UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl)

UvA-DARE (Digital Academic Repository)

Molecular and radiotherapeutic features of pancreatic cancer

Ceha, H.M.

Link to publication

Citation for published version (APA):Ceha, H. M. (2003). Molecular and radiotherapeutic features of pancreatic cancer.

General rightsIt is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s),other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Disclaimer/Complaints regulationsIf you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, statingyour reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Askthe Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam,The Netherlands. You will be contacted as soon as possible.

Download date: 11 Jan 2020

CHAPTERR 9

Summaryy / samenvatting

Summary y

Summary y

ff t

Thiss thesis focuses on molecular principles and alterations in genes in pancreatic-

cancer,, and studies concerning radiotherapy in locally advanced pancreatic cancer.

Hourr chapters describe molecular studies performed at the department of Pathology

off the Academic Center, where the author spent a research period, granted by the

Dutchh Cancer Society (Koningin Wilhelmina Fonds-KWF), during her training as a

radiationn oncologist (chapters 2. 3. 4 and 6). Two chapters describe the results and

patternss of local failure in a high dose conformal radiotherapy study performed at

thee department of Radiotherapy of the AMC, where the author was trained and

employedd (chapters 5 and 7).

Chapterr 2 provides an overview of genetic alterations associated with the

developmentt of pancreatic cancer. Point mutations in the K-ra.s' oncogene are more

frequentt in pancreatic carcinoma than in any other tumor type. Most pancreatic

cancerss harbor point mutations in codon 12 of K-ras. Also, alterations in the tumor

suppressorr gene encoding p53 are very common. Loss of heterozygosity (loss of one

allele)) at the p53 locus is found in nearly 90% of pancreatic cancers, while 50-75%

off pancreatic cancers have genetic alterations that inactivate the remaining copy of

thee gene. Cell cycle control is disrupted in nearly all pancreatic cancers through

inaetivationn of the CDKN2 gene, encoding the cyclin-dependent kinase inhibitor

pl61NK4tll (referred to as: p 16). To date, three mechanisms are known by which p 16

functionn can be suppressed, namely by homozygous deletions, by LOH or by

hypermethylationn of the gene promotor. Inaetivation of the tumor suppressor DPC4

iss found in 50% of pancreatic cancers and is relatively specific for pancreatic cancer.

Thiss gene is most likely involved in the transmission of growth and development

signalss within the TGFfi pathway. Also, pancreatic cancer can occur as an inherited

syndrome. .

138 8

Chapterr 9

Cyclin-dependentt kinase 4 (CDK4) is a key molecule in the regulation of the cell

cyclee progression at the Gl-S phase restriction point. Its activity is specifically

regulatedd by pi6. Inactivating mutations in the CDKN2 gene, encoding pi6, are

frequentlyy observed in pancreatic adenocarcinomas. Interestingly. CDKN2

mutationss have also been identified in the germline of 50% of patients with

hereditaryy melanoma. These patients also have an increased risk for the

developmentt of' pancreatic cancers. In melanoma-prone kindreds with a CDKN2

wild-typee status, a specific mutation in CDK.4 was reported, which abolishes p i6

inhibition.. To test the possible involvement of CDK.4 mutations in pancreatic

carcinoma,, sequence alterations in the pl6-binding domain of CDK4 were analyzed

inn DNA isolated from 32 tumors in the head region of the pancreas. This study is

describedd in chapter 3. Alterations in the CDK4 region between codon 1 and 56

weree not observed in any of the tumors. Thus, our results do not support disruption

off the p i6 pathway through CDK4 mutation as an oncogenic mechanism in

pancreaticc head carcinogenesis.

AA specific CDK4 mutation in codon 24 (Arginine to Cysteine) prevents pi6 binding

andd thus, inhibition by the tumor suppressor pi6. This CDK4 mutation acts as a

dominantt oncogene and has been reported in both sporadic and familial melanoma.

Inn the study described in chapter 4, the effects of other mutations in CDK4 on the

pi66 binding capacity were tested. A panel of 18 CDK4 mutants was generated to

identifyy possible novel sites of interaction. The mutant CDK.4 proteins were

producedd in vitro and tested for binding to p 16 using a pl6-GST fusion protein.

