KIT ELISA RABIES PUSVETMA

Petri Nandatina Saputri

1, Dyah Estikoma

1, Nur Sholichah

1

1. Pusat Veteriner Farma, Jalan. A. Yani 68 – 70 Surabaya

ABSTRACT

Rabies is a viral disease that caused by virus neurotropic genus Lyssavirus family

Rhabdoviridae, it is a major zoonosis for which diagnostic techniques have been

standardized internationally. Antibody detection can be tested with mouse serum

neutralization test (MNT), rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) or enzyme

linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA was used in this research in order to

increase quality and to validate the method which used in KIT that produced by

PUSVETMA. As a result, there are some alteration on conjugate dilution which is

16000 times, dilution of positive control, negative control and 1 EU/ml sera standar

which is 1:100.

Keywords: ELISA, Rabies, Pusvetma, Viral diseases

PENDAHULUAN

Rabies disebabkan oleh virus neurotropic genus Lyssavirus family Rhabdoviridae

dan dapat ditularkan dari hewan ke hewan dan dari hewan ke manusia melalui

gigitan. Karena bersifat zoonosis, maka semua material yang dicurigai terinfeksi

harus ditangani dengan memperhatikan aspek keamanan sesuai dengan spesifikasi

WHO (WHO, 1996).

Vaksinasi merupakan tindakan pencegahan yang efektif dalam mengurangi

kejadian rabies. Hasil vaksinasi Rabies harus memenuhi standar kebutuhan minimal

sesuai dengan acuan OIE, yaitu sama atau lebih besar dari 0,5 Equivalent Unit (EU).

(Hooper et al, 1998, WHO Expert Committee in Biological standards, 1985).

Antibody netralisasi diyakini merupakan komponen utama dari respon imun

melawan virus rabies. Gold standar uji adalah virus netralisasi. Pemeriksaan zat

kebal (Antibodi) pada serum dapat dilakukan dengan cara Mouse Netralization

(MN), Rapid Fluorecent Focus Inhibition Test (RFFIT) dan Enzyme Linked

Immunosorbent Assays (ELISA) atau cara immunoenzimatik lainnya.

ELISA merupakan salah satu uji untuk mendeteksi antibodi yang sangat berguna

terkait dengan survey epidemiologi dalam populasi besar (Xu et al 2007). Pada saat

ini, indirect ELISA telah dikembangkan sehingga didapatkan hasil yang relative

cepat dan tidak memerlukan fasilitas laboratorium pendukung yang rumit, seperti

fasilitas tissue culture, kandang hewan coba. Kit Indirect ELISA dikembangkan

dengan menggunakan virus utuh (Whole Virus) virus rabies strain Pasteur 35321 (PV

35321). Pada beberapa sampel, penggunaan indirect ELISA memperlihatkan hasil

yang sensitifitas dan spesifisitasnya sama dengan VN tes. ( Servat et al, 2007).

Kajian tentang efikasi vaksinasi rabies menggunakan metode ELISA dan Fluorescent

Antibody Virus Neuralization (FAVN) telah dilakukan oleh Hostnik et al., (2006).

Sebelum digunakan, Spesifisitas dan sensitivitas uji ini harus dikonfirmasikan

terlebih dahulu.Uji ELISA ini sering kali juga dikombinasikan dengan tes konfirmasi

lain seperti FAT atau virus isolasi.

Dalam perjalanan produksinya Kit ELISA Rabies PUSVETMA telah mendapat

perhatian dalam skala nasional dan internasional. Guna meningkatkan mutu dan

kualitas Kit ini telah dilakukan Penelitian dan Pengembangan metode bekerjasama

dengan DAFF Australia dalam hal ini AAHL-CSIRO pada kerangka proyek AIP-

EID. Untuk validasi metode juga bekerjasama dengan BPPV Regional II Bukittinggi

selaku lab referens Rabies di Indonesia. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk

mengkaji Kit ELISA Rabies dalam upaya peningkatan mutu dan pengembangan

metode Kit ELISA RABIES di PUSVEMA

METODE

Peralatan yang digunakan, 2 buah Mikroplat 96 well tercoating dengan antigen

rabies. (mikroplat stabil 2 minggu setelah sachet dibuka), Elisa Reader, Elisa

Washer, Vorteks/stirrer, Mikro pipet volume ≤ 10 µl, 50 µl, 300 µl, dan 1000 µl,

Freezer, Refrigerator, Mikroplate, Inkubator 37°C, 2 buah Plastik adsorben, Pereaksi

