KIT ELISA RABIES PUSVETMA
Petri Nandatina Saputri
1, Dyah Estikoma
1, Nur Sholichah
1
1. Pusat Veteriner Farma, Jalan. A. Yani 68 – 70 Surabaya
ABSTRACT
Rabies is a viral disease that caused by virus neurotropic genus Lyssavirus family
Rhabdoviridae, it is a major zoonosis for which diagnostic techniques have been
standardized internationally. Antibody detection can be tested with mouse serum
neutralization test (MNT), rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) or enzyme
linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA was used in this research in order to
increase quality and to validate the method which used in KIT that produced by
PUSVETMA. As a result, there are some alteration on conjugate dilution which is
16000 times, dilution of positive control, negative control and 1 EU/ml sera standar
which is 1:100.
Keywords: ELISA, Rabies, Pusvetma, Viral diseases
PENDAHULUAN
Rabies disebabkan oleh virus neurotropic genus Lyssavirus family Rhabdoviridae
dan dapat ditularkan dari hewan ke hewan dan dari hewan ke manusia melalui
gigitan. Karena bersifat zoonosis, maka semua material yang dicurigai terinfeksi
harus ditangani dengan memperhatikan aspek keamanan sesuai dengan spesifikasi
WHO (WHO, 1996).
Vaksinasi merupakan tindakan pencegahan yang efektif dalam mengurangi
kejadian rabies. Hasil vaksinasi Rabies harus memenuhi standar kebutuhan minimal
sesuai dengan acuan OIE, yaitu sama atau lebih besar dari 0,5 Equivalent Unit (EU).
(Hooper et al, 1998, WHO Expert Committee in Biological standards, 1985).
Antibody netralisasi diyakini merupakan komponen utama dari respon imun
melawan virus rabies. Gold standar uji adalah virus netralisasi. Pemeriksaan zat
kebal (Antibodi) pada serum dapat dilakukan dengan cara Mouse Netralization
(MN), Rapid Fluorecent Focus Inhibition Test (RFFIT) dan Enzyme Linked
Immunosorbent Assays (ELISA) atau cara immunoenzimatik lainnya.
ELISA merupakan salah satu uji untuk mendeteksi antibodi yang sangat berguna
terkait dengan survey epidemiologi dalam populasi besar (Xu et al 2007). Pada saat
ini, indirect ELISA telah dikembangkan sehingga didapatkan hasil yang relative
cepat dan tidak memerlukan fasilitas laboratorium pendukung yang rumit, seperti
fasilitas tissue culture, kandang hewan coba. Kit Indirect ELISA dikembangkan
dengan menggunakan virus utuh (Whole Virus) virus rabies strain Pasteur 35321 (PV
35321). Pada beberapa sampel, penggunaan indirect ELISA memperlihatkan hasil
yang sensitifitas dan spesifisitasnya sama dengan VN tes. ( Servat et al, 2007).
Kajian tentang efikasi vaksinasi rabies menggunakan metode ELISA dan Fluorescent
Antibody Virus Neuralization (FAVN) telah dilakukan oleh Hostnik et al., (2006).
Sebelum digunakan, Spesifisitas dan sensitivitas uji ini harus dikonfirmasikan
terlebih dahulu.Uji ELISA ini sering kali juga dikombinasikan dengan tes konfirmasi
lain seperti FAT atau virus isolasi.
Dalam perjalanan produksinya Kit ELISA Rabies PUSVETMA telah mendapat
perhatian dalam skala nasional dan internasional. Guna meningkatkan mutu dan
kualitas Kit ini telah dilakukan Penelitian dan Pengembangan metode bekerjasama
dengan DAFF Australia dalam hal ini AAHL-CSIRO pada kerangka proyek AIP-
EID. Untuk validasi metode juga bekerjasama dengan BPPV Regional II Bukittinggi
selaku lab referens Rabies di Indonesia. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk
mengkaji Kit ELISA Rabies dalam upaya peningkatan mutu dan pengembangan
metode Kit ELISA RABIES di PUSVEMA
METODE
Peralatan yang digunakan, 2 buah Mikroplat 96 well tercoating dengan antigen
rabies. (mikroplat stabil 2 minggu setelah sachet dibuka), Elisa Reader, Elisa
Washer, Vorteks/stirrer, Mikro pipet volume ≤ 10 µl, 50 µl, 300 µl, dan 1000 µl,
Freezer, Refrigerator, Mikroplate, Inkubator 37°C, 2 buah Plastik adsorben, Pereaksi
yang digunakan, 100 µl Kontrol positif serum anjing mengandung antibody rabies dan Thimerosal 0,01% dengan konsentrasi 4 EU, 100 µl Kontrol negatif serum anjing yang negatif antibodi rabies, 100 µl Serum Standar 1 EU/ml, 20 µl Konjugat Peroksidase-rec-protein A, larutan stabil 2 jam setelah dilarutkan, 30 ml Larutan ABTS siap digunakan dan sudah mengandung H2O2, PBST Konsentrat 10X. Digunakan sebagai pelarut Kontrol Positif, Kontrol Negatif, Konjugat, sampel dan proses pencucian, larutan stabil selama 1 bulan setelah dilarutkan, 30 ml Larutan stopper. Tempat penelitian dilakukan di Pusat Veterinaria Farma Surabaya – Jawa Timur – Indonesia, BPPV Regional II Bukittinggi – Sumatera Barat – Indonesia, AAHL – CSIRO – Geelong – Australia.
