Untersuchungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryonalentwicklung

Wilhelm Roux' Archiv 169, 1--40 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Zoologisches

Untersuchungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryonalentwicklung ( Urodela, Triturus vulgaris)

KLAUS LOHMANN*

Insti tut dcr Universit~t K61n, Lehrstuhl fiir Experimcntelle ~orphologie

Eingegangen am 18. Juni 1971

S tud ies on t h e P r o b l e m ol D N A C o n s t a n c y d u r i n g E m b r y o g e n e s i s

( Urodela, Triturus wdgaris) Summary. 1. During early embryogenesis (from morula to late tail-bud) of Triturus vul-

garis the DNA content of isolated nuclei from various regions was measured cytophotometri- cally. The measurement data (50 to 70 for each region and developmental stage) were collated to so-called karyograms, which show the ONA doubling during interphase and serve for determining the "normal" DNA content (DNA value of Gl-nuclei ).

2. Thereby it became evident that the DNA content of Gl-nuclei is not constant in the course of development, but varies with stage and region specifically. Beginning with high values, DNA decreases from morula to early gastrula. In the neuroectoderm (region 2), chordamesoderm (region 1), and endoderm (region 4) remarkable DNA increases of short duration occur at one time in the mid to late gastrula and at another time in the late neurula. By contrast in the presumptive epidermis an increase of DNA has only been detected during gastrulation.

3. With regard to the extent and rate of changes in DNA content there are good agreements on the one hand and considerable differences between various regions on the other.

4. In explantation experiments these results (with the exception of endoderm) could be confirmed for isolated material too. Thus non-induced ectoderm of the gastrula shows just the first DNA increase, but induced ectoderm shows also the second one. In isolated presumptive chordamcsoderm both phases of DNA increase are visible, whereas isolated endoderm is cha- racterized by absolute constancy of DNA.

5. In isolated ectoderm Actinomycin D (1 and 2 tzg/ml) prevents the additional DNA synthesis during gastrulation, whereas the second DNA increase is not impaired. (Actinomycin D does not interfere with the normal DNA reduplication.)

6. Puromycin (20 tzg/ml) has no influence on the DNA increase in the course of gastrulation and neurulation.

7. The temporal correlation of both phases of additional DNA synthesis with well-known embryological, cytological, and biochemical changes in the embryo leads to the assumption that the phase-specific increase of DNA is an expression of enhanced gene activity in definite regions of the embryo. The possibility of partial amplification of genes for the purpose of increase of transcription capacity is discussed, and a parallel is drawn with the multiplication of the nueleolus organizer during the maturation of ooeytes.

Zusammen/assung. 1. Wahrend der friihen Embryogenese (Morula bis gestreekte Schwanz- knospe) yon Triturus vulgaris wurde der DNS-GehMt isolierter Zellkerne aus verschiedenen Keimbereichen Feulgen-photometrisch bestimmt. Die Megwerte (50--70 pro Bereieh and Stadium) wurden zu Karyogrammen zusammengestellt, die die interphasische DNS-Ver- dopplung erkennen lassen und zur Ermitt lung des ,,normalen" DNS-Gehaltes (DNS-Menge der G1-Kerne ) dienen.

* Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. W. Vahs fiir die Anregung zu dieser Arbeit und fiir seine Unterstiitzung im Verlauf der Untersuchungen.

1 Wilhelm Roux' Archly, Bd. 169

2 K. Lohmann:

2. Dabei konnte gezeigt werden, dab die DNS-1Vfenge der G1-Kerne im Verlauf der Ent- wicklung keineswegs konstant, sondern stadien- und regionsspezifisch ver/~ndcrlich ist. Aus- gehend yon hohen Werten in der Morula nimmt die DNS-Menge zun~chst bis zur frfihen Gastrula ab. Im 1kTeuroektoderm (Bereich 2), Chordamesoderm (Bereich 1) und Entoderm (Bereich 4) findet einmal in der mittleren bis sp~ten Gastrula und ein zweites Mal in der sp~ten Neurula eine kurzfristige D~TS-Zunahme statt. In der pr~s. Epidermis (Bereich 3) ist dagegen nur w~hrend der Gastrulation eine DNS-Vermehrung festzustellen.

3. tIinsichtlich AusmaB und zeitlichem Verlauf der DNS-Ver/inderungen gibt es zwischen den Keimbereichen tells gute (Jbereinstimmungen, tells charakteristische Unterschiede.