Severall mutants demonstrated loss of pi6 binding. In addition to the previously

identifiedd codon 24 mutant, alterations in and around the codons 22, 25, 97 and 281

alll showed loss of p l6 binding capacity. These results indicate that several non-

contiguouss amino acid sequences of CDK4 are required for binding to pi6,

suggestingg the existence of multiple sites of interaction with pi 6. Since p!6-binding

deficientt CDK4 has oncogenic potential, these mutations may be present in

melanomass or other neoplasms. However, it remains to be shown that these

139 9

Summary y

mutationss occur with sufficient frequency to be of significance for human

carcinogenesis. .

Inn chapter 6 the value of immunostaining for Ki-67. p53. DPC4 and the K-ras

statuss as predictive and prognostic markers was evaluated in the pretreatment

biopsiess of 21 patients with locally advanced pancreatic cancer. The patients were

treatedd with high dose conformal radiotherapy, as described in chapter 5. Ki-67. p53

andd DPC4 were studied immunohistochemieally. while K-ra.v codon 12 mutations

weree determined by polymerase chain reaction and allele specific oligonucleotide

hybridization.. Local response (reduction in tumor size at 3 months after

radiotherapy),, overall survival and progression-free survival were studied in relation

too the above mentioned biomarkcrs. No significant predictive markers for local

responsee could be identified, although wildtype DPC4 status showed a trend. The

Ki-677 level was the only significant prognostic marker in relation to the

progression-freee and overall survival. This observation is also described in

resectablee pancreatic carcinoma, in which a high proliferation activity is associated

withh a shorter survival.

Inn the Academic Medical Center a phase II study was conducted in 44 patients with

locallyy advanced, non-metastatic pancreatic cancer. The feasibility and efficacy of

highh dose conformal radiotherapy were examined in this group of patients. In

chapterr 5 this study is described. The patients received 3-dimensionally. planned,

highh dose conformal radiotherapy (70 to 72 Gy in 7 weeks). Toxicity was scored

accordingg to the WHO criteria. The treatment was feasible; a dose of 72 Gy in

fractionss of 2 Gy could be administered safely. Mainly Grade 1 and Grade 2 acute

toxicityy was observed. Late adverse effects were seen in 8 patients: 3 patients had a

self-limitingg gastrointestinal bleeding, mainly from the stomach. In 2 patients a

surgicall intervention was necessary, respectively because of a stomach perforation

inn one patient suffering from local tumor progression and a non-tumor related

duodenall obstruction in the other patient. In 3 patients fatal gastro-intestinal

140 0

Chapterr 9

bleedingss occurred. In these patients, it was not possible to differentiate between

locall tumor progression or radiation-induced ulcers. At 3 months after radiotherapy.

aa reduction in tumor size was seen in 27% of patients, stable disease in 20% of

patients,, while 40% of patients had local disease progression. No true partial or

completee responses were observed. The median survival time from the date of

diagnosiss was 11 months. In case of pain, the treatment offered palliation. However,

thee efficacy of the treatment in terms of prolongation of life was not proven. Distant

metastasess remained the major problem.

Escalationn of radiotherapy doses up to potentially curative levels of 72Gy still

resultss in local disease progression in a great proportion of patients with locally

advancedd pancreatic cancer. In chapter 7 the patterns of local failure following

high-dosee conformal radiotherapy were studied to assess whether the used planning

targett volume (PTV) was appropriate or required redefinition. The follow-up CT-

scanss of the patients with local disease progression were matched with the

correspondingg planning CT-scans. The patterns of the local tumor progression

volumee (Vpmg) were qualitatively compared to the position of the PTV and the

volumee receiving at least 95% of the dose. The percentages of Vpm«, outside the PTV

andd the 95% isodose volume were determined quantitatively. In 80% of patients,

Vpro„„ appeared to be positioned entirely within the high dose volume. In 20% of the

patientss a marginal miss was seen, while no outside recurrences were observed. The

positionn displacement of Vprog in relation to the PTV was very divers. No systematic

patternn of tumor outgrowth could be recognized. Following the results of this study,

noo indication was found to enlarge the safety margin for the PTV in a specific

direction. .

