Dans un premier temps, le choix du gène thérapeutique (transgène), de
la cible (pour limiter l’expression du transgène au type cellulaire le plus approprié) et du
promoteur (pour assurer une expression durable et/ou tissu spécifique) sont des éléments
indispensables à prendre en compte. Il est ensuite très important de s’affranchir d’éventuels
effets secondaires (cytotoxicité, réponse immunitaire) induits par le vecteur. Enfin, un
élément important pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs en clinique consiste à
réguler l’expression du transgène. Ceci permet d’éteindre l’expression du transgène en cas
d’effets secondaires indésirables, mais également permet de moduler l’expression du gène
thérapeutique en fonction des besoins du patient. Dans ce cadre, notre travail a porté sur la
mise au point de systèmes de régulation de l’expression du gène thérapeutique inductibles
par la tétracycline (Tet-on).
La première partie de mon travail a consisté à incorporer le système “Tet-on” au
sein d’un vecteur lentiviral unique. En effet, jusqu’à présent l’utilisation de ce système de
régulation nécessitait deux vecteurs distincts, l’un codant pour le transactivateur, l’autre
pour le transgène. Dans notre étude, un même vecteur comportant les deux cassettes a
Avant Propos
11
permis l’expression régulée de différents gènes d’intérêt. En particulier, l’expression régulée
de la tyrosine hydroxylase humaine a été validée dans un modèle de la maladie de
Parkinson développé chez le rat. L’incorporation du système “Tet-on” dans un vecteur
lentiviral unique nous a ainsi permis d’améliorer l’efficacité d’expression et de régulation du
gène thérapeutique, et d’apporter un élément de biosécurité supplémentaire pour
l’utilisation de ce type de vecteurs.
La deuxième partie de mon travail a consisté à adapter le système « Tet-on » au
promoteur d’ARN polymérase III afin de réguler l’expression des shARN. En effet, les
systèmes de régulation existants sont adaptés à des promoteurs d’ARN polymérase II et ne
peuvent être directement transposés à la technologie de l’ARN interférence. Dans ce cadre,
les cassettes d’expression du transactivateur et du shARN ont été intégrées dans un seul
vecteur lentiviral. L’expression régulée de la protéine endogène p53 a permis de valider
l’efficacité de ce système. Ces résultats constituent une étape supplémentaire vers une
utilisation sécurisée des shARN en thérapie génique.
Dans ce manuscrit, je présenterai et discuterai l’ensemble de ces travaux de thèse,
après avoir introduit la thérapie génique (en particulier dans le système nerveux central),
l’ARN interférence, ainsi que les différents systèmes de régulations de l’expression d’un
transgène. Enfin, j’aborderai les considérations éthiques que soulève la thérapie génique
avant de conclure, d’un point de vue plus général, sur l’avenir de cette stratégie.
Introduction
12
INTRODUCTION
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
13
I. La thérapie génique dans le système nerveux central
I.1. Le concept de thérapie génique et ses origines
La thérapie génique recouvre toute approche visant à prévenir ou à traiter une
maladie par transfert de matériel génétique. Initialement imaginé pour les maladies
génétiques, le transfert de gène est désormais envisagé pour de nombreuses pathologies
innées ou acquises. Le traitement consiste à exprimer un gène, qui code une protéine
thérapeutique, ou une séquence nucléotidique. Deux stratégies sont envisagées pour
introduire un gène thérapeutique (transgène) dans les cellules de l’individu : la thérapie
génique ex vivo et la thérapie génique in vivo. La première méthode (figure 1) consiste en la
greffe (préférentiellement l’autogreffe) de cellules génétiquement modifiées en culture. Le
principe est de récupérer des cellules du malade à traiter, de les cultiver, et d’y transférer le
gène thérapeutique. Ces cellules sont ensuite réintroduites chez le malade. La seconde
approche (figure 1) est fondée sur l’introduction in vivo du gène thérapeutique dans la
circulation sanguine, ou directement au sein du tissu cible, conférant ainsi directement aux
cellules du malade la propriété de synthétiser le facteur thérapeutique (Kirschtein and
Skirboll, 2001).
La thérapie génique a bénéficié de l’essor de la biologie moléculaire à la fin des
années soixante. En 1966, Edward Tatum et Joshua Lederberg avaient émis pour la
première fois la possibilité de la manipulation des gènes chez l’homme (Tatum, 1966). La
première preuve expérimentale fût apportée par Paul Berg en 1972, qui tira profit du virus
recombinant dérivé du virus simien, SV40 pour transférer du matériel génétique exogène
dans des cellules de mammifères (Jackson et al., 1972). La découverte de matériel génétique
d’origine virale au sein du génome de cellules transformées par des virus oncogènes,
papovavirus et rétrovirus a ouvert la voie au transfert de gène (Sambrook et al., 1968; Hill
and Hillova, 1972). Des lors, les progrès conjoints de la biologie moléculaire, de la biologie
cellulaire et de la virologie ont rendu possible le transfert de gène thérapeutique dans les
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
14
cellules somatiques chez l’homme pour restaurer une fonction cellulaire déficiente
(Friedmann and Roblin, 1972).
Le premier essai clinique de thérapie génique fut réalisé par Martin Cline en 1980
chez deux patientes atteintes de β-thalassémie grâce à une approche ex vivo. Des cellules de
moelle osseuse génétiquement modifiées in vitro par un plasmide codant la β-globine
humaine ont été injectées dans la circulation sanguine. Cette tentative prématurée ne donna
pas de résultats probants (Wade, 1981). Les conditions éthiques insatisfaisantes dans
lesquelles cet essai a été réalisé ont conduit le RAC (Recombinant Advisory Committee) à
édicter en 1985 une charte soumettant les tentatives de transfert de gène chez l’homme à
une réglementation très stricte et la mise en place d’une commission, le HGTS (Human
Gene Therapy Subcommittee) chargée d’en évaluer la sécurité et l’acceptabilité éthique.
Cette réglementation, initialement mise en place aux Etats-Unis, fut adoptée par la
communauté internationale.
Les premiers essais de thérapie génique réalisés en accord avec les règles édictées par
le RAC ont débuté en 1990 et concernent une maladie immunitaire grave, le déficit
immunitaire combiné sévère (DICS). Deux équipes, l’une américaine et l’autre italienne ont
conduit en parallèle un essai de thérapie génique contre la forme de DICS causée par un
déficit en adénosine déaminase (ADA). La première équipe aux Etats-Unis a engagé un essai
sur deux petites filles de 4 et 9 ans (Blaese et al., 1995). Pendant deux ans, ces deux patientes
ont reçu des autogreffes de lymphocytes T modifiés à l’aide d’un vecteur rétroviral codant
l’ADA humaine. L’état d’une des deux patientes s’est amélioré nettement après cette
intervention. Cinq et dix ans après l’intervention, ses lymphocytes T produisaient encore
l’ADA (Blaese et al., 1995; Mullen et al., 1996; Muul et al., 2003). En revanche, l’autre
enfant a développé des anticorps dirigés contre les protéines contenues dans le sérum de
veau foetal utilisé lors de la culture des lymphocytes T, mais également des anticorps dirigés
contre l’enveloppe rétrovirale qui ont persistés pendant toute l’étude, aboutissant à un rejet
des cellules greffées (Muul et al., 2003). En parallèle, l’équipe de Claudio Bordignon à
Milan, a réalisé un autre protocole de thérapie génique ex vivo. Les précurseurs médullaires
CD34+ des enfants atteints d’ADA-DICS ont été modifiés à l’aide de vecteurs rétroviraux
murins codant l’ADA humaine et réinjectés dans la moelle osseuse (Bordignon et al., 1995).
Cependant, l’efficacité de ce traitement se révéla transitoire, en raison de la faible
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
15
proportion de cellules transduites greffées (Bordignon et al., 1995). L’augmentation du
nombre de cellules exprimant le transgène greffées, a permis de restaurer les fonctions
immunitaires des enfants traités (Aiuti et al., 2002). Ces résultats constitutent une étape
importante dans le traitement des patients atteints d’ADA-SCID. Dans le même temps,
L’équipe d’Alain Fischer en France (Cavazzana-Calvo et al., 2000) et celle de Thrasher au
Royaume-Uni (Howe and Thrasher, 2003) ont mené avec succès un essai clinique pour une
autre forme de DICS, le DICS lié au chromosome X (DICS-X1). Les enfants souffrant de
cette maladie présentaient des mutations du gène codant la sous unité γc, commune à
plusieurs récepteurs de cytokines, conduisant à un défaut complet de développement des
lymphocytes T et des cellules « natural killer ». En l’absence de greffe de moelle osseuse
allogénique, la maladie est létale au cours de la première année de vie, ce qui nécessite le
confinement des patients dans un environnement stérile (Cavazzana-Calvo et al., 2005). Dix
patients pour la première étude et quatre pour la deuxième ont été traités par transfert ex
vivo du gène γc dans leurs précurseurs médullaires CD34+ à l’aide d’un vecteur rétroviral
murin. Une correction stable du déficit immunitaire a été obtenue chez sept et quatre des
patients avec un recul de plus de cinq ans pour les essais les plus anciens (Cavazzana-Calvo
et al., 2000; Hacein-Bey-Abina et al., 2002). Toutefois, la survenue dans l’essai d’Alain
Fischer, près de trois ans après le traitement d’une prolifération clonale de lymphocytes T
chez trois des enfants traités pour DICS-X1 a soulevé la question des risques inhérents à
cette approche (Hacein-Bey-Abina et al., 2003a). Chez deux patients, c’est un événement de
mutagenèse insertionnelle survenu au sein du locus du même proto-oncogène, LMO-2, qui
est responsable de la prolifération anarchique des lymphocyte T. L’insertion du provirus
dans le premier intron dans l’un des cas, et à proximité du promoteur dans l’autre, a
provoqué un effet enhancer du LTR (Long Terminal Repeat) viral sur la transcription du
gène LMO-2 (Hacein-Bey-Abina et al., 2003b). Chez le troisième enfant, le gène LMO-2 ne
semble pas être impliqué dans la prolifération clonale (Kaiser, 2005). Cependant, plusieurs
sites d’intégrations semblent être impliqués dans cette lymphoprolifération (Hacein-Bey-
Abina et al., 2006). Des études complémentaires sont nécessaires pour comprendre la
génotoxicité du rétrovirus dans les cellules hématopoïétiques. Toutefois, les travaux de
l’équipe d’Alain Fischer et d’Adrian Thrasher ont démontrés l’efficacité thérapeutique du
transfert de gène et ont mis en évidence les problèmes soulevés par cette approche. Ceci
nécessite de revoir le rapport bénéfice/risque pour chaque pathologie, mais également de
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
16
mettre en place des méthodes thérapeutiques plus efficaces qui passent par le
développement d’outils de transfert de gène plus performants et plus sûrs.
I.2. Les outils de transfert de gènes
Comme nous l’avons vu précédemment, la thérapie génique consiste à introduire un
gène d’intérêt thérapeutique au sein d’une cellule ou d’un tissu cible. Ce gène peut être
transféré sous forme d’ADN nu, complexé à des molécules chimiques ou intégré au sein de
vecteurs dérivés de virus.
Plusieurs types de vecteurs sont aujoud’hui disponibles. Ces vecteurs sont regroupés
en deux catégories, les vecteurs non viraux (ou vecteurs synthétiques) et les vecteurs viraux.
Le choix de l’un ou l’autre de ces vecteurs est basé sur différents critères : la taille et le type
du gène thérapeutique, la cellule dans laquelle l’expression du transgène est ciblée ainsi que
la durée et le contrôle de l’expression du transgène. Il est également nécessaire de réduire au
maximum toute toxicité (cytotoxicité ou réponse immunitaire) induite par le vecteur.
I.2.1. Les vecteurs non-viraux ou vecteurs synthétiques
Les vecteurs non-viraux sont constitués d’ADN nu, d’ADN complexé à des
polymères cationiques comme la poly-lysine, ou à des lipides cationiques pour permettre le
passage de l’ADN à travers la membrane cellulaire (Park et al., 2006). Leur avantage par
rapport aux vecteurs viraux est d’assurer une plus grande sécurité, d’être synthétisés plus
aisément à grande échelle et de pouvoir, en théorie, transférer des séquences d’ADN de plus
grande taille.
L’ADN nu peut être transferé dans un tissu ou un organe par injection directe
(Wolff et al., 1990; Schwartz et al., 1996), par électrotransfert (ou électroporation) (Kreiss et
al., 1999; Gehl, 2003), projeté dans les tissus à l’aide d’un pistolet à ADN (Jiao et al., 1993)
ou encore via la circulation sanguine (Zhang et al., 1999). Cette dernière approche, bien que
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
17
séduisante, s’est révélée très peu efficace en raison de la dégradation très rapide de l’ADN
nu (Mahato, 1999) et d’une demi-vie plasmatique très courte (Houk et al., 2001). Vu son
inocuité, le transfert d’ADN nu exprimant le VEGF (vascular endothelial growth factor) a
d’ores et déjà été utilisé chez l’homme dans le cadre des affections vasculaires pour
promouvoir la revascularisation (Rauh et al., 2001). L’injection directe d’ADN nu dans le
muscle n’a pas permis d’obtenir un niveau d’expression suffisant pour induire un effet
thérapeutique (Davis et al., 1993). C’est pourquoi, afin d’augmenter l’efficacité de
transfection (in vitro ou in vivo), l’administration d’ADN nu est généralement associée à
des méthodes chimiques (complexes cationiques), ou bien à des méthodes physiques
(microinjection, électrotransfert…) (Trollet et al., 2006). Des progrès tangibles ont été
obtenus après élecrotransfert d’ADN dans le muscle squelettique où une expression à long
terme (plus d’un an) du transgène a été obtenue (Bigey et al., 2002; Deleuze et al., 2002).
L’association de l’ADN avec des polymères cationiques comme la poly(L-lysine)
(Ward et al., 2001), le polyéthylénimine (PEI) (Lungwitz et al., 2005), ou des polymères
lipidiques cationiques, forme des complexes chargés positivement, qui permettent de
condenser l’ADN et de favoriser son passage à travers la membrane cellulaire (Hirko et al.,
2003). L’utilisation de ce type de vecteurs s’est révélée particulièrement efficace in vivo et
notamment dans le système nerveux central (SNC) (Abdallah et al., 1996; Li et al., 2004).
Toutefois, l’injection intracérébrale d’ADN à l’aide de liposomes a une efficacité limitée
quant à la stabilité de l’ADN et à l’expression du transgène (Kofler et al., 1998). Ce
rendement a pu être amélioré par l’injection continue à l’aide d’une pompe osmotique
(Imaoka et al., 1998; Hadaczek et al., 2006). Cependant, les risques d’infections limitent
l’utilisation clinique de cette approche. Pour franchir cette limite, le gène d’intérêt peut être
apporté dans le CNS par l’utilisation de liposomes protégés par du polyéthylène glycol et
couplés avec des anticorps, comme l’anticorps OX26 qui reconnaît le récepteur à la
transferrine de rat (Pardridge, 2002). L’injection systémique de ces complexes liposomes-
anticorps, permet le passage de la barrière hématoencéphalique, via la reconnaissance du
récepteur transferrine, et le ciblage des cellules neurales. En dépit du fait que cette
méthodologie permet une expression du transgène dans les cellules de l’ensemble du
système nerveux central, elle n’offre pas la possibilité d’une expression durable, localisée et
cellule spécifique du transgène.
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
18
Bien que l’efficacité de ces techniques s’améliorent quotidiennement, leur application au
système nerveux central reste encore limitée et nécessite un développement accru avant de
supplanter l’emploi des vecteurs viraux.
I.2.2. Les vecteurs viraux
Les vecteurs viraux, qui utilisent les propriétés des virus à transférer leur matériel
génétique dans les cellules, sont particulièrement intérressants. Dans le cadre de ce travail,
nos efforts se sont portés sur l’utilisation des vecteurs lentiviraux dérivés du HIV-1. Nous
porterons une attention particulière aux vecteurs HIV-1, et une description plus succincte
sera faite des autres types de vecteurs. Pour la compréhension des paragraphes suivants, il
est important de distinguer les notions d’infection et de transduction. L’infection désigne
l’accomplissement d’un cycle réplicatif complet. En revanche, la transduction désigne
l’entrée d’un vecteur viral et l’expression du transgène dans une cellule.
La plus grande partie des approches de thérapie génique expérimentale et clinique est
basée sur l’utilisation des vecteurs de transfert de gène dérivés des virus. Les virus sont des
agents infectieux qui ne peuvent se multiplier qu’à l’intérieur des cellules qu’ils ont
infectées. Ils utilisent la machinerie transcriptionnelle de la cellule à leur propre fin pour se
répliquer et produire les protéines virales dont ils ont besoin. Les virions ainsi produits
sont libérés hors de la cellule et peuvent à leur tour infecter d’autres cellules. Un vecteur
viral de thérapie génique utilise les propriétés infectieuses du virus, c’est-à dire sa capacité à
introduire son matériel génétique dans une cellule, mais les séquences responsables de la
réplication sont remplacées par le transgène. Le virus devient alors non réplicatif.
Cependant, pour certaines applications, et notamment pour une thérapie génique du
cancer, certains vecteurs réplicatifs sont également développés (Galanis et al., 2001).
Quatre principaux types de vecteurs viraux sont utilisés à l’heure actuelle : les vecteurs
dérivés des Adénovirus, des virus associés aux adénovirus (AAV), des virus de l’Herpès, et
des rétrovirus, parmi lesquels les lentivirus (Tableau I).
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
19
I.2.2.1. Les Herpès virus (HSV)
Les Herpès virus sont des virus enveloppés à ADN double brin linéaire de 152 kb
(figure 2a (Todar, 2006)). Les virus de la famille « Herpes Simplex Virus » (HSV) sont
naturellement neurotropes, mais ils ont la capacité d’infecter une large gamme de cellules.
L’entrée du virus dans l’organisme se fait généralement en périphérie par les muqueuses ou
la peau. Le virus est ensuite transporté de façon antérograde et rétrograde le long des axones
et va s’établir durablement dans les neurones à l’état latent (Chiocca et al., 1990; Yamamura
et al., 2000). Le virus traverse de manière sélective la synapse, mais peut occasionellement
provoquer la lyse de la cellule infectée (Norgren and Lehman, 1998). Sous l’effet de certains
stimuli, des épisodes de réactivation apparaissent, caractérisés par une nouvelle phase de
production et d’excrétion virale.
Afin d’exploiter leur grande capacité de clonage (de l’ordre de 150 kb) et leur
capacité à atteindre un corps neuronal après inoculation périphérique, deux types de
vecteurs dérivés des HSV ont été développés : les amplicons (Saeki et al., 1998) et les
vecteurs défectifs pour la réplication (Lilley et al., 2001).
Les amplicons ne conservent du virus que les séquences cis-actives qui permettent la
réplication et l’encapsidation du vecteur contenant le transgène (figure 2b (Frampton et al.,
2005)) . Ces vecteurs sont produits à l’aide de vecteurs helpers ou transcomplémentants qui
fournissent en trans tous les gènes de structure et de régulation nécessaires (Frenkel et al.,
1994). Afin d’éviter la contamination de virus helper dans les stocks, les plasmides
amplicons sont amplifiés à l’aide d’un génome HSV dépourvu de séquences
d’encapsidation, et intégré soit dans un chromosome artificiel bactérien (Saeki et al., 1998)
soit dans une série de cinq cosmides (Fraefel et al., 1996). De cette façon, les gènes viraux
exprimés en trans sont dépourvus de signaux d’encapsidation ce qui réduit la fréquence
d’apparition de virus helper, due à l’absence d’homologie de séquence entre amplicons et
séquences transcomplémentantes. Plus récemment, l’utilisation d’un système cre-loxP a
permis d’améliorer considérablement les titres des stocks viraux d’amplicons en réduisant le
taux de contamination par le virus auxilliaire (Logvinoff and Epstein, 2001; Zaupa et al.,
2003).
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
20
Les vecteurs HSV défectifs pour la réplication sont mutés ou délétés du maximum
de gènes viraux (Palmer et al., 2000; Lilley et al., 2001). Leur production se fait à partir de
cellules qui possèdent les gènes capables de compléter en trans les fonctions manquantes.
Les dernières versions de ce type de vecteurs sont délétées de nombreux gènes précoces.
L’expression du transgène est controlée par un promoteur contenant des éléments de
régulation de l’expression de transcrits associés à la latence du virus (Lilley et al., 2001), ou
sous contrôle d’autres promoteurs (promoteur CMV « cytomégalovirus » ou promoteur
NSE « neuron-specific-enolase »). Dans ce cas, la cassette d’expression est placée à une
distance appropriée de la région transcrite au cours de la période de latence (Palmer et al.,
2000).
L’utilisation potentielle des vecteurs dérivés de HSV en clinique est actuellement
remise en cause, d’une part à cause de la cytotoxicité du virus auxiliaire dans le cas de
vecteurs HSV-amplicons ou bien de l’expression des gènes viraux dans celui des vecteurs
recombinants (Bowers et al., 2003). D’autre part, l’incapacité de ces vecteurs à exprimer des
transgènes pendant la phase de latence limite leur utilisation. De plus, comme 70 à 95 % des
hommes sont porteur du virus HSV-1, l’administration d’un vecteur herpétique pourrait
réactiver le virus sauvage et provoquer une encéphalite chez les patients traités (Mammette,
2002).
I.2.2.2. Les Virus Associés aux Adénovirus (AAV)
Le virus AAV est un parvovirus de petite taille (20 à 25 nm), non enveloppé et à
ADN simple brin de 4,7 kb. Son génome code pour trois protéines de capside (Cap) et
quatre protéines de réplication (Rep), impliquées dans la réplication et la régulation en trans
de l’expression des gènes. Ces régions sont encadrées par des séquences de 145 pb appelées
ITR (Inverted Terminal Repeat), nécessaires en cis pour la réplication et l’assemblage des
particules virales (figure 3 (Vasileva and Jessberger, 2005)). Ce virus nécessite pour sa
réplication l’aide de virus auxilliaires tels que l’adénovirus, l’herpès ou le virus de la vaccine
(Hoggan et al., 1966; Lai et al., 2002).
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
21
En l’absence de virus auxiliaires, l’AAV sauvage s’intègre préférentiellement dans un locus
spécifique du chromosome 19 humain, AAVS1 en position q13.3-qter (Kotin et al., 1990;
Kotin et al., 1992; Berns and Giraud, 1996; Linden et al., 1996).
La première preuve expérimentale d’utilisation des AAV comme vecteurs de
transfert de gène a été apportée en 1984 (Hermonat and Muzyczka, 1984). Les premiers
vecteurs utilisés ont gardé leur capacité de s’intégrer dans le chromosome 19 (Shelling and
Smith, 1994), mais leurs faibles capacités de clonage ont limité leur utilisation. La
suppression de la totalité de leurs séquences virales à l’exception des ITR a permis
d’augmenter leurs capacités de clonage (jusqu’à 4,6 kb), mais également de s’affranchir de
l’effet inhibiteur exercé par la région rep sur l’expression des gènes (Pereira et al., 1997). La
question de l’intégration du vecteur AAV est toujours débattue à l’heure actuelle. Dans
certains types cellulaires (cellules épithéliales et cellules musculaires), les vecteurs AAV
restent majoritairement sous forme épisomales (Kearns et al., 1996; Duan et al., 1999), ce
qui limite les risques de mutagenèse insertionnelle et l’activation d’oncogènes (Tenenbaum
et al., 2003). Toutefois, ces vecteurs peuvent s’intègrer de façon aléatoire dans le génome de
la cellule en prolifération (Rutledge and Russell, 1997) ou quiescente (Du et al., 1996; Wu et
al., 1998). L’intégration semble être favorisée à proximité de séquences régulatrices de gènes
(Miller et al., 2002; Nakai et al., 2003; Miller et al., 2005a), induisant des réarrangements
chromosomiques comme des délétions ou des translocations, avec comme conséquence le
risque de perturber l’expression des gènes (Nakai et al., 2005).
Les vecteurs AAV se sont révélés efficaces pour transduire des neurones (Kaplitt et
al., 1994). Ils ont été utilisés avec succès dans des modèles animaux de maladie de Parkinson
(MP)(Bjorklund et al., 2000; Muramatsu et al., 2002; Wang et al., 2002; Li et al., 2006), de la
maladie de Huntington (MH)(McBride et al., 2003; Kells et al., 2004; Xia et al., 2004), ou de
lésions de la moelle (Lu et al., 2003; Ruitenberg et al., 2004). De plus, ces vecteurs ont
montré une absence de toxicité après une (Chamberlin et al., 1998) ou plusieurs injections
(Mastakov et al., 2002) dans le cerveau. Toutefois, une réponse humorale dirigée contre la
capside après une première injection de virus recombinants a été rapportée, dans ces
modèles (Manning et al., 1998; Sabatino et al., 2005) ou chez des animaux naturellement
préimmunisés (Gao et al., 2003; Zaiss and Muruve, 2005). La présence chez l’homme
d’anticorps circulants dirigés contre l’AAV sauvage peut compromettre l’injection répétée
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
22
de vecteur AAV (Chirmule et al., 2000). En effet, le sérotype le plus répandu dans la
population est l’AAV-2 qui est également celui le plus utilisé comme vecteur de transfert de
gène (Chirmule et al., 1999; Moskalenko et al., 2000). Une solution serait d’utiliser l’un des
8 sérotypes différents (Grimm and Kay, 2003; Wu et al., 2006), des sérotypes non-humains
(Gao et al., 2003) ou des AAV chimériques combinant deux sérotypes (Bowles et al., 2003).
Dans ce sens, une étude a montrée que des anticorps neutralisants dirigés contre chaque
sérotype ne réagissaient pas ou peu de manière croisée après administration musculaire
(Riviere et al., 2006).
I.2.2.3. Les adénovirus
Les adénovirus ont été mis en évidence en 1953 par Rowe à partir de tissus
d’amygdales et de végétations prélevés sur des enfants (Rowe et al., 1953). Aujourd’hui, 51
sérotypes humains ont été mis en évidence (De Jong et al., 1999; Ebner et al., 2006). Les
adénovirus sont des virus à ADN double brin de 36 kb et d’environ 80 nm de diamètre. Ce
sont des virus dépourvus d’enveloppe mais entourés d’une capside icosaédrique (figure 4a,
(Russell, 2000)). Le génome se compose d’unités de transcriptions précoces (E1-E4),
intermédiaires (IX, IVa2) et tardives (MLTU, Major Late Transcription Unit), ainsi que des
éléments non codants nécessaires en cis pour la propagation et l’assemblage du virus. La
séquence Ψ et les séquences ITR qui servent d’origine de réplication, se trouvent aux
extrémités du génome (figure 4b).
Les vecteurs adénoviraux utilisés comme vecteurs de transfert de gène sont dérivés
des adénovirus de sérotype 2 ou 5 du groupe C. Le génome viral reste épisomal, ce qui
entraîne une expression transitoire dans les cellules en division, mais une expression
prolongée du transgène est observée dans les cellules quiescentes. On distingue des vecteurs
de « première génération », délétés des régions E1 et éventuellement E3, des vecteurs de
« deuxième génération » qui comportent une mutation supplémentaire dans E2, et des
vecteurs de « troisième génération » délétés de E4 en plus de E1 et éventuellement E3. Les
derniers nés des vecteurs adénoviraux sont dits vecteurs “gutless” et sont délétés de la
totalité des gènes viraux à l’exception des séquences ITR et de la séquence d’encapsidation.
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
23
Les vecteurs adénoviraux “gutless” sont produits dans des cellules 293 en présence d’un
virus auxiliaire capable d’apporter en trans les facteurs nécessaires à leur réplication et leur
encapsidation. Chez l’animal, les vecteurs adénoviraux présentent un large tropisme
cellulaire et se sont révélés efficaces dans le SNC (Le Gal La Salle et al., 1993; Horellou et
al., 1994; Mallet et al., 1994). De plus, ils ont la capacité d’être transporté de façon
rétrograde le long de l’axone (Ridoux et al., 1994; Ghadge et al., 1995). La forte
inflammation (Byrnes et al., 1995) induite par la première génération de vecteurs
adénoviraux a été réduite par l’utilisation des vecteurs « gutless » (Mitani et al., 1995). Ce
dernier type de vecteur permet une expression à long terme du transgène dans le cerveau
(Thomas et al., 2000). Chez l’homme, l’utilisation de ces vecteurs peut être entravée par la
présence d’anticorps neutralisants produits suite à une primo-infection par un adénovirus
sauvage. Cette limite peut être dépassée par l’utilisation de vecteurs adénoviraux non
humains (canins par exemple) (Klonjkowski et al., 1997). Une deuxième limitation à
l’utilisation de ces vecteurs est liée à la présence de virus auxiliaires contaminants (de l’ordre
de 0,01 à 1% des particules virales totales) (Logvinoff and Epstein, 2001; Sakhuja et al.,
2003). Ceci demeure un point faible qu’il faudra résoudre en vue d’une application clinique
de ces vecteurs.
I.2.2.4. Les lentivirus
I.2.2.4.1. structure
Les lentivirus (ou virus lents) appartiennent à la famille des rétrovirus qui se
caractérisent par un génome composé de deux molécules d’ARN à polarité positive. Lors
du cycle d’infection, cet ARN est rétrotranscrit en ADN, formant ainsi le génome proviral.
Celui-ci s’intègre alors dans le génome de la cellule hôte et utilise sa machinerie cellulaire
pour former de nouveaux virions qui sont libérés par bourgeonnement hors de la cellule.
D’un point de vue structural, les virions sont des particules sphériques enveloppées, d’un
diamètre de 80 à 120 nm, présentant un “core” (ou nucléocapside) interne, qui protège le
génome (figure 5, (Goldschmidt, 2004)).
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
24
Comme tous les rétrovirus, les lentivirus contiennent les gènes de structures gag, pro, pol et
env. Le gène gag code les protéines MA (matrice intramembranaire), CA (capside, qui
protège le core) et NC (nucléocapside formant le core qui protège le gènome viral). Le gène
pro est imbriqué dans les gènes gag ou pol et code la protéine PR (protéase responsable du
clivage des produits des gènes gag et pol). Le gène pol code les deux enzymes nécessaires au
cycle de réplication du virus : la rétrotranscriptase (RT) qui permet de convertir le génome
ARN en ADN et possède en plus une activité RNAseH nécessaire au cycle de
rétrotranscription, et l’intégrase (IN) nécessaire à l’intégration du génome proviral dans le
génome de la cellule hôte. Enfin, le gène env est essentiel pour la liaison du virus et son
entrée dans la cellule hôte. Il code deux sous unités protéiques de l’enveloppe : SU
(glycoprotéine de surface externe, gp120) et TM (protéine transmembranaire, composant
interne de la glycoprotéine de l’enveloppe, gp41). La glycoprotéine de surface est nécessaire
pour la liaison aux récepteurs cellulaires, alors que la glycoprotéine transmembranaire est
responsable de la fusion avec la membrane cellulaire (Coffin, 1996) (exemple du VIH-1,
figure 6).
En plus des gènes de structures, les lentivirus contiennent également des gènes
accessoires et de régulation nécessaires à l’expression des gènes viraux, à l’assemblage des
particules virales et aux pouvoirs pathogènes des virus.
Le génome des rétrovirus est formé de deux molécules d’ARN polyadénylées et
coiffées, de 7 à 12 kb de longueur. Chez tous les rétrovirus, les extrémités du génome viral
sont composés de séquences non codantes constitué par :
- La séquence R : séquence répétée à chaque extrémité du génome, indispensable à la
transcription inverse pour assurer un transfert correct des chaînes en cours de synthèse. Le
site d’initiation de la transcription se situe en 5’ de cette séquence. En 5’, cette séquence est
coiffée, alors que celle en 3’ est polyadénylée.
- La séquence U5 : située en 5’ du génome entre R et le site de fixation de la
première amorce de la transcription inverse (PBS). Elle forme l’extrémité 3’ du génome
proviral. L’extrémité 3’ contient un des sites att nécessaires au génome proviral.
- La séquence L, dite région “leader” : située entre PBS et le codon d’initiation de la
traduction du gène gag. Elle contient le premier signal d’épissage commun aux messagers
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
25
viraux ainsi que les signaux spécifiques pour l’encapsidation du génome viral dans le virion
(la séquence Ψ).
- La séquence PPT (Polypurine Tract) : séquence riche en A/G, nécessaire à la
synthèse du brin positif d’ADN durant la rétrotranscription. Chez les lentivirus, cette
séquence est aussi présente en position centrale dans le génome et est appelée central
polypurine tract ou cPPT.
- La séquence U3 : séquence unique en 3’ située entre le PPT et R. Elle contient les
signaux de régulation de l’expression virale mais aussi le signal de polyadénylation chez la
plupart des rétrovirus. Elle porte également à son extrémité 3’, une séquence att, nécessaire
à l’intégration.
La duplication des séquences U3 et U5 lors de la rétrotranscription forme, avec la séquence
R aux extrémités du génome proviral, le LTR (Long Terminal Repeat) (figure 6).
Les lentivirus sont constitués de 8 espèces de virus actuellement répertoriés (Büchen-
Osmond, 2006), mais le plus connu et le plus étudié est le virus de l’immunodéficience
humaine (VIH-1) (figure 5).
Le VIH est responsable d’une maladie chronique à évolution lente : le syndrôme de
l’immunodéficience acquise ou SIDA. Le VIH se caractérise par la présence de plusieurs
gènes accessoires : vif, vpr, vpu, nef, tat et rev. Seules les protéines Tat et Rev sont
indispensables au cycle viral.
- La protéine Tat augmente l’initiation de la transcription des gènes viraux à partir
du LTR viral et l’efficacité d’élongation des ARN transcrits.
- La protéine Rev est un transactivateur post-transcriptionnel qui permet l’export
nucléaire de l’ARN viral non épissé.
- La protéine Vpr (protéine Virale R) joue un rôle dans l’import nucléaire du
complexe de pré-intégration et diminue le taux de mutations au cours de la
rétrotranscription (Mansky et al., 2000; Chen et al., 2004). De plus, elle conduit à l’arrêt du
cycle cellulaire en phase G2 (Goh et al., 1998) et augmente l’activité des promoteurs
transcriptionnels et ainsi la production virale (Wang et al., 1995; Agostini et al., 1996).
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
26
- La protéine Nef (Facteur Négatif), contrairement à son nom, agit comme un
facteur positif en augmentant la réplication virale et l’infectivité (Schiavoni et al., 2004;
Witte et al., 2004).
- La protéine Vif (Facteur d’Infectivité Virale) joue un rôle important dans la
pathogénicité du virus. Vif interagit spécifiquement avec l’ARN viral (Dettenhofer et al.,
2000; Zhang et al., 2000; Khan et al., 2001) et les précurseurs protéiques Gag ou Gag-Pol
(Huvent et al., 1998) ce qui permet son encapsidation au sein d’un complexe
nucléoprotéique. Enfin, Vif pourrait également jouer un rôle dans la stabilisation du core
du virus (Hoglund et al., 1994; Ohagen and Gabuzda, 2000).
- La protéine Vpu régule négativement l’expression membranaire du récepteur CD4
(Chen et al., 1993). Elle favorise le relarguage des virions (Gottlinger et al., 1993).
I.2.2.4.2. Cycle réplicatif des lentivirus : cas du VIH-1
Dans le cadre de ce manuscrit, seul le cycle réplicatif du VIH-1, qui est à l’origine du
vecteur lentiviral que nous avons utilisé pour notre étude sera présenté. Toutefois, le cycle
de vie du VIH-1 est similaire à celui de tous les membres du genre des lentivirus.
Le VIH-1 infecte en priorité les lymphocytes CD4+, mais d’autres cellules du système
immunitaire peuvent être atteintes, notamment les monocytes/macrophages, les cellules
dendritiques, ainsi que les cellules des systèmes lymphatique, hématopoïétique et nerveux.
Le cycle réplicatif du VIH-1 se divise en deux phases principales :
a) Une phase dite pré-intégrative, qui débute par la reconnaissance de la cellule hôte,
l’entrée du virus et sa décapsidation, puis se poursuit par l’étape de rétrotranscription,
d’import nucléaire du génome viral et se termine par l’intégration de l’ADN proviral. Ces
étapes sont principalement réalisées par les protéines virales présentes dans le virion.
b) Une phase post-intégrative, qui débute par l’étape de transcription du provirus intégré,
puis la traduction des protéines virales, l’assemblage et la maturation du virion et enfin par
le bourgeonnement des particules virales. Au cours de cette phase, le virus détourne la
machinerie de transcription, d’épissage, de transport et de traduction de la cellule par
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
27
l’action de certaines protéines virales comme Tat et Rev pour effectuer sa propre
réplication.
a) La phase pré-intégrative (figure 7 (Didierjean, 2005))
a.1. Entrée du virus dans la cellule hôte
L’entrée du virus et la libération de son matériel génétique dans la cellule cible
nécessitent trois étapes (Cooley and Lewin, 2003):
- L’entrée est initiée par la fixation du virus à la cellule cible via la reconnaissance spécifique
entre la glycoprotéine d’enveloppe gp120 et le récepteur cellulaire CD4 (Dalgleish et al.,
1984; Maddon et al., 1986). Cette interaction induit le changement conformationnel de la
protéine virale gp120 qui permet ainsi un attachement sélectif au co-récepteur de la cellule
cible.
- L’association du complexe gp120/CD4 au co-récepteur libère le peptide de fusion de la
protéine virale gp41. L’insertion de ce peptide dans la membrane plasmique de la cellule
hôte facilite le rapprochement et la fusion des membranes cellulaire et virale. Deux types de
co-récepteurs sont impliqués dans l’entrée du virus : CXCR-4 et CCR5 (récepteurs aux
chimiokines) (Zaitseva et al., 1997).
- La fusion des deux membranes est suivie par l’entrée de la capside dans la cellule infectée.
Il est à noter que les vecteurs dérivés du VIH-1 sont généralement pseudotypés par une
enveloppe appartenant à un autre virus. L’entrée du vecteur dans la cellule hôte sera par
conséquent conditionnée au type d’enveloppe utilisée.
a.2. Etape de décapsidation et de rétrotranscription
La fusion entre les membranes virales et cellulaires entraîne l’entrée du virus
encapsidé à l’intérieur du cytoplasme. Le virus subit ensuite une étape de “décapsidation”
qui conduit à la libération du complexe viral nucléoprotéique : le complexe de
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
28
rétrotranscription. La cyclophiline A, présente dans les particules virales et associée au
“core”, jouerait un rôle dans le processus de décapsidation (Aiken, 1997). Le complexe de
rétrotranscription est composé de l’ARN génomique viral, l’ARNt3Lys, et de différentes
protéines virales et cellulaires.
La synthèse de l’ADN proviral double brin (ou provirus) à partir de l’ARN viral (servant
de matrice) et de l’ARNt3Lys (utilisé comme amorce) est réalisée au cours de l’étape nommée
rétrotranscription, sous l’action de la RT virale.
a.3. Etape de rétrotranscription ou synthèse du provirus (figure 8 (Goldschmidt,
2004)).
La rétrotranscription est une étape clé du cycle réplicatif de HIV-1 qui s’effectue
selon un processus schématisé dans la figure 8. L’initiation de la rétrotranscription débute
par la fixation de l’ARNt3Lys par sa partie 3’-terminale sur la séquence PBS, située en aval de
la région U5 du LTR 5’. Orchestré par la RT, la synthèse du brin (-) d’ADN démarre à
l’extrémité 3’ de l’ARNt et se poursuit jusqu’à l’extrémité 5’ de l’ARN viral. Cette petite
séquence d’ADN néosynthétisée va ensuite s’apparier à la séquence R en 3’ et servir
d’amorce pour la rétrotranscription du brin (-). Simultanément, la RT (via son activité
RNase H) détruit la matrice ARN au fur et à mesure que progresse la rétrotranscription.
Seuls les hétéroduplex ARN/ADN correspondant aux séquences des PPT central et 3’
résistent à la dégradation par la RNase H et permettent l’intitiation de l’étape suivante. La
synthèse du second brin d’ADN (+) est amorcée en deux points d’initiation de la
rétrotranscription. Elle s’effectue à la fois à partir du PPT3’ mais également à partir du PPT
central (cPPT). Le fragment d’ADN initié au PPT3’ est synthétisé jusqu’au PBS3’. Ce
fragment d’ADN synthétisé subit alors un saut de brin et s’apparie avec le PBS5’. A ce
niveau se poursuit la synthèse d’ADN jusqu’au CTS central. Au même moment, un
fragment d’ADN de brin (+) est synthétisé depuis le cPPT jusqu’au PBS 3’. Ces doubles
étapes d’élongation conduisent à la double synthèse de la séquence comprise entre le cPPT
et le CTS, permettant la formation d’une structure ADN à trois brins sur 99 nucléotides
dénommée ADN « flap » central ou triplex central. Cette structure conditionne la
translocation nucléaire du génome viral (Zennou et al., 2000).
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
29
Le produit final de la rétrotranscription est une molécule d’ADN double brin linéaire
contenant un « ADN flap » central et deux extrémités identiques, les LTR, contenant les
séquences U3, R et U5.
a.4. Import nucléaire du provirus (figure 9 (Sherman and Greene, 2002))
Le matériel génétique des lentivirus est transporté dans le noyau sous forme d’un
complexe dénommé “Complexe de Pré-Intégration” (CPI) (Sherman and Greene, 2002). Ce
complexe est obtenu après l’étape de rétrotranscription et comprend l’ADN proviral
néosynthétisé, des protéines virales comme l’intégrase, la MA, et Vpr (Miller et al., 1997) et
des protéines cellulaires comme la protéine HMG I (High Mobility Group) (Farnet and
Bushman, 1997) et BAF (Barrier to Autointegration Factor) (Lin and Engelman, 2003). De
plus, la présence de séquences de localisation nucléaires (NLS) au sein des protéines IN
(Bouyac-Bertoia et al., 2001), MA (Bukrinsky et al., 1993; Haffar et al., 2000) et Vpr
(Jenkins et al., 1998), ainsi que la séquence du « flap central » (Zennou et al., 2000) facilite
l’import nucléaire du CPI. Toutefois, à l’heure actuelle, de nombreux doutes subsistent sur
le mécanisme exact de l’import nucléaire du CPI (Piller et al., 2003).
a.5. Intégration du provirus (figure 10 (Goldschmidt, 2004))
Dans le noyau, le provirus existe sous 3 formes : sous forme circulaire à un ou deux
LTR, qui ne s’intégre pas, dont le rôle n’est pas encore élucidé, ou sous forme linéaire qui
s’intégre dans le génome de la cellule hôte. Cette réaction est catalysée par l’intégrase virale
qui reconnaît spécifiquement des séquences de 5 à 10 nucléotides appelées att ou “Inverted
Repeat” (IR), situées aux extrémités des deux LTR du génome viral. A chaque extrémité 3’,
l’intégrase clive un dinucléotide GT pour libérer un dinucléotide CA porteur d’un
groupement hydroxyle. Par la suite, cette enzyme clive l’ADN génomique cellulaire, puis
ligue chacune des extrémités 3’-OH de l’ADN viral aux extrémités 5’-phosphate de l’ADN
cellulaire. Enfin, les discontinuités obtenues au niveau des sites de ligation sont réparées par
l’excision des nucléotides viraux et cellulaires non appariés. Cette dernière fait intervenir
des protéines cellulaires, telles que HMG I et BAF (Barrier to autointégration factor) (Chen
and Engelman, 1998). Dans la cellule, le nombre et les sites d’intégration du provirus sont
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
30
multiples (Jung et al., 2002). Toutefois, il a été rapporté des sites préférentiels d’intégration
ou « hotspot » dans des loci actifs du génome cellulaire (Schroder et al., 2002).
b) Phase post-intégrative
Cette phase débute par les étapes de synthèse des ARN viraux, suivie de la
production des protéines virales, de l’assemblage des particules nucléoprotéiques, puis se
termine par le bourgeonnement des particules à l’extérieur de la cellule et la maturation
protéolytique des virions. Le développement d’outils de transfert de gène à partir du VIH-1
consiste à ne conserver que la phase d’intégration du provirus dans le génome et à
supprimer la phase post-intégrative.
I.3. Obtention des vecteurs lentiviraux dérivés du HIV-1
I.3.1. Caractéristiques et production
Ce qui caractérise un vecteur par rapport au virus dont il dérive, est son incapacité à
se répliquer après son entrée dans la cellule cible. Un vecteur lentiviral n’exploite que les
phases précoces ou pré-intégratives du cycle viral. Ces différentes étapes sont indépendantes
de la synthèse de protéines virales, de sorte que la majeure partie du génome viral peut être
délétée et remplacée par une (des) séquence(s) d’intérêt(s). Les séquences virales qui doivent
être conservées sont celles qui agissent en cis (RRE pour l’export des génomes ARN, Ψ
pour l’encapsidation, PBS pour l’amorce de la rétrotranscription, PPT et cPPT pour la
synthèse du brin positif, LTR et séquence att pour l’intégration du provirus). Toutefois,
pour la production des particules virales, il est nécessaire d’apporter en trans les séquences
d’expression des protéines de structures (gag), des enzymes (pol) et de l’enveloppe pour
permettre au génome du vecteur d’être encapsidé et enveloppé correctement, ainsi que les
protéines accessoires Tat et Rev.
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
31
Le principe de production de ces vecteurs repose sur la co-transfection transitoire de
trois plasmides dans des cellules HEK-293T (figure 11) :
le plasmide de transcomplémentation dans lequel les séquences LTR5’, Ψ et LTR3’
ont été délétées afin d’empêcher l’encapsidation del’ARN transcrit par ce plasmide
et sa rétrotranscription.
le plasmide d’enveloppe dans lequel les gènes codant les protéines d’enveloppe du
VIH-1 peuvent être remplacées par les gènes codant les protéines d’enveloppe
d’autres virus. C’est le pseudotypage.
le plasmide d’expression du génome ARN vecteur, qui sera encapsidé dans la
particule virale est quant à lui composé de :
- La (les) cassette(s) d’expression(s) du (des) Transgéne(s) d’intérêt(s)
- Deux LTR, pour la rétrotranscription
- La séquence Ψ pour l’encapsidation de l’ARN vecteur dans les capsides
- La séquence RRE sur laquelle se fixe la protéine Rev
Après la co-transfection transitoire de ces trois plasmides dans des cellules HEK-
293T, le surnageant est récolté et les particules virales sont concentrées par
ultracentrifugation (Naldini et al., 1996b) (figure 11). Les particules recombinantes peuvent
être titrées, d’une part en mesurant la quantité de particules physiques, et d’autre part en
mesurant la quantité de particules infectieuses. Pour quantifier les particules physiques, la
protéine virale p24 de la capside est dosée par ELISA. Cette quantité, exprimée en ng de
p24 par µl, ne reflète pas la qualité des particules virales produites, c’est à dire leur capacité
à transduire efficacement une cellule. Les particules infectieuses sont quantifiées en
transduisant des cellules avec des dilutions croissantes du stock du vecteur et en
dénombrant les cellules exprimant le transgène. L’efficacité de transduction est alors
exprimée en TU (Transducing Units) par ml.
Afin de garantir la biosécurité des vecteurs lentiviraux, l’utilisation de trois
plasmides permet de réduire les risques d’encapsider les ARN coder par les gènes viraux,
mais également de s’affranchir des risques de recombinaison entre les diverses séquences
d’ADN codant pour le vecteur et celles codant pour les gènes du virus. Dans ces
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
32
conditions, la reconstitution biologique d’un rétrovirus compétent pour la réplication
(RCR) au cours de la production de particules de vecteurs viraux nécessite trois événements
successifs de recombinaison. En effet, le remplacement dans le plasmide
transcomplémentant des LTR par un promoteur CMV en 5’ et par un signal de
polyadénylation en 3’, réduit considérablement les risques de recombinaisons homologues
entre ce plasmide et le plasmide vecteur. De plus, l’absence de la séquence Ψ dans le
plasmide transcomplémentant empêche l’encapsidation des ARNm codant les gènes viraux.
I.3.2. Pseudotypage des vecteurs lentiviraux
La présence des glycoprotéines d’enveloppe à la surface des virus détermine leur
affinité pour un type cellulaire, un tissu ou une espèce donnée. C’est ce qu’on appelle le
tropisme. Le changement d’enveloppe pour la production de vecteurs lentiviraux modifie
leurs caractéristiques. Des particules virales qui portent l’enveloppe d’un autre virus
(hétérologue), ou une enveloppe dont la séquence est manipulée (chimérique), sont appelées
des pseudotypes. La glycoprotéine d’enveloppe la plus utilisée pour les vecteurs lentiviraux,
et en particulier pour ceux qui dérivent du HIV-1, est la glycoprotéine G du virus de la
stomatite vésiculaire (VSV-G). Celle-ci permet d’obtenir des vecteurs capables de transduire
un large panel de cellules de mammifère, mais également de poissons, d’amphibiens ou
d’insectes (Burns et al., 1993). VSV-G est l’unique protéine membranaire intrinsèque des
vésiculovirus dont fait partie le VSV. Elle remplit à ce titre de nombreuses fonctions au
cours du cycle viral. Celui-ci débute par l’adhésion du vecteur à la membrane par la
reconnaissance de la glycoprotéine G et d’un récepteur cellulaire, ce qui induit l’endocytose
de la particule virale. L’abaissement du pH dans le compartiment endosomal active la
glycoprotéine G, ce qui déclenche le processus de fusion membranaire entre les membranes
virales et endosomales, libérant ainsi le génome viral dans le cytoplasme (Rolls et al., 1994).