Pembuatan pereaksi, Pengenceran PBS-T 1 kali dengan cara pengenceran, yaitu
PBST konsentrat 50 ml ditambah aquades 450 ml. Pengenceran Kontrol Positif
dilakukan pengenceran seperti diagram dibawah ini, gunakan vortex/mixer untuk
menghomogenkan (Gambar 1)
Gambar 1. Teknik pengenceran PBS-T satu kali
Protokol pengerjaan, Dilakukan pengenceran 10µl Kontrol positif ke dalam 990
µl PBST sebagai K 4 EU dan homogenkan, dilakukan seperti Gambar 1.
Ditambahkan 500 µl K 4 EU ke 500µl PBST sebagai K 2 EU. Ditambahkan 500µl
K 2 EU ke 500µl PBST sebagai K 1 EU. Dilakukan pengenceran yang sama untuk
K 0,5 EU: K 0,25 EU: dan K 0,125 EU, Dilakukan penjagaan jangan menyentuh
cairan dan selalu mengganti fintip pada pengenceran berikutnya.
K Pos
10µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl
PBST 990 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl
K 4 EU K 2 EU K 1 EU K 0,5 EU K 0,25 EU K 0,125 EU
Kontrol ST 1 EU
Encerkan2,5 µl Kontrol ST 1 EU kedalam 247,5 µl
PBST dan homogenkan
Kontrol Negatif
Encerkan 2,5 µl Kontrol Negatif kedalam 247,5 µl PBST
dan homogenkan, Pada sumuran H11 – H12 sebagai
blank, tambahkan diisi PBST 100 µl
Sampel
Encerkan 2,5 µl kedalam 247,5 µl PBST
dan homogenkan
Konjugat Protein A
Encerkan 16.000 x
Encerkan 2 µl ke dalam 30 ml PBST
dan homogenkan
Protokol, Serum Kontrol Positif K 4 EU, K 2 EU , K 1 EU, K 0,5 EU, K 0,25
EU dan K 0,125 EU; serum kontrol ST 1 EU, serum kontrol negatif dan serum
sampel yang sudah diencerkan ke dalam sumur mikroplate sebanyak 100 µl (duplo)
sesuai urutan. Pada sumuran H11 – H12, tambahkan diisi PBST 100 µl sebagai
blank. Tutup mikroplate dengan platik penutup dan inkubasikan pada suhu 37oC
selama 60 menit. Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan pada Mikroplat,
lakukan pencucian dengan volume minimal 200 µl/sumuran sebanyak 4 -5 kali dan
tapping hingga tidak ada gelembung air di dalam sumuran. Tambahkan Konjugat
Protein A pengenceran 1:16000 sebanyak 100 µl pada semua sumur di mikroplat.
Tutup mikroplate dengan platik penutup dan inkubasikan pada suhu 37oC selama
60 menit. Buka tutup plastik adsorben. Buang cairan pada Mikroplat, lakukan
pencucian dengan volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran sebanyak 4 -5 kali
dan tapping hingga tidak ada gelembung air di dalam sumuran. Tambahkan larutan
Substrat 100 µl setiap sumuran dan tempat gelap selama 10 menit (Tambahkan
larutan stopper bila terjadi perubahan warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang
Kontrol 2, 5µl ST 1 EU PBST 247,5 µl
Sampel 2,5 µl
PBST 247,5 µl
Konjugat Protein A 2 µl
PBST 30 ml
Kontrol 2,5µl Negatif PBST 247,5 µl
y = 0.683ln(x) + 1,363
R² = 0.967
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 2 4 6
Series1
Log. (Series1)
jika reaksi berjalan lambat) Tambahkan larutan stopper 100 µl kemudian baca
dengan alat ELISA Reader pada panjang gelombang 405 nm.