Inn chapter 8 was attempted to discuss the future implications of the above

mentionedd studies and related developments. New molecular observations in the

geneticc profile of pancreatic cancer have suggested a tumor progression model. This

141 1

Summary y

modell could be useful in detection of early cancers and, possibly, also in

chemoprevention. .

Thee RB-pathway is disrupted in nearly all pancreatic cancers by p 16 inactivation. It

iss also suggested that alterations in the RB-pathway occur reciprocally. At the time

off our study concerning CDK4 mutations in the pl6-binding domain of a series of

pancreaticc carcinomas, the three mechanisms to inactivate pi6 function were not yet

alll fully recognized. Thus, retrospectively, it was not very likely to detect CDK4

mutationss in the studied group of pancreatic cancers. So far. oncogenic CDK4

mutationss have only been described in melanoma. Our and other studies suggest that

thee pl6-binding domain of CDK4 resides primarily at the amino terminus of the

protein.. The finding of novel CDK4 mutations in melanomas at the codons 22 and

41.. are in line with this hypothesis. Further experimental evidence provides a central

rolee of CDK4 in melanoma and in other cancers.

Itt is unlikely to suppose thai the effects of a few genes would be large enough to

determinee the radiosensitivity of a tumor. The microarray technique may identify

genee profiles that are of importance to predict the behavior of a tumor to a certain

therapy.. Hopefully, this will lead to new opportunities for the management of

pancreaticc cancer.

Inn locally advanced pancreatic cancer chemoradiation is proven to be feasible.

However,, the long overall treatment times are of great concern in this group of

patientss with a poor prognosis. New sophisticated radiotherapy techniques, allowing

aa high dose conformal treatment, delivered in a short treatment time, together with,

preferablyy oral, chemotherapy and/or novel biologic agents might form a possible

approachh for a new study in locally advanced pancreatic cancer. The potential

possibilitiess of the use of PET, neoadjuvant chemoradiation and small molecules are

discussedd in this chapter.

142 2

Chapterr 9

Samenvatting g

Ditt proefschrift beschrijft moleculaire principes en genetische mutaties in het

pancreass carcinoom, en de rol van radiotherapie bij de behandeling van het lokaal

uitgebreidd pancreas carcinoom. Vier hoofdstukken beschrijven moleculaire studies

diee verricht werden op de afdeling Pathologie van hei Academisch median

Centrum,, waar de auteur gedurende haar specialisatie tot radiotherapeut, dankzij een

fellowshipp van het KWF een onderzocksjaar heeft genoten (Hoofdstuk 2, 3, 4 en 6).

Tweee hoofdstukken beschrijven de resultaten en het lokale recidief patroon in een

studie,, waarin hoge dosis conformatie radiotherapie werd gebruikt. Dit onderzoek

werdd verricht op de afdeling Radiotherapie van het Academisch Medisch Centrum

(Hoofdstukk 5 en 7). waar de auteur werd opgeleid en vervolgens werkzaam is

geweestt als radiotherapeut.

Hoofdstukk 2 verschaft een overzicht van de genetische veranderingen die ten

grondslagg liggen aan de ontwikkeling van het pancreascarcinoom. Punt mutaties in

hett K-ras oncogen worden vaker beschreven in pancreas carcinomen dan in enig

anderee tumor soort. Verder zijn mutaties in het tumor suppressor gen dat codeert

voorr p53 veel voorkomend. Verlies van één allel op het p53 locus wordt in bijna

907c907c van de pancreas carcinomen gevonden, terwijl 50-75% van de pancreas

carcinomenn genetische veranderingen vertonen in het resterende allel. Celcyclus

ontregelingg wordt in vrijwel alle pancreas carcinomen toegeschreven aan de

uitschakelingg van het CDKN2 gen, dat codeert voor de Cyclin-dependent kinase 4

(CDK4)) remmer pl61NK4a (afgekort tot pl6). Tot op heden zijn er 3 mechanismen

bekend,, waardoor de functie van pl6 uitgeschakeld kan worden, namelijk door

middell van homozygote deleties, door LOH of door DNA methylering van de

regulerendee promotor regio. In de helft van de pancreascarcinomen wordt

uitschakelingg gevonden van de tumor suppressor DPC4. Het lijk t erop dat dit een

relatieff specifiek gen is in de etiologie van het pancreas carcinoom. Dit gen is

143 3

Summary y

waarschijnlijkk betrokken bij de overdracht van groei en ontwikkelingssignalen in het

TGFpii pad. Voorts kan pancreascarcinoom optreden als onderdeel van een erfelijk

syndroom. .