Le récepteur du VSV n’est pas connu actuellement avec certitude. Pendant longtemps, le
seul récepteur proposé était la phosphatidylsérine (Schlegel et al., 1983). Toutefois, une
étude récente vient de montrer que la phosphatidylsérine n’est pas le récepteur de surface
cellulaire du VSV, mais que ce lipide pouvait être impliqué dans les phases précoces
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
33
d’entrée du virus (Coil and Miller, 2004). De même, la clathrine serait également impliquée
dans le processus d’endocytose des particules virales (Sun et al., 2005).
La reconnaissance, l’intégration dans la cellule hôte et la décapsidation des vecteurs
lentiviraux pseudotypés avec VSV-G suivent probablement le schéma pré-intégratif des
virus VSV. En revanche, la rétrotranscription, l’import nucléaire et l’intégration de l’ADN
proviral suivent probablement le schéma pré-intégratif du VIH-1. Quoi qu’il en soit, le
pseudotypage des vecteurs lentiviraux avec VSV-G a permis non seulement d’élargir le
tropisme des vecteurs, mais également de conférer une stabilité aux particules virales
permettant ainsi leur concentration par ultracentrifugation (Burns et al., 1993; Yee et al.,
1994; Akkina et al., 1996; Bartz and Vodicka, 1997).
I.3.3. Améliorations des vecteurs lentiviraux
Les performances des vecteurs dérivés du HIV-1 ont été améliorées, soit dans le sens
d’une plus grande efficacité, soit dans le sens d’une meilleure sécurité.
I.3.3.1. Amélioration de l’efficacité des vecteurs
L’amélioration de leur efficacité s’est portée au niveau des titres de production, de
l’efficacité de transduction et de l’efficacité de l’expression du transgène.
Des lignées cellulaires dites « lignées d’empaquetages » exprimant de façon stable
VSV-G ont été développées (Kafri et al., 1999; Klages et al., 2000). Ces lignées permettent
de s’affranchir de la variabilité des productions des stocks de vecteurs, et ouvrent également
la voie à une production à grande échelle de ces vecteurs. Toutefois, la cytotoxicité
observée suite à l’expression constitutive de VSV-G représente une limite à cette technique.
Cette limite peut être levée en contrôlant l’expression de VSV-G via un promoteur
inductible par la doxycycline (Kafri et al., 1999; Farson et al., 2001; Xu et al., 2001a) ou par
l’ecdysone (Pacchia et al., 2001). Ces lignées permettent un rendement significatif de
particules infectantes.
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
34
Le deuxième axe d’amélioration de l’efficacité des vecteurs porte sur leur potentiel
transductionnel. L’utilisation de VSV-G a permis d’accroître le tropisme des particules
recombinantes et donc l’efficacité de transduction (Naldini et al., 1996b). D’autre part,
l’introduction de la séquence ADN flap centrale a permis de favoriser l’import nucléaire
des vecteurs et d’augmenter leur efficacité de transduction (Follenzi et al., 2000; Zennou et
al., 2001).
Enfin, les modifications qui visent à améliorer l’expression du transgène
interviennent à deux niveaux :
(1) Au niveau transcriptionnel, l’ajout d’une séquence MAR (Matrix Attachment
Region ou séquence d’attachement à la matrice) améliore la conformation du provirus dans
la chromatine, ce qui favorise la fixation des facteurs de transcriptions cellulaires et donc
l’expression du transgène (Park and Kay, 2001; Lutzko et al., 2003). De plus, l’utilisation de
promoteurs forts ubiquitaires et/ou adaptés au tissu ciblé permet une transduction efficace
et à long terme du transgène (Boulos et al., 2006).
(2) Au niveau post-transcriptionnel, l’ajout de séquences telles que la séquence
WPRE (Woodchuck hepatitis virus Posttranscriptional Regulatory Element) ou les régions
3’ ou 5’ non traduites (UTR) a permis de favoriser la stabilité des ARNm et l’expression du
transgène (Zufferey et al., 1999; Brun et al., 2003; Hlavaty et al., 2005). Toutefois, Klein et
collaborateurs ont montré que l’efficacité de la séquence WPRE pouvait dépendre du
promoteur et du type cellulaire utilisé (Klein et al., 2006). De plus, une activité oncogène
du WPRE a été rapportée (Kingsman et al., 2005), mais à cette date aucune autre étude n’est
venue infirmer ou confirmer ce résultat.
I.3.3.2. Amélioration de la biosécurité
I.3.3.2.1. Des productions améliorées
Afin de renforcer la biosécurité des vecteurs lentiviraux, plusieurs modifications ont
été apportées :
- l’utilisation de quatre plasmides (séparation de Rev dans un quatrième plasmide),
permet de diminuer le risque de formation de RCR (Dull et al., 1998).
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
35
- le remplacement du promoteur LTR 5’ par un promoteur ubiquitaire CMV
permet de s’affranchir de Tat sans affecter le titre ou l’efficacité de transduction des
particules virales (Dull et al., 1998).
- la substitution de système rev/RRE d’export nucléaire de l’ARN viral par le
système d’export issu d’autre virus réduit le risque de formation de RCR (Gasmi et al.,
1999).
- la délétion des quatre gènes accessoires (vpr, vif, nef et vpu) dans le plasmide
transcomplémentant améliore la biosécurité des vecteurs lentiviraux sans affecter l’efficacité
de transduction des vecteurs (Zufferey et al., 1997; Kim et al., 1998).
- la délétion des séquences enhancer de la région U3 du LTR 3’ dans le plasmide
vecteur rend le LTR 5’ non fonctionnel pour toute recombinaison. Les vecteurs qui
possèdent cette délétion sont dits vecteur SIN (pour self-inactivating) ou encore delta-U3
(Miyoshi et al., 1998; Zufferey et al., 1998; Iwakuma et al., 1999).
I.3.3.2.2. Les vecteurs non intégratifs
La mutagenèse insertionnelle des vecteurs lentiviraux est un des risques de la
thérapie génique. Afin d’éviter ce risque, plusieurs équipes parmi lesquelles celles du LGN,
ont développé de nouveaux vecteurs non intégratifs. La stratégie consiste à empêcher
l’intégration du provirus dans le génome hôte et de favoriser les génomes circulaires
épisomaux. Pour cela, deux approches ont été utilisées. La première consiste à l’utilisation
de vecteurs qui portent des mutations dans la séquence att (Nightingale et al., 2006). La
deuxième consiste à utiliser des mutants d’intégrase incapable de catalyser la réaction
d’intégration (Philippe et al., 2006; Yanez-Munoz et al., 2006). Ces vecteurs se sont révélés
particulièrement efficaces pour une expression à long terme des transgènes in vitro et in
vivo. En effet, une expression du transgène de plus de six mois est obtenue après injection
du vecteur non intégratif dans la rétine (Philippe et al., 2006; Yanez-Munoz et al., 2006). Le
développement des vecteurs lentiviraux non-intégratifs constitue un pas important pour
l’application clinique des vecteurs lentiviraux dans des cellules quiescentes ou lorsqu’une
expression transitoire dans des cellules en division est requise.
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
36
I.3.3.2.3. Les vecteurs à intégrations ciblées
Une voie alternative pour s’affranchir du problème de mutagenèse insertionelle
consiste à développer des vecteurs à intégration ciblée. Deux stratégies sont actuellement
explorées. La première stratégie serait d’utiliser la recombinase unidirectionnelle de phage
phiC31 (Groth et al., 2000; Thyagarajan et al., 2001; Chalberg et al., 2005; Chalberg et al.,
2006). L’intégrase phiC31 est une enzyme du phage phiC31 du genre Streptomyces. Cette
enzyme catalyse la recombinaison au niveau de deux sites d’attachement, attB et attP. Le
site attP est localisé dans le génome du phage phiC31, alors que attB est retrouvé dans le
génome hôte Streptomyces (figure 12) (Ginsburg and Calos, 2005). Cette intégrase s’est
révélée fonctionnelle dans les cellules humaines HEK-293 (Groth et al., 2000). L’intégrase
phiC31 a permis de catalyser avec une fréquence de 15% l’intégration d’un plasmide
porteur du site attB et exprimant un transgène dans le génome de cellules HEK-293
contenant une copie du site attP (Thyagarajan et al., 2001). Pour les 85 % restant,
l’intégration a lieu au niveau de pseudo-sites attP, présent naturellement dans le génome des
cellules humaines (Thyagarajan et al., 2001). Il est donc envisageable d’utiliser cette
intégrase pour le développement de vecteurs lentiviraux à intégration ciblée. La deuxième
stratégie consiste à modifier la spécificité de l’intégrase du HIV1 en fusionnant celle-ci avec
un domaine de reconnaissance à l’ADN spécifique, tel que le domaine de liaison à l’ADN
des protéines en doigt de zinc (Bushman and Miller, 1997; Tan et al., 2004). En effet, les
virions qui portent une intégrase fusionné avec la protéine en doigt de zinc zif268, sont
compétant pour la réplication et l’intégration (Bushman and Miller, 1997). Cette dernière
s’effectue préferentiellement à proximité du site de liaison de zif268 (Bushman and Miller,
1997). De même, l’utilisation de l’intégrase fusionné avec la protéine en doigt de zinc E2C
permet l’intégration du provirus à proximité du site de liaison de E2C (Tan et al., 2004).
Bien que ces intégrases ne soient pas encore efficace, ces travaux constituent un pas
important dans le développement de vecteur à intégration ciblée, ce qui ouvre la voie à une
thérapie génique plus sûr.
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
37
I.4. Vecteurs lentiviraux et transfert de gène dans le système nerveux
central
Les vecteurs lentiviraux sont considérés comme des outils de choix pour le transfert
de gène dans le SNC. En effet, ils sont capables de transduire à la fois les cellules en division
et les cellules quiescentes (Naldini et al., 1996a; Blomer et al., 1997). De plus, avec une
capacité de clonage qui est de 8 kb, ils possèdent une capacité de clonage supérieure à celle
de l’AAV (4,5 kb) (Naldini et al., 1996b). Enfin, leur tropisme peut être aisément modifié
grâce à un pseudotypage à l’aide d’une large variété d’enveloppes (Watson et al., 2002;
Wong et al., 2004). L’injection directe in vivo des vecteurs lentiviraux a permis de
transduire une large variété de cellules du SNC parmi lesquelles les neurones (Naldini et al.,
1996a; Blomer et al., 1997), les astrocytes (Consiglio et al., 2004), les cellules souches
nerveuses adultes (Geraerts et al., 2006), les oligodendrocytes (McIver et al., 2005), la
microglie (Balcaitis et al., 2005) et les cellules de gliome (Miletic et al., 2004). Pour toutes
ces raisons, les vecteurs dérivés du VIH-1 sont des vecteurs lentiviraux particulièrement
intéressant pour les applications dans le SNC (Jakobsson and Lundberg, 2006).
Les vecteurs lentiviraux utilisés sont généralement pseudotypés avec VSV-G (Emi et
al., 1991). L’injection de ce type de vecteur dans le cerveau de rongeurs et de primates
permet une expression stable et à long terme du transgène (Blomer et al., 1997; Kordower
et al., 1999). Une transduction essentiellement neuronale a été rapportée après injection de
lentivirus VSV-G dans l’hippocampe de rats (Naldini et al., 1996b; Blomer et al., 1997;
Deglon et al., 2000; Baekelandt et al., 2002), dans le striatum et la substance noire de
primates (Kordower et al., 1999). Toutefois, le tropisme neuronal des vecteurs pseudotypé
par VSV est controversé. En effet, l’expression majoritairement neuronale dépendrait du
promoteur utilisé (Jakobsson et al., 2003; Jakobsson et al., 2004). Il semblerait que ces
promoteurs aient une faible activité dans les cellules gliales in vivo (Jakobsson et al., 2003).
Dans certains cas, l’expression restreinte à un certain type cellulaire peut s’avérer
nécessaire. Par exemple, l’expression dans le striatum de modèles animaux de maladie de
Parkinson (MP) de facteurs neurotrophiques tel que le GDNF (Glial cell line-Derived
Neurotrophic Factor) a conduit à un « sprouting » aberrant dans des structures non désirées
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
38
(Georgievska et al., 2002). Cet effet secondaire peut être limité en restreignant l’expression
du GDNF aux astrocytes. Ceci peut être effectué de deux façons différentes : en utilisant un
promoteur spécifique des astrocytes tel que le promoteur GFAP (glial fibrillary acidic
protein) (Jakobsson et al., 2004), en modifiant les protéines de l’enveloppe du vecteur
lentiviral. Un large panel d’enveloppes issues de différents virus a été utilisé pour générer
des pseudotypes de vecteurs lentiviraux. En plus du VSV, différentes souches de la rage
(Mazarakis et al., 2001), du virus mokola (Brizard M., soumis), du « Lymphocytic
Choriomeningitidis Virus » (LCMV) (Watson et al., 2002; Wong et al., 2004; Stein et al.,
2005), du virus de la rivière Ross (Kang et al., 2002) ont été utilisés. Ces enveloppes
modifient le tropisme des vecteurs. Par exemple, les vecteurs lentiviraux pseudotypés avec
l’enveloppe du virus de la rivière Ross ciblent plus efficacement les cellules gliales que les
neurones (Kang et al., 2002), alors que ceux pseudotypés avec le LCMV ciblent
préférentiellement les cellules souches neurales (Stein et al., 2005) et les cellules de gliomes
(Miletic et al., 2004; Steffens et al., 2004). En outre, les vecteurs lentiviraux dérivés de
l’EIAV (Equine infectious anemia virus) pseudotypés avec l’enveloppe de la rage peuvent
être transportés par un transport rétrograde, ce qui permet leur injection à la périphérie
(Mazarakis et al., 2001). Cependant, il semble que le pseudotypage des vecteurs lentiviraux
ne dérivant pas de l’EIAV par cette enveloppe ne leur confère pas cette propriété de
transport (Sarkis et al., données non publiées).
Le transfert de gène dans le SNC peut être compromis par une réponse immunitaire
innée ou adaptative contre les composants du virion ou du produit du transgène. L’un des
atouts des vecteurs lentiviraux réside dans leur faible potentiel immunogène. En effet,
contrairement aux AAV (Peden et al., 2004), aux HSV (Wood et al., 1994) et aux
adénovirus (Wood et al., 1996; Kajiwara et al., 1997; Kajiwara et al., 2000), l’injection dans
le SNC de rat n’induit pas de réaction immunitaire dirigée contre le vecteur (Abordo-
Adesida et al., 2005) ni d’extinction de l’expression du transgène (Kafri et al., 1997). Ces
données ouvrent la voie à l’utilisation de ces vecteurs en thérapeutiques humaines.
Cependant, l’éventuelle nécessité d’une injection répètée de vecteur pour le traitement de
certaines pathologies du SNC, soulève à nouveau ce problème. En effet, la réponse
immunitaire liée à des injections répètées de vecteurs est mal connue. Un début de réponse
est apporté par les études menées dans notre laboratoire ainsi que celui de Baekelandt et ses
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
39
collaborateurs. Suite à l’injection successive intracérébrale d’un vecteur lentiviral dérivé du
VIH-1, l’expression du transgène n’est pas diminuée malgré une réponse humorale dirigée
contre l’enveloppe du vecteur (Baekelandt et al., 2002; Abordo-Adesida et al., 2005; Brizard
M, submitted). Ces études suggèrent que l’injection répétée de vecteur lentiviraux n’altère
pas l’expression du transgène, ouvrant la voie à leur application clinique.
I.5. Thérapie génique des maladies neurodégénératives
Les maladies neurodégénératives se caractérisent par la mort lente et progressive des
neurones (Rego and Oliveira, 2003). Celle-ci peut être engendrée par la production
aberrante de radicaux libres (Olanow and Arendash, 1994), par un transport axonal
interrompu (Stamer et al., 2002) ou par le dépôt d’agrégats toxiques (Aβ, ou α-synucléine)
(Hardy and Orr, 2006).
Deux approches de thérapie génique sont envisageables pour ce type de pathologies.
La première dîte thérapie génique restauratrice ou substitutive, consiste à pallier les déficits
induits par la mort neuronale. La deuxième dîte thérapie génique de protection, consiste à
protéger les neurones de la dégénérescence. Dans le cadre d’une thérapie génique de
substitution, des enzymes de biosynthèse (Tyrosine hydroxylase, GTP cyclohydrolase,
Aromatic-acid decarboxylase…) peuvent permettre de palier le déficit en
neurotransmetteurs induit par la mort neuronale. En revanche, dans le cadre d’une thérapie
génique de protection, différents facteurs thérapeutiques peuvent être envisagés,
notamment les facteurs trophiques tels que le NGF (Nerve Growth Factor), le BDNF
(Brain-derived Neurotrophic Factor), le CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor), le GDNF,
les enzymes anti-radicaux libres tels que la SOD (Superoxyde Dismutase) ou GPx
(Glutathion Peroxydase), ou les enzymes antiapoptotiques tels que Bcl-2 et Bcl-xL. Ces
facteurs se sont montrés particulièrement efficaces pour protéger les neurones lors d’un
apport direct dans le cerveau sous forme de protéines dans des modèles murins et de
primates (Alberch et al., 2004; Kirik et al., 2004; Tuszynski and Blesch, 2004). Basés sur ces
résultats, des essais cliniques d’infusion intracérébroventriculaire du GDNF ont été
entrepris. Un premier essai clinique de phase I a été entrepris par Nutt et ses collègues
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
40
(Nutt et al., 2003). Cet essai testant l’infusion intracérébroventriculaire de GDNF à l’aide
d’une canule, n’a aboutit à aucune amélioration des symptomes moteurs des patients et au
contraire a révélé la survenue d’effets secondaires associés à la localisation du GDNF dans
le ventricule. Par la suite, une étude de phase I a été réalisé par une équipe britannique dans
laquelle la protéine GDNF était infusée directement à l’aide d’un cathéter relié à une
pompe dans le putamen de cinq patients parkinsoniens (Gill et al., 2003; Patel et al., 2005).
L’infusion chronique de GDNF a permis une amélioration significative des fonctions
motrices chez tous les patients. Une analyse post mortem a révélé que ces effets bénéfiques
étaient en particulier la résultante de formation de collatérales dans le striatum (Love et al.,
2005). Bien que l’ensemble de ces résultats ait été confirmé un an après par une étude de
phase I portant sur dix patients (Slevin et al., 2005), l’interprétation des résultats de ces
études cliniques est limitée par l’absence de groupe contrôle ayant reçu un placebo et par le
faible nombre de patients participants. Récemment, une nouvelle étude est venue
contredire ces résulats (Lang et al., 2006). Contrairement aux premières études, cet essai n’a
vu aucune amélioration significative des symptômes des patients traités en comparaison des
patients ayant reçu le placebo. Ces résultats ont poussés les instigateurs à arrêter l’essai, sans
que ne soit évalué les causes du manque d’efficaité du GDNF. Cependant, le caractère
protéique de ces facteurs limite leur utilisation à long terme. Leur instabilité, leur vitesse de
dégradation ainsi que leur inactivation par les protéines plasmatiques limitent leur
efficacité. De plus, le franchissement de la barrière hématoencéphalique constitue un
obstacle supplémentaire à l’injection intraveineuse de ces protéines thérapeutiques.
L’administration directe et continue par voie intracérébroventriculaire ou
intraparenchymateuse est une méthode invasive et associée à un risque élevé d’infections.
Enfin, l’instabilité des facteurs trophiques nécessite l’administration de grandes quantités de
protéines. Ces limites peuvent être contournées par l’expression locale et à long terme de
ces facteurs thérapeutiques par le biais de vecteurs viraux. Plusieurs approches
expérimentales ont démontré l’efficacité de vecteurs exprimant des facteurs
neurotrophiques dans les modèles de maladies neurodégénératives. En particulier, nous
avons montré pour la première fois au laboratoire que des vecteurs adénoviraux exprimant
le GDNF sont efficace pour prévenir la mort des neurones dopaminergiques dans des
modèles murins de maladie de Parkinson (MP) (Bilang-Bleuel et al., 1997). D’autres études
émanant du LGN ou d’autres laboratoires sont venues confirmer l’effet protecteur du
Introduction : La thérapie génique dans le système nerveux central
41
GDNF exprimer par des vecteurs adénoviraux (Connor et al., 1999; Connor et al., 2001;
Do Thi et al., 2004; Do Thi et al., 2006) ou lentiviraux (Bensadoun et al., 2000; Kordower
et al., 2000) sur la mort des neurones dopaminergiques dans des modèles de MP. Les
vecteurs viraux se sont également révélés efficace dans des modèles de la maladie
d’Alzheimer (MAlz) (Zou et al., 2002; Wu et al., 2004; Tuszynski et al., 2005), de la maladie
de Huntington (MH) (Bemelmans et al., 1999; de Almeida et al., 2001; Regulier et al., 2002;
Kells et al., 2004) ou encore de maladies neuromusculaires comme la Sclérose Latéral
Amyotrophique (SLA) (Aebischer et al., 1996; Acsadi et al., 2002; Klein et al., 2005) ou
l’Amyotrophie Spinale (Haase et al., 1997; Haase et al., 1999; Watabe et al., 2001). De
même, l’expression des facteurs antiapoptotiques Bcl-2 et Bcl-xL (Waldmeier, 2003), mais
aussi des enzymes SOD et GPx, ont permis de prévenir la mort neuronale dans des modèles
de MAlz (Blomer et al., 1998; Barkats et al., 2000), de MP (Ridet et al., 2006) et de SLA
(Azzouz et al., 2000).
La thérapie génique des maladies neurologiques nécessite une expression stable et à
long terme du (des) facteur(s) thérapeutique(s). Les vecteurs lentiviraux remplissent cette
obligation, puisque le transgène est détecté plus de seize mois après l’injection dans le SNC
(Kordower et al., 2000; Balaggan et al., 2006). De plus, leur simplicité d’utilisation, leur
biosécurité et leur production aisée en font des vecteurs de choix pour une application
thérapeutique aux pathologies du système nerveux. En outre, la transduction par un
vecteur lentiviral ne semble pas affecter les propriétés électrophysiologiques du neurone
(Dittgen et al., 2004). Cependant, dans des approches de neuroprotections, il sera nécessaire
de cibler les astrocytes pour l’expression des facteurs neurotrophiques. L’utilisation de
l’enveloppe du virus mokola permet de répondre à ce besoin (Brizard M., soumis). Ces
caractéristiques sont des éléments importants pour l’application des vecteurs lentiviraux en
thérapie génique humaine. Toutefois, afin de garantir l’utilisation clinique de ces vecteurs,
il est nécessaire de contrôler l’expression du facteur thérapeutique et ceci afin de moduler
l’apport de la protéine thérapeutique en fonction des besoins du patient, mais également
d’arrêter le traitement en cas de complications graves. Les différents systèmes de régulation
et leur incorporation dans des vecteurs lentiviraux seront documentés plus en détail dans le
chapitre III.
Introduction : L’ARN interférence
42
II. L’ARN interférence
La biologie moléculaire est rentrée dans l’ère post-génomique et permet aujourd’hui de
caractériser des gènes impliqués dans des processus physiopathologiques et de les définir
comme cibles thérapeutiques. Jusqu’à présent, l’expression d’un gène pouvait être modifiée
(surexpression ou Knock-out) en agissant directement sur le génome (ADN). Depuis la fin
des années 80, cet objectif est également devenu possible au niveau de l’ARN, molécule qui
constitue le support de la traduction de l’information génétique en protéine. La mise en
œuvre des premiers outils développés (stratégie antisens, ribozyme…), bien que spécifiques
et directs dans le principe, s’est révélée peu efficace. Cette voie a connue un nouveau regain
d’intérêt suite à la découverte d’un mécanisme nommé l’ARN interférence (ARNi).
II.1. Historique et découverte
En 1990, Richard Jorgensen, désireux de renforcer la couleur pourpre des fleurs de
pétunias, introduisit dans cette plante une copie supplémentaire du gène impliqué dans la
pigmentation, la chalcone synthase. Contre toute attente, il obtint le résultat inverse de
celui escompté : certaines plantes transgéniques avait des fleurs blanches (Napoli et al.,
1990). Ainsi, l’ajout du gène codant pour une protéine dont la synthèse était déjà assurée
par un gène endogène avait conduit à l’inhibition de l’expression de cette protéine.
L’analyse moléculaire mit en évidence que cette dépigmentation résultait de la dégradation
spécifique des l’ARNm de chalcone synthase (Van Blokland et al., 1994). C’est la première
preuve expérimentale qui montre que l’introduction d’une copie supplémentaire d’un gène
pouvait entraîner simultanément son inactivation ainsi que celle du gène endogène. Cette
extinction de l’expression de gène fût alors appelée phénomène de co-suppression car
l’équipe de Richard Jorgensen pensait que l’extinction simultanée du gène endogène et
exogène homologue découlait d’une interaction entre eux (Napoli et al., 1990). Quelques
années plus tard, ce phénomène fût relié au phénomène de dégradation de l’ARN observé
chez le ver Caenorhabditis elegans (C. elegans) par les chercheurs de l’université d’Ithaca, Su
Introduction : L’ARN interférence
43
Guo et Kenneth Kemphus. Ces derniers, pour définir le rôle du gène par-1 dans le
développement embryonnaire du ver ont injecté de l’ARN antisens dirigé contre l’ARN
messager (ARNm) de par-1 chez C elegans. Comme attendu, ils obtinrent une inhibition de
l’expression de par-1. Cependant, l’injection d’ARN sens par-1 a conduit au même résultat
mais ce phénomène ne put être expliqué (Guo and Kemphues, 1995). Il fallut attendre les
travaux de Fire et Mello pour qu’une explication soit proposée. Ces chercheurs ont montré
que l’introduction d’ARN double brin (ARNdb) dans des cellules de C. elegans pouvait
réduire l’expression spécifique de protéines en se liant à leur ARNm (Fire et al., 1998). La
formation d’ARNdb par complémentarité des bases entre les ARN sens et antisens
explique l’inhibition de Par-1 observée par Guo et Kemphus. Ce mécanisme fut nommé
ARN interférence (ARNi) ou inhibition post-transcriptionnelle (en anglais “Post-
Transcriptional Gene Silencing” PTGS).
L’ARNi est un mécanisme conservé au cours de l’évolution qui se retrouve dans de
nombreux organismes : les plantes, la drosophile, C. elegans et les mammifères y compris
l’homme (Fire et al., 1991; Romano and Macino, 1992; Pal-Bhadra et al., 1997).
II.2. Mécanisme
Le mécanisme de l’ARNi est un processus cellulaire présent chez les eucaryotes qui
régule l’expression génique de façon transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle (Hannon,
2002). L’ARNi est déclenché par la présence d’ARNdb provenant soit de transposons
(Sijen and Plasterk, 2003; Vastenhouw and Plasterk, 2004), de virus (Lecellier and Voinnet,
2004) ou d’une nouvelle classe d’ARN régulateurs non-codants, les microARN (miARN)
(Lee et al., 2003). Au niveau post-transcriptionnelle, la reconnaissance d’ARNdb entraîne
soit l’élimination de l’ARNm correspondant, soit l’arrêt de la traduction de la protéine.
Ceci se fait par un mécanisme en deux étapes : une étape d’initiation et une étape effectrice
(figure 13 (Dykxhoorn et al., 2003)).
Introduction : L’ARN interférence
44
II.2.1. Etape d’initiation
L’étape d’initiation de l’ARNi débute par la reconnaissance de l’ARNdb par une
nucléase. Celle-ci entraîne la coupure de l’ARNdb et conduit à la formation de petits ARN
de 19 à 25 nucléotides, les siARN (pour “small interfering RNA”). Ces siARN comportent
des extrémités 3’ symétriques avec deux nucléotides débordants (Elbashir et al., 2001a).
Les études biochimiques menées chez la drosophile par Berstein et ses collègues en 2001,
ont montré que la nucléase responsable de la formation des siARN était une ribonucléase
de la famille de la RNase III, appelée Dicer (Bernstein et al., 2001). Cette enzyme, très
conservée du ver C. elegans aux mammifères, est localisée dans le cytoplasme, ce qui indique
que le mécanisme d’ARNi est essentiellement un processus cytoplasmique (Billy et al.,
2001). La protéine Dicer possède un domaine ARN hélicase dans sa région N-terminale, un
domaine PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille), deux domaines RNase III et un motif de liaison à
l’ARNdb dans sa région C-terminale (figure 14) (Cerutti et al., 2000; Carmell and Hannon,
2004).
II.2.2. Etape effectrice
Une fois formés, les siARN s’associent à un complexe dénommé RISC (“RNA
Induced Silencing Complex”), qui catalyse la dégradation des ARNm ou inhibe leur
traduction (Doench et al., 2003; Zeng et al., 2003). La différence de stabilité
thermodynamique dans l’appariement des deux brins du siARN à chacune des extrémités
détermine le brin du siARN qui sera sélectionné. Le brin dont l’extrémité 5’ est la plus
faiblement appariée est préférentiellement incorporé dans le complexe RISC (Khvorova et
al., 2003; Schwarz et al., 2003).
Le complexe RISC dont la taille varie de 150 kDa (Martinez et al., 2002a) à 500 kDa
(Hammond et al., 2000; Nykanen et al., 2001), a une composition variable selon les espèces.
Chez la drosophile, où il a été identifié, il est composé d’au moins quatre protéines dont
une protéine de la famille Argonaute : Argonaute 2 (Ago2) (Hammond et al., 2000;
Hammond et al., 2001). Cette dernière est l’enzyme responsable de la coupure de l’ARNm
cible (Liu et al., 2004; Meister et al., 2004) Les protéines Argonautes sont des protéines
Introduction : L’ARN interférence
45
basiques d’une centaine de kDa. Elles possèdent un domaine PAZ permettant de lier
l’ARN simple brin (Song et al., 2003) et un domaine Piwi, possédant une activité RNase H,
situé à son extrémité C-terminale (figure 15) (Carmell et al., 2002; Hammond, 2005). La
plupart des organismes possèdent plusieurs gènes argonautes et le choix de l’argonaute
contenu dans le complexe semble influencer la fonction de RISC. Ainsi, en présence
d’Ago2 le complexe RISC provoque le clivage de l’ARNm cible, alors qu’en présence
d’Ago1 il bloque la traduction (Denli and Hannon, 2003). En plus des protéines argonautes,
le complexe RISC contient une hélicase ainsi qu’une nucléase (Hannon, 2002). La nucléase
Tudor-SN (Tudor Staphylococcal Nuclease) a été proposée comme étant l’enzyme
responsable du clivage des ARNm (Caudy et al., 2003). Cependant, d’autres études sont
venues contredire cette hypothèse. En effet la nucléase Tudor-SN est une exonucléase
calcium-dépendante, alors que l’endonucléase contenue dans le complexe RISC possède une
activité dépendante du magnésium (Martinez and Tuschl, 2004; Schwarz et al., 2004). Le
complexe RISC contient également la protéine FXR (Fragile-X-related Protein), qui semble
permettre la liaison à l’ARN (Caudy et al., 2002; Ishizuka et al., 2002), ainsi que la protéine
VIG (Vasa intronic gene), dont la fonction est inconnue, mais qui contient également un
domaine de liaison à l’ARN (Caudy et al., 2002).
II.3. Les MicroARN
Le décryptage des mécanismes moléculaires régissant le développement du ver C.
elegans a conduit en 1993 à l’identification du premier microARN (miARN) (Lee et al.,
1993). Ce dernier est exprimé par le gène lin-4 en un petit ARNdb non codant en forme de
tige boucle de 22 nucléotides (figure 16a). lin-4 contrôle la transition du stade larvaire L1 au
stade L2. En effet, le mutant lin-4 réitère en permanence la phase L1 de son développement.
Toutefois, le phénotype sauvage peut être restauré par l’expression d’un fragment d’ADN
codant un petit ARN de 22 nucléotides qui se fixe sur plusieurs sites de la région 3’UTR de
l'ARNm de lin-14. Cette fixation provoque l’arrêt de la synthèse de la protéine LIN-14 (Lee
et al., 1993; Wightman et al., 1993) qui est un répresseur de la transition du stade larvaire
L1 au stade L2 (Wightman et al., 1993). En 2000, soit sept ans après la découverte de lin-4,
un nouveau miRNA, let-7, a été identifié chez ce ver. Il contrôle la transition entre le stade
Introduction : L’ARN interférence
46
larvaire L4 et le stade adulte. Le gène let-7 code pour un miRNA de 21 nucléotides qui
inhibe l’accumulation des protéines LIN-41 et LIN-42 en se fixant sur la région 3’UTR des
ARNm correspondants. (Reinhart et al., 2000). L’ARNm de lin-41 contient également un
site de complémentarité de lin-4 dans la région 3’UTR, mais lin-4 ne semble pas réguler
l’expression de lin-41 (figure 16b) (Slack et al., 2000). Le gène let-7 a la particularité d’être
conservé au cours de l’évolution. Ainsi, l’identification d’homologues de let-7 dans de
nombreuses espèces animales a conduit à la recherche systématique de miARN chez
d’autres espèces. Ainsi, les miARN ont été mis en évidence dans divers organismes parmi
lesquels les plantes (Reinhart et al., 2002; Mallory and Vaucheret, 2006), les insectes (Lai,
2002; Brennecke et al., 2003; Stark et al., 2003), les vers (Lee et al., 1993; Reinhart et al.,
2000) et les vertébrés (Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lagos-Quintana et al.,
2002; Mourelatos et al., 2002).
Les miARN constituent une classe d’ARN non codant de 21 à 25 nucléotides qui
contrôlent l’expression génique au niveau post-transcriptionnel (Hutvagner and Zamore,
2002; Filipowicz et al., 2005). Les miARN sont transcrits par une ARN polymérase II (Lee
et al., 2004) ou III (Borchert et al., 2006) en un pri-miARN d’environ 125 nucléotides.
Celui-ci est ensuite clivé dans le noyau par la protéine Drosha pour libérer un précurseur
en forme d’épingle à cheveux d’environ 70 nucléotides, dénommé pré-miARN (Lee et al.,
2003). Ce dernier est alors exporté du noyau vers le cytoplasme par la protéine Exportin-5
(Lund et al., 2004) où il est pris en charge par la nucléase Dicer qui le découpe pour former
des miARN matures de 22 nucléotides (Grishok et al., 2001; Hutvagner et al., 2001; Ketting
et al., 2001; Cavaille, 2004) (figure 17). Les miARN matures sont ensuite incorporés dans le
complexe RISC qui permet leur appariement par homologie de base à l’ARNm
complémentaire. Une complémentarité partielle du miARN à l’ARNm conduit à la
répression de la traduction (Grishok et al., 2001) alors qu’une complémentarité parfaite
conduit au clivage de l’ARNm (Hutvagner and Zamore, 2002).
Introduction : L’ARN interférence
47
II.4. ARNi et régulation de la transcription
Le mécanisme de l’ARNi ne semble pas agir uniquement au niveau de l’ARNm. En
effet, des études récentes ont montré que la machinerie de l’ARNi affecte également
l’expression des gènes en agissant directement sur le génome. Il s’agit alors d’un mécanisme
d’extinction transcriptionnelle appelé TGS (Transcriptional Gene Silencing) (Almeida and
Allshire, 2005; Bayne and Allshire, 2005).
Cette action directe de l’ARNi sur la chromatine a été mise en évidence chez la plante.
L’introduction d’ARNdb dans les cellules d’Arabidopsis thaliana déclenche la méthylation
de l’ADN correspondant (Wassenegger et al., 1994; Mette et al., 2000). Depuis, plusieurs
travaux ont montré l’existence de TGS dans d’autres espèces, notamment la levure (Noma
et al., 2004; Verdel et al., 2004), C. elegans (Dudley et al., 2002; Grishok et al., 2005), la
drosophile (Pal-Bhadra et al., 1997) et l’homme (Kim et al., 2006). Récemment, il a été
démontré que certaines protéines impliquées dans le mécanisme d’ARNi avaient un rôle
dans les mécanismes de réarrangement du génome (Mochizuki et al., 2002), la répression de
l’expression des gènes (Janowski et al., 2006; Kim et al., 2006) et dans la ségrégation des
chromosomes (Provost et al., 2002; Volpe et al., 2002; Hall et al., 2003).
II.5. Expression des siARN
L’inhibition spécifique de gènes peut être obtenue dans des cultures de cellules par
l’apport de molécules de siARN chimiquement synthétisées (Caplen et al., 2001; Elbashir et
al., 2001b). Toutefois, ces méthodes ne permettent qu’une inhibition à court terme de
l’expression d’un gène. Une inhibition à plus long terme peut être obtenue par la synthèse
endogène de ces siARN par un vecteur plasmidique (Brummelkamp et al., 2002; Miyagishi
and Taira, 2002; Sui et al., 2002; Yu et al., 2002) ou par un vecteur viral (Abbas-Terki et al.,
2002; Qin et al., 2003; Rubinson et al., 2003). Deux stratégies sont possibles pour
synthétiser les siARN dans les cellules à partir de ces vecteurs (figure 18). La première
repose sur l’utilisation de deux promoteurs indépendants pour exprimer les brins sens et
antisens du siARN, qui s’hybrident après leur synthèse dans le noyau (Miyagishi and Taira,
2002). La seconde consiste à exprimer le brin sens et antisens du siARN à partir du même
Introduction : L’ARN interférence
48
promoteur sous la forme d’une structure en forme d’épingle à cheveux , le shARN (« short
hairpin RNA »)(Paddison et al., 2002; Yu et al., 2002). Cette boucle sera coupée par
l’enzyme Dicer pour former un siARN fonctionnel.
La présence d’une extrémité polyA empêche l’effet inhibiteur des siARNs (Xia et
al., 2002). Les shARNs doivent par conséquent être exprimés par l’ARN polymérase III qui
permet la synthèse d’ARN d’une taille réduite puisque cinq Thymidines suffisent pour
arrêter la transcription. Les promoteurs de l’ARN polymérase III, comme le promoteur H1
(Abbas-Terki et al., 2003 ; Tiscornia et al., 2003), 7SK (Czauderna et al., 2003; Sotirova et
al., 2006) ou le promoteur U6 (Qin et al., 2001, Rubinson et al., 2003 ; Stewart et al., 2003),
ont été utilisés avec succès pour exprimer les shARNs.
Plusieurs études ont montré que l’expression intracellulaire des siARN par des
vecteurs plasmidiques et viraux a permis une inhibition plus efficace du gène cible qu’avec
une administration exogène des siARN (Brummelkamp et al., 2002; Lee et al., 2002;
Miyagishi and Taira, 2002). De plus, le système basé sur l’expression de shARN est plus
efficace que le système basé sur la synthèse du duplex siARN à partir de deux promoteurs
(Yu et al., 2002). L’utilisation de vecteurs, et particulièrement des vecteurs lentiviraux,
permet d’envisager une expression à long terme des shARN.
II.6. Applications thérapeutiques
L’ARNi s’est révélé être une innovation importante en médecine moléculaire
moderne, au point que le magazine Science la déclare “découverte scientifique de l’année”
en 2002 (Couzin, 2002). En effet, l’ARNi est un mécanisme physiologique qui peut être
exploité pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Contrairement aux
stratégies antisens ou triple hélice, qui nécessitent des concentrations importantes, les
siARN requièrent peu de molécules pour activer l’ARNi, évitant ainsi de déclencher des
effets secondaires. En outre, l’un des avantages majeurs de l’ARNi est sa très haute
spécificité. L’introduction d’une seule mutation au sein du siARN abolit l’effet d’extinction
post-transcriptionnelle (Martinez et al., 2002b; Miller et al., 2003; Dykxhoorn et al., 2006;
Introduction : L’ARN interférence
49
Schwarz et al., 2006). Cette spécificité importante ouvre la voie à l’utilisation de la
technologie ARNi pour éteindre spécifiquement l’expression d’allèles portant une
mutation, une insertion ou une délétion. De ce fait, les applications médicales de l’ARNi
sont considérables. Elles peuvent concerner les pathologies causées par des allèles
dominants portant des mutations comme le cancer (Gartel and Kandel, 2006) ou les
maladies neurodégénératives (Davidson and Paulson, 2004; Miller et al., 2005c; Thakker et
al., 2006), mais également pour combattre les infections virales (Lecellier and Voinnet,
2004; Ketzinel-Gilad et al., 2006).
Plusieurs travaux ont démontré les applications possibles de l’ARNi dans des
modèles cellulaires et animaux. Un siARN dirigé contre l’allèle mutant de la protéine
suppresseur de tumeur p53 s’est révélé efficace in vitro pour inhiber l’allèle mutant sans
affecter l’allèle p53 sauvage, permettant ainsi la restauration du phénotype anti-oncogène de
la protéine p53 sauvage (Martinez et al., 2002b). Cette stratégie peut donc constituer un
outil thérapeutique intéressant pour guérir les pathologies associées aux mutations de p53
comme le syndrome de Li-Fraumeni. L’ARNi s’est également révélé efficace pour inhiber
l’expression de protéines oncogènes issues d’une translocation chromosomique, qui sont à
l’origine de nombreux cancers hématopoïétiques. Dans ce cas, le siARN a été conçu pour
cibler la jonction entre les deux messagers (Wilda et al., 2002). Cette approche a permis de
supprimer la cytotoxicité causée par la surexpression du récepteur aux androgènes
comprenant des répétitions d’acides aminés glutamine, modèle de l’atrophie musculaire
spinobulbaire (SBMA) (Caplen et al., 2002).
En ce qui concerne le SNC, malgré le nombre important d’études documentant la
capacité des siARN à réduire l’expression d’un gène dans des cultures de neurones
(Krichevsky and Kosik, 2002; Higuchi et al., 2003; Leucht et al., 2003; Bhattacharya et al.,
2004; Vasko et al., 2005; Jeske et al., 2006) et dans les cellules gliales (Nicchia et al., 2003;
Gan et al., 2004; Zhang et al., 2004; Lee et al., 2005; Rozovsky et al., 2005; Takenaga and
Kozlova, 2006), deux problèmes majeurs se posent : 1) la présence de la barrière
hématoencéphalique restreint l’entrée des siARN à partir de la circulation périphérique, ce
qui rend inefficace toute approche systémique pour inhiber un gène dans le cerveau et 2) la
variété cellulaire considérable du SNC rend difficile une inhibition spécifique dans un seul
Introduction : L’ARN interférence
50
type de cellule. Par conséquent, il est nécessaire d’exprimer les siARN localement et
spécifiquement dans les structures cérébrales atteintes. De plus, au niveau cellulaire, il est
important de maîtriser le type cellulaire ciblé afin d’éviter tout effet non désiré. Pour
répondre à ces contraintes, l’utilisation des vecteurs viraux représente un moyen pour
permettre l’application de l’ARNi en thérapeutique humaine. De nombreuses études ont
montré l’utilisation de vecteurs viraux pour l’expression de shARN dans le système
nerveux central. La preuve de principe a été apportée pour la première fois en 2002 par
l’équipe de Beverly Davidson qui a montré que l’injection d’un vecteur adénoviral codant
un siARN dirigé contre l’eGFP pouvait éteindre l’expression de ce gène dans le striatum de
souris transgéniques le surexprimant (Xia et al., 2002). Un an plus tard, Chris Van den-
Haute et collaborateurs ont montré l’efficacité des vecteurs lentiviraux dans ce type
d’approches (Van den Haute et al., 2003). L’injection d’un vecteur codant un siARN
dirigée contre l’eGFP dans le striatum de souris, suivie une semaine après de l’injection
d’un vecteur lentiviral codant la protéine, a conduit à une inhibition de l’expression de
celle-ci de plus de 75%. Cette inhibition s’est maintenue six mois après transduction,
démontrant ainsi l’efficacité d’un vecteur lentiviral pour une expression à long terme d’un
shARN (Van den Haute et al., 2003).
Les vecteurs viraux se sont révélés efficaces pour déclencher l’ARNi dans différents
modèles murins de pathologies. En particulier cette stratégie a été utilisée dans un modèle
murin (modèle G93A) de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). La SLA familiale est
une maladie neurodégénérative caractérisée par la mort des motoneurones dans le cerveau
et la moelle épinière, résultant de la mutation (G93A) du gène de la SOD1 (Cu/Zn
Superoxide dismutase 1). L’injection dans la moelle d’un vecteur lentiviral exprimant un
shARN dirigé contre la SOD1 dans ce modèle, a permis de retarder l’apparition de la
maladie, ainsi que la réduction de l’atrophie musculaire (Raoul et al., 2005). Des résultats
similaires ont été obtenus après injection intramusculaire d’un vecteur EIAV (Ralph et al.,
2005) ou d’un AAV (Miller et al., 2005b) dans le même modèle. D’autres preuves
expérimentales de la capacité des vecteurs viraux à exprimer un shARN dans des
pathologies du système nerveux central ont été apportées. Ainsi, des vecteurs recombinants
AAV ont été utilisés pour traiter par ARNi des modèles murins de maladies par expansion
de polyglutamine, telles que la maladie de Huntington (Harper et al., 2005) ou l’ataxie
spinocérébelleuse de type 1 (SCA1, spinocerebellar ataxia type 1) (Xia et al., 2004). Des
Introduction : L’ARN interférence
51
vecteurs lentiviraux exprimant des shARN ont également été utilisés dans des modèles de
maladie d’Alzheimer (Singer et al., 2005) et de Parkinson (Sapru et al., 2006).
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
52
III. Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
III.1. Pré-requis des systèmes de régulation
Comme nous l’avons vu precédemment (chapitre I), pour des raisons de biosécurité,
l’application clinique de la thérapie génique nécessite le développement de systèmes
permettant le contrôle de l’expression de gènes introduits dans les cellules. Quel que soit le
système de régulation choisi, celui-ci doit lui-même répondre à certaines exigences
d’efficacité et de sécurité. Ainsi, il est nécessaire d’obtenir un système de régulation qui
réponde aux critères suivants (Toniatti et al., 2004) :
- spécificité : Le système ne doit pas interférer avec les réseaux de régulation
endogènes et ne doit pas être activable par un ligand endogène.
– sélectivité : l’induction doit se faire uniquement par un inducteur exogène non
toxique
– inductibilité : le système doit avoir un niveau d’expression basal faible et une
induction rapide et élevée.
– biodisponibilité : l’inducteur doit être une drogue biodisponible par voie orale et
capable de pénétrer les types tissulaires ciblés.
– réversibilité : l’inducteur doit avoir une cinétique d’élimination rapide dans tous
les tissus pour permettre des cycles répétés et rapides d’induction/répression.
– faible immunogénicité : l’activateur de transcription et l’inducteur doivent avoir
un potentiel immunogène le plus faible possible.
– dose-dépendance : la réponse du système doit être modulable par variation de la
concentration de l’inducteur.
– flexibilité : les composants du système de régulation doivent être constitué de
modules interchangeables. En effet, en fonction des différentes configurations
thérapeutiques ou tissus à cibler, il est nécessaire d’optimiser ou d’adapter le système.
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
53
En thérapie génique, la stratégie thérapeutique repose sur l’apport, ou l’inhibition
par le mécanisme de l’ARNi, d’un gène. Dans le premier cas, l’expression du transgène se
fait sous le contrôle d’un promoteur d’ARN polymérase II. En revanche, dans le deuxième
cas, l’expression des siARN se fait sous le contrôle d’un promoteur d’ARN polymérase III.
Plusieurs systèmes de régulation ont été décrits pour moduler l’expression des transgènes
pour chacun de ces promoteurs.
III.2. Les systèmes de régulation de l’expression d’un transgéne
III.2.1. Régulation des promoteurs d’ARN polymérase II
III.2.1.1. Le système de régulation par la tétracycline
Le système de régulation par la tétracycline développé par Gossen et Bujard en 1992
dérive de l’opéron de résistance à la tétracycline du transposon Tn10 d’Escherichia coli
(Gossen and Bujard, 1992). Chez la bactérie, la résistance est assurée par une protéine dont
l’expression est induite par la tétracycline. Celle-ci ou son analogue, la doxycycline (Dox),
induit un changement conformationnel de la protéine répresseur de la transcription (TetR),
ce qui conduit à la dissociation des séquences opérateurs (TetO). Par contre, en absence de
tétracycline, TetR se dimérize et se lie sur TetO.