yang digunakan, 100 µl Kontrol positif serum anjing mengandung antibody rabies dan Thimerosal 0,01% dengan konsentrasi 4 EU, 100 µl Kontrol negatif serum anjing yang negatif antibodi rabies, 100 µl Serum Standar 1 EU/ml, 20 µl Konjugat Peroksidase-rec-protein A, larutan stabil 2 jam setelah dilarutkan, 30 ml Larutan ABTS siap digunakan dan sudah mengandung H2O2, PBST Konsentrat 10X. Digunakan sebagai pelarut Kontrol Positif, Kontrol Negatif, Konjugat, sampel dan proses pencucian, larutan stabil selama 1 bulan setelah dilarutkan, 30 ml Larutan stopper. Tempat penelitian dilakukan di Pusat Veterinaria Farma Surabaya – Jawa Timur – Indonesia, BPPV Regional II Bukittinggi – Sumatera Barat – Indonesia, AAHL – CSIRO – Geelong – Australia.

Pembuatan pereaksi, Pengenceran PBS-T 1 kali dengan cara pengenceran, yaitu

PBST konsentrat 50 ml ditambah aquades 450 ml. Pengenceran Kontrol Positif

dilakukan pengenceran seperti diagram dibawah ini, gunakan vortex/mixer untuk

menghomogenkan (Gambar 1)

Gambar 1. Teknik pengenceran PBS-T satu kali

Protokol pengerjaan, Dilakukan pengenceran 10µl Kontrol positif ke dalam 990

µl PBST sebagai K 4 EU dan homogenkan, dilakukan seperti Gambar 1.

Ditambahkan 500 µl K 4 EU ke 500µl PBST sebagai K 2 EU. Ditambahkan 500µl

K 2 EU ke 500µl PBST sebagai K 1 EU. Dilakukan pengenceran yang sama untuk

K 0,5 EU: K 0,25 EU: dan K 0,125 EU, Dilakukan penjagaan jangan menyentuh

cairan dan selalu mengganti fintip pada pengenceran berikutnya.

K Pos

10µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl

PBST 990 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl

K 4 EU K 2 EU K 1 EU K 0,5 EU K 0,25 EU K 0,125 EU

Kontrol ST 1 EU

Encerkan2,5 µl Kontrol ST 1 EU kedalam 247,5 µl

PBST dan homogenkan

Kontrol Negatif

Encerkan 2,5 µl Kontrol Negatif kedalam 247,5 µl PBST

dan homogenkan, Pada sumuran H11 – H12 sebagai

blank, tambahkan diisi PBST 100 µl

Sampel

Encerkan 2,5 µl kedalam 247,5 µl PBST

dan homogenkan

Konjugat Protein A

Encerkan 16.000 x

Encerkan 2 µl ke dalam 30 ml PBST

dan homogenkan

Protokol, Serum Kontrol Positif K 4 EU, K 2 EU , K 1 EU, K 0,5 EU, K 0,25

EU dan K 0,125 EU; serum kontrol ST 1 EU, serum kontrol negatif dan serum

sampel yang sudah diencerkan ke dalam sumur mikroplate sebanyak 100 µl (duplo)

sesuai urutan. Pada sumuran H11 – H12, tambahkan diisi PBST 100 µl sebagai

blank. Tutup mikroplate dengan platik penutup dan inkubasikan pada suhu 37oC

selama 60 menit. Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan pada Mikroplat,

lakukan pencucian dengan volume minimal 200 µl/sumuran sebanyak 4 -5 kali dan

tapping hingga tidak ada gelembung air di dalam sumuran. Tambahkan Konjugat

Protein A pengenceran 1:16000 sebanyak 100 µl pada semua sumur di mikroplat.

Tutup mikroplate dengan platik penutup dan inkubasikan pada suhu 37oC selama

60 menit. Buka tutup plastik adsorben. Buang cairan pada Mikroplat, lakukan

pencucian dengan volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran sebanyak 4 -5 kali

dan tapping hingga tidak ada gelembung air di dalam sumuran. Tambahkan larutan

Substrat 100 µl setiap sumuran dan tempat gelap selama 10 menit (Tambahkan

larutan stopper bila terjadi perubahan warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang

Kontrol 2, 5µl ST 1 EU PBST 247,5 µl

Sampel 2,5 µl

PBST 247,5 µl

Konjugat Protein A 2 µl

PBST 30 ml

Kontrol 2,5µl Negatif PBST 247,5 µl

y = 0.683ln(x) + 1,363

R² = 0.967

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 2 4 6

Series1

Log. (Series1)

jika reaksi berjalan lambat) Tambahkan larutan stopper 100 µl kemudian baca

dengan alat ELISA Reader pada panjang gelombang 405 nm.