100 µl
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A K 4 EU K 4 EU S1 S1 S9 S9 S17 S17 S25 S25 S33 S33
B K 2 EU K 2 EU S2 S2 S10 S10 S18 S18 S26 S26 S34 S34
C K 1 EU K 1 EU S3 S3 S11 S11 S19 S19 S27 S27 S35 S35
D K 0,5 EU K 0,5 EU S4 S4 S12 S12 S20 S20 S28 S28 S36 S36
E
K 0,25
EU
K 0,25
EU S5 S5 S13 S13 S21 S21 S29 S29 S37 S37
F
K 0,125
EU
K 0,125
EU S6 S6 S14 S14 S22 S22 S30 S30 S38 S38
G ST 1EU ST 1 EU S7 S7 S15 S15 S23 S23 S31 S31 S39 S39
H
Kontrol
Negatif
Kontrol
Negatif S8 S8 S16 S16 S24 S24 S32 S32 BL BL
S = sampel BL = Blank
Menggunakan Persamaan garis (Excel):
Cara membuat Kurva: X= nilai Equivalen Unit K 4 EU ; K 2 EU ; K 1 EU ; K
0,5 EU ; K 0,25 EU ; K 0,125 EU, Y= nilai Optical Dencity rata2 Kontrol Positif.
Blok X dan Y. Arahkan kursor pada chart wizart,klik. Pilih XY (Scater), Pilih
gambar grafik “Scatter with smooth line and markers”. Arahkan kursor pada grafik,
klik kanan. Pilih “Add Trendline”. Pilih “Logarithmic” pada Trend/Regretion Type.
Pilih “Display Equation on chart”, dan “Display R-squared value on chart”. Keluar
persamaan garis mis: Y=0,367 Ln(X) +0,900 dan R= 0,9683 ; Persamaan garis dapat
diterima apabila R2
mendekati angka 1 (antara 0,9 – 1). Persamaan garis Y- 0,900
=0,367 Ln(X). Ln X = (Y- 0,900) / 0,367. X = Exp (Inverse Ln X) (Gambar 2).
Gambar 2. Kurva Optical Dencity Kontrol Positif Vs EU
Kriteria awal diterima: OD maksimum (OD K4 EU) = 1,5 EU ≤
OD K4 EU ≤ 2.5 EU, Nilai R2 = 0,9 – 1, OD kontrol negatif <
OD K 0,5 EU, OD PBST Blank ≤ 0,1.
Interpretasi Hasil :
EU Titer Interpretasi Hasil
EU Sampel ≥ 0,5 EU Nilai Titer serum cukup Positif
EU Sampel < 0,5 EU Nilai Titer serum tak cukup Negatif
DISKUSI DAN KESIMPULAN
Peningkatan mutu dan validasi metode Kit ELISA Pusvetma meliputi berbagai segi
dalam manual ELISA Rabies . Pengujian kontrol positif, kontrol negatif dan serum
standar yang sebelumnya menggunakan SN tes, telah dilakukan oleh laboratorium
independen (AAHL-CSIRO) dengan metode FAVN. Metode uji FAVN dan SN
merupakan gold standard uji untuk uji Rabies. Perubahan pengenceran serum
Kontrol Positif , Negatif dan sampel serum menjadi pengenceran 1:100, pada kit
lama kontrol Positif 4EU tidak diencerkan dan serum sampel diencerkan 1: 50.
Perubahan pengenceran, serum kontrol positif dan serum kontrol negatif, diikuti
dengan perubahan pengenceran konjugat HRP Protein A yang semula 8000x.
Pengujian dilakukan terhadap beberapa variabel pengenceran,dan hasil yang baik
terdapat pada pengenceran 1:16.000, seperti terlihat pada Tabel 1, Tabel 2, Tabel 3,
Tabel 4 (Gambar 3) berikut ini. Berdasarkan hasil kurva terlihat bahwa pengenceran
12.000x, 15.000x dan 16.000x memberikan nilai rasio yang baik, namun berdasarkan
nilai OD pada tabel di atas maka pengenceran 16.000x memberikan hasil yang baik,
dan pada nilai 0,5 hasil lebih rendah dibandingkan seri pengenceran lain.
Diharapkan dengan berbagai perubahan dan peningkatan mutu kit ELISA Rabies ini
akan diperoleh hasil uji yang lebih valid.