Pour créer le système de régulation, Gossen et Bujard ont mis à profit la capacité du Tet R
à se lier au TetO en absence de tétracycline. Pour ce faire, ils ont remplacé le domaine
d’activation de la transcription de TetR par le domaine d’activation de la transcription
VP16 du virus HSV pour générer une protéine transactivatrice artificielle tTA (tetracycline
Transactivator). Sept copies de la séquence de TetO ont été placées en amont d’un
promoteur minimal CMV. Ainsi, en absence de tétracycline, la protéine de fusion tTA se
fixe sur TetO et active la transcription. En revanche, en présence de tétracycline, la tTA
subit un changement de conformation qui empêche sa fixation sur TetO et inactive ainsi la
transcription (Gossen and Bujard, 1992) (figure 19a). Ce système appelé “Tet-off”, a permis
une induction de l’expression d’un gène rapporteur d’un facteur 105 dans des cellules HeLa
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
54
exprimant de façon stable tTA en l’absence de tétracycline dans le milieu de culture
(Gossen and Bujard, 1992). Chez des souris transgéniques exprimant la luciférase ou la β-
galactosidase sous contrôle du système “Tet-off”, l’arrêt de l’apport en doxycycline a permis
d’augmenter jusqu’à 5000 fois le taux d’expression du gène considéré (Furth et al., 1994). Ce
système a également été utilisé in vivo pour réguler l’expression de l’EPO (Bohl et al.,
1997), d’immunoglobulines (Perez et al., 2004) ou encore de la tyrosine hydroxylase dans le
cerveau (Corti et al., 1999b; Corti et al., 1999a). Afin de réduire les interactions possibles
entre tTA et des facteurs cellulaires endogènes, le domaine d’activation VP16 du tTA a été
amputé de 12 acides aminés. Ces modifications ont permis de créer un nouveau
transactivateur tTA mieux toléré à une forte concentration intracellulaire (Baron et al.,
1997).
Le système « Tet-off » implique un apport continu de l’antibiotique pour inhiber
l’expression du gène d’intérêt, ce qui risque d’entraîner la nécessité de traitement assez long
avec l’antibiotique. Partant de ce constat, l’équipe d’Hermann Bujard a identifié un mutant
de TetR ayant un phénotype inverse, qui se fixe sur TetO en présence de tétracycline. Ce
nouveau transactivateur nommé rtTA (reverse tetracycline Transactivator) possède quatre
acides aminés mutés dans TetR. Par analogie à “Tet-off”, ce système a été nommé “Tet-on”
(Gossen et al., 1995) (figure19b).
L’activation du système Tet-on s’est révélée plus rapide que celle du système Tet-off, qui
dépend de l’élimination de la doxycycline. En effet, un facteur d’induction supérieur à 1000
a été observé dans des cellules HeLa exprimant le rtTA de façon constitutive en présence de
doxycycline dans le milieu de culture. De même, chez des souris transgéniques exprimant le
gène rapporteur luciférase sous contrôle du système “Tet-on”, l’apport de doxycycline a
permis d’induire l’expression du transgène d’un facteur supérieur à 105 (Kistner et al., 1996).
Toutefois, le système Tet-on est moins sensible à l’inducteur que le système Tet-off, ce qui
soulève la question de la concentration minimale de doxycycline nécessaire pour induire le
système Tet-on de façon efficace in vivo. Cependant, cette faible sensibilité du rtTA à la
doxycycline peut devenir un avantage et peut être exploité pour permettre une régulation
différentielle de deux gènes différents avec deux concentrations d’antibiotiques différentes.
Ainsi, les deux transactivateurs tTA et rtTA ont été utilisés pour moduler
indépendamment l’expression de deux gènes rapporteurs. Ceux-ci peuvent être maintenus
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
55
dans un état de pré-activation à une concentration intermédiaire de doxycycline (Baron et
al., 1999). Plus récemment, une approche par évolution virale a permis d’isoler des variants
de rtTA qui, en présence de doxycycline, sont 25 fois plus sensibles et 5 fois plus actifs que
le rtTA original sans affecter l’activité basale en absence de l’inducteur (Das et al., 2004).
En plus de la faible sensibilité à l’inducteur, le système Tet-on présente une activité
résiduelle due à une affinité du rtTA au TetO en absence de doxycycline. Pour remédier à
cette fuite d’expression en absence de l’inducteur, des mutations aléatoires sur le
transactivateur tTA ont été effectuées. Cette stratégie a permis d’isoler deux nouveaux
transactivateurs dénommés rtTA2-S2 et rtTA2-M2 qui possèdent une meilleure sensibilité à
l’inducteur et une activité basale réduite en absence de doxycycline (Urlinger et al., 2000).
rtTA2-S2 présente un niveau basal plus faible que rtTA2-M2, mais ce dernier présente
néanmoins l’avantage d’être environ 10 fois plus sensible à la doxycycline. (Urlinger et al.,
2000; Lamartina et al., 2002). Ces nouveaux transactivateurs ont été utilisés avec succès in
vivo pour contrôler l’expression de nombreux transgènes après transfert dans différents
tissus, et avec une grande variété de vecteurs (Aurisicchio et al., 2001; Lamartina et al.,
2002; Salucci et al., 2002; Koponen et al., 2003). Toutefois, malgré les améliorations
apportées, ces nouveaux transactivateurs présentent toujours une fuite d’expression
importante en absence d’inducteur. Pour réduire la fixation du rtTA sur les TetO en
absence d’inducteur, un répresseur de la transcription ou “silencer” tTS (tetracycline
Transcriptionnal Silencer), également dépendant de la tétracycline, a été utilisé (Freundlieb
et al., 1999). En absence de doxycycline, tTS se fixe sur TetO à la place du rtTA, ce qui
inhibe efficacement la transcription. En revanche, en présence de doxycycline, cette
répression est levée, ce qui entraîne la fixation de rtTA et induit la transcription. Le tTS est
une protéine de fusion entre le domaine répresseur de KRAB (Kruppel-Associated Box) de
la protéine humaine Kid-1 et le domaine de fixation à l’ADN de TetR. Plusieurs études ont
montré que la combinaison du système rtTA avec tTS permet de réduire l’expression basale
d’un gène in vivo (Zhu et al., 2001; Salucci et al., 2002; Lamartina et al., 2003; Mizuguchi et
al., 2003). Pour optimiser l’apport de ce système activation /répression, tous les
composants ont été introduits dans un seul vecteur adénoviral et évalués in vitro et in vivo
(Salucci et al., 2002; Mizuguchi et al., 2003; Rubinchik et al., 2005; Xiong et al., 2006).
Toutefois, il a été montré que l’inclusion de tTS induisait une diminution de l’activation du
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
56
transgène (Lamartina et al., 2003), et que cette activation était progressivement perdue dans
des cellules CHO transduites avec un vecteur lentiviral exprimant à la fois rtTA2-M2 et
tTSKid (Barde et al., 2006). Une faible activité basale et un fort taux d’induction ont toutefois
été observés dans cette étude (Barde et al., 2006).
Une approche différente pour contrôler l’expression de rtTA et de ce fait
l’expression du transgène en absence d’inducteur, consiste à placer l’expression du rtTA
sous “autorégulation” (Chtarto et al., 2003). Cette stratégie a permis in vitro une expression
basale faible et un niveau d’expression du gène d’intérêt supérieur à celui obtenu avec un
promoteur CMV (Markusic et al., 2005).
Les systèmes de régulation par la tétracycline se sont illustrés avec succès dans leurs
capacités à contrôler efficacement un gène d’intérêt in vitro et in vivo, ce qui fait d’eux
aujourd’hui des outils de choix pour la régulation de l’expression de gènes dans des cellules
de mammifères. Partant de ce constat, nous avons utilisé le système “Tet-on“ dans le cadre
de notre étude.
III.2.1.2. Le système de régulation par l’ecdysone
Durant la morphogenèse des insectes, en particulier chez la drosophile, l’ecdysone
déclenche une cascade de changements morphologiques via un récepteur hétérodimérique
composé du récepteur nucléaire à l’ecdysone (EcR) et du récepteur nucléaire ultraspiracle
(USP). En présence de l’hormone, le récepteur EcR complexé à USP se lie à des éléments de
réponse (ER) à l’ecdysone qui sont présents dans les régions promotrices de gènes
répondant aux ecdystéroïdes, ce qui permet une transactivation de la transcription (Thomas
et al., 1993). Basé sur ces observations, l’équipe de Ronald Evans a crée un système de
régulation adapté aux mammifères (No et al., 1996). Toutefois, l’origine des composants du
système de régulation par l’ecdysone des insectes peut entraîner une réponse immunitaire
qui limite l’utilisation de ce type de système en thérapie humaine. Cependant, ce système
de régulation n’en demeure pas moins un outil formidable de contrôle de l’expression d’un
transgène, qui trouve de nombreuses applications en recherche fondamentale.
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
57
Le système de régulation par l’ecdysone repose sur la capacité de cette hormone à
dimériser deux proteines pour former un hétérodimère capable de se fixer à des domaines
de liaisons sur l’ADN spécifiques situés en amont d’un promoteur. Cette fixation déclenche
la transcription. Pour ce faire, le domaine d’activation de EcR a été remplacé par le
domaine d’activation VP16 du virus HSV pour générer un transactivateur chimèrique
EcR/VP16. Le gène USP a été remplacé par son homologue chez les mammifères : le
récepteur alpha au rétinoide X (RXRα). En présence de l’ecdysone ou de son analogue, la
muristérone A, le transactivateur EcR/VP16 se lie à RXR et forme un complexe dimérique
qui se lie aux séquences ER situées en amont du promoteur du gène d’intérêt. La
transcription est ainsi activée (figure 20). La co-expression de RXR avec le récepteur
hétérodimérique dans des cellules 293 permet une stimulation jusqu’à 104 fois du gène
rapporteur en présence de 1µM de muristérone A (No et al., 1996). Ce système s’est
également révélé efficace in vivo. Le niveau basal d’expression est très faible en absence de
l’inducteur. En revanche, en présence de l’inducteur, une induction significative a été
obtenue (No et al., 1996). La nature lipophile de la muristérone A permet la diffusion
efficace dans tous les tissus y compris dans le cerveau. De plus, sa durée de vie très courte,
son absence de toxicité dans les cellules de mammifères in vitro et in vivo représentent un
avantage certain pour l’utilisation de ce système en thérapie génique expérimentale.
Toutefois, il nécessite l’expression simultanée de ces trois composants (Ecr/VP16, RXR et
le transgène) dans les cellules cibles et la surexpression du récepteur RXR risque d’entraîner
des effets pléiotropiques en interférant avec des voies de transduction endogènes.
RXR est exprimé de façon ubiquitaire dans les cellules de mammifères. Cependant, a
l’exception des cellules 293, l’expression basale de RXR dans les cellules de mamifères n’est
pas suffisante pour la formation de l’hétérocomplexe EcR/RXR en présence d’ecdysone
(Yao et al., 1992; Thomas et al., 1993; Yao et al., 1993). En effet, la formation de
l’hétérocomplexe EcR/RXR nécessite un rapport équimolaire entre les deux protéines.
Cette limite a été levée par l’expression bicistronique des deux protéines (Ecr et RXR) à
partir d’un promoteur CMV, ce qui a permis d’obtenir un taux important d’inductibilité
(Wyborski et al., 2001). Ce système a récemment été introduit dans un vecteur lentiviral et
évalué in vivo (Galimi et al., 2005). Dans cette étude, des cellules souches hématopoïétiques
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
58
ont été transduites avec deux vecteurs lentiviraux, l’un exprimant à la fois EcR et RXR et
l’autre exprimant le gène rapporteur GFP. Quatre mois après greffe de ces cellules, une
expression de GFP a pu être détectée lorsque les animaux ont été traités avec l’analogue de
l’ecdysone, démontrant ainsi l’efficacité d’un tel système pour contrôler l’expression d’un
gène d’intérêt dans le cadre d’une approche ex vivo. Cette approche, nécessite l’utilisation
de deux vecteurs viraux.
En parallèle, une nouvelle version du système ecdysone, qui ne nécessite pas de RXR, a été
développée. Celle-ci est fondée sur le récepteur à l’ecdysone du ver à soie (Bombix
mori)(BmEcR), qui permet un fort niveau de transactivation après traitement par un
agoniste de l’ecdysone, le tebufénozide (Suhr et al., 1998). En tirant profit de cette
propriété, Hoppe et ses collègues ont développé un nouveau transactivateur composé pour
sa partie de liaison à l’ADN de l’EcR de la drosophile, et pour sa partie activatrice, du
domaine activateur de BmEcR (Hoppe et al., 2000). Ce transactivateur s’est révélé efficace
après transduction de cellules de mammifères par un seul vecteur adénoviral, en présence de
ponastérone A (analogue de l’ecdysone) ou d’un diacylhydrazine GS-E (agoniste non
stéroïdien de l’ecdysone). La fonctionnalité de ce système a également été démontrée in
vivo après injection d’un vecteur adénoviral dans le muscle cardiaque de rat et traité ou non
avec le GS-E (Hoppe et al., 2000).
La recherche de nouveaux ligands capables d’améliorer l’efficacité du système de
régulation par l’ecdysone a conduit à l’identification de plusieurs phytoecdystéroides,
comme la ponastérone A, qui se sont montrés très efficaces comme activateurs de
l’expression d’un transgène in vitro et in vivo (Saez et al., 2000). De plus, une meilleure
sélectivité entre inducteurs a été obtenue par l’utilisation d’un récepteur muté à l’ecdysone
de l’espèce Choristoneura fumiferana (CfEcR) (Kumar et al., 2002). Ce récepteur a perdu la
capacité de liaison et de transactivation en présence de stéroïdes, mais pas en présence de
ligands non stéroïdiens comme GS-E (Kumar et al., 2002). Ce système peut être utile pour
contrôler l’expression de transgènes chez les insectes ou les plantes qui possèdent des
ecdystéroïdes endogènes. Pour réduire l’activité basale et augmenter le niveau d’induction,
de nouveaux transactivateurs basés sur CfEcR ont été utilisés (Karns et al., 2001; Palli et al.,
2003; Karzenowski et al., 2005). Une meilleure sensibilité à l’inducteur a été obtenue par
l’utilisation d’un nouveau mutant de CfEcR, puisqu’une induction maximale a été obtenue
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
59
avec une concentration de l’ordre du nanomolaire d’inducteurs non stéroïdiens
(Karzenowski et al., 2005).
Les versions actuelles des systèmes de régulation fondés sur le système ecdysone disposent
d’une forte sensibilité aux inducteurs stéroïdiens ou, dans le cas des versions qui dérivent de
CfEcR, aux ligands non-stéroïdiens. Ces performances, mais également l’absence
d’interactions avec des systèmes de mammifères, font de ces systèmes de régulation des
outils intéressants pour la régulation temporelle de gènes in vitro et in vivo. Toutefois, une
étude récente vient de mettre l’accent sur un effet potentiel des ecdystéroïdes dans les
cellules de mammifères (Oehme et al., 2006). En effet, l’exposition de cellules de carcinome
du colon à la muristérone A entraîne un effet antiapoptotique via l’inhibition de FasL et
TRAIL (Oehme et al., 2006). Ces résultats sont contraires aux précédentes publications
selon lesquelles les ecdystéroïdes n’influencent pas la physiologie cellulaire. Ces effets
semblent être des effets directs des analogues de l’ecdysone sur la régulation de gènes
endogènes.
III.2.1.3. Le système de régulation par le mifépristone ou RU486
Le système de régulation par le mifépristone est fondé sur les propriétés d’un
mutant du récepteur à la progestérone humaine (hPR). Une délétion dans la partie C-
terminale du récepteur entraîne la perte de fixation de la progestérone, mais n’empêche pas
une interaction avec les antagonistes comme le mifépristone (ou RU486). Une fois activé, le
récepteur muté agit comme un agoniste en activant la transcription (Vegeto et al., 1992). Le
remplacement du domaine de liaison à l’ADN de hPR par celui de Gal-4 (GL) a éliminé la
possibilité d’activation de gènes endogènes, et sa fusion avec le domaine d’activation de
VP16 (VP) crée un nouveau transactivateur chimérique (GLVP) fort (figure 21) (Wang et
al., 1994). En présence d’une concentration faible (0,01 à 1 nM) de RU486, ce récepteur
chimérique s’est révélé particulièrement efficace in vitro pour activer un gène endogène
placé sous le contrôle d’un promoteur minimal contenant en amont les éléments de
réponse de GAL-4 (Wang et al., 1997b). Ce système a également été évalué chez des souris
transgéniques exprimant GLVP et l’hormone de croissance (hGH) sous contrôle d’un
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
60
promoteur inductible (Wang et al., 1997a). En présence de doses de 250 à 500 µg/kg de
RU486, l’expression de hGH a pu être augmentée jusqu’à 3500 fois.
Dans le but d’une éventuelle application chez l’homme, le domaine d’activation
VP16 du transactivateur a été remplacé par le domaine d’activation de la sous unité P65 du
facteur NF-κB humain (Burcin et al., 1999). Un niveau basal faible de transactivation a été
mesuré en absence d’inducteur. Cependant, le transactivateur étant lui même contrôlé par
un promoteur contenant des éléments de réponse de GAL-4, la fuite en absence de ligand a
pu être réduite (Abruzzese et al., 2000). Enfin, une nouvelle version du système
mifépristone, dénommé GS4, a été développée dans laquelle le domaine GAL4 est tronqué,
permettant d’éviter la dimérisation spontanée du transactivateur, réduisant encore le niveau
d’expression basale (Nordstrom, 2002).
Les avantages du système de régulation par la mifépristone résident dans la faible
activité basale et la rapidité d’induction de l’expression du gène d’intérêt. De plus, une
concentration de 50 à 250 µg/kg de mifépristone est suffisante pour induire l’expression du
du gène rapporteur in vivo (Ye et al., 2002). Cette concentration est 40 à 80 fois inférieure à
la dose prescrite pour un effet contraceptif. Toutefois, les niveaux d’expression obtenus
avec ce système restent faibles par rapport à ceux obtenus avec le système inductible par la
tétracycline ou le système inductible par la rapamycine (Xu et al., 2003). Enfin, les
dernières versions de transactivateurs développées à cette date contiennent le domaine de
liaison à l’ADN de GAL-4 de levure et de ce fait ne sont pas entièrement d’origine
humaine. Des risques immunogènes sont donc possibles, réduisant ainsi le potentiel de ce
système en thérapie humaine.
III.2.1.4. Le système de régulation par le tamoxifène
Contrairement aux systèmes de régulations tétracycline, ecdysone et mifépristone,
le système de régulation par le tamoxifène est un système entièrement d’origine humaine ce
qui constitue un atout pour toute application clinique. Ce système consiste en un nouveau
transactivateur composé du domaine de liaison à l’ADN de HNF1α (Human hepatocyte
Nuclear Factor-1α), du domaine muté de liaison au ligand du récepteur à l’oestrogène et
pour sa partie activatrice, du domaine activateur de la sous-unité p65 de NF-κB (figure 22)
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
61
(Roscilli et al., 2002). Ce transactivateur chimérique permet la fixation du 4-
hydroxytamoxifène (4-OHT), mais a perdu la capacité de lier l’oestradiol. Ainsi en présence
de 4-OHT, ce système a permis in vitro d’obtenir un taux d’induction de la transcription
d’un facteur 1000 et in vivo d’un facteur 100. De plus, une expression à long terme (jusqu’à
10 mois) d’erythropoïétine a été obtenue via ce système chez des souris traitées chaque jour
avec du 4-OHT (Roscilli et al., 2002).
L’utilisation d’un transactivateur d’origine humaine permet de s’affranchir des effets
immunogènes possibles. De plus, le tamoxifène qui est transformé in vivo en 4-OHT, est
une molécule largement utilisée en clinique. Ces critères sont des éléments en faveur de
l’utilisation de ce système en thérapeutique humaine. Cependant, des développements
accrus, et particulièrement l’amélioration de l’affinité du transactivateur au tamoxifène sont
nécessaires. En effet, les doses de tamoxifène nécessaires à l’activation du système de
régulation excèdent les doses prescrites en clinique. Il a été mis en évidence qu’un excès de
tamoxifène peut induire des effets secondaires importants et notamment des cancers de
l’utérus ou des bouffées de chaleur (Toniatti et al., 2004). Pour s’affranchir de ces effets
secondaires, une voie possible serait l’utilisation de l’évolution dirigée pour créer de
nouveaux transactivateurs plus affins au tamoxifène et ainsi apporter des garanties
supplémentaires à l’utilisation de ce système en thérapeutique humaine.
III.2.1.5. Le système de régulation par la rapamycine
Ce système de régulation est fondé sur la capacité de la rapamycine, une molécule
immunosuppressive à induire la dimérisation de la protéine cellulaire FKBP12 (FK506
Binding Protein) avec la protéine kinase FRAP (FKBP12 Rapamycin-Associated Protein ou
mTOR) (Pollock and Clackson, 2002). Partant de ce constat, il a été développé un système de
régulation qui repose sur le contrôle de la dimèrisation de deux protéines chimèriques qui
sont inactives à l’état de monomères et forment un facteur de transcription une fois
l’hétérodimère formé en présence de rapamycine. La première protéine chimérique est
composée du domaine de liaison à l’ADN et la deuxième contient le domaine d’activation
de la transcription. Les deux contiennent les domaines de liaison au ligand qui permettent
la dimérisation en présence de rapamycine ou son analogue naturel, FK506. Dans ce
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
62
système, la première protéine chimère est une fusion entre le domaine de liaison à l’ADN
de la protéine ZFHD1 et trois domaines de liaison à la rapamycine de la protéine FKBP12.
La seconde protéine chimère est constituée du domaine de liaison FRB à la rapamycine de
la protéine cellulaire humaine FRAP fusionnée au domaine de transactivation de la
protéine NFκB p65. (Rivera et al., 1996) (Figure 23). La protéine ZFHD1 reconnaît la
séquence consensus spécifique TAATTANGGGNG sur l’ADN (Pomerantz et al., 1995).
Le gène cible est sous le contrôle d’un promoteur CMV minimal (Rivera et al., 1996) ou IL-
2 minimal (Pollock et al., 2000) qui porte en amont 12 séquences de liaison à ZFHD1. En
présence de rapamycine, ce système induit l’expression rapide du gène cible in vitro et in
vivo (Rivera et al., 1996; Magari et al., 1997; Pollock et al., 2000). L’amélioration majeure
de ce système a porté sur le domaine d’activation du transactivateur. Ainsi une version plus
activatrice a été réalisée en combinant les domaines d’activations des protéines p65 et HSF
(Human heat Shock Factor 1) humaines (Pollock et al., 2000).
Le système de régulation par la rapamycine a été inséré avec succès dans différents
vecteurs viraux parmi lesquels les vecteurs rétroviraux (Pollock et al., 2000), lentiviraux
(Kobinger et al., 2005), adénoviraux (Rivera et al., 1999; Auricchio et al., 2002a; Chong et
al., 2002), HSV (Wang et al., 2003) et AAV (Ye et al., 1999; Auricchio et al., 2002b;
Lebherz et al., 2005; Rivera et al., 2005).
L’absence d’induction du transgène, ainsi que l’absence d’interaction entre FKBP et
FRAP en absence d’inducteur, constituent un avantage certain de ce système de régulation.
En comparaison avec le système tétracycline et le système de régulation par les stéroïdes, le
système de régulation par la rapamycine presente une sensibilité plus importante à
l’inducteur. De plus, comme pour le système tétracycline, le système rapamycine permet
une induction rapide et importante de l’expression du transgène comparé au système de
régulation par les stéroïdes (Go and Ho, 2002; Xu et al., 2003). Toutefois, les propriétés
immunosuppressives de la rapamycine constituent un point faible de ce système de
régulation. Pour résoudre ce problème, des analogues de la rapamycine qui n’ont pas
d’effets immunosuppresseurs mais qui gardent la capacité de déclencher la transcription,
ont été développés. Ces analogues contiennent des modifications des carbones 7 ou 16 de la
rapamycine, et conservent la capacité de dimériser les protéines contenant les domaines
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
63
FKBP12 et FRB muté (FRB-T2098L) (Pollock and Clackson, 2002; Toniatti et al., 2004).
Ces analogues appelés AP22565 et AP21967 ont permis d’activer la dimérisation des deux
monomères chimériques et de déclencher la transcription in vitro et dans des modèles
animaux de greffe (Chong et al., 2002; Pollock and Clackson, 2002). Depuis, d’autres
analogues ont été développés, notamment l’AP22594 qui s’est révélé efficace pour contrôler
l’expression de l’EPO dans le muscle de singe rhésus après transduction par un vecteur
AAV (Rivera et al., 2005). De nouveaux ligands de dimérisation dérivés de FK506 ont
également été développés (Pollock and Clackson, 2002).
III.2. 2. Régulation des promoteurs d’ARN polymérase III
III.2.2.1. Description des promoteurs d’ARN polymérase III
Il existe trois types de promoteurs d’ARN polymérase III dénommés promoteurs de
types I à III (Paule and White, 2000; Schramm and Hernandez, 2002) :
- Le promoteur de type I est constitué du promoteur du gène de l’ARN5S qui code pour les
petits ARN ribosomaux (Bogenhagen et al., 1980; Sakonju et al., 1980).
- Le promoteur de type II inclut le promoteur du gène VAI de l’adénovirus de type 2
(Fowlkes and Shenk, 1980), ainsi que le promoteur des ARN de transfert (Galli et al., 1981;
Hofstetter et al., 1981).
- Le promoteur de type III comprend : le promoteur du gène U6 qui code pour les petits
ARN nucléaires qui composent le spliceosome (Das et al., 1988; Kunkel and Pederson,
1988), le promoteur du gène 7SK (Murphy et al., 1986) dont le produit de transcription est
impliqué dans la régulation du complexe CDK9/cycline T (Nguyen et al., 2001), ainsi que
le promoteur du gène H1 qui code pour des composants de la Ribonucléase P (Bartkiewicz
et al., 1989). A la différence des promoteurs de type III, les promoteurs de types I et II sont
intragéniques. Ils ne peuvent donc être utilisés pour l’expression régulée des shARN (figure
24).
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
64
Nous ne détaillerons ici que cette classe de promoteur et plus particulièrement le
promoteur U6 humain, utilisé dans notre étude1.
III.2.2.2. Le promoteur U6 humain
Parmi les promoteurs d’ARN polymérase III, le promoteur U6 est celui qui est le
mieux caractérisé. Le promoteur U6 humain est composé de trois éléments de séquences
qui sont situés à une position strictement définie du site d’initiation de la transcription : la
boîte TATA à la position -24 à -29, un élément de séquence proximal (ESP) de -47 à – 66 et
un élément de séquence distal (ESD) de -149 à -244 (figure 25) (Das et al., 1988; Kunkel and
Pederson, 1989). La boîte TATA et l’ESP constituent le core du promoteur (Hernandez
and Lucito, 1988). La délétion, la subsitution de séquence et certaines mutations ponctuelles
dans la boîte TATA abolissent complétement la transcription (Mattaj et al., 1988; Kunkel
and Pederson, 1989; Lobo and Hernandez, 1989; Parry and Mattaj, 1990). De même, la
suppression de la boîte TATA conduit à un changement de la transcription qui passe de
l’ARN polymérase III à l’ARN poymérase II (Mattaj et al., 1988; Lobo and Hernandez,
1989; Lescure et al., 1991). Egalement, la délétion ou la mutation dans l’ESP abolit la
transcription (Kunkel and Pederson, 1988; Lobo and Hernandez, 1989; Parry and Mattaj,
1990). L’ESD induit la transcription à partir du core du promoteur. Ainsi la délétion de
l’ESD réduit drastiquement le niveau de transcription (Murphy et al., 1989; Danzeiser et
al., 1993).
L’initiation de la transcription à partir du promoteur U6 débute par la
reconnaissance de l’ESP par un complexe multiprotéique dénommé SNAPc (« snRNA
activating protein complex »). Celui-ci induit la liaison de la protéine TBP (« TATA-
Binding Protein ») sur la boîte TATA. Une interaction existe entre les protéines SNAPc et
TBP après la fixation respective sur l’ESP et la boîte TATA (Bai et al., 1996; Henry et al.,
1996; Sadowski et al., 1996). Cette interaction entraîne la fixation du facteur de
transcription TFIIIB, qui conduit au recrutement de l’ARN polymérase III (figure 26).
1 L’utilisation de la terminologie « promoteur d’ARN polymérase III » dans la suite de ce manuscript se rapportera exclusivement à cette classe de promoteur.
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
65
L’ESD agit comme un activateur de la transcription en agissant sur le « core » du
promoteur (Murphy et al., 1986; Murphy et al., 1987; Das et al., 1988). En effet, la fixation
des facteurs de transcriptions, STAF1 (également appelé « SPH binding factor » ou SBF) et
Oct-1, sur les sites de liaison présents dans l’ESD (Schramm and Hernandez, 2002)
induisent l’activation de la transcription en interragissant avec la protéine SNAPc (Das et
al., 1995; Schuster et al., 1998). En particulier, Oct-1 stabilise la fixation du complexe
SNAPc sur l’ESP, augmentant ainsi le niveau de transcription (Murphy et al., 1992; Mittal
et al., 1996; Mittal et al., 1999).
III.2.2.3.Développement de promoteurs d’ARN polymérase III régulables
Les systèmes qui permettent de contrôler l’expression d’un transgène font appel à
un promoteur d’ARN polymérase II et ne peuvent donc être directement transposés à un
promoteur d’ARN polymérase III. L’expression des shARNs par un promoteur d’ARN
polymérase III doit répondre à des contraintes imposées par la structure même du
promoteur. Plusieurs systèmes ont été développés pour réguler ce type de promoteur.
Le premier est basé sur le système tétracycline. En raison des limites spatiales
imposées par la structure du promoteur d’ARN polymérase III, ce système repose sur une
stratégie négative. La séquence située entre la boite TATA et le site de démarrage de la
transcription a été remplacée par une seul séquence TetO. En présence de tétracycline, le
répresseur Tet (TetR) ne peut se lier à TetO. Par conséquent, les facteurs de démarrage de
la transcription peuvent induire la transcription. Inversement, en l’absence de tétracycline,
la liaison de TetR sur TetO perturbe la formation du complexe d’initiation de la
transcription. Cette stratégie a été utilisée pour construire des promoteurs H1 (van de
Wetering et al., 2003; Hosono et al., 2004; Matthess et al., 2005) ou U6 (Czauderna et al.,
2003) régulables par la tétracycline afin d’exprimer des shARN. Toutefois, une fuite
importante de la transcription a été observée. De même, l’intégration d’un TetO entre
l’ESP et la boîte TATA induit une fuite importante de la transcription (Matsukura et al.,
2003; Matthess et al., 2005). Cette fuite peut s’expliquer par la présence d’un seul TetO qui
ne permet pas une interaction forte et durable entre TetO et le transactivateur. Pour
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
66
contourner cette limite, Lin et al. (2004) ont intégré deux séquences TetO de part et d’autre
de la boite TATA et ont démontré une efficacité de régulation plus importante (Lin et al.,
2004). De la même façon au laboratoire nous avons construit plusieurs promoteurs
chimériques dérivés du promoteur U6 qui contrôlent l’expression de shARN dirigées
contre la GFP (shGFPs) (Données non publiées). Nous avons intégré une séquence TetO
en amont ou en aval de la boite TATA, ou deux séquences TetO de part et d’autre de la
boite TATA. Cependant, contrairement aux résultats obtenus par Lin et al, nous avons
observé une fuite importante de l’expression de shGFPs.
Le deuxième système est fondé sur la possibilité de contrôler l’activité
transcriptionnelle du promoteur d’ARN polymérase III à distance. Dans ce contexte,
Wiznerowicz et Trono (2003) ont intégré plusieurs séquences TetO en amont du
promoteur H1. Dans ce travail, un nouveau transactivateur a été construit. Celui-ci
comprend le domaine de liaison à l’ADN de TetR et pour sa partie effectrice le domaine
KRAB. Ce dernier est un domaine retrouvé dans un grand nombre de protéines en doigt de
zinc. KRAB inhibe la transcription des promoteurs d’ARN polymérase I, II et III sur une
distance de plus de 3 kb du site de liaison, en agissant sur la formation de
l’hétérochromatine (Urrutia, 2003). En l’absence de doxycycline, TetR-KRAB se lie sur les
TetO et supprime l’activité des promoteurs qui se trouvent à proximité. Inversement, en
présence de Dox, TetR-KRAB est séquestré et ne peut se lier aux TetO ce qui entraîne
l’expression des transgènes (Deuschle et al. 1995). Toutefois, la capacité de KRAB à
interagir avec les machineries transcriptionnelles dépendantes des polymérases II et III à
une distance de 3 kb du site de liaison (Margolin et al., 1994 ; Moosmann et al., 1997 ;
Senatore et al., 1999) peut conduire à des effets non désirés. Cette stratégie ne permet donc
pas d’induire spécifiquement un promoteur de l’ARN polymérase III et donc de réguler
uniquement l’expression des shARN.
Pour pallier ce manque de spécificité, un troisième système a été développé. Das et
al. (1995) ont construit un nouveau transactivateur (GAL4-Oct2), dans lequel le domaine
d’activation de la protéine activatrice GAL4 est remplacé par quatre copies de la portion
143 à 160 du facteurs de transcription Oct-2 dans lesquels tous les résidus glutamines sont
mutés en alanine ((Oct-2(4xQ18Q→A)). Ces mutations permettent l’activation spécifique du
Introduction : Stratégies de régulation de l’expression d’un gène
67
promoteur U6 (Das et al., 1995). GAL4-Oct2 a été utilisé pour réguler indirectement
l’ARNi (Gupta et al., 2004). Dans cette étude, les auteurs ont remplacé l’ESD du promoteur
U6 par 4 séquences de liaison à GAL4. Ceci permet la fixation du transactivateur GAL4-
Oct2 et l’activation de l’expression des shARN. Cependant, ils utilisent un système indirect
puisque la régulation s’effectue au niveau de l’expression du transactivateur GAL4-Oct2 par
le biais de l’ecdysone. L’utilisation de ce système est restreinte puisque trois unités
transcriptionnelles sont nécessaires et ne peuvent être insérées dans un seul vecteur (trois
vecteurs ont été utilisés).
.
Objectifs de notre étude
68
IV. Objectifs de notre étude
La thérapie génique des maladies du système nerveux recouvre toute approche
visant à prévenir ou à traiter une maladie par transfert de matériel génétique. Celui-ci peut
permettre l’expression d’une protéine thérapeutique ou l’inhibition d’un gène endogène par
le biais du mécanisme d’ARN interférence. La thérapie génique nécessite des outils de
transfert de gène efficaces. Les vecteurs lentiviraux dérivés du HIV-1 constituent des
vecteurs de choix pour le transfert de gènes thérapeutiques dans le système nerveux central.
Cependant, pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs en clinique, il est primordial de
réguler l’expression du transgène. Ceci permet d’exprimer le gène thérapeutique en
fonction des besoins du patient et, si nécessaire, d’éteindre l’expression du transgène en cas
d’effets secondaires indésirables. Le système de régulation inductible par la tétracycline
(Tet-on) est largement utilisé et s’est révélé efficace in vitro et in vivo.
Jusqu’à présent, l’expression régulée d’un transgène par la tétracycline nécessitait
deux vecteurs lentiviraux, un premier pour exprimer le transactivateur et le second pour
exprimer le transgène. Dans le contexte du transfert de gène in vivo, il est important de
disposer d’un seul vecteur lentiviral pour exprimer à la fois le transactivateur et le
transgène.
Au début de ce travail, seules deux équipes avaient proposé des vecteurs lentiviraux
uniques dont l’expression du transgène est régulable par la tétracycline. Cependant ces
chercheurs ont utilisé le système Tet-off. De plus, ces vecteurs décrits ne permettaient
d’exprimer de manière régulable que des petits transgènes comme la GFP. L’utilisation du
système Tet-on est indiquée pour cette application.
Objectifs de notre étude
69
Dans ce contexte, l’objectif de ce travail était :
- d’intégrer le système Tet-on dans un seul vecteur lentiviral et montrer sa capacité à
exprimer de façon régulée des gènes thérapeutiques tels que la tyrosine hydroxylase in vitro
et dans un modèle de la maladie de Parkinson
- d’adapter le système Tet-on au promoteur d’ARN polymérase III, d’incorporer
l’ensemble de ce système dans un seul vecteur lentiviral et de valider sa capacité à réguler
l’expression de shARN.
Résultats et Commentaires
70
RESULTATS ET COMMENTAIRES
Résultats et Commentaires
71
I- Construction d’un vecteur lentiviral pour permettre l’expression régulée d’un transgène dans le cerveau.
Article 1 :
A single lentivirus vector mediates doxycycline-regulated expression of
transgenes in the brain.
Roland VOGEL, Lahouari AMAR, Anh DO-THI, Paulette SAILLOUR and
Jacques MALLET
Hum Gene Ther. 2004
Lorsque nous avons entrepris ce travail, de nombreuses équipes, parmi lesquelles le
LGN avaient validé la fonctionnalité du système Tet, que ce soit dans des animaux
transgéniques (Zhu et al., 2002), ou au sein de vecteurs adénoviraux (Corti et al., 1999b),
AAV (Fitzsimons et al., 2001) et HSV (Schmeisser et al., 2002).
Le contrôle de l’expression d’un transgène nécessite l’apport de deux cassettes d’expression :
la première permet l’expression du transactivateur et la deuxième l’expression du transgène.
Ainsi, l’expression régulée d’un transgène par le système Tet-off a pu être obtenue par
l’expression indépendante des deux cassettes via deux vecteurs lentiviraux distincts (Vigna
et al., 2002).
En vue d’une éventuelle application clinique, il est nécessaire que la quantité de vecteur
administrée au patient soit la plus faible possible et ceci afin de réduire les risques de
mutagenèse insertionnelle. En effet, il a été rapporté suite à l’essai clinique sur des enfants
atteints d’un déficit immunitaire sévère lié au chromosome X, le développement d’une
leucémie chez deux de ces patients (Hacein-Bey-Abina et al., 2002). Cette leucémie est due à
l’insertion du vecteur rétroviral au sein du locus du proto-oncogène LMO-2. L’insertion du
provirus a entraîné un effet enhancer du LTR viral sur la transcription du gène LMO-2, et
induit une expression aberrante de la protéine, responsable de la transformation cellulaire
(Hacein-Bey-Abina et al., 2003a).
Afin de limiter ce type d’effets secondaires, la possibilité d’insertion des deux
cassettes d’expression dans un même vecteur a été envisagée. Cependant, la possibilité
Résultats et Commentaires
72
d’insertion des deux cassettes d’expression dans un même vecteur lentiviral était jusqu’alors
limitée par la présence de la séquence polyA qui empêchait la production des particules
virales. C’est pourquoi, nous avons développé un seul vecteur lentiviral qui permet
l’expression contrôlée d’un transgène thérapeutique par le système Tet-on. Les deux
cassettes d’expression ont été intégrées au sein du génome lentiviral de part et d’autre de la
séquence d’import nucléaire appelée séquence “Flap”.
La cassette d’expression du transgène introduite a été placée sous le contrôle d’un
promoteur CMV minimal (CMVmin) qui contient en amont les sept domaines de fixation
du transactivateur. Afin d’augmenter l’expression du transgène, une séquence WPRE a été
intégrée en aval du transgène. La deuxième cassette qui permet l’expression du
transactivateur rtTA2M2 sous le contrôle du promoteur de la phosphoglycérate kinase
(PGK) a été orientée en antisens par rapport à la synthèse du génome du vecteur.
L’orientation antisens permet la transcription du génome du vecteur pendant la production
des particules virales. Pour s’affranchir de la séquence poly(A) du LTR3’, une séquence
poly(A) unidirectionnelle qui dérive du gène de l’hormone de croissance bovine
(BGHpoly(A)) a été intégrée dans la deuxième cassette comme séquence de polyadénylation
du transcrit rtTA2M2 (figure 1). Afin de supprimer les effets transactivateurs entre les
promoteurs des deux cassettes d’expression, la séquence insulatrice de la β-globine de poulet
a été insérée entre les deux cassettes d’expression (Bell et al., 1999). Afin de maintenir la
séquence Flap dans une position centrale, une séquence stuffer de 300 pb a été intégrée en
position opposée à la séquence insulatrice (figure 1).
Nous avons étudié la capacité de ce vecteur à exprimer de façon régulée un transgène
in vitro et in vivo. Dans un premier temps, nous avons montré que le vecteur lentiviral
permettait l’expression contrôlée d’un gène rapporteur, la luciférase dans des cultures
primaires d’astrocytes. En présence de 600 ng/ml de Dox, une expression efficace de la
luciférase a été obtenue, qui était en corrélation avec la quantité de vecteur administrée
(figure 2A et 2B). En absence de l’inducteur, aucune expression de la luciférase n’a été
détectée par immunohistochimie (figure 2C). L’effet de l’inducteur est détectable après
deux jours de traitement, mais maximal après quatre jours (figure 3A et 3B). Celui-ci se
poursuit pendant au moins 14 jours (figure 3A). Le même niveau d’induction a été observé
que le traitement avec la Dox débute le jour de la transduction ou 7 jours après (figure 3B).
Résultats et Commentaires
73
Après arrêt du traitement, l’expression de la luciférase revient à son niveau basal. Celui-ci
correspond à 1% du niveau maximal de l’activité luciférase. La courbe dose-réponse montre
qu’une concentration de 600 ng/ml est nécessaire pour induire efficacement l’expression du
transgène (figure 3C).
Ce vecteur a été injecté dans le striatum de rat. Les animaux sont traités ou non avec
la doxycycline (0, 02 ou 3 mg/ml) dans l’eau de boisson pendant une période de 10 jours.
Les rats sont ensuite sacrifiés, et leur cerveau est prélevé pour analyse enzymatique et
immunohistochimique. En présence de 3 mg/ml de doxycycline, une activité totale
lucifèrase de 2,7x107 RLU/s est mesurée. En revanche, en absence de doxyxycline, cette
activité ne représente que 2% de l’activitée totale (figure 4A). Lorsque les animaux sont
traités avec 3 mg/ml de Dox dans l’eau de boisson, l’expression du transgène a pu être
détectée (figure 4B). En revanche, aucune expression de la luciférase n’a pu être détectée en
absence de Dox (figure 4C).
Ce système a ensuite été validé dans un modèle de la maladie de Parkinson. Cette
maladie est caracterisée par la perte progressive des neurones dopaminergiques de la
substance noire. L’une des approches thérapeutiques pour cette maladie consiste à apporter
l’enzyme limitante de biosynthèse de la dopamine, la tyrosine hydroxylase (TH) dans le
striatum (Azzouz et al., 2002). Dans cette approche, il est nécessaire de contrôler
l’expression de la TH afin de limiter les effets secondaires, comme la dyskinésie, due à la
production incontrôlée de dopamine (Ma et al., 2002). Le gène de la TH a été introduit
dans notre vecteur régulable. In vitro, ce vecteur a permis de réguler l’expression de la TH
grâce à l’ajout de 600 ng/ml de doxycycline dans le milieu de culture (Figure 5A). Aucune
immunoréactivité n’est observée en absence de doxycycline (figure 5B). In vivo, ce vecteur
lentiviral a été ensuite injecté par voie stéréotaxique dans le striatum gauche de rat dans des
modèles de lésions à la 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Les cellules exprimant la TH ont
été révélées par immunohistochimie chez les animaux traités avec 3 mg/ml de Dox dans
l’eau de boisson (figure 6A). Aucune cellule TH positive n’a été détectée chez les animaux
injectés et non traités avec la Dox (figure 6B).
En résumé, nous avons construit un seul vecteur lentiviral qui permet l’expression
régulée de protéines thérapeutiques dans le SNC.
Résultats et Commentaires
74
Résultats et Commentaires
75
Résultats et Commentaires
76
Résultats et Commentaires
77
Résultats et Commentaires
78
Résultats et Commentaires
79
Résultats et Commentaires
80
Résultats et Commentaires
81
Résultats et Commentaires
82
Résultats et Commentaires
83
II- Développement d’un système de régulation de l’expression de petits ARN interférents : construction d’un vecteur lentiviral pour le contrôle d’un gène endogène par ARN interférence.
Article 2 :
Control of small inhibitory RNA levels and RNA interference by doxycycline
induced activation of a minimal RNA polymerase III promoter.
Lahouari Amar, Mathieu Desclaux, Nicole Faucon-Biguet, Jacques Mallet and
Roland Vogel
Nucleic Acids Research, 2006
En 2001, l’équipe de Thomas Tuschl a mis en évidence la possibilité de déclencher
dans des cellules de mammifère le mécanisme de l’ARNi par transfection de petits ARN
double brin chimiquement synthétisés, les siARN (Elbashir et al., 2001b). La limite
majeure de cette étude est l’inhibition transitoire de l’expression d’un gène. Une inhibition
à plus long terme peut être obtenue par la synthèse endogène de shARN par un vecteur
plasmidique (Brummelkamp et al., 2002; Paddison et al., 2002) ou par un vecteur viral
(Abbas-Terki et al., 2002; Barton and Medzhitov, 2002; Qin et al., 2003; Tiscornia et al.,
2003). Une fois introduits dans la cellule, ces shARN sont rapidement clivés en siARN in
situ. Toutefois, l’inhibition constitutive d’un gène n’est pas adaptée à l’étude de la survie
cellulaire, de la régulation du cycle cellulaire ou du développement. De telles études
nécessitent une inhibition conditionnelle de l’expression d’un gène ciblé. L’inhibition
conditionnelle d’un gène peut également se révéler particulièrement importante pour une
application thérapeutique, car elle permet de contrôler l’expression des shARN par une
molécule inductrice. Le traitement peut ainsi être adapté aux besoins du patient, ou arrêté
en cas de complications graves. Dans ce contexte, nous avons développé un système
inductible d’expression des shARN qui repose sur le système “Tet-on” et ne requiert
l’utilisation que d’un seul vecteur viral.
Résultats et Commentaires
84
La présence d’une extrémité poly(A) empêche l’effet inhibiteur des siARN (Xia et
al., 2002). Les shARN doivent par conséquent être exprimés par l’ARN polymérase III qui
permet la synthèse d’ARN d’une taille réduite, puisque cinq résidus Thymidines
consécutifs suffisent pour arrêter la transcription. Au cours de cette étude nous avons
utilisé le promoteur U6.
La boite TATA et l’ESP du promoteur U6 sont reconnus par les facteurs de
démarrage de la transcription. L’ESD de ce promoteur interagit avec les facteurs de
transcription STAF1 et Oct1, qui activent la machinerie transcriptionnelle (Schramm and
Hernandez, 2002). La délétion de l’ESD réduit drastiquement l’efficacité de la transcription
(Danzeiser et al., 1993). Cet élément est par conséquent déterminant pour l’activation de la
transcription. Toutefois, il est possible de réactiver un promoteur U6 dépourvu de l’ESD
lorsque cet élément est remplacé par plusieurs sites de liaison du transactivateur GAL4 de
levure. La transcription est alors induite par un transactivateur qui contient le domaine de
liaison à l’ADN de GAL4 fusionné avec différents domaines transactivateurs (Das et al.,
1995). L’utilisation en quatre copies identiques d’une partie du domaine transactivateur du
facteur de transcription Oct2 dans lequel tous les résidus glutamines sont mutés en alanine
((Oct-2(4xQ18Q→A)) a permis la réactivation transcriptionnelle du promoteur U6. De plus,
ces mutations assurent l’activation spécifique du promoteur U6 (Das et al., 1995).
En nous basant sur ces résultats, nous avons développé une stratégie nouvelle, qui découle
de la stratégie décrite ci-dessus. Nous avons utilisé un facteur de transcription chimérique
qui comprend le domaine de liaison à l’ADN de rtTA (Urlinger et al., 2000) fusionné avec
le domaine d’activation de la protéine mutée Oct2 (Oct-2(4xQ18Q→A) (Figure 1A). Nous
avons remplacé au sein du promoteur U6 humain l’ESD par sept TetO (figure 1B). Les
cassettes d’expression des shARNs et du transactivateur rtTA-Oct2 ont été intégrées dans le
même vecteur lentiviral (figure 2A).
Dans une première étape de notre travail, nous avons évalué la capacité de notre
système à contrôler l’expression de la GFP dans une lignée 293T exprimant de façon stable
cette protéine (293T-GFP). En présence de doxycycline le transactivateur se lie sur les
séquences TetO et doit ainsi activer la transcription (figure 1D). Inversement, en l’absence
Résultats et Commentaires
85
de doxycycline, le transactivateur ne peut se lier aux séquences TetO et par conséquent
aucun effet ARNi ne doit être détecté (figure 1C). Nous avons transduit les cellules 293T-
GFP avec le vecteur lentiviral permettant la synthèse régulée de shGFPs. L’analyse par
“northern blot” montre une expression de shGFP dans les cellules transduites et cultivées
en présence de doxycycline (figure 2B). En revanche, en absence de l’inducteur, aucun
signal au-dessus de seuil de détection n’a été détecté dans les cellules transduites.