4. In Explantationsexperimenten liel]en sich diese am Ganzkeim gewonnenen Befunde (mit Ausnahme des Entoderms) auch fiir isolierte Keimteile vollauf best~tigen. So zeigt nieht- induziertes Gastrulaektoderm lediglich die erste, induziertes Ektoderm dagegen auch die zweite DNS-Vermehrung an. Der Organisatorbereich l~13t beide DNS-Vermehrungsphasen erkennen, wohingegen explantiertes Entoderm durch eine absolute DNS-Konstanz gekennzeichnet ist.

5. Im isolierten Ektoderm verhindert Actinomycin I) in einer Konzentration von 1 und 2 ~g/ml die zus~tzliche DNS-Vermehrung wKhrend der Gastrulation, w~hrend die zweite DNS- Zunahme nicht beeintr~chtigt wird. (Die interphasischeDNS-Verdopplung ist ebenfalls unge- gest6rt.)

6. Puromycin (20 ~g/ml) hat keinen EinfluB auf die DNS-Zunahme wiihrend Gastrulation und Neurulation. (Die DNS-Replikation verli~uft normal.)

7. Die zeitliche enge Korrelation der beiden DNS-Vermehrungsphasen mit bekannten cytologischen, entwicklungsphysiologischen und biochemischen Ver~nderungen im Keim stiitzt die Annahme, duB die phasenspezifische Erh6hung des DNS-Gehaltes Ausdruck einer gesteigerten Genaktivit/it in bestimmten Keimbereichen ist. Es wird die M6glichkeit einer multiplen partiellen Replikation yon Genen zwecks Steigerung der TranskriptionskapazitKt diskutiert und eine ParMlele zur Vermehrung des Nukleolus-Organisators wKhrend der Oocytenreifung gezogen.

A. Einleitung

Aufgrund der Befunde, dab Zellkerne verschiedener Zel la r ten einer Spezies denselben D N S - G e h a l t (und zwar die doppel te Menge des jenigen der Gameten- kerne) haben, formul ie r ten Boivin, Vendre ly und Vendre ly (1948) sowie Mirsky und l%is (1949) die Theorie der DNS-Konstanz, welch e bes~gt, dab die D•S der Zel lkerne und d a m i t die genetische I n f o r m a t i o n quan t i t u t i v unver / inder t yon Zell- genera t ion zu Zel lgenerat ion wei tergegeben wird. Unte r s t f i t z t wurde diese Vorste l lung durch Markierungsversuche mi t r ad ioa k t i ve n I so topen , in denen ffir die D N S eine ~ul~erordentlich hohe Stoffwechsels tabi l i t~t nachgewiesen wurde.

DM~ jedoch im Verlau~ yon Differenzierungsprozessen sog~r erhebliehe DNS- Verdgnderungen auf t re ten k6nnen, is t sei t l~ngem bekannt . Dabe i k o m m t sowohl I )NS-Vermehrung (z.B. po lyp lo ide Drfisenzellen und polyt / ine Chromosomen) Ms ~uch DNS-Ver lus t (z. B. Chroma t ind iminu t ion und Chromosomenel iminierung bei manehen E v e r t e b r a t e n sowie K e r n s c h w u n d bei S/~uger-Erythrozyten) vor. I n diesen F/s hande l t es sich jedoch ausschlielMich um irrevers ible Vermehrung bzw. 1%eduzierung ganzer Genome oder yon Teilen davon, wobei die Kor re l a t i on zwisehen D N S - G e h a l t und Zahl der Chromosomen (bzw. der Chromonemata) gewahr t ble ibt . Das gil t auch im FM1 der Diminut ion , da man diese Chromosomen heute Mlgemein als Sammelchromosomen auffaf3t.

I m Gegensatz dazu ber ieh te te eine l%eihe yon Auto ren fiber Befunde (zu- sammengefM~t bei Roels, 1966; Hale , 1966), in denen die DNS-Menge der Zell- kerne in Abh/~ngigkeit vom F u n k t i o n s z u s t a n d var i ier t . Solche sog. funkt ionel len DNS-Ver/~nderungen wurden vornehml ich nach H o r m o n a p p l i k a t i o n und un te r

Untersuehungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryonalentwicklung 3

best immten Strel3bedingungen, wie z.B. K~lte oder Hunger, in versehiedenen tierisehen Organen beobaehtet. Zur Erkl/~rung dieser Ph~nomene n immt Roels (1. c.) zwei versehiedenartige DNS-Frakt ionen an, wobei er zwisehen genetiseh stabiler und stoffwechsellabiler DNS unterscheidet.