Cyclin-dependentt kinase 4 (CDK4) speelt een sleutelrol in de regulatie van de

voortgangg van de celcyclus op de overgang van de Gl naar de S fase. De activiteit

vann het CDK4 wordt gereguleerd door pi6. Inactiverende mutaties in het CDKN2

gen,, dat codeert voor de celcyclus remmer p 16, worden frequent aangetroffen in het

adenocarcinoomm van de pancreas. Ook worden CDKN2 mutaties gevonden in de

kiembaann van ca. 50c/c van de patiënten met familiair voorkomend melanoom.

Opmerkelijkk is dat deze patiënten ook een verhoogde kans hebben op het

ontwikkelenn van een pancreas carcinoom. In familiair voorkomend melanoom is bij

patiëntenn met een wild-type CDKN2 gen, een specifieke mutatie gevonden in

CDK4.. Deze specifieke mutatie heeft tot gevolg dat pl6 niet meer kan binden en

daardoorr zijn remmende invloed als tumor suppressor niet kan uitoefenen. Om te

onderzoekenn of dergelijke specifieke CDK4 mutaties in het adenocarcinoom van de

pancreass voorkomen, werden DNA sequenties bestudeerd in het pl6-bindend

domeinn van CDK4 van een aantal carcinomen in de regio van de pancreaskop. Deze

analysee wordt beschreven in hoofdstuk 3. Er konden echter in het CDK4 domein,

datt ligt tussen de codons 1 en 56. geen mutaties worden aangetoond. Zodoende

makenn onze resultaten het minder waarschijnlijk dat een ontregeling van het pl6-

tumorr suppressor pad door een specifieke CDK4 mutatie bijdraagt aan het ontstaan

vann het pancreaskop carcinoom.

Eenn specifieke mutatie in het codon 24 van CDK.4 (Arginine naar Cysteine)

voorkomtt binding aan pl6 en heeft tot gevolg dat p 16 CDK4 niel meer kan

afremmen.. Deze CDK4 mutatie heeft een dominant oncogene werking lot gevolg en

wordtt aangetroffen zowel in het sporadische als ook in het familiair voorkomende

melanoom.. In de studie, zoals beschreven in hoofdstuk 4, hebben wij het effect van

144 4

Chapterr 9

anderee mutaties in CDK4 getest op hun bindingscapaciteit met pl6 door een aantal

CDK44 mutanten te genereren. Deze mutante CDK4 eiwitten werden in vitro

gemaaktt en getest op hun bindingscapaciteit met pi6 door gebruik te maken van een

pl6-GSTT fusie eiwit. Een aantal mutanten bleek inderdaad niet meer in staat om p 16

tee kunnen binden. Naast de eerder beschreven codon 24 mutant, lieten ook mutaties

inn en rond de codons 22, 25. 97 en 281 verlies van pl6 binding zien. Deze resultaten

gevenn aan dat er meerdere niet-aaneengesioten aminozuur sequenties van hei CDK4

eiwitt belangrijk zijn voor de binding met pi6. Dit zou kunnen suggereren dat er

meerderee gebieden van interactie tussen deze eiwitten bestaan. Aangezien CDK4

mett verlies van bindingscapaciteit aan p 16 een oncogene werking tot gevolg heeft,

zoudenn deze mutaties aanwezig kunnen zijn in melanomen of andere carcinomen.

Echter,, het moei nog worden vastgesteld of andere CDK4 mutaties, behoudens de

bekendee codon 24 mutatie (Arginine naar Cysteine), belangrijk zijn voor het

ontstaann van kanker bij de mens.