L’expression de la GFP a été analysée par FACS, avant et après induction par la
doxycycline. L’incubation des cellules transduites en présence de doxycycline conduit à une
inhibition importante de l’expression de la GFP (figure 3A). La diminution du nombre de
cellules GFP positives est corrélée avec la quantité de vecteur viral utilisé pendant la
transduction (figure 2C). Nous avons caractérisé l’efficacité de ce système en utilisant un
clone cellulaire. Nous avons évalué le temps et la dose de doxycycline nécessaires pour
obtenir une induction maximale de l’ARNi. Une réduction significative de l’expression de
la GFP a été observée après un jour de traitement et une diminution de plus de 90% a été
mesurée après quatre jours de traitement (figure 3B). La concentration de doxycycline
nécessaire pour l’induction maximale de shARNs a été évaluée par des expériences de dose-
réponses. Une inhibition de plus de 90% a été observée en présence de 6 µg/ml de
doxycycline (figure 3C). L’arrêt du traitement a conduit au retour au niveau basal de
l’expression de la GFP après 4 jours (figure 3D). Ce résultat montre la réversibilité de ce
système de régulation.
La deuxième partie de ce travail a consisté à évaluer la capacité de ce système de
régulation à contrôler l’expression d’un gène endogène. Nous avons choisi le gène p53
comme gène endogène car sa détection est aisée et un shARN efficace a été précédemment
décrit (Brummelkamp et al., 2002). Nous avons construit un second vecteur qui contient
un shARN dirigé contre la p53 humaine. Des cellules 293T, MCF-7 et A549 ont été
transduites avec différentes quantités de vecteur et incubées en présence ou en absence de 6
µg/ml de Dox. Les analyses par « western blot » ont montré une inhibition de plus de 90%
de la protéine p53 en présence de 6 µg/ml de doxycycline, alors qu’aucune diminution
significative n’a été mesurée en absence de doxycycline (figure 4). Ces résultats montrent
l’efficacité de ce système à réguler l’expression d’une protéine endogène.
Résultats et Commentaires
86
En conclusion, nous avons développé un système de régulation qui permet une expression
contrôlée par la doxycycline de shARN et démontré son inductibilité, sa réversibilité et sa
stabilité dans le déclenchement de l’ARNi dans des cellules de mammifères.
Résultats et Commentaires
87
Résultats et Commentaires
88
Résultats et Commentaires
89
Résultats et Commentaires
90
Résultats et Commentaires
91
Résultats et Commentaires
92
Résultats et Commentaires
93
Discussion
94
DISCUSSION
Discussion
95
Dans ce travail, nous avons développé des vecteurs lentiviraux permettant
l’expression régulée de facteurs thérapeutiques de nature protéiques ou nucléotidiques.
Cette régulation est basée sur l’utilisation de la dernière version du système Tet-on, qui
repose sur le transactivateur rtTA2-M2.
Ce travail a été effectué suivant deux axes. Le premier a porté sur le développement
d’un vecteur lentiviral unique capable d’exprimer à la fois les cassettes d’expression du
transgène et du transactivateur. La deuxième partie de ce travail a consisté au
développement d’un nouveau système de régulation de l’ARN interférence et à son
introduction dans un seul vecteur lentiviral.
I. Contraintes et limitations du système tétracycline
I.1. Contraintes pour la construction d’un vecteur unique contenant le
système tétracycline
I.1.1. Contrainte de taille
L’utilisation d’un vecteur lentiviral unique, ainsi que l’expression régulée d’un
transgène constituent deux éléments importants de biosécurité. Ceci permet de réduire les
risques liés à la dose du vecteur, mais également de contrôler l’expression du transgène.
L’intégration du système de régulation Tet-off dans un seul vecteur lentiviral a
précédemment été décrite (Kafri et al., 2000; Vigna et al., 2002). Ces vecteurs ont été utilisés
pour l’expression régulée d’un petit transgène comme la GFP (800 pb). Pour exprimer à
partir de ces vecteurs, à la fois le transactivateur et le petit transgène, deux cassettes
chevauchantes ont été utilisées (Kafri et al., 2000; Vigna et al., 2002). Celles-ci font toutes
les deux appel à la séquence polyA du LTR3’ du vecteur. Toutefois, leur capacité à
transférer un transgène de grande taille, comme la luciférase ou la TH (1800 pb) n’a jamais
été rapportée. Dans un des vecteurs construits (Vigna et al., 2002), le promoteur inductible
par la tétracycline (CMV minimal) a été intégré au sein du LTR3’ pour exprimer le
Discussion
96
transgène. Ceci compromet la biosécurité du vecteur qui ne peut plus être considéré
comme un vecteur SIN (self-inactivating) (établis par la délétion U3 dans le LTR3’) défectif
pour la réplication (Zufferey et al., 1998). Pour certaines applications l’utilisation du
système Tet-on est nécessaire. Dans ce contexte, nous avons i) inséré l’ensemble du système
Tet-on au sein d’un seul vecteur lentiviral, et ii) avons validé la capacité de ce système à
réguler un transgène de grande taille tel que la TH dans un modèle animal de la maladie de
Parkinson.
I.1.2. Risque d’interférence entre les promoteurs
Pour répondre à l’exigence de sécurité et prévenir les difficultés potentielles causées
par la taille du gène thérapeutique, nous avons inséré deux cassettes d’expressions
indépendantes dans le génome viral en exploitant la séquence unidirectionnelle poly(A) du
gène de l’hormone de croissance bovine. L’intégration de deux cassettes d’expression dans
un même vecteur risquait de générer des interférences transcriptionnelles entre le
promoteur CMV (qui dirige l’expression du transgène) et le promoteur PGK (qui contrôle
l’expression du transactivateur rtTA2-M2). Pour réduire ce risque, nous avons intégré entre
les deux cassettes d’expression la séquence insulatrice de la β-globine de poulet (Bell et al.,
1999), une séquence « stuffer » et la séquence centrale « flap ».
Pour évaluer la capacité de ce vecteur à exprimer efficacement et de façon régulée
l’expression d’un transgène, nous avons utilisé la luciférase comme gène rapporteur. Nous
avons évalué la fuite d’expression du promoteur CMV minimal en absence de doxycycline.
Cette fuite d’expression est de l’ordre de 1 à 2% de l’activité à l’état induit in vitro et in vivo
respectivement. Une activité basale de 1% à l’état éteint a également été rapportée lorsque
l’expression régulée de la luciférase est exprimée à partir de deux vecteurs (Vigna et al.,
2002). Ce résultat suggère que l’activation basale du promoteur CMV minimal dans notre
étude est due à l’effet transactivateur de l’environnement chromosomique dans lequel le
génome est intégré, plutôt qu’à la transactivation par un effet activateur du promoteur
PGK utilisé pour exprimer le transactivateur. Les séquences « stuffer », « flap » et
insulatrice sont donc suffisantes pour supprimer les effets transactivateurs entre les
promoteurs des deux cassettes d’expression dans le vecteur.
Discussion
97
I.2. Contraintes du système tétracycline pour une application clinique
I.2.1. Contraintes liées à la dose de doxycycline
a) Expression d’un facteur thérapeutique
L’expression régulée d’un facteur thérapeutique tel que la TH, nécessite in vivo une
dose de 3 mg/ml de doxycycline dans l’eau de boisson après injection du vecteur lentiviral
dans le striatum de rats. Cette concentration a été utilisée après injection du vecteur
lentiviral exprimant le gène rapporteur luciférase dans le striatum de rats. Nous avons
également tenu compte des études qui ont été préalablemenent publiées. Le système Tet-on
nécessite 10 à 15 fois plus de doxycycline que le système Tet-off. Ce dernier requiert une
concentration de 0,2 mg/ml de doxycycline dans l’eau de boisson pour réguler l’expression
d’un transgène après injection stéréotaxique d’un vecteur lentiviral dans le striatum de rats
(Kafri et al., 2000). Nous avons donc utilisé une concentration de 3 mg/ml de doxycycline
dans l’eau de boisson pour induire efficacement l’expression du transgène. Cependant,
Georgievska et ses collaborateurs ont montré qu’une concentration de 1 mg/ml de
doxycycline dans l’eau de boisson est suffisante pour induire l’expression de GDNF après
transfert de ce gène dans le striatum de rats (Georgievska et al., 2004). Il est donc
enviseagable de diminuer la dose de doxycycline dans le cadre de notre système.
Une concentration de 3 mg/ml de doxycycline est relativement importante pour
une application éventuelle du système rtTA en clinique humaine et en particulier pour les
pathologies du SNC. Les rats utilisés dans notre étude pesaient environ 300 g et chacun
consommaient en moyenne 20 ml d’eau par jour. Une concentration de 3 mg/ml de
doxycycline dans l’eau de boisson est équivalente à un apport journalier de 200 mg/kg soit
l’équivalent de 14 g de doxycycline pour un homme de 70 kg. Utilisée à des fins
antibactériennes, la doxycycline nécessite des doses de l’ordre de 100 mg d’antibiotique
pour un patient de 70 kg. Des intoxications sévères ont été rapportées chez l’homme après
une injection systémique journalière de 3,5 à 6 g de tétracycline (Schultz et al., 1963). La
régulation de l’expression de gène basée sur le rtTA2-M2 n’est donc pas satisfaisante pour
une application clinique de ce système dans les pathologies du SNC et ne peut être
Discussion
98
envisagée dans ces conditions. Il est donc indispensable d’améliorer l’affinité du
transactivateur du système Tet-on à l’inducteur ou de développer des molécules inductrices
plus efficaces pour une utilisation sécurisée de ce système. Pour ce faire, l’équipe de Ben
Berkhout a rapporté le développement par évolution dirigée d’un nouveau transactivateur
rtTA (Das et al., 2004). Celui-ci est 5 fois plus actif (aux doses maximales de doxycycline) et
25 fois plus sensible à l’inducteur que le rtTA original (Gossen et al., 1995). Alors que le
rtTA original nécessite in vitro 1000 ng/ml de doxycycline pour être actif, ce nouveau
variant ne requiert que 40 ng/ml de doxycycline (Das et al., 2004). Récemment, le même
laboratoire a utilisé cette technique pour isoler un nouveau variant de rtTA encore plus
sensible et plus actif que le rtTA original (Zhou et al., 2006). Ce dernier est 7 fois plus actif
et 100 fois plus sensible à la doxycycline que le rtTA développé par Gossen et Bujard
(Gossen et al., 1995). Ce nouveau variant du rtTA ne nécessite plus que 10 ng/ml pour
activer la transcription à partir du promoteur CMV minimal.
L’amélioration constante de l’affinité à l’inducteur du transactivateur, ainsi que
l’augmentation de l’activité transcriptionnelle constituent des éléments importants pour
une utilisation du système Tet-on in vivo.
b) Expression de shARN
Contrairement à un facteur thérapeutique, dont l’expression s’effectue à partir d’un
promoteur d’ARN polymérase II, l’expression régulée d’un shARN se fait à partir d’un
promoteur d’ARN polymérase III tel que le promoteur U6 minimal. Nous avons évalué la
concentration nécessaire pour une expression maximale de shARN par des expériences de
doses réponses. Il s’avère que l’expression inductible de shARN nécessite également une
concentration de doxycycline importante. Dans ce cas, pour obtenir une inhibition
maximale, une concentration de 6 µg/ml de Dox a été utilisée. Cette concentration, plus de
dix fois supérieure aux concentrations nécessaires pour activer un promoteur CMV
minimal par le transactivateur rtTA2-M2 (Urlinger et al., 2000), est tout à fait surprenante.
Alors que le domaine de fixation à la doxycycline du transactivateur rtTA-Oct-2 n’a pas été
modifié, la sensibilité du transactivateur à la doxycycline aurait théoriquement dûe être la
même que celle du rtTA2-M2.
Discussion
99
Deux hypothèses peuvent être émises pour expliquer ce phénomène : d’une part, le
domaine de transactivation Oct-2Q(Q→A) peut affecter l’affinité de la doxycycline en
agissant sur l’accessibilité ou la structure du site de liaison à la doxycycline. D’autre part,
l’hydrophobicité globale du domaine Oct-2Q(Q→A), peut affecter les caractéristiques du
domaine de liaison à l’ADN.
Le domaine Oct-2 (Q→A) est composé de quatre copies de la séquence polypeptidique
Q18III (Q→A) qui comprend 18 résidus d’acides aminés (Das et al., 1995). Quatorze de ces
18 acides aminés sont non-polaires et hydrophobes et quatre acides aminés sont polaires.
Dans ce cadre, le domaine Oct-2Q(Q→A) peut être considéré comme un ensemble
hydrophobe qui facilite la formation du complexe d’initiation de la transcription après la
fixation au promoteur U6 minimal. La séquence peptidique Q18III(Q→A) correspond aux
résidus d’acides aminés 143 à 160 du facteur de transcription humain Oct-2, dans lequel
tous les résidus glutamine sont changés en alanine. Puisque ces mutations portent sur six
des dix huit acides aminés, Q18III(Q→A) peut être considéré comme un peptide synthétique
individuel. Ces modifications permettent l’activation exclusive du promoteur d’ARN
polymérase III. (Das et al., 1995). Pour cette raison, ce facteur de transcription est incapable
d’activer d’autres promoteurs dans le voisinage du site d’intégration. L’utilisation d’un
promoteur PGK pour exprimer le transactivateur remplit également cette condition
puisqu’il ne permet pas de transactiver des promoteurs dans le voisinage du site
d’intégration du vecteur.
L’expression régulée d’un shARN nécessite une concentration importante de
doxycycline in vitro. Celle-ci limite l’utilisation de ce système in vivo. Il s’agira donc
d’améliorer l’affinité du transactivateur rtTA-Oct2 à l’inducteur afin de réduire la
concentration de doxycycline nécessaire pour induire l’expression de shARN et permettre
son utilisation in vivo. Une possibilitée serait d’utiliser la technologie d’évolution dirigée
pour sélectionner des variants de rtTA-Oct2 plus sensibles à l’inducteur et plus actifs. Une
autre voie serait d’utiliser des promoteurs d’ARN polymérase II pour exprimer des
shARN. Ceci permet d’exprimer des shARN par des promoteurs tissus spécifiques, mais
également à l’utilisation des systèmes de régulation dépendant de promoteur d’ARN
polymérase II. Pour ce faire, deux stratégies sont possibles. La première consiste en
l’utilisation d’une séquence poly(A) minimal pour arrêter la transcription. (Xia et al., 2002;
Discussion
100
Unwalla et al., 2004; Unwalla et al., 2006).Cette dernière n’empêche pas la formation par
Dicer d’un siARN fonctionnel (Xia et al., 2002). La deuxième statégie consiste dans
l’expression de shARN avec une structure qui mime les miARN (Dickins et al., 2005;
Stegmeier et al., 2005; Zhou et al., 2005; Du et al., 2006; Xia et al., 2006). Il s’agit de
remplacer la région qui code pour un miARN mature par la séquence qui code pour un
shARN qui cible le gène de son choix (Stegmeier et al., 2005). Les miARN artificiels se sont
révélés efficaces pour inhiber l’expression d’un gène cible (Zeng et al., 2002). Cette
approche a d’ores et déjà était utilisée pour l’expression régulée de shARN par le système
tétracycline par des vecteurs rétroviraux (Dickins et al., 2005) ou des vecteurs lentiviraux
(Stegmeier et al., 2005; Shin et al., 2006).
Le développement de système d’expression de shARN par un promoteur d’ARN
polymérase II est un pas important, puisqu’il ouvre la voie à l’utilisation de l’ensemble des
systèmes de régulation connus (système tétracycline, rapamycine, ecdysone…). Il permettra
également l’expression de shARN par des promoteurs tissus spécifiques.
c) Tet-on ou Tet-off ?
Les systèmes de régulation développés par l’équipe d’Hermann Bujard offrent
aujourd’hui le choix entre deux systèmes de régulation dans lesquels l’induction de
l’expression se fait en absence (Tet-off) ou en présence (Tet-on) de doxycycline. Le choix de
l’un ou l’autre de ces deux systèmes doit être fait en fonction du modèle expérimental, le
but étant de limiter l’emploi de l’antibiotique. En thérapie génique, dans le cadre d’une
stratégie de neuroprotection pouvant être limitée dans le temps, le choix du système de
régulation portera sur le système Tet-on. En revanche, dans le cas d’une stratégie
substitutive, visant à remplacer une fonction essentielle à long terme, le système Tet-off
sera plus approprié.
Le choix du système de régulation se fera également en fonction de ses cinétiques
d’induction et d’extinction du transgène. Pour les deux systèmes, les niveaux d’expression
des transgènes atteignent le niveau de base en une à deux semaines après l’induction de
l’inhibition de l’expression du transgène in vivo (Kistner et al., 1996; Corti et al., 1999b;
Discussion
101
Corti et al., 1999a; Georgievska et al., 2004). Avec le système Tet-on, les taux maximaux
d’induction de l’expression in vivo du transgène peuvent être obtenus avec un délai de
quelques jours (Kistner et al., 1996; Mansuy et al., 1998). Le système Tet-off est caractérisé
par de plus lentes cinétiques d’induction puisqu’une inhibition complète de l’expression du
transgène est obtenue deux semaines après l’apport de 1 mg/ml de doxycycline dans l’eau
de boisson (Corti et al., 1999b; Corti et al., 1999a). La réinduction de l’expression maximale
du transgène nécessite de dix semaines (Corti et al., 1999a) à plus de trois mois (Harding et
al., 1998) après retrait de la doxycycline. Ce temps d’induction de l’expression du transgène
est dû à la demi-vie biologique de la tétracycline et de ses dérivés. Lorsqu’elles sont
administrées, ces molécules s’accumulent dans le tissu musculaire et dans le tissu osseux et
de ce fait leur élimination de l’organisme est plus lente. Cependant, une réinduction plus
rapide de l’expression du transgène in vivo est possible en diminuant les doses de
doxycycline (Kistner et al., 1996) et ceci sans modifier la fonctionnalité du système Tet-off.
En effet une dose de 20 µg/ml de doxycycline permet une inhibition de l’expression du
transgène 1 jour après traitement et une réinduction totale de l’expression une semaine
après retrait de l’antibiotique de l’eau de boisson (Kistner et al., 1996).
I.2.2. Risque de réponse immunitaire contre le transactivateur
L’efficacité des systèmes de régulation par la tétracycline en tant “qu’interrupteurs
moléculaires” ne fait plus aucun doute. Toutefois, leur utilisation potentielle en thérapie
génique, soulève la question fondamentale de l’immunogénicité éventuelle des éléments
constituants le système tétracycline, en particulier du transactivateur chimèrique. Des
efforts importants ont été réalisés pour réduire cette réponse, et notamment par
l’utilisation de domaines protéiques d’origines humaines. Cependant, le risque d’une
réponse immunitaire n’est jamais éliminé, car la protéine de fusion contient une jonction
peptidique qui peut être reconnue comme un élément étranger (Rivera et al., 1996). L’étude
de la réponse immunitaire contre le transactivateur chimérique est peu évaluée dans les
études de thérapie génique qui utilisent un système de régulation. Il a été rapporté
cependant une réponse immunitaire humorale et cellulaire dirigée contre le rtTA2-M2
après électrotransfert dans le muscle de macaques (Latta-Mahieu et al., 2002) ou après
Discussion
102
injection intramusculaire d’un vecteur adénoviral chez la souris (Lena et al., 2005). Cette
réponse limite l’expression à long terme du transactivateur. Une absence de réponse
immunitaire dirigée contre le rtTA a été observé chez le macaque après injection
intramusculaire d’un vecteur AAV qui exprime de façon régulé l’EPO (Favre et al., 2002).
Toutefois, ce phénomène n’a été observé que chez un seul animal sur six transduits, ce qui
ne permet pas de conclure à une absence de réponse immunitaire dirigée contre le
transactivateur.
II. Alternatives au système tétracycline
II.1. Système de régulation par la rapamycine
L’utilisation clinique de systèmes de régulation et en particulier du système
tétracycline nécessitera des études complémentaires afin d’évaluer la réponse immunitaire
dirigée contre la protéine transactivatrice en fonction de la dose et du type de vecteur
utilisé. Pour s’affranchir d’une éventuelle réponse immunitaire chez l’homme du système
tétracycline, une possibilité serait d’utiliser des systèmes de régulations d’origine humaine
comme le système de régulation par la rapamycine (Rivera et al., 1996). Récemment une
étude menée chez le singe rhésus n’a montré aucune réponse immunitaire apparente après
l’injection intramusculaire d’un vecteur AAV qui permet l’expression régulée d’EPO par le
système rapamycine (Rivera et al., 2005). Le système de régulation par la rapamycine peut
être une approche prometteuse pour l’expression régulée d’une protéine thérapeutique en
thérapie génique. Egalement, le développement de systèmes de régulation basés sur la
technologie des protéines en doigt de zinc peut être une autre approche pour une thérapie
génique sûre et efficace.
II.2. Régulation physiologique
De nombreux systèmes de régulation nécessitent l’utilisation d’un transactivateur
chimérique qui peut entraîner une réponse immunitaire. Une approche alternative serait de
Discussion
103
placer le transgène d’intérêt sous contrôle d’éléments de régulation physiologiques (Miller
and Whelan, 1997; Varley and Munford, 1998). En effet, une régulation endogène de
protéine thérapeutique a été permise à partir d’un promoteur induit par des stimuli
inflammatoires (Varley and Munford, 1998). Ces promoteurs ont été intégrés au sein de
vecteurs viraux. Une expression régulée du facteur thérapeutique a été observée in vivo en
fonction de l’état inflammatoire des animaux (Miagkov et al., 2002; van de Loo et al., 2004).
Une régulation physiologique est également envisagée pour le traitement du diabète. Dans
ce contexte, des promoteurs dont l’activité est régulée par les taux de glucose sont utilisés
pour contrôler la synthèse de gènes thérapeutiques comme ceux codant pour l’insuline, le
VIP (Vasoactive Intestinal Peptide), ou des facteurs immunosuppresseurs (Varley and
Munford, 1998). Une étude récente a montré la capacité du promoteur à contrôler
l’expression de différents transgènes dans le SNC en réponse à une lésion cytotoxique
(Jakobsson et al., 2006). Des vecteurs lentiviraux exprimant soit la béta-galactosidase sous le
contrôle du promoteur GFAP, soit la GFP sous contrôle du promoteur de l’enképhaline
ont été injectés dans le striatum de rats lésés à la 6-OHDA, ou à l’acide iboténique
(Jakobsson et al., 2006). La GFAP est une protéine des filaments intermédiaires qui est
surexprimée lors de la réactivité gliale qui a lieu après la lésion. L’expression de
l’enképhaline est augmentée après la déplétion en dopamine induite par la liaison à la 6-
OHDA. L’expression de la beta-galactosidase et de la GFP est induite dans les astrocytes et
dans les neurones respectivement, dans le cerveau des rats lésés. L’expression des transgènes
augmente en fonction de la sévérité de la lésion.
Cette approche de régulation dépendante d’un état pathologique permet un contrôle du
transgène sans l’apport de molécule inductrice et sans l’expression d’un transactivateur, ce
qui devrait permettre d’éviter une réponse immunitaire. L’application thérapeutique d’un
système de régulation dépendant d’un état physiologique nécessite encore des
développements, mais l’accroissement de nos connaissances sur la physiopathologie des
maladies et la disponibilité d’éléments de réponses répondant à des stimuli propres aux
conditions pathologiques permettra un jour l’utilisation de ce type de système de régulation
chez l’homme.
Discussion
104
II.3. Régulation par les protéines en doigt de zinc
La disponibilité de méthodes rapides et robustes pour contrôler l’expression des
gènes est primordiale pour l’étude de la fonction de ces gènes, mais également pour des
interventions thérapeutiques. Cette dernière approche devient possible grâce à l’utilisation
des protéines en doigt de zinc (ZFP, zinc-finger proteins). Les ZFP sont des facteurs de
transcription qui possèdent deux domaines fonctionnels : un domaine de liaison à l’ADN et
un domaine effecteur (activateur ou répresseur) qui agit sur la transcription. Ce type de
protéine comporte des éléments répétés avec une forme de doigts de gant. Il existe plusieurs
types de ZFP, caractérisés par leur motif de liaison à l’ADN. Les ZFP à motif Cys2-His2
représentent les protéines les plus communes chez les eukaryotes (Beerli and Barbas, 2002).
Chaque doigt de zinc reconnaît précisément 3 paires de bases consécutives. En utilisant
deux protéines comportant chacune trois doigts de zinc pouvant être individuellement
choisis, la reconnaissance s’effectue sur une séquence spécifique de 18 nucléotides. Cette
méthode permet ainsi de cibler de manière spécifique et unique une séquence d’intérêt
connue. Le domaine en doigt de zinc Cys2-His2 est particulièrement intéressant pour la
construction de facteurs de transcription synthétiques. Alors que les domaines de liaison à
l’ADN de nombreuses protéines se lient comme des dimères et utilisent des domaines de
reconnaissance non modulables, la modification à la fois de la structure et de la fonction des
domaines de liaison des ZFP font de ces dernières des outils de choix pour contrôler la
fonction de gènes (Beerli and Barbas, 2002).
Il existe actuellement trois méthodes qui peuvent être utilisées pour affecter
l’expression de gènes en utilisant la technologie ZFP. La première consiste à bloquer la
transcription d’un gène par la surexpression d’une protéine ZFP chimèrique qui, en se
fixant de façon spécifique sur la séquence codante du gène à inhiber, va provoquer une gêne
stérique et empécher la transcription (Choo et al., 1994). La deuxième statégie est également
basée sur une gêne stérique mais il s’agira cette fois-ci de cibler le promoteur pour empêcher
la fixation des protéines d’initiation de la transcription (Kim and Pabo, 1997). Enfin, la
troisième stratégie repose sur la fusion de domaines de régulation de la transcription avec le
domaine de liaison à l’ADN des ZFP (Pomerantz et al., 1995; Choo et al., 1997; Beerli et
al., 2000a). Cette dernière stratégie a été utilisée avec succès pour générer des régulateurs
Discussion
105
d’expression de gènes, qui peuvent être utilisés comme des activateurs ou des inhibiteurs en
fonction du domaine effecteur utilisé.
Le développement de protéines ZFP chimériques, qui se lient à des séquences
spécifiques de l’ADN, facilite les stratégies de manipulation de l’expression de gènes à la
fois dans les cultures de cellules et dans les organismes entiers. Toutefois, une régulation
constitutive d’un gène cible n’est pas désirable à long terme. Pour toute application
thérapeutique, une régulation réversible par l’apport d’une molécule inductrice est
préférable et ceci afin de limiter les effets secondaires et d’augmenter la sécurité. Plusieurs
systèmes de régulations ont été décris (voir plus haut). Ainsi, la fusion des domaines de
liaison à l’ADN des ZFP avec les domaines régulateurs de la transcription a permis
d’obtenir des protéines modulatrices de la transcription en fonction de l’apport d’une
molécule inductrice (Beerli et al., 2000b; Xu et al., 2001b). En effet, la fusion du domaine de
liaison du ligand du recepteur aux œstrogènes et du domaine d’activation de la
transcription VP16 avec le domaine de liaison à l’ADN de ZFP a permis de contrôler avec
succès l’expression de la luciférase (Xu et al., 2001b).
Les composants des systèmes de régulation en vue d’une application clinique ne
doivent pas entraîner de réponses immunitaires et dans ce cadre, des composants humains
(système rapamycine ou protéine ZFP) doivent être utilisés. De plus, l’utilisation d’un
système qui peut être contrôlé par un inducteur exogène est un élement important.
Cependant, des développements supplémentaires seront nécessaires. A terme, le clinicien
pourra doser la quantité de molécules thérapeutiques (protéine ou shARN) en fonction des
besoins de chaque patient et arrêter le traitement en cas de complication grave.
Discussion
106
III. Contraintes et limitations de l’expression des shARN
III.1. Risque de saturation de l’ARNi
L’ARNi est un outil puissant pour inhiber l’expression d’un gène au niveau post-
transcriptionnel. De plus, une étude récemment publiée par Grimm et al est venue
apporter des éléments supplémentaires en faveur d’une régulation de l’ARNi (Grimm et al.,
2006). Ce travail a montré que l’expression à long terme de shARN peut entraîner une
létalité importante des souris. Les auteurs montrent que cette mortalité est due à la
compétition entre les shARN et les miARN au niveau du transport nucléo-cytoplasmique
réalisé par l’exportine 5 (Grimm et al., 2006). La saturation de la voie endogène de l’ARNi
peut être donc évitée par le contrôle strict de l’expression des shARN thérapeutiques. Ce
résultat confirme la nécessité de développer des systèmes de régulations sûrs et efficaces
pour le contrôle de l’expression des shARN.
III.2. Risque de réponse immunitaire
L’inhibition spécifique d’un gène par ARNi a ouvert la voie à l’utilisation
thérapeutique des siARN. Toutefois, plusieurs études sont venues réduire l’engouement
qu’avait suscité cette technologie. En effet, il a été rapporté que les siARN pouvaient
activer les cellules du système immunitaire et induire la production de cytokine à la fois in
vitro et in vivo (Sioud and Sorensen, 2003; Kariko et al., 2004). Ils peuvent également
activer le système interféron in vitro (Bridge et al., 2003; Sledz et al., 2003; Kim et al., 2004).
La transfection de monocytes humains avec des siARN synthétiques induit l’expression de
TNFα (Tumor necrosis factor) et d’IL6 (Judge et al., 2005). De même, la transfection de
cellules mononucléaires sanguines avec des siARN ou des shARN induit l’expression
d’INFα, IL6 et de TNFα (Hornung et al., 2005; Judge et al., 2005; Sioud, 2005).
L’induction de la réponse immunitaire contre l’ARN a lieu chez la souris et l’homme via
certains sous-types de cellules immunitaires et dépend de la séquence et du type de cellules
(Wang et al., 2002). Certains motifs (5’-GUCCUUCAA-3’ et 5-UGUGU-3’) présents dans
Discussion
107
les siARN/shARN et même dans des ARN simple brin sont des inducteurs de la
production de cytokines, et particulièrement d’IFN dans les cellules dendritiques via le
TLR7 (« Toll Like Receptor » 7 (Hornung et al., 2005) et de TNFα dans les monocytes
probablement via TLR8 (Heil et al., 2004; Sioud, 2005). De manière générale, les ARN
riches en GU sont immunostimulateurs, à la fois dans les cellules murines et humaines en
activant NF-κB lorsqu’ils sont apportés à forte concentration par un véhicule lipidique dans
des cellules HEK-293 exprimant TLR8, suggérant que les ARN contenant des séquences
GU sont plus immunostimulateurs (Heil et al., 2004).
III.3. Risque de toxicité
Les effets secondaires des siARN doivent être pris en compte pour toute application
thérapeutique. Des effets potentiellement délétères ont été illustrés par des expériences dans
lesquelles des souris injectées avec des siARN présentent des signes de toxicité et
notamment des niveaux sériques élevés d’aspartate aminotransférase (signe d’atteinte
hépatique) et d’une réduction du nombre de lymphocytes et de plaquettes (Judge et al.,
2005). Il est donc nécessaire d’éviter les effets secondaires des siARN, tout en conservant
une activité ARNi. Pour cela, il faudrait sélectionner une séquence du siARN et éviter les
motifs immunostimulateurs (Judge et al., 2005).
IV. Contraintes liées à l’utilisation des vecteurs lentiviraux en vue d’une application clinique
L’utilisation des vecteurs lentiviraux en thérapie génique humaine, et
particulièrement pour les pathologies du système nerveux, implique un cahier des charges
très strict. En effet, les vecteurs lentiviraux devront avant toute utilisation chez l’homme
remplir des conditions de sécurité (absence de mutagenèse insertionnelle) et d’efficacité
(expression du transgène forte, spécifique et régulée). Un grand nombre d’études a déjà
apporté des éléments en faveur d’une utilisation clinique de ces vecteurs. De plus, pour
réduire les effets d’insertions aléatoires et l’activation d’oncogènes, le développement de
Discussion
108
vecteurs lentiviraux non-intégratifs (Nightingale et al., 2006; Philippe et al., 2006; Yanez-
Munoz et al., 2006) ou à intégration ciblée (Recchia et al., 1999; Kogure et al., 2001)
améliore les conditions pour une meilleure sécurité. D’autre part, pour répondre aux
exigences d’efficacité, l’utilisation de promoteurs forts et/ou spécifiques d’un type cellulaire
(GFAP, NSE…) a permis d’obtenir une expression satisfaisante et spécifique du type
cellulaire ciblé. En outre, l’utilisation et la maîtrise de nouvelles enveloppes virales ouvrent
la voie vers de nouvelles possibilités de ciblage cellulaire. Enfin, le développement de
systèmes de régulation de plus en plus sûrs et efficaces est un élément supplémentaire en
faveur du passage des vecteurs lentiviraux en thérapeutique humaine.
L’utilisation en routine des vecteurs lentiviraux implique également une
amélioration de la qualité des lots cliniques. En effet, il est possible de retrouver des
contaminations de débris cellulaires et de composants du milieu de culture qui se révèlent
potentiellement toxiques et immunogènes après l’étape de concentration par
ultracentrifugation (Park et al., 2000). En remplaçant cette étape par une purification en
chromatographie échangeuse d’ions, on ne retrouve plus de signes de toxicité aiguë ou
durable, ni d’inflammation (Scherr et al., 2002). La qualité peut également être améliorée en
produisant des vecteurs par des cellules cultivées sans sérum, tout en gardant l’étape
d’ultracentrifugation. Les anticorps générés sont faibles et peu neutralisants (Baekelandt et
al., 2003).
Enfin, l’homme étant potentiellement l’hôte du VIH-1 et la pathogénie du virus
étant suffisamment grave et étendue, se pose le problème des interactions vecteur et virus in
vivo (Bukovsky et al., 1999). L’utilisation des vecteurs SIN ou delta-U3 permet de
s’affranchir de cette interaction (Miyoshi et al., 1998; Zufferey et al., 1998).
Les étapes de développement des vecteurs lentiviraux en terme de biosécurité,
d’efficacité, et de qualité des vecteurs produits ont été importantes jusqu’à présent.
Toutefois, beaucoup de chemin reste à parcourir pour répondre à l’ensemble des exigences
du cahier des charges pour l’utilisation clinique de ces vecteurs lentiviraux, en particulier
ceux dérivés du VIH-1.
Discussion
109
V. Considérations éthiques et avenir de la thérapie génique
Il est difficile de décrire les techniques relatives à la thérapie génique sans discuter
des questions qu’elles soulèvent au niveau éthique. Il serait d’ailleurs vain de restreindre ces
questions au simple transfert de gène. Dans sa perspective thérapeutique, le transfert de
gène exige, comme pour tout nouveau médicament, une évaluation stricte du rapport
risque/bénéfice. Celui-ci doit être le plus faible possible, en particulier au regard des
pratiques thérapeutiques utilisées jusqu’alors. C’est à ce type de thérapie génique que le
comité consultatif national d’éthique a donné un avis favorable le 13 décembre 1990. En
France, les essais de thérapie génique sont encadrés par la loi Huriet-Sérusclat (loi n°88-1138
du 20/12/88), les lois de bioéthique de juillet 1994 et du 6 août 2004. Elles définissent les
règles des essais de thérapie génique chez l’homme et garantissent une protection efficace
des patients.
Les préoccupations actuelles de la société concernent le transfert de gène dans un but
de modification ou d’amélioration de l’individu. Le transfert de gène dans les cellules
somatiques pose le problème d’une éventuelle dérive eugénique de la thérapie génique.
Le transfert de gène dans les cellules germinales, c'est-à-dire toute modification du
capital génétique des cellules reproductrices (ovocytes, spermatozoïdes et leurs précurseurs)
qui aurait pour conséquence une modification du génome de tout l’individu, est proscrite
par toutes les réglementations en matière de transfert de gène thérapeutique chez l’homme.
D’ailleurs, pour être accepté, tout protocole de thérapie génique doit démontrer que les
vecteurs utilisés n’affecteront pas les cellules germinales du patient. Néanmoins, la preuve
de principe du transfert de gène dans les cellules foetales embryonnaires humaines a été
apportée par transfection d’ADN (Shamblott et al., 2001). Ces expériences montrent qu’il
est possible d’exprimer un gène étranger dans les cellules germinales. Dans ce cadre, afin
d’éviter toute dérive délibérée eugénique, il est indispensable de veiller à ce que les cellules
germinales modifiées ne soient jamais utilisées dans un but de procréation.
Le transfert de gène chez le foetus pose également un problème éthique. La thérapie
génique in utero est pour l’instant envisagée pour des pathologies génétiques extrêmement
Discussion
110
graves. En France depuis 1999, le diagnostic préimplantatoire est autorisé dans le cadre de
pathologies génétiques graves. Celui-ci permet de choisir in vitro les embryons lorsque une
maladie génétique grave est crainte. Cependant d’un point de vue éthique, cette pratique
soulève de nombreuses questions, en particulier celle d’une dérive eugénique. La thérapie
génique in utero pourrait être une alternative au diagnostic préimplantatoire. Bien que la
technique ne soit pas encore au point, il est probable que le développement de nouveaux
outils permettra de dépasser ces limites. Cependant, il est nécessaire de s’assurer que le
transfert de gène n’affecte pas les cellules germinales du fœtus, de même, qu’il n’y ait pas de
modifications génétiques des cellules de la mère. Enfin, il est nécessaire de s’assurer que ce
transfert de gène n’induise pas de risques d’avortement prématuré. En prenant en compte
toutes ces conditions, la question qui se pose est de savoir à quel stade du développement le
futur enfant doit être soigné ? C’est à cet ensemble de questions que le législateur devra
répondre. Pour ma part, il me semble important de maintenir des garde-fous stricts afin
d’éviter tout risque d’eugénisme. En tout état de cause, il est important que ces pratiques
(diagnostic préimplantatoire ou thérapie génique in utero) ne soient autorisées que dans le
cas où une maladie grave est crainte chez l’enfant à naître.
L’application du transfert de gène chez l’homme dans un but d’amélioration des
compétences physiques est aujourd’hui revenue sur la scène publique dans le cadre du
dopage sportif. Chez l’animal, le transfert de gène du facteur de croissance IGF-1 dans les
cellules musculaires de souris augmente de 15% la masse musculaire des animaux
(Takahashi et al., 2003; Barton, 2006). L’introduction du gène de l’EPO dans les cellules de
muscles de primates a conduit à une production d’EPO 10 fois supérieure à la normale
associée à une augmentation de plus de 60% du taux de globules rouges (Zhou et al., 1998).
Même si cette pratique n’a pas encore été utilisée chez les sportifs de haut niveau, le centre
international de lutte antidopage a d’ores et déjà interdit l’utilisation de la thérapie génique
pour toute amélioration des capacités physiques des sportifs.
Comme pour tous les autres secteurs de la biologie, l’avenir de la thérapie génique
est conditionné par les expériences du passé. Jusqu’alors, les échecs pour guérir une maladie
étaient dûs essentiellement à la méconnaissance de certains aspects de la maladie ou au
manque d’outils appropriés. Le séquençage complet du génome humain et l’amélioration
Discussion
111
des outils de biologie moléculaire et de bioinformatique vont favoriser notre
compréhension des processus de nombreuses pathologies. Les résultats de ces études auront
un impact considérable dans le choix des stratégies thérapeutiques par transfert de gène. Ces
mêmes techniques vont permettre de mieux connaître l’impact du transfert de gène dans
des modèles animaux. Ce type d’informations favorisera la prise de position sur la validité
médicale et éthique d’un protocole de thérapie génique. Dans le même temps,
l’amélioration constante des outils de transfert de gène permet déjà d’accroître les stratégies
thérapeutiques et de minimiser les risques éventuels. Il est probable que dans un avenir
proche, l’amélioration de l’efficacité de transduction, de la stabilité, de la biosécurité et du
tropisme des vecteurs permettra aux prochains essais cliniques d’être plus probants que les
précédents. Enfin, il est à prévoir que les vecteurs de transfert de gène seront utilisés
comme des outils de correction génique par recombinaison homologue du transgène avec
une séquence génomique mutante. De nombreuses études ont montré la faisabilité de ce
type de stratégies in vitro (Russell and Hirata, 1998; Feederle et al., 2004; Ohbayashi et al.,
2005) et in vivo (Miller et al., 2006). L’efficacité de cette méthode reste encore à être
améliorée, mais elle ouvre la voie au transfert de gène afin de corriger un gène muté.
Références Bibliographiques
112
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Références Bibliographiques
113
Abbas-Terki T, Blanco-Bose W, Deglon N, Pralong W, Aebischer P (2002) Lentiviral-mediated RNA interference. Hum Gene Ther 13:2197-2201.
Abdallah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA (1996) A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: polyethylenimine. Hum Gene Ther 7:1947-1954.
Abordo-Adesida E, Follenzi A, Barcia C, Sciascia S, Castro MG, Naldini L, Lowenstein PR (2005) Stability of lentiviral vector-mediated transgene expression in the brain in the presence of systemic antivector immune responses. Hum Gene Ther 16:741-751.
Abruzzese RV, Godin D, Mehta V, Perrard JL, French M, Nelson W, Howell G, Coleman M, O'Malley BW, Nordstrom JL (2000) Ligand-dependent regulation of vascular endothelial growth factor and erythropoietin expression by a plasmid-based autoinducible GeneSwitch system. Mol Ther 2:276-287.
Acsadi G, Anguelov RA, Yang H, Toth G, Thomas R, Jani A, Wang Y, Ianakova E, Mohammad S, Lewis RA, Shy ME (2002) Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy. Hum Gene Ther 13:1047-1059.
Aebischer P, Schluep M, Deglon N, Joseph JM, Hirt L, Heyd B, Goddard M, Hammang JP, Zurn AD, Kato AC, Regli F, Baetge EE (1996) Intrathecal delivery of CNTF using encapsulated genetically modified xenogeneic cells in amyotrophic lateral sclerosis patients. Nat Med 2:696-699.
Agostini I, Navarro JM, Rey F, Bouhamdan M, Spire B, Vigne R, Sire J (1996) The human immunodeficiency virus type 1 Vpr transactivator: cooperation with promoter-bound activator domains and binding to TFIIB. J Mol Biol 261:599-606.
Aiken C (1997) Pseudotyping human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) by the glycoprotein of vesicular stomatitis virus targets HIV-1 entry to an endocytic pathway and suppresses both the requirement for Nef and the sensitivity to cyclosporin A. J Virol 71:5871-5877.
Aiuti A, Vai S, Mortellaro A, Casorati G, Ficara F, Andolfi G, Ferrari G, Tabucchi A, Carlucci F, Ochs HD, Notarangelo LD, Roncarolo MG, Bordignon C (2002) Immune reconstitution in ADA-SCID after PBL gene therapy and discontinuation of enzyme replacement. Nat Med 8:423-425.
Akkina RK, Walton RM, Chen ML, Li QX, Planelles V, Chen IS (1996) High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G. J Virol 70:2581-2585.
Alberch J, Perez-Navarro E, Canals JM (2004) Neurotrophic factors in Huntington's disease. Prog Brain Res 146:195-229.
Almeida R, Allshire RC (2005) RNA silencing and genome regulation. Trends Cell Biol 15:251-258.
Auricchio A, Gao GP, Yu QC, Raper S, Rivera VM, Clackson T, Wilson JM (2002a) Constitutive and regulated expression of processed insulin following in vivo hepatic gene transfer. Gene Ther 9:963-971.
Auricchio A, Rivera VM, Clackson T, O'Connor EE, Maguire AM, Tolentino MJ, Bennett J, Wilson JM (2002b) Pharmacological regulation of protein expression from adeno-associated viral vectors in the eye. Mol Ther 6:238-242.
Aurisicchio L, Bujard H, Hillen W, Cortese R, Ciliberto G, La Monica N, Palombo F (2001) Regulated and prolonged expression of mIFN(alpha) in immunocompetent mice mediated by a helper-dependent adenovirus vector. Gene Ther 8:1817-1825.
Références Bibliographiques
114
Azzouz M, Hottinger A, Paterna JC, Zurn AD, Aebischer P, Bueler H (2000) Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2. Hum Mol Genet 9:803-811.
Azzouz M, Martin-Rendon E, Barber RD, Mitrophanous KA, Carter EE, Rohll JB, Kingsman SM, Kingsman AJ, Mazarakis ND (2002) Multicistronic lentiviral vector-mediated striatal gene transfer of aromatic L-amino acid decarboxylase, tyrosine hydroxylase, and GTP cyclohydrolase I induces sustained transgene expression, dopamine production, and functional improvement in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci 22:10302-10312.
Baekelandt V, Eggermont K, Michiels M, Nuttin B, Debyser Z (2003) Optimized lentiviral vector production and purification procedure prevents immune response after transduction of mouse brain. Gene Ther 10:1933-1940.
Baekelandt V, Claeys A, Eggermont K, Lauwers E, De Strooper B, Nuttin B, Debyser Z (2002) Characterization of lentiviral vector-mediated gene transfer in adult mouse brain. Hum Gene Ther 13:841-853.
Bai L, Wang Z, Yoon JB, Roeder RG (1996) Cloning and characterization of the beta subunit of human proximal sequence element-binding transcription factor and its involvement in transcription of small nuclear RNA genes by RNA polymerases II and III. Mol Cell Biol 16:5419-5426.
Balaggan KS, Binley K, Esapa M, Iqball S, Askham Z, Kan O, Tschernutter M, Bainbridge JW, Naylor S, Ali RR (2006) Stable and efficient intraocular gene transfer using pseudotyped EIAV lentiviral vectors. J Gene Med 8:275-285.
Balcaitis S, Weinstein JR, Li S, Chamberlain JS, Moller T (2005) Lentiviral transduction of microglial cells. Glia 50:48-55.
Barde I, Zanta-Boussif MA, Paisant S, Leboeuf M, Rameau P, Delenda C, Danos O (2006) Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Mol Ther 13:382-390.
Barkats M, Millecamps S, Abrioux P, Geoffroy MC, Mallet J (2000) Overexpression of glutathione peroxidase increases the resistance of neuronal cells to Abeta-mediated neurotoxicity. J Neurochem 75:1438-1446.
Baron U, Gossen M, Bujard H (1997) Tetracycline-controlled transcription in eukaryotes: novel transactivators with graded transactivation potential. Nucleic Acids Res 25:2723-2729.
Baron U, Schnappinger D, Helbl V, Gossen M, Hillen W, Bujard H (1999) Generation of conditional mutants in higher eukaryotes by switching between the expression of two genes. Proc Natl Acad Sci U S A 96:1013-1018.
Bartkiewicz M, Gold H, Altman S (1989) Identification and characterization of an RNA molecule that copurifies with RNase P activity from HeLa cells. Genes Dev 3:488-499.
Barton ER (2006) Viral expression of insulin-like growth factor-I isoforms promotes different responses in skeletal muscle. J Appl Physiol 100:1778-1784.
Barton GM, Medzhitov R (2002) Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99:14943-14945.
Bartz SR, Vodicka MA (1997) Production of high-titer human immunodeficiency virus type 1 pseudotyped with vesicular stomatitis virus glycoprotein. Methods 12:337-342.
Bayne EH, Allshire RC (2005) RNA-directed transcriptional gene silencing in mammals. Trends Genet 21:370-373.
Beerli RR, Barbas CF, 3rd (2002) Engineering polydactyl zinc-finger transcription factors. Nat Biotechnol 20:135-141.
Références Bibliographiques
115
Beerli RR, Dreier B, Barbas CF, 3rd (2000a) Positive and negative regulation of endogenous genes by designed transcription factors. Proc Natl Acad Sci U S A 97:1495-1500.
Beerli RR, Schopfer U, Dreier B, Barbas CF, 3rd (2000b) Chemically regulated zinc finger transcription factors. J Biol Chem 275:32617-32627.
Bell AC, West AG, Felsenfeld G (1999) The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98:387-396.
Bemelmans AP, Horellou P, Pradier L, Brunet I, Colin P, Mallet J (1999) Brain-derived neurotrophic factor-mediated protection of striatal neurons in an excitotoxic rat model of Huntington's disease, as demonstrated by adenoviral gene transfer. Hum Gene Ther 10:2987-2997.
Bensadoun JC, Deglon N, Tseng JL, Ridet JL, Zurn AD, Aebischer P (2000) Lentiviral vectors as a gene delivery system in the mouse midbrain: cellular and behavioral improvements in a 6-OHDA model of Parkinson's disease using GDNF. Exp Neurol 164:15-24.
Berns KI, Giraud C (1996) Biology of adeno-associated virus. Curr Top Microbiol Immunol 218:1-23.
Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409:363-366.
Bhattacharya M, Babwah AV, Godin C, Anborgh PH, Dale LB, Poulter MO, Ferguson SS (2004) Ral and phospholipase D2-dependent pathway for constitutive metabotropic glutamate receptor endocytosis. J Neurosci 24:8752-8761.
Bigey P, Bureau MF, Scherman D (2002) In vivo plasmid DNA electrotransfer. Curr Opin Biotechnol 13:443-447.
Bilang-Bleuel A, Revah F, Colin P, Locquet I, Robert JJ, Mallet J, Horellou P (1997) Intrastriatal injection of an adenoviral vector expressing glial-cell-line-derived neurotrophic factor prevents dopaminergic neuron degeneration and behavioral impairment in a rat model of Parkinson disease. Proc Natl Acad Sci U S A 94:8818-8823.
Billy E, Brondani V, Zhang H, Muller U, Filipowicz W (2001) Specific interference with gene expression induced by long, double-stranded RNA in mouse embryonal teratocarcinoma cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A 98:14428-14433.