100 µl

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A K 4 EU K 4 EU S1 S1 S9 S9 S17 S17 S25 S25 S33 S33

B K 2 EU K 2 EU S2 S2 S10 S10 S18 S18 S26 S26 S34 S34

C K 1 EU K 1 EU S3 S3 S11 S11 S19 S19 S27 S27 S35 S35

D K 0,5 EU K 0,5 EU S4 S4 S12 S12 S20 S20 S28 S28 S36 S36

E

K 0,25

EU

K 0,25

EU S5 S5 S13 S13 S21 S21 S29 S29 S37 S37

F

K 0,125

EU

K 0,125

EU S6 S6 S14 S14 S22 S22 S30 S30 S38 S38

G ST 1EU ST 1 EU S7 S7 S15 S15 S23 S23 S31 S31 S39 S39

H

Kontrol

Negatif

Kontrol

Negatif S8 S8 S16 S16 S24 S24 S32 S32 BL BL

S = sampel BL = Blank

Menggunakan Persamaan garis (Excel):

Cara membuat Kurva: X= nilai Equivalen Unit K 4 EU ; K 2 EU ; K 1 EU ; K

0,5 EU ; K 0,25 EU ; K 0,125 EU, Y= nilai Optical Dencity rata2 Kontrol Positif.

Blok X dan Y. Arahkan kursor pada chart wizart,klik. Pilih XY (Scater), Pilih

gambar grafik “Scatter with smooth line and markers”. Arahkan kursor pada grafik,

klik kanan. Pilih “Add Trendline”. Pilih “Logarithmic” pada Trend/Regretion Type.

Pilih “Display Equation on chart”, dan “Display R-squared value on chart”. Keluar

persamaan garis mis: Y=0,367 Ln(X) +0,900 dan R= 0,9683 ; Persamaan garis dapat

diterima apabila R2

mendekati angka 1 (antara 0,9 – 1). Persamaan garis Y- 0,900

=0,367 Ln(X). Ln X = (Y- 0,900) / 0,367. X = Exp (Inverse Ln X) (Gambar 2).

Gambar 2. Kurva Optical Dencity Kontrol Positif Vs EU

Kriteria awal diterima: OD maksimum (OD K4 EU) = 1,5 EU ≤

OD K4 EU ≤ 2.5 EU, Nilai R2 = 0,9 – 1, OD kontrol negatif <

OD K 0,5 EU, OD PBST Blank ≤ 0,1.

Interpretasi Hasil :

EU Titer Interpretasi Hasil

EU Sampel ≥ 0,5 EU Nilai Titer serum cukup Positif

EU Sampel < 0,5 EU Nilai Titer serum tak cukup Negatif

DISKUSI DAN KESIMPULAN

Peningkatan mutu dan validasi metode Kit ELISA Pusvetma meliputi berbagai segi

dalam manual ELISA Rabies . Pengujian kontrol positif, kontrol negatif dan serum

standar yang sebelumnya menggunakan SN tes, telah dilakukan oleh laboratorium

independen (AAHL-CSIRO) dengan metode FAVN. Metode uji FAVN dan SN

merupakan gold standard uji untuk uji Rabies. Perubahan pengenceran serum

Kontrol Positif , Negatif dan sampel serum menjadi pengenceran 1:100, pada kit

lama kontrol Positif 4EU tidak diencerkan dan serum sampel diencerkan 1: 50.

Perubahan pengenceran, serum kontrol positif dan serum kontrol negatif, diikuti

dengan perubahan pengenceran konjugat HRP Protein A yang semula 8000x.

Pengujian dilakukan terhadap beberapa variabel pengenceran,dan hasil yang baik

terdapat pada pengenceran 1:16.000, seperti terlihat pada Tabel 1, Tabel 2, Tabel 3,

Tabel 4 (Gambar 3) berikut ini. Berdasarkan hasil kurva terlihat bahwa pengenceran

12.000x, 15.000x dan 16.000x memberikan nilai rasio yang baik, namun berdasarkan

nilai OD pada tabel di atas maka pengenceran 16.000x memberikan hasil yang baik,

dan pada nilai 0,5 hasil lebih rendah dibandingkan seri pengenceran lain.

Diharapkan dengan berbagai perubahan dan peningkatan mutu kit ELISA Rabies ini

akan diperoleh hasil uji yang lebih valid.