Inn hoofdstuk 6 wordt een studie beschreven over de voorspellende en prognostische

waardee van de status van p53, DPC4, K-ras en van de proliferatie activiteit.

uitgedruktt in het Ki-67 niveau. Hiervoor werden biopten, die afgenomen waren voor

aanvangg van de radiotherapie, gebruikt van 21 patiënten met een lokaal uitgebreid

pancreass carcinoom. De status van de genoemde biomarkers werd met behulp van

immunohistochemiee bepaald. Met uitzondering van de K-ras codon 12 mutaties, die

bepaaldd werden door middel van de polymerase kettingreactie, gevolgd door een

alle]] specifieke oligonucleotide hybridisatie. De tumor respons (gedefinieerd als een

verminderingg van omvang van de tumor 3 maanden na de behandeling), de totale

overlevingstijdd en de progress ie-vrije overleving werden bestudeerd in relatie tot de

eerderr genoemde biomarkers. Alle patiënten werden behandeld met hoog-

gedoseerdee conformatie radiotherapie, zoals beschreven in hoofdstuk 5. Het bleek

datt geen van de onderzochte biomarkers belangrijk waren voor het voorspellen van

eenn respons op de radiotherapie. Alleen DPC4 liet een trend zien. Het Ki-67 niveau

wass van significante betekenis voor zowel de totale overleving als de progressie-

145 5

Sumniar\ \

vrijee overleving. Deze bevinding wordt in de literatuur ook beschreven bij het

resectabelee pancreas carcinoom. waarbij een hoge proliferatie activiteit correleert

mett een kortere overleving.

Inn het Academisch Medisch Centrum werd een Case II studie uitgevoerd in 44

patiëntenn met een lokaal uitgebreid, niel-geinetastaseerd pancreas carcinoom. De

haalbaarheidd en de effectiviteit van hoge dosis conformatie radiotherapie werd

bestudeerdd in deze patiëntengroep. Deze studie wordt beschreven in hoofdstuk 5.

Dee patiënten werden behandeld door middel van 3-D geplande, hoog-gedoseerde

conformatiee radiotherapie (70-72 Gy in 7 weken). De toxiciteit werd gescoord

volgenss de geldende WHO criteria. Een dosis van 72 Gy. in fracties van 2Gy. bleek

toegediendd te kunnen worden zonder dat dit leidde tot verhoogde acute of late

bijwerkingen.. Er werd voornamelijk graad I en graad 2 acute toxiciteit

waargenomen.. Ernstige late toxiciteit werd gezien in 8 patiënten: 3 patiënten hadden

eenn maagbloeding, die zonder ingrijpen tot staan kwam. In 2 patiënten was

chirurgischh ingrijpen noodzakelijk, respectievelijk in verband met een

maagperforatiee in een patiënt met lokale tumor progressie en in de andere patiënt in

verbandd met een niet-tumor gerelateerde duodenum obstructie. In 3 patiënten

ontstondd een fatale gastro-intestinale bloeding. In deze gevallen was het onduidelijk

off er sprake was van lokale lumorgroei of van slijmvlies ulceraties door de

bestraling.. Drie maanden na de radiotherapie werd in 27% van de patiënten een

tumorr verkleining gezien. Een ongewijzigde tumorgrootte werd gezien in 20%,

terwijll 40% van de patiënten lokale tumor progressie hadden. Complete en partiële

remissiess werden niet gezien. De mediane overlevingstijd. gemeten vanaf het stellen

vann de diagnose, bedroeg 11 maanden. In geval van pijnklachten, kon de

behandelingg palliatie bewerkstelligen. Echter, de effectiviteit van de behandeling

mett belrekking tot een verlenging van de overlevingstijd kon niet worden

aangetoond.. Mctastasering op afstand was het grootste probleem.