Bjorklund A, Kirik D, Rosenblad C, Georgievska B, Lundberg C, Mandel RJ (2000) Towards a neuroprotective gene therapy for Parkinson's disease: use of adenovirus, AAV and lentivirus vectors for gene transfer of GDNF to the nigrostriatal system in the rat Parkinson model. Brain Res 886:82-98.
Blaese RM, Culver KW, Miller AD, Carter CS, Fleisher T, Clerici M, Shearer G, Chang L, Chiang Y, Tolstoshev P, Greenblatt JJ, Rosenberg SA, Klein H, Berger M, Mullen CA, Ramsey WJ, Muul L, Morgan RA, Anderson WF (1995) T lymphocyte-directed gene therapy for ADA- SCID: initial trial results after 4 years. Science 270:475-480.
Blomer U, Kafri T, Randolph-Moore L, Verma IM, Gage FH (1998) Bcl-xL protects adult septal cholinergic neurons from axotomized cell death. Proc Natl Acad Sci U S A 95:2603-2608.
Blomer U, Naldini L, Kafri T, Trono D, Verma IM, Gage FH (1997) Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector. J Virol 71:6641-6649.
Bogenhagen DF, Sakonju S, Brown DD (1980) A control region in the center of the 5S RNA gene directs specific initiation of transcription: II. The 3' border of the region. Cell 19:27-35.
Bohl D, Naffakh N, Heard JM (1997) Long-term control of erythropoietin secretion by doxycycline in mice transplanted with engineered primary myoblasts. Nat Med 3:299-305.
Références Bibliographiques
116
Borchert GM, Lanier W, Davidson BL (2006) RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol 13:1097-1101.
Bordignon C, Notarangelo LD, Nobili N, Ferrari G, Casorati G, Panina P, Mazzolari E, Maggioni D, Rossi C, Servida P, Ugazio AG, Mavilio F (1995) Gene therapy in peripheral blood lymphocytes and bone marrow for ADA- immunodeficient patients. Science 270:470-475.
Boulos S, Meloni BP, Arthur PG, Bojarski C, Knuckey NW (2006) Assessment of CMV, RSV and SYN1 promoters and the woodchuck post-transcriptional regulatory element in adenovirus vectors for transgene expression in cortical neuronal cultures. Brain Res 1102:27-38.
Bouyac-Bertoia M, Dvorin JD, Fouchier RA, Jenkins Y, Meyer BE, Wu LI, Emerman M, Malim MH (2001) HIV-1 infection requires a functional integrase NLS. Mol Cell 7:1025-1035.
Bowers WJ, Olschowka JA, Federoff HJ (2003) Immune responses to replication-defective HSV-1 type vectors within the CNS: implications for gene therapy. Gene Ther 10:941-945.
Bowles DE, Rabinowitz JE, Samulski RJ (2003) Marker rescue of adeno-associated virus (AAV) capsid mutants: a novel approach for chimeric AAV production. J Virol 77:423-432.
Brennecke J, Hipfner DR, Stark A, Russell RB, Cohen SM (2003) bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila. Cell 113:25-36.
Bridge AJ, Pebernard S, Ducraux A, Nicoulaz AL, Iggo R (2003) Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells. Nat Genet 34:263-264.
Brizard M HY, Perrin P, Jallet C, Bemelmans AP, Tordo N, Faucon-Biguet N, Mallet J, Sarkis S (submitted) Immune Responses induced by repeated injections of HIV-1 based vectors pseudotyped with VSV and Mokola envelopes into the brain do not preclude sustained transgene expression.
Brizard M. HY, Mammeri H., Jan C., Bemelmans AP., Serguera C., N. Dufour, P. Colin, Perrin P., Tordo N., Charneau P., Tuffereau C, Hantraye P., Deglon N., Mallet J.and . Sarkis C (soumis) Pseudotyping of HIV-1 based vectors with the Mokola virus envelope : immune reaction and species dependent tropism.
Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R (2002) A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296:550-553.
Brun S, Faucon-Biguet N, Mallet J (2003) Optimization of transgene expression at the posttranscriptional level in neural cells: implications for gene therapy. Mol Ther 7:782-789.
Büchen-Osmond D (2006) Retroviridae In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version 4 Büchen-Osmond, C (Ed), Columbia University, New York, USA
Bukovsky AA, Song JP, Naldini L (1999) Interaction of human immunodeficiency virus-derived vectors with wild-type virus in transduced cells. J Virol 73:7087-7092.
Bukrinsky MI, Haggerty S, Dempsey MP, Sharova N, Adzhubel A, Spitz L, Lewis P, Goldfarb D, Emerman M, Stevenson M (1993) A nuclear localization signal within HIV-1 matrix protein that governs infection of non-dividing cells. Nature 365:666-669.
Burcin MM, Schiedner G, Kochanek S, Tsai SY, O'Malley BW (1999) Adenovirus-mediated regulable target gene expression in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 96:355-360.
Burns JC, Friedmann T, Driever W, Burrascano M, Yee JK (1993) Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and
Références Bibliographiques
117
efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 90:8033-8037.
Bushman FD, Miller MD (1997) Tethering human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes to target DNA promotes integration at nearby sites. J Virol 71:458-464.
Byrnes AP, Rusby JE, Wood MJ, Charlton HM (1995) Adenovirus gene transfer causes inflammation in the brain. Neuroscience 66:1015-1024.
Caplen NJ, Parrish S, Imani F, Fire A, Morgan RA (2001) Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc Natl Acad Sci U S A 98:9742-9747.
Caplen NJ, Taylor JP, Statham VS, Tanaka F, Fire A, Morgan RA (2002) Rescue of polyglutamine-mediated cytotoxicity by double-stranded RNA-mediated RNA interference. Hum Mol Genet 11:175-184.
Carmell MA, Hannon GJ (2004) RNase III enzymes and the initiation of gene silencing. Nat Struct Mol Biol 11:214-218.
Carmell MA, Xuan Z, Zhang MQ, Hannon GJ (2002) The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev 16:2733-2742.
Caudy AA, Myers M, Hannon GJ, Hammond SM (2002) Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interference machinery. Genes Dev 16:2491-2496.
Caudy AA, Ketting RF, Hammond SM, Denli AM, Bathoorn AM, Tops BB, Silva JM, Myers MM, Hannon GJ, Plasterk RH (2003) A micrococcal nuclease homologue in RNAi effector complexes. Nature 425:411-414.
Cavaille J (2004) [MicroRNA are everywhere]. Med Sci (Paris) 20:399-401. Cavazzana-Calvo M, Lagresle C, Hacein-Bey-Abina S, Fischer A (2005) Gene therapy for
severe combined immunodeficiency. Annu Rev Med 56:585-602. Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G, Gross F, Yvon E, Nusbaum P, Selz F,
Hue C, Certain S, Casanova JL, Bousso P, Deist FL, Fischer A (2000) Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-X1 disease. Science 288:669-672.
Cerutti L, Mian N, Bateman A (2000) Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the Piwi domain. Trends Biochem Sci 25:481-482.
Chalberg TW, Genise HL, Vollrath D, Calos MP (2005) phiC31 integrase confers genomic integration and long-term transgene expression in rat retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 46:2140-2146.
Chalberg TW, Portlock JL, Olivares EC, Thyagarajan B, Kirby PJ, Hillman RT, Hoelters J, Calos MP (2006) Integration specificity of phage phiC31 integrase in the human genome. J Mol Biol 357:28-48.
Chamberlin NL, Du B, de Lacalle S, Saper CB (1998) Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Res 793:169-175.
Chen H, Engelman A (1998) The barrier-to-autointegration protein is a host factor for HIV type 1 integration. Proc Natl Acad Sci U S A 95:15270-15274.
Chen MY, Maldarelli F, Karczewski MK, Willey RL, Strebel K (1993) Human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein induces degradation of CD4 in vitro: the cytoplasmic domain of CD4 contributes to Vpu sensitivity. J Virol 67:3877-3884.
Chen R, Le Rouzic E, Kearney JA, Mansky LM, Benichou S (2004) Vpr-mediated incorporation of UNG2 into HIV-1 particles is required to modulate the virus mutation rate and for replication in macrophages. J Biol Chem 279:28419-28425.
Références Bibliographiques
118
Chiocca EA, Choi BB, Cai WZ, DeLuca NA, Schaffer PA, DiFiglia M, Breakefield XO, Martuza RL (1990) Transfer and expression of the lacZ gene in rat brain neurons mediated by herpes simplex virus mutants. New Biol 2:739-746.
Chirmule N, Propert K, Magosin S, Qian Y, Qian R, Wilson J (1999) Immune responses to adenovirus and adeno-associated virus in humans. Gene Ther 6:1574-1583.
Chirmule N, Xiao W, Truneh A, Schnell MA, Hughes JV, Zoltick P, Wilson JM (2000) Humoral immunity to adeno-associated virus type 2 vectors following administration to murine and nonhuman primate muscle. J Virol 74:2420-2425.
Chong H, Ruchatz A, Clackson T, Rivera VM, Vile RG (2002) A system for small-molecule control of conditionally replication-competent adenoviral vectors. Mol Ther 5:195-203.
Choo Y, Sanchez-Garcia I, Klug A (1994) In vivo repression by a site-specific DNA-binding protein designed against an oncogenic sequence. Nature 372:642-645.
Choo Y, Castellanos A, Garcia-Hernandez B, Sanchez-Garcia I, Klug A (1997) Promoter-specific activation of gene expression directed by bacteriophage-selected zinc fingers. J Mol Biol 273:525-532.
Chtarto A, Bender HU, Hanemann CO, Kemp T, Lehtonen E, Levivier M, Brotchi J, Velu T, Tenenbaum L (2003) Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector. Gene Ther 10:84-94.
Coffin JM (1996) Retroviridae: The Viruse and their Replication, Third Edition Edition. Coil DA, Miller AD (2004) Phosphatidylserine is not the cell surface receptor for vesicular
stomatitis virus. J Virol 78:10920-10926. Connor B, Kozlowski DA, Schallert T, Tillerson JL, Davidson BL, Bohn MC (1999)
Differential effects of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in the striatum and substantia nigra of the aged Parkinsonian rat. Gene Ther 6:1936-1951.
Connor B, Kozlowski DA, Unnerstall JR, Elsworth JD, Tillerson JL, Schallert T, Bohn MC (2001) Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) gene delivery protects dopaminergic terminals from degeneration. Exp Neurol 169:83-95.
Consiglio A, Gritti A, Dolcetta D, Follenzi A, Bordignon C, Gage FH, Vescovi AL, Naldini L (2004) Robust in vivo gene transfer into adult mammalian neural stem cells by lentiviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A 101:14835-14840.
Cooley LA, Lewin SR (2003) HIV-1 cell entry and advances in viral entry inhibitor therapy. J Clin Virol 26:121-132.
Corti O, Sanchez-Capelo A, Colin P, Hanoun N, Hamon M, Mallet J (1999a) Long-term doxycycline-controlled expression of human tyrosine hydroxylase after direct adenovirus-mediated gene transfer to a rat model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A 96:12120-12125.
Corti O, Sabate O, Horellou P, Colin P, Dumas S, Buchet D, Buc-Caron MH, Mallet J (1999b) A single adenovirus vector mediates doxycycline-controlled expression of tyrosine hydroxylase in brain grafts of human neural progenitors. Nat Biotechnol 17:349-354.
Couzin J (2002) Breakthrough of the year. Small RNAs make big splash. Science 298:2296-2297.
Czauderna F, Santel A, Hinz M, Fechtner M, Durieux B, Fisch G, Leenders F, Arnold W, Giese K, Klippel A, Kaufmann J (2003) Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic Acids Res 31:e127.
Dalgleish AG, Beverley PC, Clapham PR, Crawford DH, Greaves MF, Weiss RA (1984) The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus. Nature 312:763-767.
Références Bibliographiques
119
Danzeiser DA, Urso O, Kunkel GR (1993) Functional characterization of elements in a human U6 small nuclear RNA gene distal control region. Mol Cell Biol 13:4670-4678.
Das AT, Zhou X, Vink M, Klaver B, Verhoef K, Marzio G, Berkhout B (2004) Viral evolution as a tool to improve the tetracycline-regulated gene expression system. J Biol Chem 279:18776-18782.
Das G, Hinkley CS, Herr W (1995) Basal promoter elements as a selective determinant of transcriptional activator function. Nature 374:657-660.
Das G, Henning D, Wright D, Reddy R (1988) Upstream regulatory elements are necessary and sufficient for transcription of a U6 RNA gene by RNA polymerase III. Embo J 7:503-512.
Davidson BL, Paulson HL (2004) Molecular medicine for the brain: silencing of disease genes with RNA interference. Lancet Neurol 3:145-149.
Davis HL, Whalen RG, Demeneix BA (1993) Direct gene transfer into skeletal muscle in vivo: factors affecting efficiency of transfer and stability of expression. Hum Gene Ther 4:151-159.
de Almeida LP, Zala D, Aebischer P, Deglon N (2001) Neuroprotective effect of a CNTF-expressing lentiviral vector in the quinolinic acid rat model of Huntington's disease. Neurobiol Dis 8:433-446.
De Jong JC, Wermenbol AG, Verweij-Uijterwaal MW, Slaterus KW, Wertheim-Van Dillen P, Van Doornum GJ, Khoo SH, Hierholzer JC (1999) Adenoviruses from human immunodeficiency virus-infected individuals, including two strains that represent new candidate serotypes Ad50 and Ad51 of species B1 and D, respectively. J Clin Microbiol 37:3940-3945.
Deglon N, Tseng JL, Bensadoun JC, Zurn AD, Arsenijevic Y, Pereira de Almeida L, Zufferey R, Trono D, Aebischer P (2000) Self-inactivating lentiviral vectors with enhanced transgene expression as potential gene transfer system in Parkinson's disease. Hum Gene Ther 11:179-190.
Deleuze V, Scherman D, Bureau MF (2002) Interleukin-10 expression after intramuscular DNA electrotransfer: kinetic studies. Biochem Biophys Res Commun 299:29-34.
Denli AM, Hannon GJ (2003) RNAi: an ever-growing puzzle. Trends Biochem Sci 28:196-201.
Dettenhofer M, Cen S, Carlson BA, Kleiman L, Yu XF (2000) Association of human immunodeficiency virus type 1 Vif with RNA and its role in reverse transcription. J Virol 74:8938-8945.
Dickins RA, Hemann MT, Zilfou JT, Simpson DR, Ibarra I, Hannon GJ, Lowe SW (2005) Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors. Nat Genet 37:1289-1295.
Didierjean J (2005) Etude d'une nouvelle classe d'inhibiteurs de la rétrotranscriptase et de l'intégrase du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Thèse de doctorat, Université Louis Pasteur, Strasbourg I.
Dittgen T, Nimmerjahn A, Komai S, Licznerski P, Waters J, Margrie TW, Helmchen F, Denk W, Brecht M, Osten P (2004) Lentivirus-based genetic manipulations of cortical neurons and their optical and electrophysiological monitoring in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 101:18206-18211.
Do Thi NA, Saillour P, Ferrero L, Paunio T, Mallet J (2006) Does neuronal expression of GDNF effectively protect dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease? Gene Ther.
Do Thi NA, Saillour P, Ferrero L, Dedieu JF, Mallet J, Paunio T (2004) Delivery of GDNF by an E1,E3/E4 deleted adenoviral vector and driven by a GFAP promoter prevents
Références Bibliographiques
120
dopaminergic neuron degeneration in a rat model of Parkinson's disease. Gene Ther 11:746-756.
Doench JG, Petersen CP, Sharp PA (2003) siRNAs can function as miRNAs. Genes Dev 17:438-442.
Du B, Wu P, Boldt-Houle DM, Terwilliger EF (1996) Efficient transduction of human neurons with an adeno-associated virus vector. Gene Ther 3:254-261.
Du G, Yonekubo J, Zeng Y, Osisami M, Frohman MA (2006) Design of expression vectors for RNA interference based on miRNAs and RNA splicing. Febs J 273:5421-5427.
Duan D, Yan Z, Yue Y, Engelhardt JF (1999) Structural analysis of adeno-associated virus transduction circular intermediates. Virology 261:8-14.
Dudley NR, Labbe JC, Goldstein B (2002) Using RNA interference to identify genes required for RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A 99:4191-4196.
Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, Naldini L (1998) A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol 72:8463-8471.
Dykxhoorn DM, Novina CD, Sharp PA (2003) Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol 4:457-467.
Dykxhoorn DM, Schlehuber LD, London IM, Lieberman J (2006) Determinants of specific RNA interference-mediated silencing of human beta-globin alleles differing by a single nucleotide polymorphism. Proc Natl Acad Sci U S A 103:5953-5958.
Ebner K, Rauch M, Preuner S, Lion T (2006) Typing of Human Adenoviruses in Specimens from Immunosuppressed Patients by PCR-Fragment Length Analysis and Real-Time Quantitative PCR. J Clin Microbiol 44:2808-2815.
Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T (2001a) RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev 15:188-200.
Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001b) Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411:494-498.
Emi N, Friedmann T, Yee JK (1991) Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J Virol 65:1202-1207.
Farnet CM, Bushman FD (1997) HIV-1 cDNA integration: requirement of HMG I(Y) protein for function of preintegration complexes in vitro. Cell 88:483-492.
Farson D, Witt R, McGuinness R, Dull T, Kelly M, Song J, Radeke R, Bukovsky A, Consiglio A, Naldini L (2001) A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviral vectors. Hum Gene Ther 12:981-997.
Favre D, Blouin V, Provost N, Spisek R, Porrot F, Bohl D, Marme F, Cherel Y, Salvetti A, Hurtrel B, Heard JM, Riviere Y, Moullier P (2002) Lack of an immune response against the tetracycline-dependent transactivator correlates with long-term doxycycline-regulated transgene expression in nonhuman primates after intramuscular injection of recombinant adeno-associated virus. J Virol 76:11605-11611.
Feederle R, Delecluse HJ, Rouault JP, Schepers A, Hammerschmidt W (2004) Efficient somatic gene targeting in the lymphoid human cell line DG75. Gene 343:91-97.
Filipowicz W, Jaskiewicz L, Kolb FA, Pillai RS (2005) Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Curr Opin Struct Biol 15:331-341.
Fire A, Albertson D, Harrison SW, Moerman DG (1991) Production of antisense RNA leads to effective and specific inhibition of gene expression in C. elegans muscle. Development 113:503-514.
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391:806-811.
Références Bibliographiques
121
Fitzsimons HL, McKenzie JM, During MJ (2001) Insulators coupled to a minimal bidirectional tet cassette for tight regulation of rAAV-mediated gene transfer in the mammalian brain. Gene Ther 8:1675-1681.
Follenzi A, Ailles LE, Bakovic S, Geuna M, Naldini L (2000) Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet 25:217-222.
Fowlkes DM, Shenk T (1980) Transcriptional control regions of the adenovirus VAI RNA gene. Cell 22:405-413.
Fraefel C, Song S, Lim F, Lang P, Yu L, Wang Y, Wild P, Geller AI (1996) Helper virus-free transfer of herpes simplex virus type 1 plasmid vectors into neural cells. J Virol 70:7190-7197.
Frampton AR, Jr., Goins WF, Nakano K, Burton EA, Glorioso JC (2005) HSV trafficking and development of gene therapy vectors with applications in the nervous system. Gene Ther 12:891-901.
Frenkel N, Singer O, Kwong AD (1994) Minireview: the herpes simplex virus amplicon--a versatile defective virus vector. Gene Ther 1 Suppl 1:S40-46.
Freundlieb S, Schirra-Muller C, Bujard H (1999) A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med 1:4-12.
Friedmann T, Roblin R (1972) Gene therapy for human genetic disease? Science 175:949-955.
Furth PA, St Onge L, Boger H, Gruss P, Gossen M, Kistner A, Bujard H, Hennighausen L (1994) Temporal control of gene expression in transgenic mice by a tetracycline-responsive promoter. Proc Natl Acad Sci U S A 91:9302-9306.
Galanis E, Vile R, Russell SJ (2001) Delivery systems intended for in vivo gene therapy of cancer: targeting and replication competent viral vectors. Crit Rev Oncol Hematol 38:177-192.
Galimi F, Saez E, Gall J, Hoong N, Cho G, Evans RM, Verma IM (2005) Development of ecdysone-regulated lentiviral vectors. Mol Ther 11:142-148.
Galli G, Hofstetter H, Birnstiel ML (1981) Two conserved sequence blocks within eukaryotic tRNA genes are major promoter elements. Nature 294:626-631.
Gan L, Ye S, Chu A, Anton K, Yi S, Vincent VA, von Schack D, Chin D, Murray J, Lohr S, Patthy L, Gonzalez-Zulueta M, Nikolich K, Urfer R (2004) Identification of cathepsin B as a mediator of neuronal death induced by Abeta-activated microglial cells using a functional genomics approach. J Biol Chem 279:5565-5572.
Gao G, Alvira MR, Somanathan S, Lu Y, Vandenberghe LH, Rux JJ, Calcedo R, Sanmiguel J, Abbas Z, Wilson JM (2003) Adeno-associated viruses undergo substantial evolution in primates during natural infections. Proc Natl Acad Sci U S A 100:6081-6086.
Gartel AL, Kandel ES (2006) RNA interference in cancer. Biomol Eng 23:17-34. Gasmi M, Glynn J, Jin MJ, Jolly DJ, Yee JK, Chen ST (1999) Requirements for efficient
production and transduction of human immunodeficiency virus type 1-based vectors. J Virol 73:1828-1834.
Gehl J (2003) Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiol Scand 177:437-447.
Georgievska B, Kirik D, Bjorklund A (2002) Aberrant sprouting and downregulation of tyrosine hydroxylase in lesioned nigrostriatal dopamine neurons induced by long-lasting overexpression of glial cell line derived neurotrophic factor in the striatum by lentiviral gene transfer. Exp Neurol 177:461-474.
Références Bibliographiques
122
Georgievska B, Jakobsson J, Persson E, Ericson C, Kirik D, Lundberg C (2004) Regulated delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor into rat striatum, using a tetracycline-dependent lentiviral vector. Hum Gene Ther 15:934-944.
Geraerts M, Eggermont K, Hernandez-Acosta P, Garcia-Verdugo JM, Baekelandt V, Debyser Z (2006) Lentiviral Vectors Mediate Efficient and Stable Gene Transfer in Adult Neural Stem Cells In Vivo. Hum Gene Ther.
Ghadge GD, Roos RP, Kang UJ, Wollmann R, Fishman PS, Kalynych AM, Barr E, Leiden JM (1995) CNS gene delivery by retrograde transport of recombinant replication-defective adenoviruses. Gene Ther 2:132-137.
Gill SS, Patel NK, Hotton GR, O'Sullivan K, McCarter R, Bunnage M, Brooks DJ, Svendsen CN, Heywood P (2003) Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease. Nat Med 9:589-595.
Ginsburg DS, Calos MP (2005) Site-specific integration with phiC31 integrase for prolonged expression of therapeutic genes. Adv Genet 54:179-187.
Go WY, Ho SN (2002) Optimization and direct comparison of the dimerizer and reverse tet transcriptional control systems. J Gene Med 4:258-270.
Goh WC, Rogel ME, Kinsey CM, Michael SF, Fultz PN, Nowak MA, Hahn BH, Emerman M (1998) HIV-1 Vpr increases viral expression by manipulation of the cell cycle: a mechanism for selection of Vpr in vivo. Nat Med 4:65-71.
Goldschmidt V (2004) La retrotranscription de HIV-1: étude du complexe d'initiation et des mécanismes de résistance aux inhibiteurs nucléosidiques. Thèse de doctorat, Université Louis Pasteur, Strasbourg I.
Gossen M, Bujard H (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A 89:5547-5551.
Gossen M, Freundlieb S, Bender G, Muller G, Hillen W, Bujard H (1995) Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science 268:1766-1769.
Gottlinger HG, Dorfman T, Cohen EA, Haseltine WA (1993) Vpu protein of human immunodeficiency virus type 1 enhances the release of capsids produced by gag gene constructs of widely divergent retroviruses. Proc Natl Acad Sci U S A 90:7381-7385.
Grimm D, Kay MA (2003) From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr Gene Ther 3:281-304.
Grimm D, Streetz KL, Jopling CL, Storm TA, Pandey K, Davis CR, Marion P, Salazar F, Kay MA (2006) Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature 441:537-541.
Grishok A, Sinskey JL, Sharp PA (2005) Transcriptional silencing of a transgene by RNAi in the soma of C. elegans. Genes Dev 19:683-696.
Grishok A, Pasquinelli AE, Conte D, Li N, Parrish S, Ha I, Baillie DL, Fire A, Ruvkun G, Mello CC (2001) Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell 106:23-34.
Groth AC, Olivares EC, Thyagarajan B, Calos MP (2000) A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc Natl Acad Sci U S A 97:5995-6000.
Guo S, Kemphues KJ (1995) par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 81:611-620.
Gupta S, Schoer RA, Egan JE, Hannon GJ, Mittal V (2004) Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 101:1927-1932.
Références Bibliographiques
123
Haase G, Pettmann B, Bordet T, Villa P, Vigne E, Schmalbruch H, Kahn A (1999) Therapeutic benefit of ciliary neurotrophic factor in progressive motor neuronopathy depends on the route of delivery. Ann Neurol 45:296-304.
Haase G, Kennel P, Pettmann B, Vigne E, Akli S, Revah F, Schmalbruch H, Kahn A (1997) Gene therapy of murine motor neuron disease using adenoviral vectors for neurotrophic factors. Nat Med 3:429-436.
Hacein-Bey-Abina S, von Kalle C, Schmidt M, Le Deist F, Wulffraat N, McIntyre E, Radford I, Villeval JL, Fraser CC, Cavazzana-Calvo M, Fischer A (2003a) A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N Engl J Med 348:255-256.
Hacein-Bey-Abina S, Schmidt M, Le Deist F, Garrigue A, Wulffraat N, Alexander I, G. S-B, JL C, von Kalle C, Fischer A, M. C-c (2006) Gene therapy for severe combined immunodeficiency X1. XIV Annual Congress of the European Society of Gene Therapy:17.
Hacein-Bey-Abina S, Le Deist F, Carlier F, Bouneaud C, Hue C, De Villartay JP, Thrasher AJ, Wulffraat N, Sorensen R, Dupuis-Girod S, Fischer A, Davies EG, Kuis W, Leiva L, Cavazzana-Calvo M (2002) Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy. N Engl J Med 346:1185-1193.
Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, McCormack MP, Wulffraat N, Leboulch P, Lim A, Osborne CS, Pawliuk R, Morillon E, Sorensen R, Forster A, Fraser P, Cohen JI, de Saint Basile G, Alexander I, Wintergerst U, Frebourg T, Aurias A, Stoppa-Lyonnet D, Romana S, Radford-Weiss I, Gross F, Valensi F, Delabesse E, Macintyre E, Sigaux F, Soulier J, Leiva LE, Wissler M, Prinz C, Rabbitts TH, Le Deist F, Fischer A, Cavazzana-Calvo M (2003b) LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science 302:415-419.
Hadaczek P, Yamashita Y, Mirek H, Tamas L, Bohn MC, Noble C, Park JW, Bankiewicz K (2006) The "perivascular pump" driven by arterial pulsation is a powerful mechanism for the distribution of therapeutic molecules within the brain. Mol Ther 14:69-78.
Haffar OK, Popov S, Dubrovsky L, Agostini I, Tang H, Pushkarsky T, Nadler SG, Bukrinsky M (2000) Two nuclear localization signals in the HIV-1 matrix protein regulate nuclear import of the HIV-1 pre-integration complex. J Mol Biol 299:359-368.
Hall IM, Noma K, Grewal SI (2003) RNA interference machinery regulates chromosome dynamics during mitosis and meiosis in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A 100:193-198.
Hammond SM (2005) Dicing and slicing: the core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett 579:5822-5829.
Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ (2000) An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404:293-296.
Hammond SM, Boettcher S, Caudy AA, Kobayashi R, Hannon GJ (2001) Argonaute2, a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293:1146-1150.
Hannon GJ (2002) RNA interference. Nature 418:244-251. Harding TC, Geddes BJ, Murphy D, Knight D, Uney JB (1998) Switching transgene
expression in the brain using an adenoviral tetracycline-regulatable system. Nat Biotechnol 16:553-555.
Hardy J, Orr H (2006) The genetics of neurodegenerative diseases. J Neurochem 97:1690-1699.
Harper SQ, Staber PD, He X, Eliason SL, Martins IH, Mao Q, Yang L, Kotin RM, Paulson HL, Davidson BL (2005) RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A 102:5820-5825.
Références Bibliographiques
124
Heil F, Hemmi H, Hochrein H, Ampenberger F, Kirschning C, Akira S, Lipford G, Wagner H, Bauer S (2004) Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science 303:1526-1529.
Henry RW, Ma B, Sadowski CL, Kobayashi R, Hernandez N (1996) Cloning and characterization of SNAP50, a subunit of the snRNA-activating protein complex SNAPc. Embo J 15:7129-7136.
Hermonat PL, Muzyczka N (1984) Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector: transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A 81:6466-6470.
Hernandez N, Lucito R (1988) Elements required for transcription initiation of the human U2 snRNA gene coincide with elements required for snRNA 3' end formation. Embo J 7:3125-3134.
Higuchi H, Yamashita T, Yoshikawa H, Tohyama M (2003) Functional inhibition of the p75 receptor using a small interfering RNA. Biochem Biophys Res Commun 301:804-809.
Hill M, Hillova J (1972) Virus recovery in chicken cells tested with Rous sarcoma cell DNA. Nat New Biol 237:35-39.
Hirko A, Tang F, Hughes JA (2003) Cationic lipid vectors for plasmid DNA delivery. Curr Med Chem 10:1185-1193.
Hlavaty J, Schittmayer M, Stracke A, Jandl G, Knapp E, Felber BK, Salmons B, Gunzburg WH, Renner M (2005) Effect of posttranscriptional regulatory elements on transgene expression and virus production in the context of retrovirus vectors. Virology 341:1-11.
Hofstetter H, Kressman A, Birnstiel ML (1981) A split promoter for a eucaryotic tRNA gene. Cell 24:573-585.
Hoggan MD, Blacklow NR, Rowe WP (1966) Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological, and immunological characteristics. Proc Natl Acad Sci U S A 55:1467-1474.
Hoglund S, Ohagen A, Lawrence K, Gabuzda D (1994) Role of vif during packing of the core of HIV-1. Virology 201:349-355.
Hoppe UC, Marban E, Johns DC (2000) Adenovirus-mediated inducible gene expression in vivo by a hybrid ecdysone receptor. Mol Ther 1:159-164.
Horellou P, Vigne E, Castel MN, Barneoud P, Colin P, Perricaudet M, Delaere P, Mallet J (1994) Direct intracerebral gene transfer of an adenoviral vector expressing tyrosine hydroxylase in a rat model of Parkinson's disease. Neuroreport 6:49-53.
Hornung V, Guenthner-Biller M, Bourquin C, Ablasser A, Schlee M, Uematsu S, Noronha A, Manoharan M, Akira S, de Fougerolles A, Endres S, Hartmann G (2005) Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7. Nat Med 11:263-270.
Hosono T, Mizuguchi H, Katayama K, Xu ZL, Sakurai F, Ishii-Watabe A, Kawabata K, Yamaguchi T, Nakagawa S, Mayumi T, Hayakawa T (2004) Adenovirus vector-mediated doxycycline-inducible RNA interference. Hum Gene Ther 15:813-819.
Houk BE, Martin R, Hochhaus G, Hughes JA (2001) Pharmacokinetics of plasmid DNA in the rat. Pharm Res 18:67-74.
Howe S, Thrasher AJ (2003) Gene therapy for inherited immunodeficiencies. Curr Hematol Rep 2:328-334.
Hutvagner G, Zamore PD (2002) A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science 297:2056-2060.
Hutvagner G, McLachlan J, Pasquinelli AE, Balint E, Tuschl T, Zamore PD (2001) A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA. Science 293:834-838.
Références Bibliographiques
125
Huvent I, Hong SS, Fournier C, Gay B, Tournier J, Carriere C, Courcoul M, Vigne R, Spire B, Boulanger P (1998) Interaction and co-encapsidation of human immunodeficiency virus type 1 Gag and Vif recombinant proteins. J Gen Virol 79 ( Pt 5):1069-1081.
Imaoka T, Date I, Ohmoto T, Yasuda T, Tsuda M (1998) In vivo gene transfer into the adult mammalian central nervous system by continuous injection of plasmid DNA-cationic liposome complex. Brain Res 780:119-128.
Ishizuka A, Siomi MC, Siomi H (2002) A Drosophila fragile X protein interacts with components of RNAi and ribosomal proteins. Genes Dev 16:2497-2508.
Iwakuma T, Cui Y, Chang LJ (1999) Self-inactivating lentiviral vectors with U3 and U5 modifications. Virology 261:120-132.
Jackson DA, Symons RH, Berg P (1972) Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 69:2904-2909.
Jakobsson J, Lundberg C (2006) Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Mol Ther 13:484-493.
Jakobsson J, Georgievska B, Ericson C, Lundberg C (2004) Lesion-dependent regulation of transgene expression in the rat brain using a human glial fibrillary acidic protein-lentiviral vector. Eur J Neurosci 19:761-765.
Jakobsson J, Ericson C, Jansson M, Bjork E, Lundberg C (2003) Targeted transgene expression in rat brain using lentiviral vectors. J Neurosci Res 73:876-885.
Jakobsson J, Rosenqvist N, Marild K, D VA, Lundberg C (2006) Evidence for disease-regulated transgene expression in the brain with use of lentiviral vectors. J Neurosci Res 84:58-67.
Janowski BA, Huffman KE, Schwartz JC, Ram R, Nordsell R, Shames DS, Minna JD, Corey DR (2006) Involvement of AGO1 and AGO2 in mammalian transcriptional silencing. Nat Struct Mol Biol 13:787-792.
Jenkins Y, McEntee M, Weis K, Greene WC (1998) Characterization of HIV-1 vpr nuclear import: analysis of signals and pathways. J Cell Biol 143:875-885.
Jeske NA, Patwardhan AM, Gamper N, Price TJ, Akopian AN, Hargreaves KM (2006) Cannabinoid WIN 55,212-2 regulates TRPV1 phosphorylation in sensory neurons. J Biol Chem.
Jiao S, Cheng L, Wolff JA, Yang NS (1993) Particle bombardment-mediated gene transfer and expression in rat brain tissues. Biotechnology (N Y) 11:497-502.
Judge AD, Sood V, Shaw JR, Fang D, McClintock K, MacLachlan I (2005) Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA. Nat Biotechnol 23:457-462.
Jung A, Maier R, Vartanian JP, Bocharov G, Jung V, Fischer U, Meese E, Wain-Hobson S, Meyerhans A (2002) Multiply infected spleen cells in HIV patients. Nature 418:144.
Kafri T, van Praag H, Gage FH, Verma IM (2000) Lentiviral vectors: regulated gene expression. Mol Ther 1:516-521.
Kafri T, Blomer U, Peterson DA, Gage FH, Verma IM (1997) Sustained expression of genes delivered directly into liver and muscle by lentiviral vectors. Nat Genet 17:314-317.
Kafri T, van Praag H, Ouyang L, Gage FH, Verma IM (1999) A packaging cell line for lentivirus vectors. J Virol 73:576-584.
Kaiser J (2005) Gene therapy. Panel urges limits on X-SCID trials. Science 307:1544-1545. Kajiwara K, Byrnes AP, Charlton HM, Wood MJ, Wood KJ (1997) Immune responses to
adenoviral vectors during gene transfer in the brain. Hum Gene Ther 8:253-265. Kajiwara K, Byrnes AP, Ohmoto Y, Charlton HM, Wood MJ, Wood KJ (2000) Humoral
immune responses to adenovirus vectors in the brain. J Neuroimmunol 103:8-15.
Références Bibliographiques
126
Kang Y, Stein CS, Heth JA, Sinn PL, Penisten AK, Staber PD, Ratliff KL, Shen H, Barker CK, Martins I, Sharkey CM, Sanders DA, McCray PB, Jr., Davidson BL (2002) In vivo gene transfer using a nonprimate lentiviral vector pseudotyped with Ross River Virus glycoproteins. J Virol 76:9378-9388.
Kaplitt MG, Leone P, Samulski RJ, Xiao X, Pfaff DW, O'Malley KL, During MJ (1994) Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet 8:148-154.
Kariko K, Bhuyan P, Capodici J, Weissman D (2004) Small interfering RNAs mediate sequence-independent gene suppression and induce immune activation by signaling through toll-like receptor 3. J Immunol 172:6545-6549.
Karns LR, Kisielewski A, Gulding KM, Seraj JM, Theodorescu D (2001) Manipulation of gene expression by an ecdysone-inducible gene switch in tumor xenografts. BMC Biotechnol 1:11.
Karzenowski D, Potter DW, Padidam M (2005) Inducible control of transgene expression with ecdysone receptor: gene switches with high sensitivity, robust expression, and reduced size. Biotechniques 39:191-192, 194, 196 passim.
Kearns WG, Afione SA, Fulmer SB, Pang MC, Erikson D, Egan M, Landrum MJ, Flotte TR, Cutting GR (1996) Recombinant adeno-associated virus (AAV-CFTR) vectors do not integrate in a site-specific fashion in an immortalized epithelial cell line. Gene Ther 3:748-755.
Kells AP, Fong DM, Dragunow M, During MJ, Young D, Connor B (2004) AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Mol Ther 9:682-688.
Ketting RF, Fischer SE, Bernstein E, Sijen T, Hannon GJ, Plasterk RH (2001) Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes Dev 15:2654-2659.
Ketzinel-Gilad M, Shaul Y, Galun E (2006) RNA interference for antiviral therapy. J Gene Med 8:933-950.
Khan MA, Aberham C, Kao S, Akari H, Gorelick R, Bour S, Strebel K (2001) Human immunodeficiency virus type 1 Vif protein is packaged into the nucleoprotein complex through an interaction with viral genomic RNA. J Virol 75:7252-7265.
Khvorova A, Reynolds A, Jayasena SD (2003) Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell 115:209-216.
Kim DH, Villeneuve LM, Morris KV, Rossi JJ (2006) Argonaute-1 directs siRNA-mediated transcriptional gene silencing in human cells. Nat Struct Mol Biol.
Kim DH, Longo M, Han Y, Lundberg P, Cantin E, Rossi JJ (2004) Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase. Nat Biotechnol 22:321-325.
Kim JS, Pabo CO (1997) Transcriptional repression by zinc finger peptides. Exploring the potential for applications in gene therapy. J Biol Chem 272:29795-29800.
Kim VN, Mitrophanous K, Kingsman SM, Kingsman AJ (1998) Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1. J Virol 72:811-816.
Kingsman SM, Mitrophanous K, Olsen JC (2005) Potential oncogene activity of the woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE). Gene Ther 12:3-4.
Kirik D, Georgievska B, Bjorklund A (2004) Localized striatal delivery of GDNF as a treatment for Parkinson disease. Nat Neurosci 7:105-110.
Kirschtein R, Skirboll L (2001) Stem cells: Scientific Progress and Future Research Directions. NIH Reports
Références Bibliographiques
127
Kistner A, Gossen M, Zimmermann F, Jerecic J, Ullmer C, Lubbert H, Bujard H (1996) Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 93:10933-10938.
Klages N, Zufferey R, Trono D (2000) A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther 2:170-176.
Klein R, Ruttkowski B, Knapp E, Salmons B, Gunzburg WH, Hohenadl C (2006) WPRE-mediated enhancement of gene expression is promoter and cell line specific. Gene 372:153-161.
Klein SM, Behrstock S, McHugh J, Hoffmann K, Wallace K, Suzuki M, Aebischer P, Svendsen CN (2005) GDNF delivery using human neural progenitor cells in a rat model of ALS. Hum Gene Ther 16:509-521.
Klonjkowski B, Gilardi-Hebenstreit P, Hadchouel J, Randrianarison V, Boutin S, Yeh P, Perricaudet M, Kremer EJ (1997) A recombinant E1-deleted canine adenoviral vector capable of transduction and expression of a transgene in human-derived cells and in vivo. Hum Gene Ther 8:2103-2115.
Kobinger GP, Deng S, Louboutin JP, Vatamaniuk M, Rivera VM, Lian MM, Markmann JF, Clackson T, Raper SE, Matschinsky F, Wilson JM (2005) Pharmacologically regulated regeneration of functional human pancreatic islets. Mol Ther 11:105-111.
Kofler P, Wiesenhofer B, Rehrl C, Baier G, Stockhammer G, Humpel C (1998) Liposome-mediated gene transfer into established CNS cell lines, primary glial cells, and in vivo. Cell Transplant 7:175-185.
Kogure K, Urabe M, Mizukami H, Kume A, Sato Y, Monahan J, Ozawa K (2001) Targeted integration of foreign DNA into a defined locus on chromosome 19 in K562 cells using AAV-derived components. Int J Hematol 73:469-475.
Koponen JK, Kankkonen H, Kannasto J, Wirth T, Hillen W, Bujard H, Yla-Herttuala S (2003) Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther 10:459-466.
Kordower JH, Bloch J, Ma SY, Chu Y, Palfi S, Roitberg BZ, Emborg M, Hantraye P, Deglon N, Aebischer P (1999) Lentiviral gene transfer to the nonhuman primate brain. Exp Neurol 160:1-16.
Kordower JH, Emborg ME, Bloch J, Ma SY, Chu Y, Leventhal L, McBride J, Chen EY, Palfi S, Roitberg BZ, Brown WD, Holden JE, Pyzalski R, Taylor MD, Carvey P, Ling Z, Trono D, Hantraye P, Deglon N, Aebischer P (2000) Neurodegeneration prevented by lentiviral vector delivery of GDNF in primate models of Parkinson's disease. Science 290:767-773.
Kotin RM, Linden RM, Berns KI (1992) Characterization of a preferred site on human chromosome 19q for integration of adeno-associated virus DNA by non-homologous recombination. Embo J 11:5071-5078.
Kotin RM, Siniscalco M, Samulski RJ, Zhu XD, Hunter L, Laughlin CA, McLaughlin S, Muzyczka N, Rocchi M, Berns KI (1990) Site-specific integration by adeno-associated virus. Proc Natl Acad Sci U S A 87:2211-2215.
Kreiss P, Bettan M, Crouzet J, Scherman D (1999) Erythropoietin secretion and physiological effect in mouse after intramuscular plasmid DNA electrotransfer. J Gene Med 1:245-250.
Krichevsky AM, Kosik KS (2002) RNAi functions in cultured mammalian neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 99:11926-11929.
Kumar MB, Fujimoto T, Potter DW, Deng Q, Palli SR (2002) A single point mutation in ecdysone receptor leads to increased ligand specificity: implications for gene switch applications. Proc Natl Acad Sci U S A 99:14710-14715.
Références Bibliographiques
128
Kunkel GR, Pederson T (1988) Upstream elements required for efficient transcription of a human U6 RNA gene resemble those of U1 and U2 genes even though a different polymerase is used. Genes Dev 2:196-204.
Kunkel GR, Pederson T (1989) Transcription of a human U6 small nuclear RNA gene in vivo withstands deletion of intragenic sequences but not of an upstream TATATA box. Nucleic Acids Res 17:7371-7379.
Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T (2001) Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science 294:853-858.
Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, Meyer J, Lendeckel W, Tuschl T (2002) Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Curr Biol 12:735-739.
Lai CM, Lai YK, Rakoczy PE (2002) Adenovirus and adeno-associated virus vectors. DNA Cell Biol 21:895-913.
Lai EC (2002) Micro RNAs are complementary to 3' UTR sequence motifs that mediate negative post-transcriptional regulation. Nat Genet 30:363-364.
Lamartina S, Roscilli G, Rinaudo CD, Sporeno E, Silvi L, Hillen W, Bujard H, Cortese R, Ciliberto G, Toniatti C (2002) Stringent control of gene expression in vivo by using novel doxycycline-dependent trans-activators. Hum Gene Ther 13:199-210.
Lamartina S, Silvi L, Roscilli G, Casimiro D, Simon AJ, Davies ME, Shiver JW, Rinaudo CD, Zampaglione I, Fattori E, Colloca S, Gonzalez Paz O, Laufer R, Bujard H, Cortese R, Ciliberto G, Toniatti C (2003) Construction of an rtTA2(s)-m2/tts(kid)-based transcription regulatory switch that displays no basal activity, good inducibility, and high responsiveness to doxycycline in mice and non-human primates. Mol Ther 7:271-280.
Lang AE, Gill S, Patel NK, Lozano A, Nutt JG, Penn R, Brooks DJ, Hotton G, Moro E, Heywood P, Brodsky MA, Burchiel K, Kelly P, Dalvi A, Scott B, Stacy M, Turner D, Wooten VG, Elias WJ, Laws ER, Dhawan V, Stoessl AJ, Matcham J, Coffey RJ, Traub M (2006) Randomized controlled trial of intraputamenal glial cell line-derived neurotrophic factor infusion in Parkinson disease. Ann Neurol 59:459-466.
Latta-Mahieu M, Rolland M, Caillet C, Wang M, Kennel P, Mahfouz I, Loquet I, Dedieu JF, Mahfoudi A, Trannoy E, Thuillier V (2002) Gene transfer of a chimeric trans-activator is immunogenic and results in short-lived transgene expression. Hum Gene Ther 13:1611-1620.
Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP (2001) An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 294:858-862.
Le Gal La Salle G, Robert JJ, Berrard S, Ridoux V, Stratford-Perricaudet LD, Perricaudet M, Mallet J (1993) An adenovirus vector for gene transfer into neurons and glia in the brain. Science 259:988-990.
Lebherz C, Auricchio A, Maguire AM, Rivera VM, Tang W, Grant RL, Clackson T, Bennett J, Wilson JM (2005) Long-term inducible gene expression in the eye via adeno-associated virus gene transfer in nonhuman primates. Hum Gene Ther 16:178-186.
Lecellier CH, Voinnet O (2004) RNA silencing: no mercy for viruses? Immunol Rev 198:285-303.
Lee K, Jeon K, Kim JM, Kim VN, Choi DH, Kim SU, Kim S (2005) Downregulation of GFAP, TSP-1, and p53 in human glioblastoma cell line, U373MG, by IE1 protein from human cytomegalovirus. Glia 51:1-12.
Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li MJ, Ehsani A, Salvaterra P, Rossi J (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat Biotechnol 20:500-505.
Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V (1993) The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75:843-854.
Références Bibliographiques
129
Lee Y, Kim M, Han J, Yeom KH, Lee S, Baek SH, Kim VN (2004) MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. Embo J 23:4051-4060.
Lee Y, Ahn C, Han J, Choi H, Kim J, Yim J, Lee J, Provost P, Radmark O, Kim S, Kim VN (2003) The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature 425:415-419.
Lena AM, Giannetti P, Sporeno E, Ciliberto G, Savino R (2005) Immune responses against tetracycline-dependent transactivators affect long-term expression of mouse erythropoietin delivered by a helper-dependent adenoviral vector. J Gene Med 7:1086-1096.
Lescure A, Carbon P, Krol A (1991) The different positioning of the proximal sequence element in the Xenopus RNA polymerase II and III snRNA promoters is a key determinant which confers RNA polymerase III specificity. Nucleic Acids Res 19:435-441.
Leucht C, Simoneau S, Rey C, Vana K, Rieger R, Lasmezas CI, Weiss S (2003) The 37 kDa/67 kDa laminin receptor is required for PrP(Sc) propagation in scrapie-infected neuronal cells. EMBO Rep 4:290-295.
Li XG, Okada T, Kodera M, Nara Y, Takino N, Muramatsu C, Ikeguchi K, Urano F, Ichinose H, Metzger D, Chambon P, Nakano I, Ozawa K, Muramatsu S (2006) Viral-mediated temporally controlled dopamine production in a rat model of Parkinson disease. Mol Ther 13:160-166.
Li Y, Wang J, Lee CG, Wang CY, Gao SJ, Tang GP, Ma YX, Yu H, Mao HQ, Leong KW, Wang S (2004) CNS gene transfer mediated by a novel controlled release system based on DNA complexes of degradable polycation PPE-EA: a comparison with polyethylenimine/DNA complexes. Gene Ther 11:109-114.
Lilley CE, Groutsi F, Han Z, Palmer JA, Anderson PN, Latchman DS, Coffin RS (2001) Multiple immediate-early gene-deficient herpes simplex virus vectors allowing efficient gene delivery to neurons in culture and widespread gene delivery to the central nervous system in vivo. J Virol 75:4343-4356.
Lin CW, Engelman A (2003) The barrier-to-autointegration factor is a component of functional human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. J Virol 77:5030-5036.
Lin X, Yang J, Chen J, Gunasekera A, Fesik SW, Shen Y (2004) Development of a tightly regulated U6 promoter for shRNA expression. FEBS Lett 577:376-380.
Linden RM, Ward P, Giraud C, Winocour E, Berns KI (1996) Site-specific integration by adeno-associated virus. Proc Natl Acad Sci U S A 93:11288-11294.
Liu J, Carmell MA, Rivas FV, Marsden CG, Thomson JM, Song JJ, Hammond SM, Joshua-Tor L, Hannon GJ (2004) Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 305:1437-1441.