Tabel 1. Seri Pengenceran Konjugat HRP Protein A

Tabel 2. Perbedaan Kit Elisa Baru dan Lama

Seri Pengenceran Konjugate

8000 12000 15000 16000 20000

4 3.159 2.36 2.2295 2.3525 2.1985

2 2.815 2.00 1.8115 1.8745 1.667

1 2.535 1.40 1.306 1.195 1.0245

0.5 1.7715 0.77 0.7015 0.636 0.514

0.25 0.957 0.37 0.382 0.2605 0.2245

0.125 0.41 0.22 0.2165 0.1185 0.099

negatif 0.161 0.43 0.39 0.38 0.31

Bahan Kit ELISA Lama Kit ELISA Baru

(Perbaikan AAHL)

Pengujian

Kontrol Positif

Dengan mengunakan

Serum Netralisasi Test

dengan serum standar

International WHO

Dengan menggunakan

Florescent Antibody

Netralisation Test dengan

serum standar OIE

Pengenceran 4 iu langsung tidak 4 iu diencerkan 1:100

Tabel 3. Perbedaan Panduan Cara Kerja

Cara Kerja Lama Cara Kerja Baru

1. Serum Kontrol Positif K 4 EU; K 2 EU; K 1

EU; K 0,5 EU; K 0,25 EU dan K 0,125 EU;

serum Kontrol Negatif tidak diencerkan, serum

Sampel yang sudah diencerkan 1:50

dimasukkan kedalam sumuran mikroplat

sebanyak 100 µl (duplo) sesuai urutan

2. Tutup mikroplat dengan plastic adsorben dan

inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit

3. Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan

dalam mikroplat, lakukan pencucian dengan

volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran

sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada

gelembung udara di dalam sumuran

4. Tambahkan Konjugat Protein A pengenceran

1:8.000 sebanyak 100 µl pada semua sumuran

di mikroplat

5. Tutup mikroplat dengan plastik penutup dan

inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit

6. Buka tutup plastic penutup. Buang cairan pada

mikroplat, lakukan pencucian dengan volume

minimal 200 µl PBST setiap sumuran

sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada

gelembung udara di dalam sumuran

7. Tambahkan larutan Substrat 100 µl setiap

sumuran dan tempat gelap selama 10 menit

(tambahkan stopper bila terjadi perubahan

warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang

jika reaksi lambat)

Tambahkan larutan Stopper 100 µl setiap

sumuran kemudian baca dengan alat ELISA

Reader dengan panjang gelombang 405 nm.

1. . Serum Kontrol Positif K 4 EU; K 2 EU; K 1

EU; K 0,5 EU; K 0,25 EU dan K 0,125 EU;

serum Kontrol Negatif dan serum Sampel yang

sudah diencerkan 1:100 dimasukkan kedalam

sumuran mikroplat sebanyak 100 µl (duplo)

sesuai urutan

2. Tutup mikroplat dengan plastic adsorben dan

inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit

3. Buka tutup plastik adsorben dan buang cairan

dalam mikroplat, lakukan pencucian dengan

volume minimal 200 µl PBST setiap sumuran

sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada

gelembung udara di dalam sumuran

4. Tambahkan Konjugat Protein A pengenceran

1:16.000 sebanyak 100 µl pada semua sumuran

di mikroplat

5. Tutup mikroplat dengan plastik penutup dan

inkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit

6. Buka tutup plastic penutup. Buang cairan pada

mikroplat, lakukan pencucian dengan volume

minimal 200 µl PBST setiap sumuran

sebanyak 4-5 kali dan tapping hingga tidak ada

gelembung udara di dalam sumuran

7. Tambahkan larutan Substrat 100 µl setiap

sumuran dan tempat gelap selama 10 menit

(tambahkan stopper bila terjadi perubahan

warna dengan cepat, waktu dapat diperpanjang

jika reaksi lambat)

Tambahkan larutan Stopper 100 µl setiap

sumuran kemudian baca dengan alat ELISA

Reader dengan panjang gelombang 405 nm.