146 6

Chapterr 9

Verhogingg van de radiotherapie dosis tot een potentieel curatief niveau van 72 Gy

leidtt nog steeds in een groot deel van de patiënten met een lokaal uitgebreid

pancreass carcinoom tot lokale tumor progressie. In hoofdstuk 7 werden de lokale

recidievenn bestudeerd na hoog-gedoseerde conformatie radiotherapie. Het lokale

recidieff patroon werd geanalyseerd, met als doel te beoordelen of het gekozen PTV

aanpassingg behoefde. De follow-up CT-scans van de patiënten met lokale tumor

progressiee werden gematched mei de plannings CT-scans van vóór de behandeling.

Dee ligging van het lokale recidief volume (Viim?) werd kwalitatief beoordeeld in

relatiee tot de ügging van het planning target volume (PTV) en het volume, dat

tenminstee 95% van de voorgeschreven dosis ontving. Het percentage Vpmj, buiten

hell PTV en buiten het 95%-isodose volume werd kwantitatief bepaald. In 80% van

dee patiënten bleek Vpmü binnen het hoge dosis gebied te liggen. In 20% van de

patiëntenn werd een randrecidief vastgesteld, terwijl er geen recidieven buiten het

bestralingsveldd werden gevonden. De ligging van Vprog in relatie tot het PTV was zo

verschillend,, dat geen systematisch patroon van recidief tumorgroei werd gevonden.

Volgenss deze resultaten kon geconcludeerd worden, dat er geen indicatie bestond

omm de veiligheidsmarge rond het PTV in een bepaalde richting uit te breiden.

Inn hoofdstuk 8 is getracht implicaties van de beschreven studies en de hieraan

gerelateerdee ontwikkelingen te bespreken. Bevindingen van recent moleculair

biologischh onderzoek in het genetische profiel van het pancreas carcinoom

suggererenn het bestaan van een progressie model. Dit model kan zinvol zijn. zowel

voorr de vroege detectie als ook voor mogelijke chemopreventie.

Hett Z?ZÏ-signaal transmissie pad wordt in bijna alle pancreas carcinomen verstoord

doorr uitschakeling van pi6. Voorts bestaat er een zekere mate van wederkerigheid

vann het optreden van mutaties binnen dit signaalpad. Ten tijde van de studie naar de

aanwezigheidd van CDK4 mutaties in het pl6-bindingsdomein in een serie pancreas

carcinomen,, waren de 3 mogelijke mechanismen, waardoor pl6 geïnactiveerd kan

worden,, nog niet volledig bekend. In een groep tumoren waarin p 16 meestal is

uitgeschakeld,, zoals in het pancreas carcinoom, zou het dus retrospectief gezien.

147 7

Summar\ \

minderr waarschijnlijk zijn om CDK4 mutaties aan te treffen. Tot nu toe zijn er

alleenn in het melanoom oncogene CDK4 mutaties gevonden. Onze studie en ook

anderee studies laten zien dat het pl6-bindingsdomcin van CDK4 zich voornamelijk

moett bevinden aan het amino-uitcinde van hei eiwit. In het melanoom werden

nieuwee CDK4 mutaties gevonden in de codons 22 en 41, hetgeen in lijn is met deze

hypothese. .

Dee effecten van een beperkt aantal genen zou groot moeten zijn om de

radiosensitiviteitt van een bepaald weefsel te kunnen voorspellen. Mei behulp van de

dee microarray techniek zou het wellicht mogelijk kunnen zijn om bepaalde gen-

profielenn te identificeren, die belangrijk zijn bijvoorbeeld voor de radiosensitiviteit

vann een tumor. Hopelijk zou dit nieuwe inzichten in de behandeling van hel

pancreass carcinoom kunnen bieden.

Inn lokaal uitgebreid pancreas carcinoom is de behandeling met radiochemotherapie

haalbaarr gebleken. Echter, gezien de korte levensverwachting is een lange

behandeltijdd in deze patiëntengroep niet wenselijk. Geavanceerde radiotherapie-

technieken,, die een hoge dosis bestraling in korte tijd mogelijk maken, in

combinatiee met. bij voorkeur orale, chemotherapie en /of nieuwe biologische

middelenn bieden hopelijk nieuwe mogelijkheden. Het gebruik van PET,

neoadjuvantee chemoradiatie en small molecules in de behandeling van het pancreas

carcinoomm wordt besproken.

148 8