Lobo SM, Hernandez N (1989) A 7 bp mutation converts a human RNA polymerase II snRNA promoter into an RNA polymerase III promoter. Cell 58:55-67.
Logvinoff C, Epstein AL (2001) A novel approach for herpes simplex virus type 1 amplicon vector production, using the Cre-loxP recombination system to remove helper virus. Hum Gene Ther 12:161-167.
Love S, Plaha P, Patel NK, Hotton GR, Brooks DJ, Gill SS (2005) Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain. Nat Med 11:703-704.
Lu YY, Wang LJ, Muramatsu S, Ikeguchi K, Fujimoto K, Okada T, Mizukami H, Matsushita T, Hanazono Y, Kume A, Nagatsu T, Ozawa K, Nakano I (2003) Intramuscular injection of AAV-GDNF results in sustained expression of transgenic GDNF, and its delivery to spinal motoneurons by retrograde transport. Neurosci Res 45:33-40.
Références Bibliographiques
130
Lund E, Guttinger S, Calado A, Dahlberg JE, Kutay U (2004) Nuclear export of microRNA precursors. Science 303:95-98.
Lungwitz U, Breunig M, Blunk T, Gopferich A (2005) Polyethylenimine-based non-viral gene delivery systems. Eur J Pharm Biopharm 60:247-266.
Lutzko C, Senadheera D, Skelton D, Petersen D, Kohn DB (2003) Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. J Virol 77:7341-7351.
Ma Y, Feigin A, Dhawan V, Fukuda M, Shi Q, Greene P, Breeze R, Fahn S, Freed C, Eidelberg D (2002) Dyskinesia after fetal cell transplantation for parkinsonism: a PET study. Ann Neurol 52:628-634.
Maddon PJ, Dalgleish AG, McDougal JS, Clapham PR, Weiss RA, Axel R (1986) The T4 gene encodes the AIDS virus receptor and is expressed in the immune system and the brain. Cell 47:333-348.
Magari SR, Rivera VM, Iuliucci JD, Gilman M, Cerasoli F, Jr. (1997) Pharmacologic control of a humanized gene therapy system implanted into nude mice. J Clin Invest 100:2865-2872.
Mahato RI (1999) Non-viral peptide-based approaches to gene delivery. J Drug Target 7:249-268.
Mallet J, Le Gal La Salle G, Robert JJ, Berrard S, Ridoux V, Stratford-Perricaudet LD, Perricaudet M (1994) Adenovirus mediated gene transfer to the central nervous system. Gene Ther 1 Suppl 1:S52.
Mallory AC, Vaucheret H (2006) Functions of microRNAs and related small RNAs in plants. Nat Genet 38 Suppl:S31-36.
Mammette A (2002) Virologie Médicale: Presse Universitaire de Lyon. Manning WC, Zhou S, Bland MP, Escobedo JA, Dwarki V (1998) Transient
immunosuppression allows transgene expression following readministration of adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther 9:477-485.
Mansky LM, Preveral S, Selig L, Benarous R, Benichou S (2000) The interaction of vpr with uracil DNA glycosylase modulates the human immunodeficiency virus type 1 In vivo mutation rate. J Virol 74:7039-7047.
Mansuy IM, Winder DG, Moallem TM, Osman M, Mayford M, Hawkins RD, Kandel ER (1998) Inducible and reversible gene expression with the rtTA system for the study of memory. Neuron 21:257-265.
Markusic D, Oude-Elferink R, Das AT, Berkhout B, Seppen J (2005) Comparison of single regulated lentiviral vectors with rtTA expression driven by an autoregulatory loop or a constitutive promoter. Nucleic Acids Res 33:e63.
Martinez J, Tuschl T (2004) RISC is a 5' phosphomonoester-producing RNA endonuclease. Genes Dev 18:975-980.
Martinez J, Patkaniowska A, Urlaub H, Luhrmann R, Tuschl T (2002a) Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi. Cell 110:563-574.
Martinez LA, Naguibneva I, Lehrmann H, Vervisch A, Tchenio T, Lozano G, Harel-Bellan A (2002b) Synthetic small inhibiting RNAs: efficient tools to inactivate oncogenic mutations and restore p53 pathways. Proc Natl Acad Sci U S A 99:14849-14854.
Mastakov MY, Baer K, Symes CW, Leichtlein CB, Kotin RM, During MJ (2002) Immunological aspects of recombinant adeno-associated virus delivery to the mammalian brain. J Virol 76:8446-8454.
Matsukura S, Jones PA, Takai D (2003) Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic Acids Res 31:e77.
Références Bibliographiques
131
Mattaj IW, Dathan NA, Parry HD, Carbon P, Krol A (1988) Changing the RNA polymerase specificity of U snRNA gene promoters. Cell 55:435-442.
Matthess Y, Kappel S, Spankuch B, Zimmer B, Kaufmann M, Strebhardt K (2005) Conditional inhibition of cancer cell proliferation by tetracycline-responsive, H1 promoter-driven silencing of PLK1. Oncogene 24:2973-2980.
Mazarakis ND, Azzouz M, Rohll JB, Ellard FM, Wilkes FJ, Olsen AL, Carter EE, Barber RD, Baban DF, Kingsman SM, Kingsman AJ, O'Malley K, Mitrophanous KA (2001) Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery. Hum Mol Genet 10:2109-2121.
McBride JL, During MJ, Wuu J, Chen EY, Leurgans SE, Kordower JH (2003) Structural and functional neuroprotection in a rat model of Huntington's disease by viral gene transfer of GDNF. Exp Neurol 181:213-223.
McIver SR, Lee CS, Lee JM, Green SH, Sands MS, Snider BJ, Goldberg MP (2005) Lentiviral transduction of murine oligodendrocytes in vivo. J Neurosci Res 82:397-403.
Meister G, Landthaler M, Patkaniowska A, Dorsett Y, Teng G, Tuschl T (2004) Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Mol Cell 15:185-197.
Mette MF, Aufsatz W, van der Winden J, Matzke MA, Matzke AJ (2000) Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. Embo J 19:5194-5201.
Miagkov AV, Varley AW, Munford RS, Makarov SS (2002) Endogenous regulation of a therapeutic transgene restores homeostasis in arthritic joints. J Clin Invest 109:1223-1229.
Miletic H, Fischer YH, Neumann H, Hans V, Stenzel W, Giroglou T, Hermann M, Deckert M, Von Laer D (2004) Selective transduction of malignant glioma by lentiviral vectors pseudotyped with lymphocytic choriomeningitis virus glycoproteins. Hum Gene Ther 15:1091-1100.
Miller DG, Rutledge EA, Russell DW (2002) Chromosomal effects of adeno-associated virus vector integration. Nat Genet 30:147-148.
Miller DG, Trobridge GD, Petek LM, Jacobs MA, Kaul R, Russell DW (2005a) Large-scale analysis of adeno-associated virus vector integration sites in normal human cells. J Virol 79:11434-11442.
Miller DG, Wang PR, Petek LM, Hirata RK, Sands MS, Russell DW (2006) Gene targeting in vivo by adeno-associated virus vectors. Nat Biotechnol 24:1022-1026.
Miller MD, Farnet CM, Bushman FD (1997) Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J Virol 71:5382-5390.
Miller N, Whelan J (1997) Progress in transcriptionally targeted and regulatable vectors for genetic therapy. Hum Gene Ther 8:803-815.
Miller TM, Kaspar BK, Kops GJ, Yamanaka K, Christian LJ, Gage FH, Cleveland DW (2005b) Virus-delivered small RNA silencing sustains strength in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 57:773-776.
Miller VM, Paulson HL, Gonzalez-Alegre P (2005c) RNA interference in neuroscience: progress and challenges. Cell Mol Neurobiol 25:1195-1207.
Miller VM, Xia H, Marrs GL, Gouvion CM, Lee G, Davidson BL, Paulson HL (2003) Allele-specific silencing of dominant disease genes. Proc Natl Acad Sci U S A 100:7195-7200.
Références Bibliographiques
132
Mitani K, Graham FL, Caskey CT, Kochanek S (1995) Rescue, propagation, and partial purification of a helper virus-dependent adenovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A 92:3854-3858.
Mittal V, Ma B, Hernandez N (1999) SNAP(c): a core promoter factor with a built-in DNA-binding damper that is deactivated by the Oct-1 POU domain. Genes Dev 13:1807-1821.
Mittal V, Cleary MA, Herr W, Hernandez N (1996) The Oct-1 POU-specific domain can stimulate small nuclear RNA gene transcription by stabilizing the basal transcription complex SNAPc. Mol Cell Biol 16:1955-1965.
Miyagishi M, Taira K (2002) U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat Biotechnol 20:497-500.
Miyoshi H, Blomer U, Takahashi M, Gage FH, Verma IM (1998) Development of a self-inactivating lentivirus vector. J Virol 72:8150-8157.
Mizuguchi H, Xu ZL, Sakurai F, Mayumi T, Hayakawa T (2003) Tight positive regulation of transgene expression by a single adenovirus vector containing the rtTA and tTS expression cassettes in separate genome regions. Hum Gene Ther 14:1265-1277.
Mochizuki K, Fine NA, Fujisawa T, Gorovsky MA (2002) Analysis of a piwi-related gene implicates small RNAs in genome rearrangement in tetrahymena. Cell 110:689-699.
Moskalenko M, Chen L, van Roey M, Donahue BA, Snyder RO, McArthur JG, Patel SD (2000) Epitope mapping of human anti-adeno-associated virus type 2 neutralizing antibodies: implications for gene therapy and virus structure. J Virol 74:1761-1766.
Mourelatos Z, Dostie J, Paushkin S, Sharma A, Charroux B, Abel L, Rappsilber J, Mann M, Dreyfuss G (2002) miRNPs: a novel class of ribonucleoproteins containing numerous microRNAs. Genes Dev 16:720-728.
Mullen CA, Snitzer K, Culver KW, Morgan RA, Anderson WF, Blaese RM (1996) Molecular analysis of T lymphocyte-directed gene therapy for adenosine deaminase deficiency: long-term expression in vivo of genes introduced with a retroviral vector. Hum Gene Ther 7:1123-1129.
Muramatsu S, Fujimoto K, Ikeguchi K, Shizuma N, Kawasaki K, Ono F, Shen Y, Wang L, Mizukami H, Kume A, Matsumura M, Nagatsu I, Urano F, Ichinose H, Nagatsu T, Terao K, Nakano I, Ozawa K (2002) Behavioral recovery in a primate model of Parkinson's disease by triple transduction of striatal cells with adeno-associated viral vectors expressing dopamine-synthesizing enzymes. Hum Gene Ther 13:345-354.
Murphy S, Tripodi M, Melli M (1986) A sequence upstream from the coding region is required for the transcription of the 7SK RNA genes. Nucleic Acids Res 14:9243-9260.
Murphy S, Di Liegro C, Melli M (1987) The in vitro transcription of the 7SK RNA gene by RNA polymerase III is dependent only on the presence of an upstream promoter. Cell 51:81-87.
Murphy S, Yoon JB, Gerster T, Roeder RG (1992) Oct-1 and Oct-2 potentiate functional interactions of a transcription factor with the proximal sequence element of small nuclear RNA genes. Mol Cell Biol 12:3247-3261.
Murphy S, Pierani A, Scheidereit C, Melli M, Roeder RG (1989) Purified octamer binding transcription factors stimulate RNA polymerase III--mediated transcription of the 7SK RNA gene. Cell 59:1071-1080.
Muul LM, Tuschong LM, Soenen SL, Jagadeesh GJ, Ramsey WJ, Long Z, Carter CS, Garabedian EK, Alleyne M, Brown M, Bernstein W, Schurman SH, Fleisher TA, Leitman SF, Dunbar CE, Blaese RM, Candotti F (2003) Persistence and expression of the adenosine deaminase gene for 12 years and immune reaction to gene transfer
Références Bibliographiques
133
components: long-term results of the first clinical gene therapy trial. Blood 101:2563-2569.
Nakai H, Montini E, Fuess S, Storm TA, Grompe M, Kay MA (2003) AAV serotype 2 vectors preferentially integrate into active genes in mice. Nat Genet 34:297-302.
Nakai H, Wu X, Fuess S, Storm TA, Munroe D, Montini E, Burgess SM, Grompe M, Kay MA (2005) Large-scale molecular characterization of adeno-associated virus vector integration in mouse liver. J Virol 79:3606-3614.
Naldini L, Blomer U, Gage FH, Trono D, Verma IM (1996a) Efficient transfer, integration, and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a lentiviral vector. Proc Natl Acad Sci U S A 93:11382-11388.
Naldini L, Blomer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D (1996b) In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272:263-267.
Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R (1990) Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell 2:279-289.
Nguyen VT, Kiss T, Michels AA, Bensaude O (2001) 7SK small nuclear RNA binds to and inhibits the activity of CDK9/cyclin T complexes. Nature 414:322-325.
Nicchia GP, Frigeri A, Liuzzi GM, Svelto M (2003) Inhibition of aquaporin-4 expression in astrocytes by RNAi determines alteration in cell morphology, growth, and water transport and induces changes in ischemia-related genes. Faseb J 17:1508-1510.
Nightingale SJ, Hollis RP, Pepper KA, Petersen D, Yu XJ, Yang C, Bahner I, Kohn DB (2006) Transient gene expression by nonintegrating lentiviral vectors. Mol Ther 13:1121-1132.
No D, Yao TP, Evans RM (1996) Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 93:3346-3351.
Noma K, Sugiyama T, Cam H, Verdel A, Zofall M, Jia S, Moazed D, Grewal SI (2004) RITS acts in cis to promote RNA interference-mediated transcriptional and post-transcriptional silencing. Nat Genet 36:1174-1180.
Nordstrom JL (2002) Antiprogestin-controllable transgene regulation in vivo. Curr Opin Biotechnol 13:453-458.
Norgren RB, Jr., Lehman MN (1998) Herpes simplex virus as a transneuronal tracer. Neurosci Biobehav Rev 22:695-708.
Nutt JG, Burchiel KJ, Comella CL, Jankovic J, Lang AE, Laws ER, Jr., Lozano AM, Penn RD, Simpson RK, Jr., Stacy M, Wooten GF (2003) Randomized, double-blind trial of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in PD. Neurology 60:69-73.
Nykanen A, Haley B, Zamore PD (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107:309-321.
Oehme I, Bosser S, Zornig M (2006) Agonists of an ecdysone-inducible mammalian expression system inhibit Fas Ligand- and TRAIL-induced apoptosis in the human colon carcinoma cell line RKO. Cell Death Differ 13:189-201.
Ohagen A, Gabuzda D (2000) Role of Vif in stability of the human immunodeficiency virus type 1 core. J Virol 74:11055-11066.
Ohbayashi F, Balamotis MA, Kishimoto A, Aizawa E, Diaz A, Hasty P, Graham FL, Caskey CT, Mitani K (2005) Correction of chromosomal mutation and random integration in embryonic stem cells with helper-dependent adenoviral vectors. Proc Natl Acad Sci U S A 102:13628-13633.
Olanow CW, Arendash GW (1994) Metals and free radicals in neurodegeneration. Curr Opin Neurol 7:548-558.
Références Bibliographiques
134
Pacchia AL, Adelson ME, Kaul M, Ron Y, Dougherty JP (2001) An inducible packaging cell system for safe, efficient lentiviral vector production in the absence of HIV-1 accessory proteins. Virology 282:77-86.
Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, Conklin DS (2002) Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev 16:948-958.
Pal-Bhadra M, Bhadra U, Birchler JA (1997) Cosuppression in Drosophila: gene silencing of Alcohol dehydrogenase by white-Adh transgenes is Polycomb dependent. Cell 90:479-490.
Palli SR, Kapitskaya MZ, Kumar MB, Cress DE (2003) Improved ecdysone receptor-based inducible gene regulation system. Eur J Biochem 270:1308-1315.
Palmer JA, Branston RH, Lilley CE, Robinson MJ, Groutsi F, Smith J, Latchman DS, Coffin RS (2000) Development and optimization of herpes simplex virus vectors for multiple long-term gene delivery to the peripheral nervous system. J Virol 74:5604-5618.
Pardridge WM (2002) Drug and gene targeting to the brain with molecular Trojan horses. Nat Rev Drug Discov 1:131-139.
Park F, Kay MA (2001) Modified HIV-1 based lentiviral vectors have an effect on viral transduction efficiency and gene expression in vitro and in vivo. Mol Ther 4:164-173.
Park F, Ohashi K, Kay MA (2000) Therapeutic levels of human factor VIII and IX using HIV-1-based lentiviral vectors in mouse liver. Blood 96:1173-1176.
Park TG, Jeong JH, Kim SW (2006) Current status of polymeric gene delivery systems. Adv Drug Deliv Rev 58:467-486.
Parry HD, Mattaj IW (1990) Positive and negative functional interactions between promoter elements from different classes of RNA polymerase III-transcribed genes. Embo J 9:1097-1104.
Patel NK, Bunnage M, Plaha P, Svendsen CN, Heywood P, Gill SS (2005) Intraputamenal infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in PD: a two-year outcome study. Ann Neurol 57:298-302.
Paule MR, White RJ (2000) Survey and summary: transcription by RNA polymerases I and III. Nucleic Acids Res 28:1283-1298.
Peden CS, Burger C, Muzyczka N, Mandel RJ (2004) Circulating anti-wild-type adeno-associated virus type 2 (AAV2) antibodies inhibit recombinant AAV2 (rAAV2)-mediated, but not rAAV5-mediated, gene transfer in the brain. J Virol 78:6344-6359.
Pereira DJ, McCarty DM, Muzyczka N (1997) The adeno-associated virus (AAV) Rep protein acts as both a repressor and an activator to regulate AAV transcription during a productive infection. J Virol 71:1079-1088.
Perez N, Bigey P, Scherman D, Danos O, Piechaczyk M, Pelegrin M (2004) Regulatable systemic production of monoclonal antibodies by in vivo muscle electroporation. Genet Vaccines Ther 2:2.
Philippe S, Sarkis C, Barkats M, Mammeri H, Ladroue C, Petit C, Mallet J, Serguera C (2006) Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 103:17684-17689.
Piller SC, Caly L, Jans DA (2003) Nuclear import of the pre-integration complex (PIC): the Achilles heel of HIV? Curr Drug Targets 4:409-429.
Pollock R, Clackson T (2002) Dimerizer-regulated gene expression. Curr Opin Biotechnol 13:459-467.
Pollock R, Issner R, Zoller K, Natesan S, Rivera VM, Clackson T (2000) Delivery of a stringent dimerizer-regulated gene expression system in a single retroviral vector. Proc Natl Acad Sci U S A 97:13221-13226.
Références Bibliographiques
135
Pomerantz JL, Sharp PA, Pabo CO (1995) Structure-based design of transcription factors. Science 267:93-96.
Provost P, Silverstein RA, Dishart D, Walfridsson J, Djupedal I, Kniola B, Wright A, Samuelsson B, Radmark O, Ekwall K (2002) Dicer is required for chromosome segregation and gene silencing in fission yeast cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99:16648-16653.
Qin XF, An DS, Chen IS, Baltimore D (2003) Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A 100:183-188.
Ralph GS, Radcliffe PA, Day DM, Carthy JM, Leroux MA, Lee DC, Wong LF, Bilsland LG, Greensmith L, Kingsman SM, Mitrophanous KA, Mazarakis ND, Azzouz M (2005) Silencing mutant SOD1 using RNAi protects against neurodegeneration and extends survival in an ALS model. Nat Med 11:429-433.
Raoul C, Abbas-Terki T, Bensadoun JC, Guillot S, Haase G, Szulc J, Henderson CE, Aebischer P (2005) Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med 11:423-428.
Rauh G, Pieczek A, Irwin W, Schainfeld R, Isner JM (2001) In vivo analysis of intramuscular gene transfer in human subjects studied by on-line ultrasound imaging. Hum Gene Ther 12:1543-1549.
Recchia A, Parks RJ, Lamartina S, Toniatti C, Pieroni L, Palombo F, Ciliberto G, Graham FL, Cortese R, La Monica N, Colloca S (1999) Site-specific integration mediated by a hybrid adenovirus/adeno-associated virus vector. Proc Natl Acad Sci U S A 96:2615-2620.
Rego AC, Oliveira CR (2003) Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res 28:1563-1574.
Regulier E, Pereira de Almeida L, Sommer B, Aebischer P, Deglon N (2002) Dose-dependent neuroprotective effect of ciliary neurotrophic factor delivered via tetracycline-regulated lentiviral vectors in the quinolinic acid rat model of Huntington's disease. Hum Gene Ther 13:1981-1990.
Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, Bartel B, Bartel DP (2002) MicroRNAs in plants. Genes Dev 16:1616-1626.
Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, Pasquinelli AE, Bettinger JC, Rougvie AE, Horvitz HR, Ruvkun G (2000) The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 403:901-906.
Ridet JL, Bensadoun JC, Deglon N, Aebischer P, Zurn AD (2006) Lentivirus-mediated expression of glutathione peroxidase: neuroprotection in murine models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis 21:29-34.
Ridoux V, Robert JJ, Zhang X, Perricaudet M, Mallet J, Le Gal La Salle G (1994) The use of adenovirus vectors for intracerebral grafting of transfected nervous cells. Neuroreport 5:801-804.
Rivera VM, Ye X, Courage NL, Sachar J, Cerasoli F, Jr., Wilson JM, Gilman M (1999) Long-term regulated expression of growth hormone in mice after intramuscular gene transfer. Proc Natl Acad Sci U S A 96:8657-8662.
Rivera VM, Gao GP, Grant RL, Schnell MA, Zoltick PW, Rozamus LW, Clackson T, Wilson JM (2005) Long-term pharmacologically regulated expression of erythropoietin in primates following AAV-mediated gene transfer. Blood 105:1424-1430.
Rivera VM, Clackson T, Natesan S, Pollock R, Amara JF, Keenan T, Magari SR, Phillips T, Courage NL, Cerasoli F, Jr., Holt DA, Gilman M (1996) A humanized system for pharmacologic control of gene expression. Nat Med 2:1028-1032.
Références Bibliographiques
136
Riviere C, Danos O, Douar AM (2006) Long-term expression and repeated administration of AAV type 1, 2 and 5 vectors in skeletal muscle of immunocompetent adult mice. Gene Ther.
Rolls MM, Webster P, Balba NH, Rose JK (1994) Novel infectious particles generated by expression of the vesicular stomatitis virus glycoprotein from a self-replicating RNA. Cell 79:497-506.
Romano N, Macino G (1992) Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol Microbiol 6:3343-3353.
Roscilli G, Rinaudo CD, Cimino M, Sporeno E, Lamartina S, Ciliberto G, Toniatti C (2002) Long-term and tight control of gene expression in mouse skeletal muscle by a new hybrid human transcription factor. Mol Ther 6:653-663.
Rowe WP, Huebner RJ, Gilmore LK, Parrott RH, Ward TG (1953) Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proc Soc Exp Biol Med 84:570-573.
Rozovsky I, Wei M, Morgan TE, Finch CE (2005) Reversible age impairments in neurite outgrowth by manipulations of astrocytic GFAP. Neurobiol Aging 26:705-715.
Rubinchik S, Woraratanadharm J, Yu H, Dong JY (2005) New complex Ad vectors incorporating both rtTA and tTS deliver tightly regulated transgene expression both in vitro and in vivo. Gene Ther 12:504-511.
Rubinson DA, Dillon CP, Kwiatkowski AV, Sievers C, Yang L, Kopinja J, Rooney DL, Ihrig MM, McManus MT, Gertler FB, Scott ML, Van Parijs L (2003) A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference. Nat Genet 33:401-406.
Ruitenberg MJ, Blits B, Dijkhuizen PA, te Beek ET, Bakker A, van Heerikhuize JJ, Pool CW, Hermens WT, Boer GJ, Verhaagen J (2004) Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer of brain-derived neurotrophic factor reverses atrophy of rubrospinal neurons following both acute and chronic spinal cord injury. Neurobiol Dis 15:394-406.
Russell DW, Hirata RK (1998) Human gene targeting by viral vectors. Nat Genet 18:325-330. Russell WC (2000) Update on adenovirus and its vectors. J Gen Virol 81:2573-2604. Rutledge EA, Russell DW (1997) Adeno-associated virus vector integration junctions. J Virol
71:8429-8436. Sabatino DE, Mingozzi F, Hui DJ, Chen H, Colosi P, Ertl HC, High KA (2005) Identification
of mouse AAV capsid-specific CD8+ T cell epitopes. Mol Ther 12:1023-1033. Sadowski CL, Henry RW, Kobayashi R, Hernandez N (1996) The SNAP45 subunit of the
small nuclear RNA (snRNA) activating protein complex is required for RNA polymerase II and III snRNA gene transcription and interacts with the TATA box binding protein. Proc Natl Acad Sci U S A 93:4289-4293.
Saeki Y, Ichikawa T, Saeki A, Chiocca EA, Tobler K, Ackermann M, Breakefield XO, Fraefel C (1998) Herpes simplex virus type 1 DNA amplified as bacterial artificial chromosome in Escherichia coli: rescue of replication-competent virus progeny and packaging of amplicon vectors. Hum Gene Ther 9:2787-2794.
Saez E, Nelson MC, Eshelman B, Banayo E, Koder A, Cho GJ, Evans RM (2000) Identification of ligands and coligands for the ecdysone-regulated gene switch. Proc Natl Acad Sci U S A 97:14512-14517.
Sakhuja K, Reddy PS, Ganesh S, Cantaniag F, Pattison S, Limbach P, Kayda DB, Kadan MJ, Kaleko M, Connelly S (2003) Optimization of the generation and propagation of gutless adenoviral vectors. Hum Gene Ther 14:243-254.
Références Bibliographiques
137
Sakonju S, Bogenhagen DF, Brown DD (1980) A control region in the center of the 5S RNA gene directs specific initiation of transcription: I. The 5' border of the region. Cell 19:13-25.
Salucci V, Scarito A, Aurisicchio L, Lamartina S, Nicolaus G, Giampaoli S, Gonzalez-Paz O, Toniatti C, Bujard H, Hillen W, Ciliberto G, Palombo F (2002) Tight control of gene expression by a helper-dependent adenovirus vector carrying the rtTA2(s)-M2 tetracycline transactivator and repressor system. Gene Ther 9:1415-1421.
Sambrook J, Westphal H, Srinivasan PR, Dulbecco R (1968) The integrated state of viral DNA in SV40-transformed cells. Proc Natl Acad Sci U S A 60:1288-1295.
Sapru MK, Yates JW, Hogan S, Jiang L, Halter J, Bohn MC (2006) Silencing of human alpha-synuclein in vitro and in rat brain using lentiviral-mediated RNAi. Exp Neurol 198:382-390.
Scherr M, Battmer K, Eder M, Schule S, Hohenberg H, Ganser A, Grez M, Blomer U (2002) Efficient gene transfer into the CNS by lentiviral vectors purified by anion exchange chromatography. Gene Ther 9:1708-1714.
Schiavoni I, Trapp S, Santarcangelo AC, Piacentini V, Pugliese K, Baur A, Federico M (2004) HIV-1 Nef enhances both membrane expression and virion incorporation of Env products. A model for the Nef-dependent increase of HIV-1 infectivity. J Biol Chem 279:22996-23006.
Schlegel R, Tralka TS, Willingham MC, Pastan I (1983) Inhibition of VSV binding and infectivity by phosphatidylserine: is phosphatidylserine a VSV-binding site? Cell 32:639-646.
Schmeisser F, Donohue M, Weir JP (2002) Tetracycline-regulated gene expression in replication-incompetent herpes simplex virus vectors. Hum Gene Ther 13:2113-2124.
Schramm L, Hernandez N (2002) Recruitment of RNA polymerase III to its target promoters. Genes Dev 16:2593-2620.
Schroder AR, Shinn P, Chen H, Berry C, Ecker JR, Bushman F (2002) HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell 110:521-529.
Schultz JC, Adamson JS, Jr., Workman WW, Norman TD (1963) Fatal Liver Disease after Intravenous Administration of Tetracycline in High Dosage. N Engl J Med 269:999-1004.
Schuster C, Krol A, Carbon P (1998) Two distinct domains in Staf to selectively activate small nuclear RNA-type and mRNA promoters. Mol Cell Biol 18:2650-2658.
Schwartz B, Benoist C, Abdallah B, Rangara R, Hassan A, Scherman D, Demeneix BA (1996) Gene transfer by naked DNA into adult mouse brain. Gene Ther 3:405-411.
Schwarz DS, Tomari Y, Zamore PD (2004) The RNA-induced silencing complex is a Mg2+-dependent endonuclease. Curr Biol 14:787-791.
Schwarz DS, Hutvagner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD (2003) Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115:199-208.
Schwarz DS, Ding H, Kennington L, Moore JT, Schelter J, Burchard J, Linsley PS, Aronin N, Xu Z, Zamore PD (2006) Designing siRNA That Distinguish between Genes That Differ by a Single Nucleotide. PLoS Genet 2.
Shamblott MJ, Axelman J, Littlefield JW, Blumenthal PD, Huggins GR, Cui Y, Cheng L, Gearhart JD (2001) Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 98:113-118.
Shelling AN, Smith MG (1994) Targeted integration of transfected and infected adeno-associated virus vectors containing the neomycin resistance gene. Gene Ther 1:165-169.
Références Bibliographiques
138
Sherman MP, Greene WC (2002) Slipping through the door: HIV entry into the nucleus. Microbes Infect 4:67-73.
Shin KJ, Wall EA, Zavzavadjian JR, Santat LA, Liu J, Hwang JI, Rebres R, Roach T, Seaman W, Simon MI, Fraser ID (2006) A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A 103:13759-13764.
Sijen T, Plasterk RH (2003) Transposon silencing in the Caenorhabditis elegans germ line by natural RNAi. Nature 426:310-314.
Singer O, Marr RA, Rockenstein E, Crews L, Coufal NG, Gage FH, Verma IM, Masliah E (2005) Targeting BACE1 with siRNAs ameliorates Alzheimer disease neuropathology in a transgenic model. Nat Neurosci 8:1343-1349.
Sioud M (2005) Induction of inflammatory cytokines and interferon responses by double-stranded and single-stranded siRNAs is sequence-dependent and requires endosomal localization. J Mol Biol 348:1079-1090.
Sioud M, Sorensen DR (2003) Cationic liposome-mediated delivery of siRNAs in adult mice. Biochem Biophys Res Commun 312:1220-1225.
Slack FJ, Basson M, Liu Z, Ambros V, Horvitz HR, Ruvkun G (2000) The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Mol Cell 5:659-669.
Sledz CA, Holko M, de Veer MJ, Silverman RH, Williams BR (2003) Activation of the interferon system by short-interfering RNAs. Nat Cell Biol 5:834-839.
Slevin JT, Gerhardt GA, Smith CD, Gash DM, Kryscio R, Young B (2005) Improvement of bilateral motor functions in patients with Parkinson disease through the unilateral intraputaminal infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor. J Neurosurg 102:216-222.
Song JJ, Liu J, Tolia NH, Schneiderman J, Smith SK, Martienssen RA, Hannon GJ, Joshua-Tor L (2003) The crystal structure of the Argonaute2 PAZ domain reveals an RNA binding motif in RNAi effector complexes. Nat Struct Biol 10:1026-1032.
Sotirova VN, Calciano MA, Krueger W, Lalande M (2006) Inclusion of a matrix-attached region in a 7SK pol III vector increases the efficiency of shRNA-mediated gene silencing in embryonic carcinoma cells. Plasmid 55:216-226.
Stamer K, Vogel R, Thies E, Mandelkow E, Mandelkow EM (2002) Tau blocks traffic of organelles, neurofilaments, and APP vesicles in neurons and enhances oxidative stress. J Cell Biol 156:1051-1063.
Stark A, Brennecke J, Russell RB, Cohen SM (2003) Identification of Drosophila MicroRNA targets. PLoS Biol 1:E60.
Steffens S, Tebbets J, Kramm CM, Lindemann D, Flake A, Sena-Esteves M (2004) Transduction of human glial and neuronal tumor cells with different lentivirus vector pseudotypes. J Neurooncol 70:281-288.
Stegmeier F, Hu G, Rickles RJ, Hannon GJ, Elledge SJ (2005) A lentiviral microRNA-based system for single-copy polymerase II-regulated RNA interference in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 102:13212-13217.
Stein CS, Martins I, Davidson BL (2005) The lymphocytic choriomeningitis virus envelope glycoprotein targets lentiviral gene transfer vector to neural progenitors in the murine brain. Mol Ther 11:382-389.
Suhr ST, Gil EB, Senut MC, Gage FH (1998) High level transactivation by a modified Bombyx ecdysone receptor in mammalian cells without exogenous retinoid X receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 95:7999-8004.
Références Bibliographiques
139
Sui G, Soohoo C, Affar el B, Gay F, Shi Y, Forrester WC, Shi Y (2002) A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99:5515-5520.
Sun X, Yau VK, Briggs BJ, Whittaker GR (2005) Role of clathrin-mediated endocytosis during vesicular stomatitis virus entry into host cells. Virology 338:53-60.
Takahashi T, Ishida K, Itoh K, Konishi Y, Yagyu KI, Tominaga A, Miyazaki JI, Yamamoto H (2003) IGF-I gene transfer by electroporation promotes regeneration in a muscle injury model. Gene Ther 10:612-620.
Takenaga K, Kozlova EN (2006) Role of intracellular S100A4 for migration of rat astrocytes. Glia 53:313-321.
Tan W, Zhu K, Segal DJ, Barbas CF, 3rd, Chow SA (2004) Fusion proteins consisting of human immunodeficiency virus type 1 integrase and the designed polydactyl zinc finger protein E2C direct integration of viral DNA into specific sites. J Virol 78:1301-1313.
Tatum EL (1966) Molecular biology, nucleic acids, and the future of medicine. Perspect Biol Med 10:19-32.
Tenenbaum L, Lehtonen E, Monahan PE (2003) Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr Gene Ther 3:545-565.
Thakker DR, Hoyer D, Cryan JF (2006) Interfering with the brain: use of RNA interference for understanding the pathophysiology of psychiatric and neurological disorders. Pharmacol Ther 109:413-438.
Thomas CE, Schiedner G, Kochanek S, Castro MG, Lowenstein PR (2000) Peripheral infection with adenovirus causes unexpected long-term brain inflammation in animals injected intracranially with first-generation, but not with high-capacity, adenovirus vectors: toward realistic long-term neurological gene therapy for chronic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A 97:7482-7487.
Thomas HE, Stunnenberg HG, Stewart AF (1993) Heterodimerization of the Drosophila ecdysone receptor with retinoid X receptor and ultraspiracle. Nature 362:471-475.
Thyagarajan B, Olivares EC, Hollis RP, Ginsburg DS, Calos MP (2001) Site-specific genomic integration in mammalian cells mediated by phage phiC31 integrase. Mol Cell Biol 21:3926-3934.
Tiscornia G, Singer O, Ikawa M, Verma IM (2003) A general method for gene knockdown in mice by using lentiviral vectors expressing small interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 100:1844-1848.
Todar K (2006) Animal Viruses http://wwwbactwiscedu/themicrobialworld/AnimalViruseshtml.
Toniatti C, Bujard H, Cortese R, Ciliberto G (2004) Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther 11:649-657.
Trollet C, Bloquel C, Scherman D, Bigey P (2006) Electrotransfer into skeletal muscle for protein expression. Curr Gene Ther 6:561-578.
Tuszynski MH, Blesch A (2004) Nerve growth factor: from animal models of cholinergic neuronal degeneration to gene therapy in Alzheimer's disease. Prog Brain Res 146:441-449.
Tuszynski MH, Thal L, Pay M, Salmon DP, U HS, Bakay R, Patel P, Blesch A, Vahlsing HL, Ho G, Tong G, Potkin SG, Fallon J, Hansen L, Mufson EJ, Kordower JH, Gall C, Conner J (2005) A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Nat Med 11:551-555.
Unwalla HJ, Li HT, Bahner I, Li MJ, Kohn D, Rossi JJ (2006) Novel Pol II fusion promoter directs human immunodeficiency virus type 1-inducible coexpression of a short hairpin RNA and protein. J Virol 80:1863-1873.
Références Bibliographiques
140
Unwalla HJ, Li MJ, Kim JD, Li HT, Ehsani A, Alluin J, Rossi JJ (2004) Negative feedback inhibition of HIV-1 by TAT-inducible expression of siRNA. Nat Biotechnol 22:1573-1578.
Urlinger S, Baron U, Thellmann M, Hasan MT, Bujard H, Hillen W (2000) Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A 97:7963-7968.
Urrutia R (2003) KRAB-containing zinc-finger repressor proteins. Genome Biol 4:231. Van Blokland R, Van der Geest N, Mol JNM, Kooter JM (1994) Transgene-mediated
suppression of chalcone synthase expression in Petunia hybrida results from an increase in RNA turnover The Plant Journal Vol. 6 Page 787-968.
van de Loo FA, de Hooge AS, Smeets RL, Bakker AC, Bennink MB, Arntz OJ, Joosten LA, van Beuningen HM, van der Kraan PK, Varley AW, van den Berg WB (2004) An inflammation-inducible adenoviral expression system for local treatment of the arthritic joint. Gene Ther 11:581-590.
van de Wetering M, Oving I, Muncan V, Pon Fong MT, Brantjes H, van Leenen D, Holstege FC, Brummelkamp TR, Agami R, Clevers H (2003) Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep 4:609-615.
Van den Haute C, Eggermont K, Nuttin B, Debyser Z, Baekelandt V (2003) Lentiviral vector-mediated delivery of short hairpin RNA results in persistent knockdown of gene expression in mouse brain. Hum Gene Ther 14:1799-1807.
Varley AW, Munford RS (1998) Physiologically responsive gene therapy. Mol Med Today 4:445-451.
Vasileva A, Jessberger R (2005) Precise hit: adeno-associated virus in gene targeting. Nat Rev Microbiol 3:837-847.
Vasko MR, Guo C, Kelley MR (2005) The multifunctional DNA repair/redox enzyme Ape1/Ref-1 promotes survival of neurons after oxidative stress. DNA Repair (Amst) 4:367-379.
Vastenhouw NL, Plasterk RH (2004) RNAi protects the Caenorhabditis elegans germline against transposition. Trends Genet 20:314-319.
Vegeto E, Allan GF, Schrader WT, Tsai MJ, McDonnell DP, O'Malley BW (1992) The mechanism of RU486 antagonism is dependent on the conformation of the carboxy-terminal tail of the human progesterone receptor. Cell 69:703-713.
Verdel A, Jia S, Gerber S, Sugiyama T, Gygi S, Grewal SI, Moazed D (2004) RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex. Science 303:672-676.
Vigna E, Cavalieri S, Ailles L, Geuna M, Loew R, Bujard H, Naldini L (2002) Robust and efficient regulation of transgene expression in vivo by improved tetracycline-dependent lentiviral vectors. Mol Ther 5:252-261.
Volpe TA, Kidner C, Hall IM, Teng G, Grewal SI, Martienssen RA (2002) Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science 297:1833-1837.
Wade N (1981) Gene therapy caught in more entanglements. Science 212:24-25. Waldmeier PC (2003) Prospects for antiapoptotic drug therapy of neurodegenerative diseases.
Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 27:303-321. Wang L, Mukherjee S, Jia F, Narayan O, Zhao LJ (1995) Interaction of virion protein Vpr of
human immunodeficiency virus type 1 with cellular transcription factor Sp1 and trans-activation of viral long terminal repeat. J Biol Chem 270:25564-25569.
Wang L, Muramatsu S, Lu Y, Ikeguchi K, Fujimoto K, Okada T, Mizukami H, Hanazono Y, Kume A, Urano F, Ichinose H, Nagatsu T, Nakano I, Ozawa K (2002) Delayed
Références Bibliographiques
141
delivery of AAV-GDNF prevents nigral neurodegeneration and promotes functional recovery in a rat model of Parkinson's disease. Gene Ther 9:381-389.
Wang S, Petravicz J, Breakefield XO (2003) Single HSV-amplicon vector mediates drug-induced gene expression via dimerizer system. Mol Ther 7:790-800.
Wang Y, O'Malley BW, Jr., Tsai SY, O'Malley BW (1994) A regulatory system for use in gene transfer. Proc Natl Acad Sci U S A 91:8180-8184.
Wang Y, DeMayo FJ, Tsai SY, O'Malley BW (1997a) Ligand-inducible and liver-specific target gene expression in transgenic mice. Nat Biotechnol 15:239-243.
Wang Y, Xu J, Pierson T, O'Malley BW, Tsai SY (1997b) Positive and negative regulation of gene expression in eukaryotic cells with an inducible transcriptional regulator. Gene Ther 4:432-441.
Ward CM, Read ML, Seymour LW (2001) Systemic circulation of poly(L-lysine)/DNA vectors is influenced by polycation molecular weight and type of DNA: differential circulation in mice and rats and the implications for human gene therapy. Blood 97:2221-2229.
Wassenegger M, Heimes S, Riedel L, Sanger HL (1994) RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants. Cell 76:567-576.
Watabe K, Sakamoto T, Ohashi T, Kawazoe Y, Oyanagi K, Takeshima T, Inoue K, Eto Y, Kim SU (2001) Adenoviral gene transfer of glial cell line-derived neurotrophic factor to injured adult motoneurons. Hum Cell 14:7-15.
Watson DJ, Kobinger GP, Passini MA, Wilson JM, Wolfe JH (2002) Targeted transduction patterns in the mouse brain by lentivirus vectors pseudotyped with VSV, Ebola, Mokola, LCMV, or MuLV envelope proteins. Mol Ther 5:528-537.
Wightman B, Ha I, Ruvkun G (1993) Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75:855-862.
Wilda M, Fuchs U, Wossmann W, Borkhardt A (2002) Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference (RNAi). Oncogene 21:5716-5724.
Witte V, Laffert B, Rosorius O, Lischka P, Blume K, Galler G, Stilper A, Willbold D, D'Aloja P, Sixt M, Kolanus J, Ott M, Kolanus W, Schuler G, Baur AS (2004) HIV-1 Nef mimics an integrin receptor signal that recruits the polycomb group protein Eed to the plasma membrane. Mol Cell 13:179-190.
Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani A, Felgner PL (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247:1465-1468.
Wong LF, Azzouz M, Walmsley LE, Askham Z, Wilkes FJ, Mitrophanous KA, Kingsman SM, Mazarakis ND (2004) Transduction patterns of pseudotyped lentiviral vectors in the nervous system. Mol Ther 9:101-111.
Wood MJ, Byrnes AP, Rabkin SD, Pfaff DW, Charlton HM (1994) Immunological consequences of HSV-1-mediated gene transfer into the CNS. Gene Ther 1 Suppl 1:S82.
Wood MJ, Charlton HM, Wood KJ, Kajiwara K, Byrnes AP (1996) Immune responses to adenovirus vectors in the nervous system. Trends Neurosci 19:497-501.
Wu K, Meyers CA, Guerra NK, King MA, Meyer EM (2004) The effects of rAAV2-mediated NGF gene delivery in adult and aged rats. Mol Ther 9:262-269.
Wu P, Phillips MI, Bui J, Terwilliger EF (1998) Adeno-associated virus vector-mediated transgene integration into neurons and other nondividing cell targets. J Virol 72:5919-5926.
Wu Z, Asokan A, Samulski RJ (2006) Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol Ther 14:316-327.
Wyborski DL, Bauer JC, Vaillancourt P (2001) Bicistronic expression of ecdysone-inducible receptors in mammalian cells. Biotechniques 31:618-620, 622, 624.
Références Bibliographiques
142
Xia H, Mao Q, Paulson HL, Davidson BL (2002) siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol 20:1006-1010.
Xia H, Mao Q, Eliason SL, Harper SQ, Martins IH, Orr HT, Paulson HL, Yang L, Kotin RM, Davidson BL (2004) RNAi suppresses polyglutamine-induced neurodegeneration in a model of spinocerebellar ataxia. Nat Med 10:816-820.
Xia XG, Zhou H, Samper E, Melov S, Xu Z (2006) Pol II-expressed shRNA knocks down Sod2 gene expression and causes phenotypes of the gene knockout in mice. PLoS Genet 2:e10.
Xiong W, Goverdhana S, Sciascia SA, Candolfi M, Zirger JM, Barcia C, Curtin JF, King GD, Jaita G, Liu C, Kroeger K, Agadjanian H, Medina-Kauwe L, Palmer D, Ng P, Lowenstein PR, Castro MG (2006) Regulatable gutless adenovirus vectors sustain inducible transgene expression in the brain in the presence of an immune response against adenoviruses. J Virol 80:27-37.
Xu K, Ma H, McCown TJ, Verma IM, Kafri T (2001a) Generation of a stable cell line producing high-titer self-inactivating lentiviral vectors. Mol Ther 3:97-104.
Xu L, Zerby D, Huang Y, Ji H, Nyanguile OF, de los Angeles JE, Kadan MJ (2001b) A versatile framework for the design of ligand-dependent, transgene-specific transcription factors. Mol Ther 3:262-273.
Xu ZL, Mizuguchi H, Mayumi T, Hayakawa T (2003) Regulated gene expression from adenovirus vectors: a systematic comparison of various inducible systems. Gene 309:145-151.
Yamamura J, Kageyama S, Uwano T, Kurokawa M, Imakita M, Shiraki K (2000) Long-term gene expression in the anterior horn motor neurons after intramuscular inoculation of a live herpes simplex virus vector. Gene Ther 7:934-941.
Yanez-Munoz RJ, Balaggan KS, MacNeil A, Howe SJ, Schmidt M, Smith AJ, Buch P, MacLaren RE, Anderson PN, Barker SE, Duran Y, Bartholomae C, von Kalle C, Heckenlively JR, Kinnon C, Ali RR, Thrasher AJ (2006) Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med 12:348-353.
Yao TP, Segraves WA, Oro AE, McKeown M, Evans RM (1992) Drosophila ultraspiracle modulates ecdysone receptor function via heterodimer formation. Cell 71:63-72.
Yao TP, Forman BM, Jiang Z, Cherbas L, Chen JD, McKeown M, Cherbas P, Evans RM (1993) Functional ecdysone receptor is the product of EcR and Ultraspiracle genes. Nature 366:476-479.
Ye X, Schillinger K, Burcin MM, Tsai SY, O'Malley BW (2002) Ligand-inducible transgene regulation for gene therapy. Methods Enzymol 346:551-561.
Ye X, Rivera VM, Zoltick P, Cerasoli F, Jr., Schnell MA, Gao G, Hughes JV, Gilman M, Wilson JM (1999) Regulated delivery of therapeutic proteins after in vivo somatic cell gene transfer. Science 283:88-91.
Yee JK, Friedmann T, Burns JC (1994) Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range. Methods Cell Biol 43 Pt A:99-112.
Yu JY, DeRuiter SL, Turner DL (2002) RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 99:6047-6052.
Zaiss AK, Muruve DA (2005) Immune responses to adeno-associated virus vectors. Curr Gene Ther 5:323-331.
Zaitseva M, Blauvelt A, Lee S, Lapham CK, Klaus-Kovtun V, Mostowski H, Manischewitz J, Golding H (1997) Expression and function of CCR5 and CXCR4 on human Langerhans cells and macrophages: implications for HIV primary infection. Nat Med 3:1369-1375.
Références Bibliographiques
143
Zaupa C, Revol-Guyot V, Epstein AL (2003) Improved packaging system for generation of high-level noncytotoxic HSV-1 amplicon vectors using Cre-loxP site-specific recombination to delete the packaging signals of defective helper genomes. Hum Gene Ther 14:1049-1063.
Zeng Y, Wagner EJ, Cullen BR (2002) Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells. Mol Cell 9:1327-1333.
Zeng Y, Yi R, Cullen BR (2003) MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms. Proc Natl Acad Sci U S A 100:9779-9784.
Zennou V, Petit C, Guetard D, Nerhbass U, Montagnier L, Charneau P (2000) HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap. Cell 101:173-185.
Zennou V, Serguera C, Sarkis C, Colin P, Perret E, Mallet J, Charneau P (2001) The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nat Biotechnol 19:446-450.
Zhang G, Budker V, Wolff JA (1999) High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther 10:1735-1737.
Zhang H, Pomerantz RJ, Dornadula G, Sun Y (2000) Human immunodeficiency virus type 1 Vif protein is an integral component of an mRNP complex of viral RNA and could be involved in the viral RNA folding and packaging process. J Virol 74:8252-8261.
Zhang Q, Fukuda M, Van Bockstaele E, Pascual O, Haydon PG (2004) Synaptotagmin IV regulates glial glutamate release. Proc Natl Acad Sci U S A 101:9441-9446.
Zhou H, Xia XG, Xu Z (2005) An RNA polymerase II construct synthesizes short-hairpin RNA with a quantitative indicator and mediates highly efficient RNAi. Nucleic Acids Res 33:e62.
Zhou S, Murphy JE, Escobedo JA, Dwarki VJ (1998) Adeno-associated virus-mediated delivery of erythropoietin leads to sustained elevation of hematocrit in nonhuman primates. Gene Ther 5:665-670.