Kontrol Positif diencerkan

Pengenceran

Serum sampel

1:50 1:100

Pengenceran

Konjugate

Protein A

1:8000 1:16.000

Aqua yang

dipakai

Aquades vetma Aqua demin

Tabel 4. Hasil Duration Of Immunity Dengan menggunakan Kit ELISA baru

Pre Vak

1 bln V2

2 bln V2

3 bln V2

4 bln V2

5 bln V2

6 bln

V2

7bln V2

8 bln

V2

9 bln

V2

10 bln V2

11 bln V2

12 bln V2

13 bln V2

14 blnV2

15 bln V2

15 bln

V2

17 bln V2

18 bln

V2

19 bln

V2

0,5 EU

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

0,892

Anj

No1

0,429

1,554

1,521

1,617

1,65

2,107

2,122

2,084

2,109

1,84

1,78

1,711

1,784

1,836

1,871

2,251

2,21

2,075

2,241

1,967

Anj

No2

0,429

0,933

0,943

0,425

0,543

1,548

1,546

1,748

1,643

1,656

1,677

1,522

1,574

1,688

1,751

2,326

2,344

2,018

2,066

1,952

Anj

No3

0,429

0,991

0,967

0,729

0,865

1,821

1,824

1,84

1,832

1,698

1,688

1,286

1,325

1,469

1,641

2,16

2,188

1,807

1,809

2,181

Anj

No 8

0,429

0,474

0,566

0,403

0,643

0,414

0,531

1,693

1,653

1,151

1,231

0,899

0,888

2,035

1,761

1,947

1,978

1,896

1,899

1,604

Gambar 3. Perbedaan teknik lama dan teknik baru masa kekebalan vaksin

PreVak

1 blnV2

2blnV2

3blnV2

4blnV2

5blnV2

6blnV2

7blnV2

8blnV2

9 blnV2

10blnV2

11blnV2

12bln V2

13blnV2

14blnV2

15blnV2

15bln V2

17blnV2

18bln V2

19blnV2

0,5 EU 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892 0.892

Anj No1 0.429 1.554 1.521 1.617 1.65 2.107 2.122 2.084 2.109 1.84 1.78 1.711 1.784 1.836 1.871 2.251 2.21 2.075 2.241 1.967

Anj No2 0.429 0.933 0.943 0.425 0.543 1.548 1.546 1.748 1.643 1.656 1.677 1.522 1.574 1.688 1.751 2.326 2.344 2.018 2.066 1.952

Anj No3 0.429 0.991 0.967 0.729 0.865 1.821 1.824 1.84 1.832 1.698 1.688 1.286 1.325 1.469 1.641 2.16 2.188 1.807 1.809 2.181

Anj No 8 0.429 0.474 0.566 0.403 0.643 0.414 0.531 1.693 1.653 1.151 1.231 0.899 0.888 2.035 1.761 1.947 1.978 1.896 1.899 1.604

0

0.5

1

1.5

2

2.5

DOI Rabivet Supra 92 1-19 bln Kit Pusvetma

Kesimpulan kit ELISA metode baru ini telah digunakan untuk menguji hasil

penelitian mengenai Duration of Imunity dari vaksin Rabivet Supra ’92, dengan hasil

terlihat pada tabel 4 beserta grafik. Perlu dilakukan pengecekan pH air yang akan

digunakan sebelum mengencerkan PBST. Perlu dilakukan kajian penggunaan antigen

rekombinan untuk mendapatkan hasil yang lebih konsisten dan stabil.

DAFTAR PUSTAKA

HOOPER D.C., MORIMOTO K., BETTE M., WEIHE E., KOPROWSKI H. &

DIETZSCHOLD B. (1998). Collaboration of antibody and inflammation in

clearance of rabies virus from the central nervous system. J. Virol., 72, 3711–

3719.

Hostnik P, Pavlinic MS, Stezinar SL, Kragelj LZ. 2006. Vaccination againts rabies

and protective antibodies – comparison of ELISA and Fluorescent Antibody

Virus Neutralization (FAVN) assay. Slovenia: Medical Faculty University of

Ljbljana.

OIE, 2011, Terestrial Manual, Rabies, Chapter 2.1.13.

WORLD HEALTH ORGANISATION (1996). Laboratory Techniques in Rabies,

Fourth Edition, Meslin F.-X., Kaplan M.M. & Koprowski H., eds. WHO,

Geneva, Switzerland.

WORLD HEALTH ORGANIZATION EXPERT COMMITTEE ON BIOLOGICAL

STANDARDS. THIRTY-FIFTH REPORT (1985). World Health Organisation

Technical Report Series No. 725. WHO, Geneva, Switzerland.

SERVAT A., FEYSSAGUET M., BLANCHARD I., MORIZE J.L., SCHEREFFER

J.L., BOUÉ F. & CLIQUET F. (2007). A quantitative indirect ELISA to

monitor the effectiveness of rabies vaccination in domestic and wild carnivores.

J.Immunol. Methods, 318, 1–10.

XU G., WEBER P., HU Q., XUE H., AUDRY L., LI C., WU J. & BOURHY H.

(2007). A simple sandwich ELISA (WELYSSA) for the detection of lyssavirus

nucleocapsid in rabies suspected specimens using mouse monoclonal

antibodies. Biologicals, 35, 297–302.