Mittels Autoradiographie wiesen Pele u. Mitarb. (zusammengefaBt bei Pele, 1964, 1968) in versehiedenen Geweben adulter g a t t e n und M'~use eine mitose- unabh~tngige DNS-Synthese naeh und erkl~rten diese Befunde mit dem Vor- handensein metabolisch labiler DNS. Weitere Hinweise ffir die Existenz meta- bolischer DNS ]ieferten die bioehemischen Untersuehungen von Sampson u. Mitarb. (1963), die aus waehsenden Pflanzenzellen zwei DNS-Fraktionen mit unterschiedliehem Molekulargewieht isolierten, yon denen diejenige mit dem niedrigeren Molekulargewicht auch in sp/tteren Versuehen (1966) als stoffwechsel- labil erkannt wurde.

So wie diese Experimente die yon Roels aufgestellte Hypothese stfitzen, gibt es andere, dig die Existenz funktioneller DNS-Ver~nderungen in Frage stellen. Arold und Sandritter (1967) sowie Cohn und van Duijn (1967) gelang es beispiels- weise nieht, die yon Viola-Magni (1966) und lZoels (1. c.) besehriebenen, experi- mentell induzierten DNS-Ver/tnderungen in Rattenorganen zu reproduzieren.

Weitaus interessanter als diese nur unter experimentellen Bedingungen auftretenden DNS-Ver/inderungen in adulten Geweben sind deshalb Angaben fiber DNS-Inkonstanz in embryonalen Systernen. Lison und Pasteels (1951) besehrieben Ver/~nderungen im DNS-Gehalt w/ihrend der Embryogenese yon Paracentrotus lividus. Bei Cyclops strenuus ermittelte Stich (1962) in den Prophasekernen zur 5. Furchungsteilung eine DNS-Zunahme fiber den normalen Verdopplungswert hinaus, wAhrend die nachfolgenden Telophasen wieder normale Werte zeigten.

Auch in der Wirbeltierentwicklung sind Beispiele fiir DNS-Inkonstanz besehrieben worden. So lassen die Messungen yon Moore (1957) in der Frfihentwicklung yon Rana pipiens zwei Phasen erkennen, dig junge Blastula und das Dotter- pfropfstadium, in denen die Kerne merklieh h6here DNS-Mengen enthalten. Am Hfihnehenkeim stellte Emanuelsson (1961) ebenfalls im Blastulastadium sowohl im Ektoderm als aueh im Entoderm eine starke DNS-Vermehrnng fest.

Hinsiehtlieh der Frage nach der Existenz partieller DNS-Vermehrung sind vor allem die Befunde in embryonalen Systemen yon besonderer Bedeutung, da in allen F/~llen reversible DNS-Ver~nderungen innerhalb derselben Ploidie- klasse beschrieben wurden. Dies war somit eine wesentliehe Stfitze ffir die An- nahme, dal~ wghrend der frfihen Embryogenese im Zusammenhang mit Deter- minations- und Differenzierungsprozessen aueh quantitat ive DNS-Vergnderungen auftreten.

Da in der Literatur nur wenige, oft widerspreehende Angaben zu dieser Frage vorliegen, sollte deshalb durch eigene Untersuehungen mit den inzwischen wesentlich verfeinerten Methoden der Cytophotometrie ein Beitrag zu diesem Problemkreis geliefert werden.

B. Material und Methoden

Alle Untersuchungen wurden an Keimen yon Trituru~ vulgaris in den Stadien Morula bis sp~te Schwanzknospe durchgeffihrt. Zur Entn~hme kleiner Gewebebereiche aus dem Ganz- keim wurden die bis zum gewfinschten Stadium entwickelten Keime in sterile Holtfreter-

1 "

4 K. Lohmann:

L6sung mit 0,1% Na-Debenal-Zusatz umgesetzt. Die Eihiillen und das Dotterhiiutchen wurden erst unmittelbar vor jedem Versuch entfernt.

Die Aufzueht der Explantate erfolgte in der yon Jones und Elsdale (1963) empfohlenen gepufferten Steinberg-L6sung, die auf pH 7,8--8,0 eingestellt war und ebenfMls 0,i % Na- Debenal enthielt.