Zhou X, Vink M, Klaver B, Berkhout B, Das AT (2006) Optimization of the Tet-On system for regulated gene expression through viral evolution. Gene Ther 13:1382-1390.
Zhu Z, Ma B, Homer RJ, Zheng T, Elias JA (2001) Use of the tetracycline-controlled transcriptional silencer (tTS) to eliminate transgene leak in inducible overexpression transgenic mice. J Biol Chem 276:25222-25229.
Zhu Z, Zheng T, Lee CG, Homer RJ, Elias JA (2002) Tetracycline-controlled transcriptional regulation systems: advances and application in transgenic animal modeling. Semin Cell Dev Biol 13:121-128.
Zou L, Yuan X, Long Y, Shine HD, Yang K (2002) Improvement of spatial learning and memory after adenovirus-mediated transfer of the nerve growth factor gene to aged rat brain. Hum Gene Ther 13:2173-2184.
Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ (1999) Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J Virol 73:2886-2892.
Zufferey R, Nagy D, Mandel RJ, Naldini L, Trono D (1997) Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol 15:871-875.
Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, Bukovsky A, Quiroz D, Naldini L, Trono D (1998) Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol 72:9873-9880.
Figure 1 : Stratégies de thérapie génique A gauche : Thérapie génique directe dite in vivo A droite : Thérapie génique ex vivo (D’après Kirschtein et Skirboll, 2001)
Figure 2a : Structure de l’Herpès simplex Virus de type 1 (HSV1) (d’après Todar, K 2006) Le virus HSV1 est un virus d’une centaine de nm composé d’un corps dense aux électrons comprenant l’ADN double brin, d’une capside icosapentahédrique, d’un tégument (une couche protéique entourant la capside) et d’une enveloppe.
Figure 2b : Représentation schématique du génome de l’Herpès Simplex Virus de type 1 (d’après Frampton, et al. 2005) Le génome du HSV1 est constitué de deux segments désignés L (long) et S (short :court). Chacun de ces segments est composé d’une séquence unique (UL ou US) flanquée de larges séquences répétées inversées (SRI). Les SRI situées aux extrémités du segment UL sont désignées ab et b’a’ alors que celles du segment US sont nommées a’c’et ca. La localisation des gènes essentiels (nécessaires pour la réplication virale) et les gènes accessoires (qui peuvent être délétés sans affecter la réplication) sont indiqués.
Figure 3 : Structure du génome de l’AAV (d’après Vasileva et Jessberger, 2005) Le génome de l’AAV est encadré par des séquences répétées appelées ITR (Inverted Terminal Repeat). Le gène rep code pour des protéines impliquées dans la réplication virale et le gène cap code pour des protéines nécessaires pour l’encapsidation du virus. L’AAV s’intègre dans un locus spécifique du chromosome 19 humain, AAVS1.
Figure 3A : Caractérisation du système de régulation Transduction de cellules 293T-GFP par un vecteur lentiviral qui exprime de manière régulable un shARN dirigé contre la GFP. Les cellules sont cultivées en absence ou en présence de 6 µg/ml de doxycycline.
Figure 4a : Représentation schématique de la structure d’un adénovirus. (d’après Russell, WC 2000)
Figure 4b : Structure du génome d’un adénovirus de sérotype 5 Les extrémités du génome sont bordées par les ITR (Inverted Terminal Repeat). Les unités de transcription sont les unités précoces (deE1A à E4), les deux unités intermédiaires pIX et IVa et l’unité majeure tardive MLTU (Major Late Transcription Unit). Ψ est le signal d’encapsidation de l’ADN viral.
Figure 5 : Structure d’un lentivirus : exemple du VIH-1 (d’après Goldschmidt, V 2004)
Figure 6 : Structure du génome du VIH-1 gag, pol, et env, gènes de structure. vif, vpr, vpu et nef, gènes régulateurs. LTR : Long Terminal Repeat
Figure 7 : Phase pré-intégrative du cycle réplicatif du HIV-1 (d’après Didierjean, J 2005) 1) Fixation SUgp120 au récepteur CD4+ ; 2) Fusion des deux enveloppes, entrée du virus dans la cellule et décapsidation ; 3) Rétrotranscription de l’ARN viral en ADN proviral double brin ; 4) Formation du complexe de pré-intégration (CPI) ; 5) Intégration de l’ADN proviral dans le génome de la cellule hôte.
Figure 8 : Mécanisme de rétrotranscription de l’ARN génomique du VIH-1. (d’après Goldschmidt, V 2004) 1) Initiation de la synthèse du brin d'ADN (-) ; 2) Synthèse de l'ADN (-) et dégradation par la RNase H de l'ARN matrice ; 3) Saut du brin d'ADN (-) ; 4) Fin de la synthèse du brin d'ADN (-) et dégradation par la RNase H de la matrice ; 5) Initiation de la synthèse du brin d'ADN (+) au niveau du PPT3' ; 6) Synthèse de l'ADN (+) et initiation de la synthèse du brin d'ADN (+) au niveau du PPTc ; 7) Dégradation des amorces ARN et ARNt et saut de brin de l'ADN (+) ; 8) Terminaison de la synthèse des deux brins d'ADN et synthèse d'un "DNA flap" au niveau du CTS.
Figure 9 : Import nucléaire du provirus, formation du complexe de pré-intégration (CPI) (d’après Sherman, MP 2002) Le CPI est composé de l’ADN proviral, des protéines virales MA, Vpr, IN et RT, ainsi que des protéines cellulaires HMG-I et BAF. Figure 10 : Intégration du provirus dans le génome de la cellule hôte (d’après Goldschmith, V 2004) (En jaune est représentée l’intégrase) L’intégrase clive l’ADN génomique de l’hôte ainsi que les extrémités de l’ADN proviral pour libérés une extrémité CA avec un 3’-hydroxyle. L’ADN proviral est ligué aux extrémités 5’ phosphate de l’ADN hôte par l’intégrase. Les extrémités sortantes sont ensuite éliminées et les discontinuités générées au niveau du site de ligation sont réparées par les enzymes cellulaires
Figure 11 : Plasmides de production des vecteurs lentiviraux pseudotypés avec VSV-G. La production des vecteurs lentiviraux dérivés du VIH-1 nécessite la co-transfection transitoire de ces trois plasmides dans des cellules HEK-293T.
Figure 12 : Mécanisme d’intégration site spécifique catalysée par l’intégrase de phage phiC31 : Chez streptomyces, l’intégrase phiC31 permet la recombinaison entre le site attB, présent dans le génome de streptomyces et le site attP formant les jonctions attL et attR. b) Dans les cellules de mammifères, phiC31 permet l’intégration d’un plasmide porteur du site attB et d’un transgène au niveau de pseudo-sites attP. (d’après Chalberg et al., 2005).
Figure 13 : Schéma du mécanisme de l’ARN interférence a) Structure d’un siARN. b) Biosynthèse d’un siARN et dégradation de l’ARNm cible. (D’après Dykxhoorn, DM 2003) L’ARNdb est clivé pendant l’étape d’initiation par l’enzyme Dicer pour former de petits fragments d’ARNdb de 19 à 25 nucléotides, les siARN. Au cours de l’étape effectrice, un seul brin du siARN sera incorporé dans le complexe RISC. La liaison par homologie des bases du siARN avec l’ARNm cible entraîne sa dégradation par RISC.
Helicase PAZ RIIIa RIIIb dsRBDDUF283Helicase PAZ RIIIa RIIIb dsRBDDUF283
PiwiPAZ PiwiPAZ
Figure 14 : Structure de la protéine Dicer humaine : (d’après Carmell, A et Hannon, GJ 2004) Dicer appartient à la famille des protéines RNase III et contient deux domaines catalytiques (RIIIa et RIIIb) et d’un domaine de liaison à l’ARNdb (dsRBD). Dicer est également constitué dans sa partie N-terminale d’un domaine hélicase, qui permet de séparer les brins d’ARNdb, suivie par un domaine de fonction inconnue, DUF283, puis d’un domaine PAZ. Figure 15 : Structure des protéines Argonautes : (d’après Filipowicz et al ; 2005) Les protéines Agonautes présentent dans le complexe RISC sont composées de deux principaux domaines : un domaine PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille) dans sa partie N-terminale et d’un domaine PIWI dans sa partie C-terminale. Le domaine PAZ d’une longueur d’environ 120 acides aminés permet de lier l’ARNdb. Le domaine PIWI d’une longueur d’environ 400 acides aminés est responsable de l’activité catalytique de l’ARNm.
lin-4 lin-14
Stade L1
Stade L2
let-7 lin-41lin-42
Stade L4
Stade adulte
A B
lin-4 lin-14
Stade L1
Stade L2
let-7 lin-41lin-42
Stade L4
Stade adulte
lin-4 lin-14
Stade L1
Stade L2
let-7 lin-41lin-42
Stade L4
Stade adulte
A B
Figure 16 : a) Structure des pré-miARN lin-4 et let-7, membres fondateurs de la famille des microARN. b) Mécanisme d’action des miARN lin-4 et let-7 (figure tirée de Bartel, DP 2004) a) Avant maturation par la protéine Dicer, l’ARN lin-4 et let-7 ont une longueur d’environ 70 nucléotides et forment une structure en tige-boucle. La maturation produit des molécules de 22 nucléotides (en rouge), partiellement complémentaire de la région 3’-UTR de leurs ARNm cibles b) Le miARN lin-4 se fixe sur la région 3’-UTR de lin-14 permettant ainsi le passage de stade larvaire L1 vers L2. Le miARN let-7 se fixe sur deux cibles, lin-41 et lin-42, déclenchant le passage de la phase larvaire L4 au stade adulte.
Figure 17 : Biosynthèse des microARN (D’après Cavaille, J 2004) Les miARN sont synthétisés à partir d’un ARN précurseur en tige boucle imparfaite en un ARN double brin d’environ 22 nucléotides. Ce miARN s’associe avec le complexe RISC et s’apparie avec un ARNm. Si la complémentarité est parfaite, il y a dégradation de l’ARNm cible, alors que si la complémentarité est imparfaite, il y a blocage de la traduction. Ce mécanisme d’inhibition n’est pas complètement élucidé.
Figure 18 : Stratégie d’expression des siARN L’expression des siARN se fait par l’intermédiaire de promoteurs d’ARN polymérase III. La succession de 5 résidus thymidines permet de stopper la transcription. A) Utilisation de deux promoteurs pour la synthèse du brin sens et brin antisens du siARN. B) Utilisation d’un seul promoteur pour la synthèse d’un siARN en épingle à cheveux, le shARN. Le brin sens et antisens sont séparés par une boucle de 9 pb.
PGK TetR TetR
VP16
VP16
Tet
Tet
Tet
7TetO CMVmin Transgène 7TetO CMVmin Transgène
TetR
VP16Tet
+
tTA
TetR
VP16
PGK TetR TetR
VP16
TetR
VP16
VP16
Tet
Tet
Tet
7TetO CMVmin Transgène 7TetO CMVmin Transgène
TetR
VP16Tet
TetR
VP16Tet
+
tTA
TetR
VP16
TetR
VP16
PGK rTetR rTetR
VP16
VP16
Tet
Tet
Tet
7TetO CMVmin 7TetO CMVmin
rTetR
VP16Tet
+
rtTA
Transgène Transgène
PGK rTetR rTetR
VP16
VP16
Tet
Tet
Tet
7TetO CMVmin 7TetO CMVmin
rTetR
VP16Tet
+
rtTA
Transgène Transgène
Figure 19a : Système de régulation suppressible par la tétracycline, “Tet-off” TetR, domaine de fixation à l’ADN du répresseur tétracycline VP16, domaine activateur de la transcription de VP16 du HSV. En présence de tétracycline ou de doxycycline, le transactivateur tTA ne peut se fixer sur les séquences TetO. La transcription est alors inactivée. Figure 19b : Système de régulation inductible par la tétracycline, “Tet-on” rTetR, domaine muté de fixation à l’ADN du répresseur tétracycline. En présence de tétracycline, le transactivateur rtTA se fixe sur les séquences TetO et déclenche la transcription.
Figure 20 : Système de régulation par l’ecdysone RXR, Récepteur au Rétinoïde X ; EcR, domaine de liaison à l’ADN du récepteur à l’ecdysone ; VP16, domaine activateur de VP16 du HSV ; ER, Elément de Réponse de EcR. En présence d’ecdysone, le transactivateur EcR/VP16 se lie à RXR pour former un complexe qui se lie sur les séquences ER en amont du promoteur du gène d’intérêt, déclanchant ainsi la transcription. En revanche, en absence d’ecdysone, il n’y a pas de dimérisation de EcR/VP16 avec RXR. Il n’y donc pas d’induction de la transcription.
hPR VP16
Gal4
RE TransgèneCMVmin
RU486
Transgène
hPR VP16
Gal4
Gal4 hPR VP16CMV hPR VP16
Gal4GLVP
RU486
+
RU486
RU486
CMVminRE
hPR VP16
Gal4
RE TransgèneCMVmin
RU486
Transgène
hPR VP16
Gal4
Gal4 hPR VP16CMV hPR VP16
Gal4GLVP
RU486
+
RU486
RU486
CMVminRE
Figure 21 : Système de régulation par la mifépristone ou RU486 Gal4, domaine de liaison à l’ADN de Gal4 ; hPR, domaine muté de liaison à la mifépristone ; VP16, domaine activateur de VP16 du HSV. En présence de mifépristone ou RU486, le transactivateur chimérique GLVP se fixe sur les éléments de réponse ER présent en amont du promoteur, déclanchant ainsi la transcription. En revanche en absence de RU486, GLVP ne se fixe pas sur le promoteur. Il n’y a donc pas d’expression du transgène.
Figure 22 : Système de régulation par le tamoxifène RE, Response Element., séquence de liaison de HNF1α ; HNF1α, domaine de liaison à l’ADN de HNF1α (Human hepatocyte Nuclear Factor-1α. ER, domaine de liaison au ligand 4-hydroxytamoxifène (4-OHT). p65, domaine activateur de la sous unité p65 de NF-κB. En présence de 4-OHT, le transactivateur HNF1α/:ER/p65 se lie au séquence de liaison de HNF1α située en amont du promoteur. Cette liaison déclenche l’expression du transgène. En revanche, en absence de 4-OHT, ce transactivateur ne se fixe pas. Il n’y a pas de transcription.
Figure 23 : Système de régulation par la rapamycine (R, rapamycine) ZFHD1, domaine de liaison à l’ADN de la protéine ZFHD1 ; FKBP12, domaine de liaison à la rapamycine de la protéine FKBP12 ; FRAP, domaine de liaison FRB de la protéine FRAP ; p65, domaine d’activation de la protéine NFκB p65. En présence de rapamycine, FRAP/p65 se dimérise avec ZFHD1/3-FKBP pour former un hétérodimère qui se fixe sur des éléments de réponses spécifique situés en amont du promoteur. Cette fixation entraîne la transcription. En revanche, en absence de rapamycine, l’hétérodimère ne se fixe pas. Il n’ y a pas d’expression du transgène.
Figure 24 : Description des différents types de promoteurs d’ARN polymérase III. (d’après Schramm et Hernandez, 2002) Le promoteur de type I comporte une région de contrôle interne (ICR) se laquelle se fixe les protéines d’initiation de la transcription. Il code pour les ARN ribosomaux. Le promoteur de type II comporte une boîte A et B et code pour des ARN de transfert. Les promoteurs de types III code par exemple pour des ARN nucléaires. Contrairement aux promoteurs de type I et II les promoteurs de types III sont extragéniques.
+1
SNAPc TBP
Pol III
ESP Boîte TATA
+1
SNAPc TBP
Pol III
ESP Boîte TATA
Figure 25 : Structure du promoteur U6 humain ESD, Elément de Séquence Distal, ESP, Elément de Séquence Proximal. Figure 26 : Mécanisme simplifié de transcription à partir d’un promoteur d’ARN polymérase III. (Modifié d’après Schramm et Hernandez, 2002) N’est représenté ici que le “core” du promoteur (ESP et boîte TATA). Le facteur de transcription SNAPc se fixe sur l’ESP et induit la fixation de la protéine TBP sur la boîte TATA. L’interaction entre SNAPc et TBP recrute l’ARN polymérase III qui démarre la transcription à partir d’un nucléotide précis (une guanine dans le cas du promoteur U6).
Adénovirus AAV HSV Lentivirus
Type de virus ADNdb ADNsb ADNdb ARN Transduction
des cellules quiescentes
Oui Oui Oui Oui
Intégration non oui/non
(dépendant du type cellulaire)
non oui
Capacité de clonage
7,5 kb (sauf gutless 37
kb)
4,5 kb 30-150 kb 8 kb
Avantages
- Transduction des cellules quiescentes et en division. - Production à haut titre
- Transduction des cellules quiescentes et en division. - Peu immunogène
- Forte capacité de clonage. - Fort tropisme pour les neurones
- Transduction des cellules quiescentes et en division. - Expression à long terme - Peu immunogène
Inconvénients
- Pas de réadministration (anticorps neutralisants) - Durée d’expression courte - Immunogène
- Pas de réadministration (anticorps neutralisants) - faible capacité de clonage
- Durée d’expression courte - Immunogène
- Risque de mutagenèse insertionnelle
Tableau I : Comparaison des principaux vecteurs de transfert de gène.
HUMAN GENE THERAPY 15:157–165 (February 2004)© Mary Ann Liebert, Inc.
A Single Lentivirus Vector Mediates Doxycycline-RegulatedExpression of Transgenes in the Brain
ROLAND VOGEL, LAHOUARI AMAR, ANH DO THI, PAULETTE SAILLOUR, and JACQUES MALLET
ABSTRACT
A single lentivirus vector allowing doxycycline-regulated expression of transgenes in the brain was generatedby incorporating the tetracycline (Tet)-dependent regulatory system into the backbone of the vector. Two dis-tinct expression cassettes were inserted upstream and downstream from the central Flap sequence that pro-vides for enhanced transduction of nondividing cells. The first cassette was used to express the transgene un-der the control of the Tet-dependent minimal cytomegalovirus promoter. The second cassette was employedto express constitutively the Tet-dependent transactivator rtTA2-M2, which activates the Tet-dependent pro-moter after binding of doxycycline (Tet-on system). Vectors carrying luciferase and tyrosine hydroxylase asthe transgene were constructed, tested in astroglia-rich primary cultures, and injected into the striata of rats.The constructs allowed in vitro and in vivo robust expression of the transgene that could be regulated overtwo orders of magnitude by the addition and withdrawal of doxycycline. The vector may thus be useful formany applications in gene therapy research, including the development of a therapeutic protocol for the treat-ment of Parkinson’s disease based on the restoration of regulated dopamine production.
157
OVERVIEW SUMMARY
The use of gene transfer as a therapeutic tool requires thedevelopment of vectors that permit to control the expres-sion of the therapeutic gene by administration of small in-ducer molecules. The treatment could then be adapted tothe needs of the patient and, should complications arise, thetherapy could be stopped or interrupted. Optimized vectorsthat only need to be applied to the patient in minimalamounts would contribute further to the safety of genetransfer for human therapy. Therefore, we constructed andcharacterized a single optimized lentivirus vector allowingdoxycycline-regulated expression of transgenes. Transgeneexpression from this vector can be regulated in vitro and invivo over two orders of magnitude by administration andwithdrawal of doxycycline. Thus, the vector may be usefulfor many applications in gene therapy research.
INTRODUCTION
THE DEVELOPMENT OF VECTORS that allow regulated expres-sion of therapeutic genes is essential for the clinical appli-
cation of gene therapy. The delivery of genes controlled by a
regulatory system would improve both efficacy and safety byenabling clinicians to adapt the therapy to the needs of the pa-tient and to stop therapeutic gene expression at the onset of anyadverse secondary effect. Gene regulation is particularly nec-essary when the gene transfer vectors permit long-term ex-pression of the transgene. The importance of controlled thera-pies is most evident in the field of therapeutic angiogenesis andin the treatment of Parkinson’s disease. The devastating con-sequences of unregulated vascular endothelial growth factor(VEGF) synthesis (Yancopoulos et al., 2000) and the occur-rence of persistent dyskinesia in patients caused by unregulatedsynthesis of dopamine by implanted fetal dopaminergic cells(Ma et al., 2002) are well documented.
Several systems that allow transgene expression to be mod-ulated have been developed (Fussenegger, 2001). Among these,the Tet-dependent regulatory system (Gossen and Bujard, 1992)reveals excellent performance in vitro and in vivo. The initialversion of the Tet system was based on an engineered tran-scription factor that combines functional domains from theEscherichia coli Tet repressor protein and the Herpes simplexVP16 transactivator. In the absence of doxycycline this trans-activator activates a minimal cytomegalovirus (CMV) promoterby binding to the Tet operon repeats incorporated into its 59 re-gion (Tet-off system). In the most recent version a modified
Laboratoire de Génétique Moléculaire de la Neurotransmission et des Processus Neurodégénératifs (LGN), CNRS-UMR 7091, Paris, France.
transcription factor (rtTA2-M2) is used: it contains three min-imal VP16 transactivator domains (Baron et al., 1997) and amutated tetracycline-binding domain (Urlinger et al., 2000).This transactivator requires doxycycline to activate the mini-mal CMV promoter (Tet-on system). The various versions ofthe Tet system have been successfully used in transgenic ani-mals (Zhu et al., 2002) and have also been integrated into ad-enoviral vectors (Corti et al., 1999) and adeno-associated viralvectors (Fitzsimons et al., 2001).
Tet-regulated transgene expression in a host cell requires thedelivery of two expression cassettes, one to express the trans-activator and the other to express the transgene. In RNA virusvectors, such as lentivirus vectors, the possibilities of insertingmore than one expression cassette appear to be limited, becausetermination of transcription due to additional poly(A) sequencesmust be avoided during vector production. To deliver regulatedexpression of small transgenes, such as that encoding green flu-orescent protein (GFP), by lentivirus vectors, the problem hasbeen overcome by the use of overlapping expression cassettes(Kafri et al., 2000; Vigna et al., 2002); that is, the cassettes re-quired to produce (1) the vector, (2) the transactivator, and (3)the transgene all share the poly(A) sequence in the long termi-nal repeat (LTR) of the vector. Doxycycline-regulated expres-sion of transgenes has also be obtained by delivering two ex-pression cassettes by two separate lentivirus vectors (Vigna etal., 2002).
The amount of vector administered to patients should be assmall as possible, in order to minimize the risk of oncogene ac-tivation by the integrating vector genome. In a clinical trial ofex vivo gene therapy for X-linked severe combined immune de-ficiency (Hacein-Bey-Abina et al., 2002), one of four success-fully treated patients developed leukemia 30 months after im-plantation of CD341 cells transduced with a Moloney murineleukemia virus vector (Hacein-Bey-Abina et al., 2003). The leu-kemia observed was probably due to oncogene activationcaused by the integrating vector genome (Hacein-Bey-Abina etal., 2003).
Thus, we set out to develop a single, self-inactivating lentivi-ral vector to deliver Tet-regulated expression of therapeuticgenes. Two distinct expression cassettes were integrated intothe lentiviral backbone to optimize induction of larger thera-peutic genes by doxycycline. To further reduce the amount ofvector that has to be applied in vivo, the Woodchuck HepatitisVirus Responsive Element (WPRE) was incorporated: this el-ement increases transgene expression by stabilizing the trans-gene mRNA (Zufferey et al., 1999). To facilitate transductionof neural cells, the central HIV-1 Flap sequence (Zennou et al.,2001) was inserted into the vector.
MATERIALS AND METHODS
Plasmid construction
The plasmid pTrip-EF1a-eGFP, which contains the back-bone of the lentiviral genome including the central Flap se-quence (Zennou et al., 2001), was kindly provided by P.Charneau (Pasteur Institute, Paris, France). The plasmids pUHR10-3 and pUHRT62-1, which contain the components of theTet system, were kindly provided by H. Bujard (Zentrum für
Molekulare Biologie, Heidelberg, Germany). A BamHI–KpnIDNA fragment containing the WPRE and an MluI–BamHIDNA fragment containing the tetracycline-regulated minimalCMV promoter and the 39 polylinker NdeI–SpeI–BalI were am-plified by polymerase chain reaction (PCR) from pNI-WPREand pUHR 10-3, respectively. The fragments were ligated intothe pTrip plasmid from which the EF1a promoter and the eGFPcDNA had been removed by MluI–KpnI digestion, resulting inpTrip-CMVmin-WPRE. A 400-bp NotI–EcoRI DNA fragmentcontaining the lentiviral encapsidation sequence c and the 39
cloning linker NheI–SalI was generated by PCR from this con-struct. The fragment was used to replace the 900-bp NotI–EcoRIfragment in pTrip-CMVmin-WPRE, thereby deleting 500 bpupstream from the Flap sequence. The resulting plasmid wascalled pD500Trip-CMVmin-WPRE and an MluI–XhoI frag-ment containing the minimal enhancer-blocking site of thechicken b-globin insulator (Bell et al., 1999) was inserted be-tween the Flap sequence and the minimal CMV promoter. Thisfragment was generated by annealing the synthetic oligonu-cleotides 59-CGCGTGCTATCGATGGCCTGCTGCCCCCT-AGCGGGGGAGGGACGTAATTACATCCCTGGGG-GCGCTCTAGAACGC-3 9 and 59-TCGAGCGTCTAGAGCG-CCCCCAGGGATGTAATTACGTCCC TCCCCCGCTAG-GGGGCAGCAGGCATCGATAGCA-3 9, which were boughtfrom Qbiogene (Evry, France). NdeI–BamHI DNA fragmentscarrying luciferase and human tyrosine hydroxylase 1 cDNAswere inserted into the resulting plasmid pD500Trip-Ins-CMVmin-WPRE.
rtTA2-M2 cDNA was recovered from pUHRT62-1 byEcoRI–BamHI digestion and inserted into pD500Trip-CMVmin-WPRE from which the central Flap sequence and theminimal CMV promoter had been removed by EcoRI–BamHIdigestion. The WPRE sequence in the resulting plasmidpD500rtTA2-M2-WPRE was replaced by a BamHI–KpnI frag-ment containing the poly(A) sequences of the bovine growthhormone gene and an NheI site at the 39 terminus. The poly(A)sequence was amplified by PCR from the pcDNA 3 vector (In-vitrogen, Groningen, The Netherlands). An SalI–EcoRI frag-ment cotaining the phosphoglycerate kinase (PGK) promoterwas amplified by PCR and inserted into the SalI–EcoRI site up-stream from rtTA2-M2, yielding the plasmid pD500-PGK-rtTA2-M2-BGHpolyA.
The rtTA2-M2 expression cassette was recovered frompD500-PGK-rtTA2-M2-BGHpolyA by SalI–NheI digestionand inserted between the SalI and NheI sites of pD500Trip-Ins-CMVmin-Transgene-WPRE, which contained either luciferaseor human tyrosine hydroxylase 1 as the transgene. In the re-sulting plasmid the central Flap sequence between the SalI andMluI sites was replaced by an SalI–MluI fragment containinga 300-bp stuffer DNA and the central Flap sequence amplifiedfrom pTrip-EF1a-eGFP by PCR. All plasmid constructs wereverified by sequencing with an ABI-PRISM 377 DNA se-quencer (Applied Biosystems, Courtabeuf, France).
Production and quantification of vector stocks
Vector particles were produced by transient cotransfectionof 293T cells by the vector plasmid, an encapsidation plasmid(p 8.7), and a vesicular stomatitis virus (VSV) expression plas-mid (pHCMV-G) as previously described (Zennou et al., 2001).
VOGEL ET AL.158
To quantify the vector stocks the amount of p24 capsid proteinwas determined by a human immunodeficiency virus type 1(HIV-1) core profile enzyme-linked immunosorbent assay(Beckman Coulter, Roissy, France) as described by the manu-facturer. Transducing units (TU) were quantified by an 8-hr in-cubation of serial dilutions of the vector stocks with HeLa cellsin the presence of DEAE-dextran (10 mg/ml; Sigma-Aldrich,St. Quentin Fallavier, France). To induce transgene expression,cells were incubated for 72 hr with culture medium containingdoxycycline (600 ng/ml) and then analyzed by immunocyto-chemical staining and counting of immunopositive cellcolonies. Vector preparations containing 5.6 3 108 and 2.8 3
108 TU were obtained from 2 3 108 transiently transfected293T cells when the vector construct carried luciferase and ty-rosine hydroxylase as the transgene, respectively. A TU-to-p24ratio of 6 3 104 TU/ng of p24 and 8 3 104 TU/ng of p24 wasdetermined in the preparations of vectors expressing luciferaseand tyrosine hydroxylase, respectively.
Characterization of the vectors in vitro
Astroglia-rich primary cultures containing 70–80% astro-cytes (Stieg et al., 1980) were prepared from the brains ofneonatal Sprague-Dawley rats as described (Hamprecht andLöffler, 1985). In each well of a 12-well dish, 500,000 viablecells were seeded in 1.5 ml of culture medium (90% DMEM,10% fetal calf serum, penicillin G [20 units/ml], and strepto-mycin sulfate [20 mg/ml]) and cultivated at 37°C under a hu-midified atmosphere of 5% CO2/95% air in a cell incubator.The medium was renewed after 7 days. After 14 days, whenthe cultures had reached their final cell density, the mediumwas again renewed and lentivirus preparations were added. Af-ter overnight incubation the medium was replaced by fresh cul-ture medium and doxycycline was added at various concentra-tions (Sigma-Aldrich). The culture medium was renewed 3, 5,7, 9, and 12 days after the first application of doxycycline andfresh doxycycline was administered each time. Luciferase ac-tivity in the cultured cells was assayed with the luciferase as-say system (Promega, Lyon, France). Tyrosine hydroxylase ac-tivity was determined by monitoring the release of 3H2O from[3,5-3H]tyrosine (Amersham Biosciences, Orsay, France) as de-scribed (Reinhard et al., 1986). Protein was quantified accord-ing to the method of Bradford (1976) with the Bio-Rad proteinassay (Bio-Rad Laboratories, Munich, Germany), using bovineserum albumin as standard.
For immunocytochemical analysis cells were cultivated onglass coverslips. The culture medium was removed and cellswere washed twice with PBS and fixed by a 10-min incubationat 37°C in 4% paraformaldehyde in PBS. For immunocyto-chemistry antisera raised against luciferase (Europa Bioprod-ucts, Cambridge, UK) and tyrosine hydroxylase (Institut J. Boy,Strasbourg, France) were used and the peroxidase VectastainABC kit (AbCys, Paris, France) was used for detection.
Stereotaxic injections
Young adult female Sprague-Dawley rats (Janvier, Le Gen-est St. Isle, France) were anesthetized with a dose of 1 ml/kgbody weight of a 1:1 mixture of ketamine (Virbac, Carros,France) and Rompun (Bayer, Puteaux, France). The virus sus-pension was injected with a 10-ml Hamilton syringe into the
striatum at the following stereotaxic coordinates: (1) 11.8 an-terior to bregma (AB), 12.5 lateral to midline (LM), 5 and 4.6ventral to the dural surface (V); (2) 10.6 AB, 13.2 LM, 5 and4.6 V; (3) 10.6 AB, 12 LM, 5 and 4.6 V. Five weeks beforethe administration of the vector carrying tyrosine hydroxylaseas the transgene, 6.5 mg of 6-hydroxydopamine (6-OHDA;Sigma-Aldrich) was intrastriatally injected at each of the fol-lowing stereotaxic coordinates: 11.2 AB, 12.5 LM, 5, 4.6, and4.2 V. Two days before the injection of vector the degenera-tion of dopaminergic terminals in the striatum was verified bymonitoring apomorphine-induced rotational behavior of the an-imals as described (Horellou et al., 1990).
Qualitative and quantitative histological analyses
Ten days after administration of doxycycline in drinking wa-ter the animals were killed by decapitation. For immunohisto-chemistry the brains were removed and immediately frozen in280°C isopentane. Cryostat sections (16 mm thick) of the frozenbrains were fixed by an overnight incubation at 4°C in a solu-tion of 4% paraformaldehyde in PBS. The sections were used forimmunohistochemistry with antisera raised against luciferase(Europa Bioproducts) and tyrosine hydroxylase (Institut J. Boy),and the peroxidase Vectastain ABC kit (AbCys) for detection.
To quantify luciferase activity, forebrain tissue containingthe striatum was removed by microdissection. The tissue washomogenized in 1.5-ml microcentrifuge tubes (Eppendorf, LePecq, France) with 2 ml of cell culture lysis reagent of the lu-ciferase assay system (Promega) per milligram wet tissue anda motor-driven micropestle. The homogenate was centrifugedat 4°C and 12,000 3 g for 5 min. The supernatant was storedon ice. The pellet was homogenized four more times with 300ml of lysis reagent and centrifuged as described above. The fivesupernatants were combined, and the total activity of luciferasewas determined with the luciferase assay system (Promega).
RESULTS
Construction of the vector
Two expression cassettes were inserted into the backbone ofthe vector (Fig. 1). The first cassette that was used to expressthe transgene under the control of the Tet-dependent minimalCMV promoter contained a WPRE sequence (Zufferey et al.,1999), to enhance transgene production, and employed thepoly(A) sequence of the vector in the 39 long terminal repeat(LTR). The second cassette, which served to express the Tet-dependent transactivator rtTA2-M2 under the control of thephosphoglycerate kinase promoter, was oriented in the antisensedirection with respect to the vector RNA. A monodirectionalpoly(A) sequence derived from the bovine growth hormone genewas inserted into the second cassette for polyadenylation of thertTA2-M2 transcript without disturbing transcription of the vec-tor genome during production of the vector. To suppress trans-activatory effects between the promoters of the two cassettes thetwo promoter sequences were separated by the insertion of (1)the minimal enhancer-blocking site of the chicken b-globin in-sulator (Bell et al., 1999), (2) the central Flap sequence, and (3)a 300-bp stuffer sequence. The central Flap sequence and thestuffer were both derived from HIV-1. The central Flap sequence
HIV-1 VECTOR TRANSFERS REGULATABLE GENES 159
was also employed to improve the transduction of neural cellas previously described (Zennou et al., 2001). The U3 promoterregion was deleted from the 39 LTR to obtain a self-inactivat-ing vector as described (Zufferey et al., 1998).
Characterization of the vector in astroglia-rich primary cultures
Astroglia-rich primary cultures derived from the brains ofnewborn rats were transduced with the vector construct carry-
ing luciferase as the transgene. In the presence of doxycycline(600 ng/ml) robust expression of the transgene was obtained,which was monitored by the determination of luciferase activ-ity in lysates from doxycycline-treated, transduced cells. Theactivity of luciferase correlated with the amount of vector ap-plied for transduction (Fig. 2A). The production of luciferaseenzyme in response to doxycycline was also demonstrated im-munocytochemically (Fig. 2B). About 2% of the primary cellswere immunopositive when cells were transduced with vectorcorresponding to a multiplicity of infection (MOI) of 1. The
VOGEL ET AL.160
FIG. 1. Schematic diagram of the lentivirus vector developed to deliver regulated expression of therapeutic genes. LTR, c,Stuffer, and Flap (the long terminal repeats, the packaging sequence, a 300-bp Stuffer DNA, and the central Flap element, re-spectively) are sequences derived from HIV-1. PCMV min and PPGK are the Tet-regulated minimal CMV promoter and the phos-phoglycerate kinase promoter, respectively; poly A(BGH) is a monodirectional poly(A) site derived from the bovine growth hor-mone gene, INS is a minimal insulator sequence derived from the chicken b-globin insulator, and WPRE is the WoodchuckHepatitis Virus Responsive Element. rtTA2-M2 is cDNA encoding the Tet-dependent transactivator rtTA2-M2. Arrows indicatethe direction of transcription and the orientation of the poly(A) sequence.
FIG. 2. Transduction of astroglia-rich primary cultures with the vector construct carrying luciferase as the transgene. (A) Cells(6 3 105) corresponding to 150 mg of protein were incubated overnight with various quantities of vector expressed as transduc-ing units (TU) per cell (multiplicity of infection, MOI), and cultivated in the presence of doxycycline (600 ng/ml) for 7 days.Values represent means of specific luciferase activities 6 SE; n 5 3. (B and C) Production of luciferase in transduced astroglia-rich primary cultures as determined by immunocytochemistry. Cells (3 3 105) were incubated overnight with vector (MOI of 1),and cultivated in the presence (B) and in the absence (C) of doxycycline (600 ng/ml) for 7 days. Scale bars: 100 mm.
transduced cells clearly revealed astrocytic morphology. No lu-ciferase immunoreactivity was observed when transduced cellswere incubated in the absence of doxycycline (Fig. 2C). Theeffect of the inducer was evident 2 days after the addition ofdoxycycline (Fig. 3A and B). After 5 days the activity of lu-ciferase reached a plateau, which was stable until the end of theobservation period of 14 days (Fig. 3A). This profile was in-dependent of whether doxycycline was added to the culturemedium immediately (day 0) or 1 week (day 7) after the ad-ministration of vector (Fig. 3B). The withdrawal of doxycyclineafter 1 week was followed by a decrease in luciferase activityto the background level within 5–7 days (Fig. 3B). We deter-mined the minimal dose of doxycycline required to induce ex-pression of the transgene in vitro (Fig. 3C). A concentration of600 ng/ml was required to fully induce luciferase activity. Inthe absence of doxycycline enzymatic activity of luciferase wasdetectable and was 1% of the activity in the fully induced state.No enzymatic activity of luciferase was detected in lysates fromcells that had not been transduced by administration of the vec-tor (data not shown).
Characterization of the vector in vivo
The vector construct carrying luciferase cDNA was injectedinto the striata of rats (Fig. 4). Two days after surgery the ani-mals were treated for 10 days with doxycycline (0, 0.02, or 3mg/ml) in the drinking water. The animals were then killed andthe brains removed for enzymatic and immunohistochemicalanalysis. In striatal extracts from animals that had received doxy-
cycline at 3 mg/ml the total enzymatic activity of luciferase was(2.1 6 0.4) 3 107 RLU/sec (n 5 3). In extracts from animalsthat had received either no doxycycline or doxycycline at 0.02mg/ml, enzymatic activity of luciferase was 2% of that in ex-tracts from animals treated with doxycycline at 3 mg/ml (Fig.4A). Expression of the transgene was also detected immuno-histochemically in striatal sections from animals treated withdoxycycline at 3 mg/ml (Fig. 4B). No luciferase immunoreac-tivity was observed when series of 150 striatal sections were ex-amined covering the injected areas of the striata of animals thathad not been treated with doxycycline. A representative area ofa representative section is displayed (Fig. 4C).
Regulated expression of tyrosine hydroxylase in vitroand in vivo
Restoration of dopamine production is a promising approachfor gene therapy of Parkinson’s disease (Azzouz et al., 2002;Muramatsu et al., 2002). Regulated delivery of dopamine byregulated expression of tyrosine hydroxylase may allow toavoid the side effects of unregulated dopamine production, such as dyskinesia (Ma et al., 2002). Thus, a vector carryinghuman tyrosine hydroxylase 1 cDNA as the transgene was gen-erated and tested in astroglia-rich primary cultures. Primarycells (4 3 105) were incubated overnight with various quanti-ties of the vector and cultivated in the presence and in the ab-sence of doxycycline (600 ng/ml) for 7 days. Similar to thetransductions with the vector carrying luciferase as the trans-gene, the activity of tyrosine hydroxylase in lysates from cells
HIV-1 VECTOR TRANSFERS REGULATABLE GENES 161
FIG. 3. Effect of doxycycline on the activity of luciferase in astroglia-rich primary cultures transduced with the vector con-struct carrying luciferase as the transgene. Cells (6 3 105) were incubated overnight with vector (MOI of 0.5) and used to studythe regulation of transgene expression by the administration of doxycycline. (A) Luciferase activity in transduced primary cellscultivated up to 14 days in the presence (solid diamonds) and in the absence (open diamonds) of doxycycline (600 ng/ml). (B)Luciferase activity in transduced primary cells cultivated for 7 days in the presence of doxycycline (600 ng/ml) and for 7 daysin the absence of doxycycline. Solid diamonds represent cells cultivated in the presence of doxycycline to day 7, open diamondsrepresent cells that were cultivated in the presence of doxycycline from day 7 to day 14 after transduction. (C) Luciferase ac-tivity in transduced primary cells cultivated for 7 days in the presence of various concentrations of doxycycline. Activity in thepresence of doxycycline (3000 ng/ml) was defined as 100%, values represent means 6 SE, n 5 3.
cultivated in the presence of doxycycline correlated with theamount of vector applied (data not shown). In lysates of cellsthat had been transduced with vector corresponding to an MOIof 1 and that had been cultivated in the presence of doxycy-cline, a tyrosine hydroxylase activity of 24,800 6 1700 pmol/hr ? mg protein was determined 7 days after transduction (n 5
3). No activity of tyrosine hydroxylase was detectable in lysatesof transduced cells cultivated in the absence of doxycycline, be-cause of the limited sensitivity of the assay for tyrosine hy-droxylase activity. Robust expression of tyrosine hydroxylasewas also detected immunocytochemically when doxycycline(600 ng/ml) was present in the culture medium (Fig. 5A). About3% of the primary cells were immunopositive when cells weretransduced with vector corresponding to an MOI of 0.5. Again,the transduced cells clearly revealed astrocytic morphology. Notyrosine hydroxylase immunoreactivity was observed whencells were cultivated in the absence of doxycycline (Fig. 5B).The vector was injected into the left striata of rats from whichendogenous tyrosine hydroxylase had been removed by 6-hy-droxydopamine (6-OHDA) lesion. Cells expressing the trans-gene were detected immunohistochemically in animals treated
with doxycycline at 3 mg/ml (Fig. 6A). Series of 100 sectionscovering the injected areas from the striata of animals that hadnot received doxycycline were prepared, and screened by tyro-sine hydroxylase immunohistochemistry. Neither tyrosine hy-droxylase-producing cells nor tyrosine hydroxylase immunore-activity enhanced over the strongly decreased endogeneouslevel of the 6-OHDA-lesioned striatum could be observed. Arepresentative area of a representative section is displayed (Fig.6B). In the contralateral (right) striatum into which neither 6-OHDA nor vector was injected tyrosine hydroxylase immuno-histochemistry resulted in neuropil staining, indicating intactdopaminergic terminals in the right hemisphere (Fig. 6C).
DISCUSSION
The aim of the study was to develop a lentivirus vector thatpermits doxycycline-controlled expression of therapeutic trans-genes in the brain. A single vector was used to deliver the ex-pression cassettes for both the transgene and the transactivatorin order to avoid populations of singly transduced cells and to
VOGEL ET AL.162
FIG. 4. Intrastriatal injection of the vector construct carrying luciferase as the transgene. Vector (1.4 3 106 TU) was injectedinto each of six sites in the striata of rats (see Materials and Methods). (A) Total luciferase activity in striatal extracts from ratsthat received doxycycline at 0, 0.02, or 3 mg/ml in their drinking water for 10 days. Drinking water containing doxycycline wasrenewed every day; daily consumption was 20 6 5 ml/rat. The mean activity (2.1 3 107 RLU/sec) in extracts from animals thatreceived doxycycline (3 mg/ml) in drinking water was defined as 100%; values represent means 6 SE, n 5 3. (B) Immunohis-tochemical demonstration of luciferase in the striatum of an animal that received doxycycline at 3 mg/ml in its drinking waterfor 10 days. (C) Immunohistochemistry using anti-luciferase antiserum, and striatal sections from an animal that was not treatedwith doxycycline. A representative area of a representative section is displayed (negative control). Scale bars: 50 mm.
reduce the amount of virus that has to be applied for efficienttransduction. Single lentiviral vectors that allow doxycycline-controlled expression of transgenes have already been described(Kafri et al., 2000; Vigna et al., 2002). These vectors employoverlapping expression cassettes, that is, the cassette requiredto drive production of the genome of the vector from the pre-cursor plasmid, and the cassettes used to express the transacti-
vator and the transgene, share the poly(A) sequence in the 39
LTR of the vector. These systems have been successfully usedto deliver regulated expression of small transgenes, such as GFP(800 bp); however, their performance in transferring largertransgenes, such as luciferase and tyrosine hydroxylase (1800bp), has never been reported. One of these single-vector con-structs (Vigna et al., 2002) utilizes the deleted U3 promoter re-
HIV-1 VECTOR TRANSFERS REGULATABLE GENES 163
FIG. 5. Immunocytochemistry revealing doxycycline-controlled expression of tyrosine hydroxylase in astroglia-rich primarycultures after gene delivery by vector carrying human tyrosine hydroxylase 1 as the transgene. Cells (3 3 105) were incubatedovernight with vector (MOI of 0.5), and cultivated in the presence (A) and in the absence (B) of doxycycline (600 ng/ml) for 7days. Scale bars: 100 mm.
FIG. 6. Intrastriatal injection of vector construct carrying tyrosine hydroxylase as the transgene. Vector (9 3 105 TU) was in-jected into each of six sites in the left striata of rats (see Materials and Methods) from which endogenous tyrosine hydroxylasehad been eliminated by 6-OHDA treatment. (A) Immunohistochemical demonstration of tyrosine hydroxylase in cells of the leftstriatum of an animal that received doxycycline (3 mg/ml) in its drinking water for 10 days. (B) Immunohistochemistry usinganti-tyrosine hydroxylase antiserum, and sections of the left striatum from an animal not treated with doxycycline. A represen-tative area of a representative section is shown (negative control). (C) Immunohistochemical demonstration of dopaminergic ter-minals, using anti-tyrosine hydroxylase antiserum, and a representative section of the right striatum into which neither 6-OHDAnor vector was injected. Scale bars: 50 mm.
gion in the 39 LTR to deliver the Tet-dependent promoter re-quired to express the transgene. Thereby, the self-inactivatingsystem established by the deletion of the U3 promoter in the 39
LTR (Zufferey et al., 1998) is compromised, and the safety ofthat construct is reduced. To avoid safety problems and to pre-vent potential difficulties caused by the size of the therapeuticgene we inserted two distinct expression cassettes into the back-bone of the vector by exploiting the monodirectional poly(A)sequence from the bovine growth hormone gene.
To characterize doxycycline-regulated transgene expressionfrom our vector, we studied a construct carrying luciferase asthe transgene. A very sensitive assay of luciferase enzyme ac-tivity allowed determination of the background expression ofthe transgene caused by leakage transcription from the minimalCMV promoter in the absence of doxycycline. This backgroundexpression led to detectable enzymatic activity that was 1 and2% of the activity in the induced state in vitro and in vivo, re-spectively. Background activity of 1% in the off-state has alsobeen reported when doxycycline-regulated expression of lucif-erase was delivered by two lentivirus vectors (Vigna et al.,2002). This suggests that the background activation of the min-imal CMV promoter is due to transactivatory effects of the chro-mosomal environment into which the vector genome is inte-grated, rather than to transactivation by enhancer elements inthe phosphoglycerate kinase promoter used to express the trans-activator. Thus, the stuffer sequence, the Flap sequence, and theminimal enhancer-blocking site of the chicken b-globin insu-lator (Bell et al., 1999) were sufficient to largely suppress trans-activatory effects between the promoters of the two expressioncassettes in our vector.
Full and reversible induction of luciferase was obtained invitro by the addition and withdrawal of doxycycline (600ng/ml). This is consistent with the characteristics of rtTA2-M2(Urlinger et al., 2000). Luciferase activity was induced in vivowhen doxycycline (3 mg/ml) was added to the drinking waterof the rats after the injection of virus. This relatively high con-centration was chosen, because doxycyline at 0.2 mg/ml wasrequired to regulate transgene expression in the brains of liv-ing rats by the Tet-off system (Kafri et al., 2000) that is regu-lated in vitro by doxycycline at 0.1 ng/ml (Corti et al., 1999).The rats used in our study weighed about 300 g and each con-sumed about 20 ml of drinking water daily. Thus, 3 mg/ml inthe drinking water is equivalent to a daily dose of 200 mg/kgbody weight or a daily uptake of 14 g of doxycycline by a 70-kg person. The LD50 value for rats, determined by a single in-traperitoneal administration of doxycycline, is 262 mg/kg bodyweight (Goldenthal, 1971). Severe intoxications have been re-ported in humans after daily intravenous applications of 3.5–6 gof tetracycline (Schultz et al., 1963). Antibacterial therapy withdoxycycline involves a dose of 100 mg of doxycycline for a 70kg patient. If the regulatory system is to be able to fulfill clin-ical requirements at this dose, transgene expression must be in-duced in rats by a 0.02 mg/ml concentration of doxycycline indrinking water. The application of doxycycline at 0.02 mg/mlin drinking water failed to induce the expression of luciferasein vivo. Thus, doxycycline-regulated gene expression based onrtTA2-M2 is unsatisfactory for treating diseases of the centralnervous system in humans. For clinical application the trans-activator rtTA2-M2 needs to be improved and more suitable in-ducer molecules must be developed. However, the lentivirus
vector we developed, containing the most recent version of theTet-dependent regulatory system, could be useful for gene ther-apy studies using animal models.