Tabel 1. Seri Pengenceran Konjugat HRP Protein A
Tabel 2. Perbedaan Kit Elisa Baru dan Lama
Seri Pengenceran Konjugate
8000 12000 15000 16000 20000
4 3.159 2.36 2.2295 2.3525 2.1985
2 2.815 2.00 1.8115 1.8745 1.667
1 2.535 1.40 1.306 1.195 1.0245
0.5 1.7715 0.77 0.7015 0.636 0.514
0.25 0.957 0.37 0.382 0.2605 0.2245
0.125 0.41 0.22 0.2165 0.1185 0.099
negatif 0.161 0.43 0.39 0.38 0.31
Bahan Kit ELISA Lama Kit ELISA Baru
(Perbaikan AAHL)
Pengujian
Kontrol Positif
Dengan mengunakan
Serum Netralisasi Test
dengan serum standar
International WHO
Dengan menggunakan
Florescent Antibody
Netralisation Test dengan
serum standar OIE
Pengenceran 4 iu langsung tidak 4 iu diencerkan 1:100
Tabel 3. Perbedaan Panduan Cara Kerja
Cara Kerja Lama Cara Kerja Baru
1. Serum Kontrol Positif K 4 EU; K 2 EU; K 1
EU; K 0,5 EU; K 0,25 EU dan K 0,125 EU;
serum Kontrol Negatif tidak diencerkan, serum
Sampel yang sudah diencerkan 1:50
dimasukkan kedalam sumuran mikroplat
sebanyak 100 µl (duplo) sesuai urutan
2. Tutup mikroplat dengan plastic adsorben dan
inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit
3. Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan
dalam mikroplat, lakukan pencucian dengan
volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran
sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada
gelembung udara di dalam sumuran
4. Tambahkan Konjugat Protein A pengenceran
1:8.000 sebanyak 100 µl pada semua sumuran
di mikroplat
5. Tutup mikroplat dengan plastik penutup dan
inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit
6. Buka tutup plastic penutup. Buang cairan pada
mikroplat, lakukan pencucian dengan volume
minimal 200 µl PBST setiap sumuran
sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada
gelembung udara di dalam sumuran
7. Tambahkan larutan Substrat 100 µl setiap
sumuran dan tempat gelap selama 10 menit
(tambahkan stopper bila terjadi perubahan
warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang
jika reaksi lambat)
Tambahkan larutan Stopper 100 µl setiap
sumuran kemudian baca dengan alat ELISA
Reader dengan panjang gelombang 405 nm.
1. . Serum Kontrol Positif K 4 EU; K 2 EU; K 1
EU; K 0,5 EU; K 0,25 EU dan K 0,125 EU;
serum Kontrol Negatif dan serum Sampel yang
sudah diencerkan 1:100 dimasukkan kedalam
sumuran mikroplat sebanyak 100 µl (duplo)
sesuai urutan
2. Tutup mikroplat dengan plastic adsorben dan
inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit
3. Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan
dalam mikroplat, lakukan pencucian dengan
volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran
sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada
gelembung udara di dalam sumuran
4. Tambahkan Konjugat Protein A pengenceran
1:16.000 sebanyak 100 µl pada semua sumuran
di mikroplat
5. Tutup mikroplat dengan plastik penutup dan
inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit
6. Buka tutup plastic penutup. Buang cairan pada
mikroplat, lakukan pencucian dengan volume
minimal 200 µl PBST setiap sumuran
sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada
gelembung udara di dalam sumuran
7. Tambahkan larutan Substrat 100 µl setiap
sumuran dan tempat gelap selama 10 menit
(tambahkan stopper bila terjadi perubahan
warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang
jika reaksi lambat)
Tambahkan larutan Stopper 100 µl setiap
sumuran kemudian baca dengan alat ELISA
Reader dengan panjang gelombang 405 nm.