Da Feulgen-photometrisehe Messungen an Sehnittpr'aparaten naturgem~B mit einem grogen Fehler behaftet sind und keine Aussagen fiber geringffigige quantitative Veriinderungen gestatten, muBte zunS~ehst ein geeignetes Verfahren zur tterstellung yon Ausstrichprgparaten gefunden werden. Die bei Blut- und Gewebsausstriehen fibliehen Techniken sind bei diesem embryonalen Material wegen der enormen Gr613e der Zellen und der Kerne nieht anwendbar, da beim Ausstreiehen und der anschlieBenden Lufttrocknung fast alle Zellkerne zerst6rt werden. Dasselbe passiert bei der Anwendung ungeeigneter Fixierungsgemisehe.

In umfangreiehen Vorversuchen erwies sich das Fixierungsgemiseh Alkohol absolut / Eis- essig im Verh~ltnis 9:1 zur Strukturerhaltung der Kerne als besonders gfinstig.

Zur Isolierung der Kerne wurde naeh der Entnahme aus den verschiedenen Keimbereichen jedes Gewebestfickchen einzeln mit einer feinen Pipette auf einen mit EiweiB-Glycerin bestri- chenen Objekttriiger gebraeht. Die Flfissigkeitsmenge war dabei so bemessen, dab das Stiiek- ehen nach dem Auftupfen yon einem kleinen Tropfen umgeben war, der wegen der Aus- trocknungsgefahr nicht auseinanderflieBen durfte. Unter dem Binokular wurde dann das Gewebestfiekchen mit Glasnadeln vorsiehtig zerzupft, wobei sieh herausstellte, dal] bei der Berfihrung mit der Tropfenoberflgehe zwar die Zellen, aber nieht die Kerne zerplatzen. Dureh vorsichtiges tteranbringen der Zellen an die Tropfenoberfliiehe gelang es daher, die meisten Zellen zu zerst6ren und damit die Kerne zu isolieren. AnsehlieBend wurde der Tropfen, in dem sich Zellkerne, Zellfragmente und auch noeh einige unbeschiidigt~e Zellen befanden, in dfinner Schieht auf dem Objekttriiger gespreitet und in noch feuchtem Zustand fixiert.

Fixiert wurde 30 rain bei Zimmertemperatur. Die Nachbehandlung effolgte 15 rain mit absolutem Alkohol. AnschlieGend wurden die Priiparate fiber Methylbenzoat und Benzol in Paraffin gebraeht und durch Erkalten an der Luft mit einem dfinnen Film fiberzogen. In diesem Zustand konnten sie bis zur Weiterbehandlung im Kfihlsehrank aufbewahrt werden.

Die Feulgen-Hydrolyse wurde nicht in der fiblichen Weise mit n HC1 bei 60 ~ C, sondern mit 5 n HClbei 20~ durehgefiihrt. Die bedeutendenVorteile der ttydrolyse bei Zimmertemperatur bei gewfinschter quantitativer Auswertung der Feulgen-Reaktion wurden in neuerer Zeit wiederholt best~tigt (Decosse und Aiello, 1966; BShm, 1968; Deiteh u. Mitarb., 1968; Fox, 1969). Da die Errnittlung des Hydrolyseoptimums in den schnellwachsenden embryonalen Geweben wegen der interphasisehen DNS-Verdopplung sehr schwierig ist, wurde die fiir Blut- und Leberzellen derselben Spezies bestimmte Hydrolysezeit auch in den Embryonalstadien angewendet. Die ttydrolysezeit betrug 30 min.

Die Herstellung des Schiffchen-Reagenzes (fuchsinsehweflige Sgure) erfolgte nach Grau- mann (1953). Gef~rbt wurde 45 min bei 20 ~ C. Die Weiterbehandlung erfolgte wie iib]ich.

Die Auswertung der ersten Serie wurde mit einem selbstkonstruierten Cytophotometer (Vahs, 1970) vorgenommen. Im Scanning-Verfahren wurde jeder Zellkern mit 60 MeBpunkten belegt und daraus die mittlere Extinktion erreehnet. Dann wurde jeder Kern mit Hilfe eines Zeichenapparates gezeichnet und seine Flgche mittels Planimeter bestimmt. Das Produkt aus der mittleren Extinktion und der Kernflgehe ergibt dann die Arbeitseinheiten (AE) als Marl [i~r die relative D2VS-Menge. Wegen des extrem hohen DNS-Gehaltes der Kerne und den daraus resultierenden ungiinstigen Extinktionen ( > 1,0) durfte nieht im Absorptionsmaximum des Feulgen-Farbstoffs von 560 nm gemessen werden. Deshalb wurde zun~ehst geprfift, bei welcher Wellenlgnge die Extinktionen < 1,0 sind. Dies war bei 500 am der Fall, bei der dann alle Messungen gemaeht wurden.