Restoration of dopamine production in the striatum by genetransfer of tyrosine hydroxylase, aromatic acid decarboxylase,and GTP cyclohydrolase I is a promising approach to treatingParkinson’s disease (Azzouz et al., 2002; Muramatsu et al.,2002). Restoration of dopamine production may even help invery late stages of Parkinson’s disease, when dopaminergic in-put to the striatum has almost completely disappeared becauseof the degeneration of dopaminergic neurons from the sub-stantia nigra. However, the therapeutic production of dopaminemust be regulated to avoid side effects, such as dyskinesia (Maet al., 2002). Regulated expression of tyrosine hydroxylase al-lows the synthesis of dopamine to be controlled at the rate-lim-iting step. Therefore, a lentivirus vector carrying human tyro-sine hydroxylase 1 cDNA as the transgene was generated. Theconstruct drove robust and regulatable expression of tyrosinehydroxylase and may thus serve to develop a protocol in ani-mal models for the gene therapy for Parkinson’s disease basedon the restoration of regulated dopamine production.
In summary, we developed a single, self-inactivating lenti-virus vector for doxycycline-regulated expression of transgenesand demonstrated robust and regulatable transgene expressionfrom the construct in the central nervous system. The vectorshould be useful for many applications in gene therapy researchusing animal models.
ACKNOWLEDGMENTS
We are grateful to Pierre Charneau and Hermann Bujard forproviding the plasmid pTrip-EF1a-eGFP and the plasmidspUHR 10-3 and pUHRT62-1, respectively. Furthermore, we aregrateful to the European Community for supporting this workby a Marie Curie fellowship to R.V. We thank la DélégationGénérale pour l’Armement (DGA) for financial support of L.A.,and we also thank l’Université Paris VI (Pierre et Marie Curie),l’Institut pour la Recherche sur la Moelle Epinière (IRME), andRetina France for support of this work.
REFERENCES
AZZOUZ, M., MARTIN-RENDON, E., BARBER, R.D., MITRO-PHANOUS, K.A., CARTER, E.E., ROHLL, J.B., KINGSMAN,S.M., KINGSMAN, A.J., and MAZARAKIS, N.D. (2002). Multi-cistronic lentiviral vector-mediated striatal gene transfer of aromaticL-amino acid decarboxylase, tyrosine hydroxylase, and GTP cyclo-hydrolase I induces sustained transgene expression, dopamine pro-duction, and functional improvement in a rat model of Parkinson’sdisease. J. Neurosci. 22, 10302–10312.
BARON, U., GOSSEN, M., and BUJARD, H. (1997). Tetracycline-controlled transcription in eukaryotes: Novel transactivators withgraded transactivation potential. Nucleic Acids Res. 25, 2723–2729.
BELL, A.C., WEST, A.G., and FELSENFELD, G. (1999). The proteinCTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate in-sulators. Cell 98, 387–396.
BRADFORD, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quan-titation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248–254.
VOGEL ET AL.164
CORTI, O., SABATE, O., HORELLOU, P., COLIN, P., DUMAS, S.,BUCHET, D., BUCCARON, M.H., and MALLET, J. (1999). A sin-gle adenovirus vector mediates doxycycline-controlled expression oftyrosine hydrfoxylase in brain grafts of human neural progenitors.Nat. Biotechnol. 17, 349–354.
FITZSIMONS, H.L., MCKENZIE, J.M., and DURING, M.J. (2001).Insulators coupled to a minimal bidirectional tet cassette for tightregulation of rAAV-mediated gene transfer in the mammalian brain.Gene Ther. 8, 1675–1681.
FUSSENEGGER, M. (2001). The impact of mammalian gene regula-tion concepts on functional genomic research, metabolic engineer-ing, and advanced gene therapies. Biotechnol. Prog. 17, 1–51.
GOLDENTHAL, E.I. (1971). A compilation of LD50 values in new-born and adult animals. Toxicol. Appl. Pharmacol. 18, 185–207.
GOSSEN, M., and BUJARD, H. (1992). Tight control of gene expres-sion in mammalian cells by tetracycline responsive promoters. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547–5551.
HACEIN-BEY-ABINA, S., LE DEIST, F., CARLIER, F., BOUNEAUD,C., HUE, C., DE VILLARTAY, J.-P., THRASHER, A.J., WULF-FRAAT, N., SORENSEN, R., DUPUIS-GIROD, S., FISCHER, A.,and CAVAZZANA-CALVO, M. (2002). Sustained correction of X-linked severe combined immunodeficiency by ex vivo gene therapy.N. Engl. J. Med. 346, 1185–1193.
HACEIN-BEY-ABINA, S., VON KALLE, C., SCHMIDT, M., LEDEIST, F., WULF-FRAAT, N., MCINTYRE, E., RADFORD, I.,VILLEVAL, J.L., FRASER, C.C., CAVAZZANA-CALVO, M., andFISCHER, A. (2003). A serious adverse event after successful genetherapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N. Engl.J. Med. 348, 255–256.
HAMPRECHT, B., and LÖFFLER, F. (1985). Primary glial culturesas a model for studying hormone action. Methods Enzymol. 109,341–345.
HORELLOU, P., BRUNDIN, P., KALEN, P., MALLET, J., andBJORKLUND, A. (1990). In vivo release of dopa and dopaminefrom genetically engineered cells grafted to the denervated rat stria-tum. Neuron 5, 393–402.
KAFRI, T., VAN PRAAG, H., GAGE, F.H., and VERMA, I.M. (2000).Lentiviral vectors: Regulated gene expression. Mol. Ther. 1,516–521.
MA, Y., FEIGIN, A., DHAWAN, V., FUKUDA, M., SHI, Q.,GREENE, P., BREEZE, R., FAHN, S., FREED, C., and EIDEL-BERG, D. (2002). Dyskinesia after fetal cell transplantation forparkinsonism: A PET study. Ann. Neurol. 52, 628–634.
MURAMATSU, S., FUJIMOTO, K., IKEGUCHI, K., SHIZUMA, N.,KAWASAKI, K., ONO, F., SHEN, Y., WANG, L., MIZUKAMI,H., KUME, A., MATSUMURA, M., NAGATSU, I., URANO, F.,ICHINOSE, H., NAGATSU, T., TERAO, K., NAKANO, I., andOZAWA, K. (2002). Behavioral recovery in a primate model ofParkinson’s disease by triple transduction of striatal cells with adeno-associated viral vectors expressing dopamine-synthesizing enzymes.Hum. Gene Ther. 13, 345–354.
REINHARD, J.F., SMITH, G.K., and NICHOL, C.A. (1986). A rapidand sensitive assay for tyrosine-3-monooxygenase based upon the
release of 3H2O and adsorption of [3H]-tyrosine by charcoal. LifeSci. 39, 2185–2189.
SCHULTZ, J.C., ADAMSON, J.S., WORKMAN, W.W., and NOR-MAN, T.D. (1963). Fatal liver disease after intravenous administra-tion of tetracycline in high dosage. N. Engl. J. Med. 269, 999.
STIEG, P.E., KIMMELBERG, H.K., MAZURKIEWICZ, J.E., andBANKER, G.A. (1980). Distribution of glial fibrillary acidic proteinand fibronectin in primary astroglial cultures from rat brain. BrainRes. 199, 493–500.
URLINGER, S., BARON, U., THELLMANN, M., HASAN, M.T., BU-JARD, H., and HILLEN, W. (2000). Exploring the sequence spacefor tetracycline-dependent transcriptional activators: Novel muta-tions yield expanded range and sensitivity. Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 97, 7963–7968.
VIGNA, E., CAVALIERI, S., AILLES, L., GEUNA, M., LOEW, R.,BUJARD, H., and NALDINI, L. (2002). Robust and efficient regu-lation of transgene expression in vivo by improved tetracycline-dependent lentiviral vectors. Mol. Ther. 5, 252–261.
YANCOPOULOS, G.D., DAVIS, S., GALE, N.W., RUDGE, J.S.,WIEGAND, S.J., and HOLASH, J. (2000). Vascular-specific growthfactors and blood vessel formation. Nature 407, 242–248.
ZENNOU, V., SERGUERA, C., SARKIS, C., COLIN, P., PERRET,E., MALLET, J., and CHARNEAU, P. (2001). The HIV-1 DNA Flapstimulates HIV vector mediated cell transduction in the brain. Nat.Biotechnol. 19, 446–450.
ZHU, Z., ZHENG, T., LEE, C.G., HOMER, R.J., and ELIAS, J.A.(2002). Tetracycline-controlled transcriptional regulation systems:Advances and application in transgenic animal modeling. Semin.Cell. Dev. Biol. 13, 121–128.
ZUFFEREY, R., DULL, T., MANDEL, R.J., BUKOVSKY, A.,QUIROZ, D., NALDINI, L., and TRONO, D. (1998). Self-inacti-vating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.J. Virol. 72, 9873–9880.
ZUFFEREY, R., DONELLO, J.E., TRONO, D., and HOPE, T.J.(1999). Woodchuck hepatitis virus posttrancriptional regulatory ele-ment enhances expression of transgenes delivered by retroviral vec-tors. J. Virol. 73, 2886–2892.
Address reprint requests to:Dr. Jacques Mallet
LGN/CNRS-UMR 7091, Bât. CERVIHôpital de la Pitié Salpêtrière
83 Boulevard de l’Hôpital75013 Paris, France
E-mail: [email protected]
Received for publication June 5, 2003; accepted after revisionDecember 31, 2003.
Published online: January 20, 2004.
HIV-1 VECTOR TRANSFERS REGULATABLE GENES 165
Control of small inhibitory RNA levels and RNAinterference by doxycycline induced activation ofa minimal RNA polymerase III promoterLahouari Amar, Mathieu Desclaux, Nicole Faucon-Biguet,
Jacques Mallet* and Roland Vogel
Laboratoire de la Genetique Moleculaire de la Neurotransmission et des Processus Neurodegeneratifs (LGN),CNRS-UMR 7091, Batiment CERVI, Hopital de la Pitie Salpetriere, 83 Boulevard de l’Hopital, 75013 Paris, France
Received September 21, 2005; Revised November 21, 2005; Accepted February 21, 2006
ABSTRACT
RNA interference (RNAi) mediated by expressionof short hairpin RNAs (shRNAs) is a powerful toolfor efficiently suppressing target genes. The appro-ach allows studies of the function of individual genesand may also be applied to human therapy. However,in many instances regulation of RNAi by administra-tion of a small inducer molecule will be required.To date, the development of appropriate regulatorysystems has been hampered by the few possibilitiesfor modification within RNA polymerase III promoterscapable of driving efficient expression of shRNAs.We have developed an inducible minimal RNA poly-merase III promoter that is activated by a novelrecombinant transactivator in the presence of doxy-cycline (Dox). The recombinant transactivator andthe engineered promoter together form a systempermitting regulation of RNAi by Dox-inducedexpression of shRNAs. Regulated RNAi was medi-ated by one single lentiviral vector, blocked theexpression of green fluorescent protein (GFP) in aGFP-expressing HEK 293T derived cell line and sup-pressed endogenous p53 in wild-type HEK 293T,MCF-7 and A549 cells. RNA interference was inducedin a dose- and time-dependent manner by admin-istration of Dox, silenced the expression of both targetgenes by 90% and was in particular reversible afterwithdrawal of Dox.
INTRODUCTION
The efficient and specific suppression of genes by RNAi (1)constitutes a valuable new tool to study the physiological role
of individual genes in vitro and in vivo. The method may alsobe applied to human therapy whenever genes involved in therespective pathology have to be inhibited. Silencing of geneexpression by RNAi may be induced in target cells by express-ing short hairpin RNAs (shRNAs) yielding small inhibitoryRNAs (siRNAs) after in situ cleavage (2). Since long poly Atails strongly interfere with the silencing effect (3), shRNAsare appropriately expressed by RNA polymerase III whichrecognizes a simple run of T residues as a stop signal andtherefore does not require a poly A sequence to terminatetranscription. As a consequence, respective RNA polymeraseIII promoters, such as the H1 promoter (4,5) or the U6 pro-moter (6–8), are widely used to drive the production ofshRNAs. Both the H1 and the U6 promoters are constitutivelyactive, and therefore shRNAs can be expressed in a largevariety of cells in order to study the consequences of the stableinhibition of target genes. However, constitutive gene silen-cing cannot be used in the context of transgenic ‘knock-down’animals when genes essential for cell survival, cell cycle regu-lation and cell development are analyzed. Such studies requireconditional gene silencing induced by administration or with-drawal of a small inducer molecule. Conditional suppressionof genes will also be important for therapeutic applications bypermitting termination of treatments at the onset of unwantedside effects.
Conditional RNAi can be obtained by expression ofshRNAs from a modified RNA polymerase III promoter allow-ing external control of its activity. A further requirement fordrug-induced transcriptional activity is the expression of aheterologous transcription factor that specifically interferes,in the presence or the absence of the inducer molecule,with the activity of the modified promoter but does not interactwith the genome of the host cell. Because of their simplestructural organization RNA polymerase III promoters offeronly a few possibilities for modification. The U6 promoter (9)is composed of a TATA box, a proximal (PSE) and a distal
*To whom correspondence should be addressed. Tel: +33 1 42 17 75 32; Fax: +33 1 42 17 75 33; Email: [email protected]
� The Author 2006. Published by Oxford University Press. All rights reserved.
The online version of this article has been published under an open access model. Users are entitled to use, reproduce, disseminate, or display the open accessversion of this article for non-commercial purposes provided that: the original authorship is properly and fully attributed; the Journal and Oxford University Pressare attributed as the original place of publication with the correct citation details given; if an article is subsequently reproduced or disseminated not in its entirety butonly in part or as a derivative work this must be clearly indicated. For commercial re-use, please contact [email protected]
Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 5 e37doi:10.1093/nar/gkl034
sequence element (DSE) that are each located at fixed dis-tances upstream from the transcription initiation site. Thespace between the individual elements are restricted, therebylimiting approaches based on steric interference with thetranscription initiation complex. Modifications may be appliedneither to the TATA box nor to the PSE since together theyform the essential core unit of the promoter recruiting thetranscription initiation complex.
In several studies (10–13) regulatory systems have beenproposed that employ RNA polymerase III promoter con-structs controlled by reversible steric inhibition of the forma-tion of the transcription initiation complex. However, Lin et al.observed severe leakiness when using these systems (14).Another recent attempt has been based on a Krab-Tet repressorfusion protein which allows Dox-controlled inhibition ofthe expression of shRNAs from a H1 promoter juxtaposedwith Tet-operon sequences (15). However, this approachmay be limited by secondary effects due to the inhibitoryactivity of Krab on both RNA polymerase II and RNA poly-merase III promoters over long distances (16). A third attempthas been based on the activation of an engineered U6 promoterby the recombinant transcription factor Gal4-Oct-2Q(Q!A)that constitutively binds to four Gal-4 binding sites replac-ing the DSE sequence in the promoter construct (17).The transcription factor Gal4-Oct-2Q(Q!A) comprises theDNA binding unit of the transactivator Gal-4 from yeastand an artificial transactivation domain referred to as theOct-2Q(Q!A) domain. This transactivation domain is com-posed of four copies of the peptide sequence Q18III(Q!A)comprising the amino acid residues 143 to 160 of the humantranscription factor Oct-2 in which all glutamine residues hadbeen changed to alanine. Regulated expression of the tran-scription factor Gal4-Oct-2Q(Q!A) under the control of theecdysone dependent regulatory system ultimately allowedregulated production of shRNAs from the engineered U6 pro-moter (18). However, the usefulness of this indirectly regu-lated expression of shRNAs is limited since three vectors werenecessary to mediate expression of all the componentsrequired.
In the present study, we set out to develop a regulatorysystem that (i) allows efficient regulation of RNAi, (ii) doesnot cause secondary effects and (iii) can be delivered to targetcells by one single lentiviral vector. We based our approachon a heterologous transactivator that conditionally binds inthe presence of a small inducer molecule to a minimal U6promoter thereby activating transcription of shRNAs. Weinvestigated whether the Oct-2Q(Q!A) domain can be con-ditionally and functionally linked to a minimal U6 promoterconstruct via the conditional DNA binding domain of thetransactivator rtTA2-M2 that derives from the Escherichiacoli Tet-repressor protein and mediates dimerization andDoxycycline (Dox)-induced binding to tet operator sequenceswith high affinity (19). We replaced the three minimal VP16-derived activation domains in rtTA2-M2 (20) by theOct-2Q(Q!A) domain. For conditional binding to an indu-cible minimal U6 promoter, the functional recognition sitesfor Staf and Oct-1 within the DSE of the human U6 promoter(21) were replaced by seven tet operator sequences. The modi-fied promoter and the engineered transcription factor werecapable of together forming a regulatory system allowingconditional RNAi by Dox-dependent expression of shRNAs.
The regulatory system was delivered to target cells by onesingle lentiviral vector.
MATERIALS AND METHODS
Plasmid constructions
The plasmids pUHR 10-3 and pUHRT 62-1, which containthe components of the Tet regulatory system, were kindlyprovided by H. Bujard (Zentrum fur Molekulare Biologie,Heidelberg, Germany). The plasmid pcDNA-D that allowsthe use of BbsI in subsequent cloning experiments was gen-erated by self-ligation of the vector fragment obtained byPstI digestion of the plasmid pcDNA 3 (Invitrogen, CergyPontoise, France). The core unit of the human U6 promoterthat did not contain the functional binding sites for the tran-scription factors Staf and Oct-1 (21) was amplified by PCRfrom genomic DNA of HEK293T cells. The oligonucleotides50-CGACGCGTTGCAGAGCTCGTTAGAGAGATAATTA-GAATTAATTTGACTGTAAACACAAAG-30 and 50-CGG-GATCCAGAAGACCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-GAT-30 (Eurogentec, Angers, France) were the sense andantisense primers respectively, and the DNA fragment amp-lified contained both a MluI and a SacI site upstream, and aBbsI and a BamHI site downstream from the truncatedU6 promoter. The fragment was inserted between the MluIand BamHI sites of pcDNA-D yielding the plasmid pcDNA-DU6t. A MluI–SacI fragment containing seven tet operatorsequences was amplified by PCR from pUHR 10-3 and inser-ted between the MluI and BamHI sites of pcDNA-DU6t togive pcDNA-DU6min. The DNA fragment encoding shRNAsdesigned to silence expression of green fluorescent protein(shGFP) was generated by annealing the oligonucleotides50-ACCGCAAGCTGACCCTGAAGTTCTTCAAGAGAGA-ACTTCAGGGTCAGCTTGCTTTTTCTCGAGG-30 and 50-GATCCCTCGAGAAAAAGCAAGCTGACCCTGAAGTT-CTCTCTTGAAGAACTTCAGGGTCAGCTTG-30. Anneal-ing of the oligonucleotides 50-ACCGACTCCAGTGGTAA-TCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTT-TTCTCGAGG-30 and 50-GATCCCTCGAGAAAAAGACT-CCAGTGGTAATCTACTCTCTTGAAGTAGATTACCAC-TGGAGT-30 yielded the DNA fragment encoding shRNAsdesigned to silence expression of p53 (shp53). Both DNAfragments encoding shRNAs were inserted into pcDNA-DU6min linearized by BbsI–BamHI digestion. The resultingplasmids were named pcDNA-DU6min-shGFP and pcDNA-DU6min-shp53, respectively.
An EcoRI–BamHI fragment encoding the conditional DNAbinding domain of rtTA2-M2 (19) was amplified by PCR frompUHRT 62-1 using the oligonucleotides 50-CGGAATTCAC-CATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAG-30 and 50-CG-GGATCCTGAAGACTACGGTCCGCCGCTTTCGCACTT-TAGCTGT-30 as the sense and antisense primers, respectively.Upstream from the BamHI site the fragment contained a stopcodon and a BbsI site allowing extension with a fragmentencoding additional amino acid residues. Insertion of the frag-ment between the EcoRI–BamHI sites of pcDNA-D yieldedthe plasmid pcDNA-D/rtTA2-M2trunc. The DNA fragmentcoding the peptide sequence Q18III(Q!A) was generatedby annealing the oligonucleotides 50-ACCGAACCTGTTCG-CTCTCCCCGCTGCAACAGCGGGAGCCCTACTGACAT-
e37 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 5 PAGE 2 OF 7
CAGCACCGTAGTCTTCG-30 and 50-GATCCGAAGACTA-CGGTGCTGATGTCAGTAGGGCTCCCGCTGTTGCAGC-GGGGAGAGCGAACAGGTT-30 and was inserted intopcDNA-D/rtTA2-M2trunc linearized by BbsI–BamHI diges-tion. The resulting plasmid contained again a stop codon anda BbsI site upstream from the BamHI site allowing furtherrounds of extension with the same fragment. Extension withthe fragment encoding Q18III(Q!A) was repeated three timesyielding the plasmid containing the rtTA2-Oct2 cDNA. Thesequence encoding rtTA2-Oct2 was recovered by EcoRI–BamHI digestion and inserted into pD500rtTA2-M2-WPRE(22) from which rtTA2-M2 had been removed by EcoRI–BamHI digestion. A SalI–EcoRI fragment containing thephosphoglyerate kinase (PGK) promoter was amplified byPCR and inserted between the SalI–EcoRI sites upstreamfrom rtTA2-Oct2 yielding pD500PGK-rtTA2-Oct2-WPRE.
The cassettes allowing shRNA expression were recoveredfrom pcDNA-DU6min-shGFP and pcDNA-DU6min-shp53by MluI–SpeI digestion and inserted into the lentivectorprecursor plasmid pTrip-CMVmin-WPRE (22) from whichthe element CMVmin had been removed by MluI–SpeI diges-tion. The WPRE sequence was removed from the resultingplasmids (pTrip-U6min-shGFP-WPRE and pTrip-U6min-shp53-WPRE) by SpeI–KpnI digestion and replaced by thertTA2-Oct2 expression cassette recovered from pD500PGK-rtTA2-Oct2-WPRE by NheI–KpnI digestion. The resultingplasmids, pTrip-U6min-shGFP-PGK-rtTA2-Oct2-WPRE andpTrip-U6min-shp53-PGK-rtTA2-Oct2-WPRE, were used forthe production of lentivirus vector particles.
The DNA fragment encoding the riboprobe for the detectionof the GFP silencing siRNAs was generated by annealing theoligonucleotides 50-GATCCGCAAGCTGACCCTGAAGTT-CTTCAAGAGAGAACG-30 and 50-AATTCGTTCTCTCTT-GAAGAACTTCAGGGTCAGCTTGCG-30 and was insertedbetween the BamHI–EcoRI sites of pcDNA 3. All plasmidconstructs were verified by sequencing using a ABI-PRISM13100 DNA sequencer (Applied Biosystems, Courtabeuf,France).
Cell culture, lentiviral transductions andselection of transduced cells
The HEK 293T, MCF-7 and A549 cell lines were cultivatedat 37�C under a humidified atmosphere of 5% CO2 / 95% airin DMEM supplemented with 10% fetal calf serum (FCS),20 U/ml penicillin G and 20 mg/ml streptomycin sulfate.Lentivirus vector particles were produced by transient cotrans-fection of HEK 293T cells by the vector plasmid, an encap-sidation plasmid (p8.7), and a VSV expression plasmid(pHCMV-G) as described (23). Vector stocks were titeredby determination of the amount of the p24 capsid proteinusing an HIV-1 core profile enzyme linked immunosorbentassay (ELISA) (Beckman Coulter, Roissy, France). For trans-duction HEK 293T GFP cells were incubated overnight withvector in the presence of 10 mg/ml DEAE dextran (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, France). Transduced cellswere selected after 5 days of cultivation in the presence of6 mg/ml Dox using a FACSVantage SE cell-sorting instru-ment (Becton Dickinson, Rungis, France). Selected cloneswere expanded and analyzed by fluorescence microscopyand FACS.
Northern blot analysis
A 32P-labeled riboprobe was transcribed from the plas-mid encoding the riboprobe using [a-32P]ATP (AmershamBiosciences, Orsay, France) and the Riboprobe System–T7(Promega, Charbonnieres, France). Small RNAs were isolatedfrom aliquots of 107 cells with the mirVana� PARIS� Kit(Ambion, Huntingdon, UK). Samples containing 3.3 mgof small RNAs were denatured by heating at 95�C for 5min in the presence of 50% formamide. After electrophoresison a 15% polyacrylamide gel in the presence of 8 M urea theRNA was stained with ethidium bromide and examined on atransilluminator. The RNA was then transferred byelectroblotting to a BrightStar-Plus Nylon membrane(Ambion), fixed by ultraviolet (UV) crosslinking and hybrid-ized to the probe. The resulting 32P-labeled RNA–RNAhybrids were detected by autoradiography using Hyperfilm�MP (Amersham Biosciences).
Western blot analysis
Cell extracts were prepared in lysis buffer [25 mM Tris–HCl(pH 7.5), 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate,5 mM EDTA, 150 mM NaCl] containing a cocktail of proteaseinhibitors (Roche, Meylan, France). The protein samples(30 mg) were separated on SDS–9% polyacrylamide gelsand then transferred to Protan nitrocellulose membranes(Schleicher and Schuell, Dassel, Germany) in an electroblot-ting apparatus, using standard procedures (24). Immunodetec-tion was performed as described previously (25), using amonoclonal anti-p53 antibody (BD Biosciences, Erembode-gem, Belgium), a monoclonal anti-actin antibody (Chemicon,Hampshire, UK) and an anti-mouse Ig-horseradish peroxidase(HRP) conjugate (Amersham Biosciences).
RESULTS AND DISCUSSION
To achieve regulated RNAi, we engineered a novel Tet-dependent transactivator (Figure 1A) by linking the condi-tional DNA binding domain of the tetracycline-dependenttransactivator rtTA2-M2 (19) to the Oct-2Q(Q!A) domain(17) which is capable of specifically activating a minimalU6 promoter (Figure 1A). An inducible minimal U6 promoterwas constructed by replacing the functional binding sites (21)for the transcription factors Staf-1 and Oct-1 within the DSEby seven tet operator sequences (Figure 1B). In the absenceof Dox the recombinant Tet-dependent transactivator willnot bind to the minimal U6 promoter (Figure 1C) and as aconsequence the shRNA coding sequence will not be tran-scribed. In contrast, the Tet-dependent transactivator willbind to the minimal U6 promoter in the presence of Dox(Figure 1D), thereby activating the expression of shRNAs.
As a delivery system we designed a single lentivirus vectorby inserting two expression cassettes into its backbone(Figure 2A). The first cassette contained the minimal U6promoter and was used to produce shRNAs. The second cas-sette was employed to express the engineered transcriptionfactor rtTA2-Oct2 composed of the conditional DNA bind-ing domain of rtTA2-M2 and the Oct-2Q(Q!A) activationdomain. The transcription factor was constitutively tran-scribed from the PGK promoter; and the polyA sequence ofthe vector in the 30 long terminal repeat (LTR) was used for
PAGE 3 OF 7 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 5 e37
polyadenylation. The vector contained a WPRE sequence (26)to enhance the expression of rtTA2-Oct2 and to stabilizethe RNA genome of the vector during the production of vectorparticles in transiently transfected HEK 293T cells. A Flapsequence was also included to improve transduction ofnon-dividing cells (23). For safety reasons the U3 promoterregion was deleted from the 30 LTR so that the vector wasself-inactivating (27).
A first vector contained a shRNA encoding sequence whichwas designed to silence the expression of GFP as described (5).A HEK 293T GFP cell-clone that stably expresses GFP as atransgene was transduced with the vector construct. Cells werecultivated in the presence and absence of Dox (6 mg/ml) priorto isolating small RNAs from the cultures as well as fromcontrols (non-transduced HEK 293T GFP cells). ‘NorthernBlot’ analysis of the RNA samples revealed that siRNAsdesigned to silence GFP were expressed in transduced cellscultivated in the presence of Dox (Figure 2B). The siRNAswere not detected in non-transduced cells. In transducedcells cultivated without Dox no signal exceeding the detectionthreshold was observed. ‘Northern Blotting’ did not allowdetection of shRNAs probably because of their rapid cleavageinto siRNAs by Dicer nuclease.
Subsequently, HEK 293T GFP cells were transduced withvarious amounts of vector and incubated in the presence andabsence of Dox (6 mg/ml). Incubation with Dox reducedthe number of GFP-expressing cells by up to 60% as wasdetermined by FACS analysis (Figure 2C). The decrease inGFP-positive cells correlated with the amount of vectorapplied. The number of GFP-positive cells among transducedcells incubated in the absence of Dox was 10–15% lower thanamong non-transduced cells. This difference also correlatedwith the amount of vector applied and may have been caused
Figure 1. Schematic diagrams illustrating the regulatory system allowing Dox-induced RNAi. (A) Primary structure of the transactivator rtTA-Oct2 composed of theconditional DNA binding domain of rtTA2-M2, and the Oct-2Q(Q!A) domain mediating specific induction of a minimal RNA polymerase III promoter (17). (B)Structure of the minimal U6 promoter: The 202 bp sequence upstream from the transcription start site was derived from the human U6 promoter and contains the PSEand the TATA box. Upstream from this sequence, seven tet operator sequences (tetOs) have been inserted to allow conditional binding of the transactivator. (C) In theabsence of Dox (off state), rtTA-Oct2 does not bind to the operator sequences and hence shRNAs are not synthesized. (D) In the presence of Dox (on state), thetransactivator binds and thereby activates the expression of shRNAs designed to induce the degradation of the respective target mRNAs.
Figure 2. A single lentiviral vector mediates Dox-regulated RNAi. (A) Designof the vector: LTR, y and Flap are sequences derived from HIV-1 (the LTRs,the packaging sequence and the central Flap element, respectively). P U6 min andP PGK are the Tet-regulated minimal U6 promoter and the phosphoglyceratekinase promoter; WPRE is the Woodchuck hepatitis virus responsive element;rtTA-Oct2, the cDNA encoding the transcription factor rTA-Oct2; and shRNA,the sequence encoding shRNAs. (B and C) Experimental validation of regu-lated RNAi using a vector that expresses shRNAs designed to silence theexpression of GFP. (B) ‘Northern blot’ analysis of Dox-regulated expressionof siRNAs from the vector. HEK 293T GFP cells (1 · 105) were incubated for24 h with and without vector corresponding to 141 ng of protein p24, andcultivated in the presence and absence of 6 mg/ml Dox for 7 days. Then, smallRNAs were isolated from the cells and probed for siRNAs designed to silencethe expression of GFP. 5S-rRNA detected by ethidium bromide staining of thepolyacrylamide gel served as an internal control to show equal loading. (C)Experimental validation of RNAi-mediated silencing of GFP. HEK 293T GFPcells (8 · 104) were incubated overnight with various quantities of vectorexpressed as ng of protein p24, and cultivated in the absence (grey bars)and in the presence (white bars) of 6 mg/ml Dox for 5 days prior to FACSanalysis. Values are averages of percentages of GFP-positive cells ± SE,n ¼ 3.
e37 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 5 PAGE 4 OF 7
by leakage expression of shRNAs in cells containing multiplecopies of the vector genome.
To establish uniform conditions for precise characterizationof the regulatory system, cell clones were amplified from indi-vidual transduced cells. Several clones were obtained thatdisplayed Dox-regulated expression of GFP (see Supplement-ary Table). Fluorescence microscopy of a representative clone(C9) demonstrated that GFP was only expressed in the absenceof Dox (Figure 3A). We then used FACS analysis to study theeffect of Dox on the expression of GFP. The addition of Doxto the cells was followed by a significant decrease in GFPfluorescence within 24 h; after 5–6 days the reduction ofGFP fluorescence was 90% (Figure 3B). In the absence ofDox there was no change in GFP fluorescence during theincubation. To determine the minimal concentration of Doxrequired to induce RNAi, cells of the clone C9 were incubatedwith various concentrations of Dox (Figure 3C). A concentra-tion of 6 mg/ml was required to induce a 90% suppression ofGFP within 5 days. Lower concentrations of Dox were eitherineffective or caused incomplete or delayed RNAi. To testinducible RNAi for reversibility, cells of the clone C9 werecultivated for 5 days in the presence of Dox. Then Dox wasremoved, and the expression of GFP was followed. GFP
fluorescence had increased significantly 48 h after the removalof Dox (Figure 3D); however, incubation without Dox for5–6 days was required to restore maximal expression ofGFP. No increase in GFP fluorescence was detected in cellsincubated with Dox throughout the experiment.
The next step was to investigate whether the regulationsystem can be employed for the silencing of other targetgenes. As a target we chose the p53 gene because of detectableexpression in mammalian cells, availability of reliable anti-bodies to monitor levels of the protein, and the existence of anefficient shRNA (2). Moreover, in a recent study genetic dele-tion of p53 suppressed neurodegeneration in animal modelsof Huntington’s disease (28). Thus, local and regulated down-regulation of p53 may potentially constitute a novel genetherapy approach for the treatment of Huntington diseasepatients. We constructed a second vector, which containeda shRNA encoding sequence designed to silence expressionof human p53 as described (2). HEK 293T cells, MCF-7 cellsand A549 cells were transduced with various amounts of vec-tor and incubated in the presence and absence of Dox (6 mg/ml)for 5–7 days before protein was extracted from the cultures aswell as from non-tansduced controls. ‘Western blot’ analysisof protein samples containing identical amounts of protein
Figure 3. Characterization of Dox-regulated RNAi in a representative cell-clone (C9): (A) Microscopic analysis of cells incubated in the presence or in the absence of6 mg/ml Dox at 72 h after induction. (B) Time course of Dox-induced RNAi: RNAi was induced or not induced at day 0 by administration of 6 mg/ml Dox and meanintensities of GFP fluorescence were measured by FACS analysis at various times after induction. Closed triangles represent intensities of cells incubated with Dox,open triangles give those of untreated cells. The fluorescence intensity observed at day 0 was defined as 100%, values are means ± SE, n ¼ 3. (C) Mean intensities(± SE, n ¼ 3) of GFP fluorescence obtained by FACS analysis of cells cultivated for 5 days in the presence of various concentrations of Dox. The fluorescenceintensity in untreated cells was defined as 100%. (D) Reappearance of GFP fluorescence after withdrawal of Dox: prior to the analysis, cells were cultivated for 5 daysin the presence of 6 mg/ml Dox. At day 0, Dox was withdrawn or not withdrawn and the mean fluorescence intensity was followed by FACS analysis. Closedrhomboids represent values from cells that were not treated with Dox from day 0, open rhomboids give values from cells incubated with 6 mg/ml Dox throughout theexperiment. The fluorescence intensity measured 8 days after removal of Dox was defined as 100%, values are means ± SE, n ¼ 3.
PAGE 5 OF 7 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 5 e37
revealed that p53 levels were efficiently reduced when trans-duced cells were incubated in the presence of Dox (Figure 4).An up to 90% inhibition of the expression of p53 was observedin Dox treated cultures of transduced cells as assessed bydensitometric analysis of the Blot data. No down-regulationof p53, or at best some minimal silencing because of leakageexpression of shRNAs, was obtained when transduced cellswere cultivated in the absence of Dox. The expression of p53was not reduced when non-transduced cells were incubatedin the presence of Dox (6 mg/ml).
Considered together, our findings indicate that the engin-eered minimal U6 promoter was conditionally reactivatedby Dox-controlled binding of rtTA2-Oct2 containing theOct-2Q(Q!A) domain for transactivation. The minimal U6promoter and the recombinant transcription factor togetherformed a regulatory system allowing conditional RNAi byDox-controlled production of shRNAs. In particular, the sys-tem allowed the expression of the reporter transgene GFPas well as the expression of the endogenous gene p53 to berendered under external regulation by means of administrationof Dox. To fully induce RNAi a Dox concentration of 6 mg/mlwas necessary which is more than 10-fold the concentrationrequired to activate a minimal (cytomegalovirus) CMV pro-moter by the transactivator rtTA2-M2 (19). Indeed, theresponsiveness to Dox was similar to that of the Tet-dependent regulatory system which, by using rtTA as a trans-activator, requires a Dox concentration of 1 mg/ml to inducethe expression of transgenes in vitro (29). That system wassuccessfully applied in the context of transgenic mice (30).Taken into account that an at least 70% induction of RNAiwas already observed in the presence of 1 mg/ml of Dox(Figure 3C), the regulation system presented here holds prom-ise to be also applicable to animal studies. However, furtherstudies using transgenic mice are required to examine theefficiency of Dox-regulated RNAi in vivo.
Nevertheless the finding that 6 mg/ml of Dox are necessaryto fully induce RNAi in cultured cells is an unexpected result.It may be caused by the Oct-2Q(Q!A) transactivationdomain which may affect the affinity for Dox by interferencewith either the accessibility or the structure of the Dox bindingsite. Secondary intramolecular effects of the transactivation
domain on characteristics of the conditional DNA bindingdomain can in particular not be ruled out because of the overallhydrophobicity of the Oct-2Q(Q!A) domain.
The Oct-2Q(Q!A) domain is composed of four copies ofthe peptide sequence Q18III(Q!A) which comprises 18 aminoacid residues (17). Fourteen out of the 18 amino acid resi-dues are non-polar and hydrophobic. Four amino acid residuesare polar, and charged amino acid side chains are lacking(Figure 1A). Because of these characteristics the Oct-2Q(Q!A) domain probably forms a hydrophobic patchwhich facilitates the formation of the transcription initiationcomplex after binding in a correct steric orientation to theminimal U6 promoter. The peptide sequence Q18III(Q!A)corresponds to the amino acid residues 143 to 160 of thehuman transcription factor Oct-2 in which all glutamine resi-dues have been changed to alanine. Since the mutationschange 6 amino acid residues out of 18, the Q18III(Q!A)sequence may almost be considered as an individual syntheticpeptide sequence. In particular, it is noteworthy that the Q!Amutations remove the capacity of transactivating RNA poly-merase II promoters (17). For this reason and because weuse the weak PGK promoter to drive expression of the trans-activator, the regulatory system reported in the present studyshould not cause secondary effects by transactivation of pro-moters in the vicinity of the vector integration site.
The regulatory system that we developed requires expres-sion of only one heterologous transactivator and can thereforebe delivered to target cells by one single lentiviral vector. Itis by far more complicated to establish conditional RNAi byecdysone-regulated expression of the Gal4-Oct-2Q(Q!A)transcription factor that in turn activates a minimal U6 pro-moter construct by constitutive binding. This indirect regulat-ory approach required expression of additional heterologuoscomponents, and as a consequence three vectors were neces-sary to deliver regulated RNAi to target cells (18). The deliv-ery of our regulatory system by one single lentiviral vectorwill significantly facilitate the application of conditional RNAiin many instances.
In summary, we have developed a regulatory system allow-ing Dox-controlled expression of shRNAs and demonstratedinducible, reversible and stable RNAi in mammalian cells.
Figure 4. ‘Western blot’ analysis demonstrating silencing of p53 by Dox-regulated RNAi in (A) HEK 293T cells, (B) MCF-7 cells and (C) A549 cells. Cells (1 · 105)were incubated overnight with indicated quantities of vector, expressed as ng of protein p24, and then cultivated in the absence and in the presence of 6 mg/ml Dox.After a 5 day (MCF-7 and A549 cells) and a 7 day cultivation (HEK 293T cells), protein was extracted from the cells and analyzed by immunoblotting. Both p53 andactin were detected; the latter served as a control to demonstrate equal loading.
e37 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 5 PAGE 6 OF 7
The system may allow the expression of any gene to be ren-dered under external control by means of administration ofDox. Inducible RNAi will find applications in genetic studiesusing transgenic animals and will also open the door for novelgene therapy approaches such as the treatment of Huntington’sdisease by local and regulated silencing of p53.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors are grateful to Murielle Hurion for technical assis-tance and to Christophe Parizot (INSERM U 543) for helpwith the cell-sorting instrument. The authors are also gratefulto Hermann Bujard for providing the plasmids pUHR 10-3 andpUHRT 62-1. The authors thank ‘la Delegation Generale pourl’Armement (DGA)’ for supporting this work through a fellow-ship to L.A. The authors also thank ‘l’Universite Paris VI(Pierre et Marie Curie)’, ‘l’Association francaise contre lesmyopathies (AFM)’ and ‘Retina France’ for financial supportof this work. Funding to pay the Open Access publicationcharges for this article was provided by the Centre Nationalde la Recherche Scientifique (CNRS).
Conflict of interest statement. None declared.
REFERENCES
1. Hannon,G.J. (2002) RNA interference. Nature, 418, 244–251.2. Brummelkamp,T.R., Bernards,R. and Agami,R. (2002) A system for
stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.Science, 296, 550–553.
3. Xia,H., Mao,Q., Paulson,H.L.and Davidson,B.L. (2002) siRNA mediatedgene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol., 20, 1006–1010.
4. Abbas-Terki,T., Blanco-Bose,W., Deglon,N., Pralong,W. andAebischer,P. (2002) Lentiviral-mediated RNA interference.Hum. Gene Ther., 13, 2197–2201.
5. Tiscornia,G., Singer,O., Ikawa,M. and Verma,I.M. (2003) A generalmethod for gene knockdown in mice by using lentiviral vectors expressingsmall interfering RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 100,1844–1848.
6. Qin,X.-F., An,D.S., Chen,I.S.Y. and Baltimore,D. (2003)Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral mediateddelivery of small interfering RNA against CCR5. Proc. Natl Acad. Sci.USA, 100, 183–184.
7. Rubinson,D.A., Dillon,C.P., Kwiatkowski,A.V., Sievers,C., Yang,L.,Kopinja,J., Zhang,M., McManus,M.T., Gertler,F.B., Scott,F.B. et al.(2003) A lentivirus-based system to functionally silencegenes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice byRNA interference. Nature Genet., 33, 401–406.
8. Stewart,S.A., Dykxhoorn,D.M., Palliser,D., Mizuno,H., Yu,E.Y.,An,D.S., Sabatini,D.M., Chen,I.S.Y., Hahn,W.C., Sharp,P.A.et al. (2003)Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.RNA, 9, 493–501.
9. Schramm,L. and Hernandez,N. (2002) Recruitment of RNA polymeraseIII to its target promoters. Genes Dev., 16, 2593–2620.
10. van de Wetering,M., Oving,I., Muncan,V., Pon Fong,M.T., Brantjes,H.,van Leenen,D., Holstege,F.C.P., Brummelkamp,T.R., Agami,R. andClevers,H. (2003) Specific inhibition of gene expressionusing a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.EMBO rep., 4, 609–615.
11. Czauderna,F., Santel,A., Hinz,M., Fechtner,M., Durieux,B., Fisch,G.,Leenders,F., Arnold,W., Giese,K., Klippel,A. et al. (2003) Inducible
shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.Nucleic Acids Res., 31, e127.
12. Matsukura,S., Jones,P.A. and Takai,D. (2003) Establishment ofconditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.Nucleic Acids Res., 31, e77.
13. Hosono,T., Mizuguchi,H., Katayama,K., Xu,Z.-L., Sakurai,F.,Ishi-Watabe,A., Kawabata,K., Yamaguchi,T., Nakagawa,S.,Mayumi,T. et al. (2004) Adenovirus mediated Doxycycline inducibleRNA interference. Hum. Gene Ther., 15, 813–819.
14. Lin,X., Yang,J., Chen,J., Gunasekera,A., Fesik,S.W. and Shen,Y. (2004)Development of a tightly regulated U6 promoter for shRNA expression.FEBS Lett., 577, 376–380.
15. Wiznerowicz,M. and Trono,D. (2003) Conditional suppression of cellulargenes: Lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J.Virol., 77, 8975–8961.
16. Moosmann,P., Georgiev,O., Thiesen,H.-J., Hagmann,M. andSchaffner,W. (1997) Silencing of RNA polymerase II and III-dependenttranscription by the Krab protein domain of Kox1, a Kruppel-type zincfinger factor. Biol. Chem., 378, 669–677.
17. Das,G., Hinkley,C.S. and Herr,W. (1995) Basal promoter elements as aselective determinant of transcriptional activator function.Nature, 374, 657–660.
18. Gupta,S., Schoer,R.A., Egan,J.E., Hannon,G.J. and Mittal,V. (2004)Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells.Proc. Natl Acad. Sci. USA, 101, 1927–1932.
19. Urlinger,S., Baron,U., Thellmann,M., Hasan,M.T., Bujard,H. andHillen,W. (2000) Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expandedrange and sensitivity. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 7963–7968.
20. Baron,U., Gossen,M. and Bujard,H. (1997) Tetracycline-controlledtranscription in eukaryotes: novel transactivators with gradedtransactivation potential. Nucleic Acids Res., 25, 2723–2729.
21. Danzeiser,D.A., Urso,O. and Kunkel,G.R. (1993) Functionalcharacterization of elements in a human U6 smallnuclear RNA gene distal control region. Mol. Cell. Biol., 13,4670–4678.
22. Vogel,R., Amar,L., Do Thi,A., Saillour,P. and Mallet,J. (2004) A singlelentivirus vector mediates doxycycline-regulated expression oftransgenes in the brain. Hum. Gene Ther., 15, 157–165.
23. Zennou,V., Serguera,C., Sarkis,C., Colin,P., Perret,E., Mallet,J. andCharneau,P. (2001) The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector mediatedcell transduction in the brain. Nat. Biotechnol., 19, 446–450.
24. Towbin,H., Staehelin,T. and Gordon,J. (1979) Electrophoretic transfer ofproteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applications. Biotechnology, 24, 145–149.
25. Tejedor-Real,P., Vogel,R., Mallet,J. and Faucon-Biguet,N. (2005) Gi/Goprotein-dependent presynaptic mechanisms are involved in clozapineinduced down-regulation of tyrosine hydroxylase in PC 12 cells.J. Neurosci. Res., 81, 739–745.
26. Zufferey,R., Donello,J.E., Trono,D. and Hope,T.J. (1999) Woodchuckhepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhancesexpression of transgenes delivered by retroviral vectors. J. Virol., 73,2886–2892.
27. Zufferey,R., Dull,T., Mandel,R.J., Bukovsky,A., Quiroz,D., Naldini,L.and Trono,D. (1998) Self-inactivating lentivirus vector for safe andefficient in vivo gene delivery. J. Virol., 72, 9873–9880.
28. Bae,B.-I., Xu,H., Igarashi,S., Fujimuro,M., Agrawal,N., Taya,Y.,Hayward,S.D., Moran,T.H., Montell,C., Ross,C.A. et al. (2005) p53mediates cellular dysfunction and behavioural abnormalities inHuntington’s disease. Neuron, 47, 29–41.
29. Gossen,M., Freundlieb,S., Bender,G., Muller,G., Hillen,W. andBujard,H. (1995) Transcriptional activation by tetracyclines inmammalian cells. Science, 268, 1766–1769.
30. Kistner,A., Gossen,M., Zimmermann,F., Jerecic,J., Ullmer,C.,Lubbert,H. and Bujard,H. (1996) Doxycycline-mediated quantitative andtissue-specific control of gene expression in transgenic mice.Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 10933–10938.
PAGE 7 OF 7 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 5 e37
La thérapie génique est envisagée pour le traitement de nombreuses maladies du
système nerveux. Le transfert de gène peut être utilisé pour compenser l’absence ou le
dysfonctionnement d’un gène déficient, coder une protéine thérapeutique, ou inhiber un
gène par ARN interférence. L’utilisation de vecteurs lentiviraux pour transférer un gène
thérapeutique, est une approche prometteuse pour de futures applications thérapeutiques.
Cependant, pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs, il est nécessaire de contrôler
l’expression des gènes thérapeutiques. Ceci permettra d’adapter le traitement aux besoins
du patient ou de l’arrêter en cas de complications graves. Dans ce contexte, mon travail a
porté sur la mise au point de systèmes de régulation de l’expression de gènes thérapeutiques
inductibles par la tétracycline (Tet-on) au sein d’un seul vecteur lentiviral.
Dans une première approche, le système Tet-on a été incorporé au sein d’un vecteur
lentiviral unique. Des vecteurs codant la luciférase et la tyrosine hydroxylase (TH) ont été
produits et caractérisés in vitro et in vivo. Ces vecteurs ont permis d’exprimer de façon
régulée les transgènes avec une expression induite d’un facteur 100 en présence de
doxycycline. Le vecteur TH inductible a été par la suite validé dans un modèle de rat de la
maladie de Parkinson pour démontrer son efficacité et la possibilité de réguler un gène
thérapeutique in vivo.
Le deuxième volet de mon travail a porté sur le développement d’un système
inductible d’expression des shARN utilisant un nouveau transactivateur dépendant de la
doxycycline capable d’induire la transcription de shARN à partir d’un promoteur d’ARN
polymérase III minimal. Après intégration dans un vecteur lentiviral, ce système a permis
de contrôler efficacement et de manière réversible l’expression de la GFP et de la protéine
p53 in vitro. En présence de doxycycline, une extinction de 90 % de l’expression des deux
gènes cibles a été obtenue. Cette expression a été réinduite après retrait de la doxycycline.
L’efficacité de ce système est dépendante de la dose et du temps de traitement avec la
doxycycline.
L’intégration de systèmes de régulations efficaces au sein d’un vecteur lentiviral
unique constitue une étape cruciale pour une utilisation sécurisée de ces vecteurs en
thérapeutique humaine.
Top Related