Kontrol Positif diencerkan
Pengenceran
Serum sampel
1:50 1:100
Pengenceran
Konjugate
Protein A
1:8000 1:16.000
Aqua yang
dipakai
Aquades vetma Aqua demin
Tabel 4. Hasil Duration Of Immunity Dengan menggunakan Kit ELISA baru
Pre Vak
1 bln V2
2 bln V2
3 bln V2
4 bln V2
5 bln V2
6 bln
V2
7bln V2
8 bln
V2
9 bln
V2
10 bln V2
11 bln V2
12 bln V2
13 bln V2
14 blnV2
15 bln V2
15 bln
V2
17 bln V2
18 bln
V2
19 bln
V2
0,5 EU
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
0,892
Anj
No1
0,429
1,554
1,521
1,617
1,65
2,107
2,122
2,084
2,109
1,84
1,78
1,711
1,784
1,836
1,871
2,251
2,21
2,075
2,241
1,967
Anj
No2
0,429
0,933
0,943
0,425
0,543
1,548
1,546
1,748
1,643
1,656
1,677
1,522
1,574
1,688
1,751
2,326
2,344
2,018
2,066
1,952
Anj
No3
0,429
0,991
0,967
0,729
0,865
1,821
1,824
1,84
1,832
1,698
1,688
1,286
1,325
1,469
1,641
2,16
2,188
1,807
1,809
2,181
Anj
No 8
0,429
0,474
0,566
0,403
0,643
0,414
0,531
1,693
1,653
1,151
1,231
0,899
0,888
2,035
1,761
1,947
1,978
1,896
1,899
1,604
Gambar 3. Perbedaan teknik lama dan teknik baru masa kekebalan vaksin
PreVak
1 blnV2
2blnV2
3blnV2
4blnV2
5blnV2
6blnV2
7blnV2
8blnV2
9 blnV2
10blnV2
11blnV2
12bln V2
13blnV2
14blnV2
15blnV2
15bln V2
17blnV2
18bln V2
19blnV2
0,5 EU 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892
Anj No1 0.429 1.554 1.521 1.617 1.65 2.107 2.122 2.084 2.109 1.84 1.78 1.711 1.784 1.836 1.871 2.251 2.21 2.075 2.241 1.967
Anj No2 0.429 0.933 0.943 0.425 0.543 1.548 1.546 1.748 1.643 1.656 1.677 1.522 1.574 1.688 1.751 2.326 2.344 2.018 2.066 1.952
Anj No3 0.429 0.991 0.967 0.729 0.865 1.821 1.824 1.84 1.832 1.698 1.688 1.286 1.325 1.469 1.641 2.16 2.188 1.807 1.809 2.181
Anj No 8 0.429 0.474 0.566 0.403 0.643 0.414 0.531 1.693 1.653 1.151 1.231 0.899 0.888 2.035 1.761 1.947 1.978 1.896 1.899 1.604
0
0.5
1
1.5
2
2.5
DOI Rabivet Supra 92 1-19 bln Kit Pusvetma
Kesimpulan kit ELISA metode baru ini telah digunakan untuk menguji hasil
penelitian mengenai Duration of Imunity dari vaksin Rabivet Supra ’92, dengan hasil
terlihat pada tabel 4 beserta grafik. Perlu dilakukan pengecekan pH air yang akan
digunakan sebelum mengencerkan PBST. Perlu dilakukan kajian penggunaan antigen
rekombinan untuk mendapatkan hasil yang lebih konsisten dan stabil.
DAFTAR PUSTAKA
HOOPER D.C., MORIMOTO K., BETTE M., WEIHE E., KOPROWSKI H. &
DIETZSCHOLD B. (1998). Collaboration of antibody and inflammation in
clearance of rabies virus from the central nervous system. J. Virol., 72, 3711–
3719.
Hostnik P, Pavlinic MS, Stezinar SL, Kragelj LZ. 2006. Vaccination againts rabies
and protective antibodies – comparison of ELISA and Fluorescent Antibody
Virus Neutralization (FAVN) assay. Slovenia: Medical Faculty University of
Ljbljana.
OIE, 2011, Terestrial Manual, Rabies, Chapter 2.1.13.
WORLD HEALTH ORGANISATION (1996). Laboratory Techniques in Rabies,
Fourth Edition, Meslin F.-X., Kaplan M.M. & Koprowski H., eds. WHO,
Geneva, Switzerland.
WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT COMMITTEE ON BIOLOGICAL
STANDARDS. THIRTY-FIFTH REPORT (1985). World Health Organisation
Technical Report Series No. 725. WHO, Geneva, Switzerland.
SERVAT A., FEYSSAGUET M., BLANCHARD I., MORIZE J.L., SCHEREFFER
J.L., BOUÉ F. & CLIQUET F. (2007). A quantitative indirect ELISA to
monitor the effectiveness of rabies vaccination in domestic and wild carnivores.
J.Immunol. Methods, 318, 1–10.
XU G., WEBER P., HU Q., XUE H., AUDRY L., LI C., WU J. & BOURHY H.
(2007). A simple sandwich ELISA (WELYSSA) for the detection of lyssavirus
nucleocapsid in rabies suspected specimens using mouse monoclonal
antibodies. Biologicals, 35, 297–302.
Top Related