Die Auswertung der spiiteren Serien erfolgte mit dem integrierenden Mikrodensitometer naeh Deeley (1955) (Typ GN 2, Barr & Stroud, Glasgow). Um den Megfehler mSglichst klein zu halten, wurde das Leerfeld jeweils links und rechts neben jedem Kern bestimmt und der Kern selbst dreimal gemessen. Die Differenz der Mittelwerte aus Kernmessung und Leer- feldmessung ergibt die Arbeitseinheiten ffir jeden Kern. Aus dem oben angegebenen Grund wurde auch mit diesem Ger~t, das Extinktionen > 1,0 nicht mitintegriert, nicht im Absorp- tionsmaximum, sondern bei 490 nm gemessen.

Untersuchungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryonalentwicklung 5

C. Experimente 1. Entnahme der Keimteile

Es vers teh t sich yon selbst, da6 nieht das gesamte Muster aller Organanlagen

berfieksiehtigt werden konnte. Da beabsieht ig t war, die Phasen der Gastrulat ion,

Neuru]a t ion und der frfihen Embryob i ldung m6gliehst lfickenlos zu untersuehen,

wurden v ie lmehr solehe Bereiehe gew~hlt, die sich in allen Stadien des Unter-

suehungszei t raums gut identif izieren lassen. Dies sind in erster Linie die drei

embryona len Keimbl~t te r .

Im pres. Mesoderm wurde der ,,Organisator"-Bereich untersucht, der als autodifferen- zierendes Material sowie im Zusammenhang mit der primEren Induktion besonders interessant ist. Da die Lage dieses Bereichs und seine prospektive Bedeutung genau bekannt sind, ist es leieht, dieses Material in allen Entwieklungsstadien zu verfolgen. Im Falle des Neuroektoderms ist eine Mare Abgrenzung der Organanlagen nicht m6glich. Erst dutch die Verlagerung des Organisators in das Keimesinnere und die damit verbundene primEre Induktion wird die Entwicklungsrichtung des Ektoderms festgelegt. Eine Gliederung in pres. Organanlagen kann deshalb erst nach abgeschlossener Invagination vorgenommen werden. Um einen m6g- lichen Unterschied zwisehen induziertem und nieht-induziertem Ektoderm aufzuzeigen, wurde in allen Stadien Material aus dem ventralen Epidermisbereich untersucht. Bei Epidermis- zellen handelt es sich ebenso wie bei Neuralze]len um Ektodermderivate, die aber im Gegensatz zum Neuroektoderm keiner organologisehen Differenzierung unterliegen.

Die Sehnittfiihrung in den Gastrulastadien erfolgte so, dab die Keime mit einem Median- schnitt neben dem Urmund in zwei ungleiche HElften geteilt wurden, von denen jeweils die grSBere zur Entnahme der verschiedenen Gewebestficke diente. Anhand des Vogtsehen Anlage- plans wurden aus jedem Keim vier Bereiehe herausgetrennt (Abb. 1), und zwar: pres. Chorda- mesoderm (Organisatorbereieh, Bereich 1), Neuroektoderm (Bereich2), pres. Epidermis (Bereich 3) nnd Entoderm (Bereich 4).

Da in Morula und Blastula die Lage der prEsumptiven Keimbereiche noeh nicht bestimmt werden kann, beschrEnkte sich in diesen Stadien die Entnahme auf Zellen aus dem animalen and vegetativen Polbereich.

Von besonderem Interesse sind die VerhEltnisse im induzierenden und reagierenden System wEhrend der Gastrulation (Bereich 1 und 2). Deshalb wurde sorgfEltig darauf geachtet, dab das Ektoderm von seiner Unterlagerung, dem Urdarmdach, sauber isoliert und beide Regionen getrennt ausgestrichen wurden.

Die Bestimmung der Entwicklungsstadien erfolgte nach Harrison. Jedoeh wurde die Form des Urmundes in den Gastrulastadien nur zur groben Orientierung verwandt, wEhrend fiir die eigentliche Stadienbestimmung der Grad der Invagination (am Medianschnitt) diente.

In den Neurulastadien erfolgte die Entnahme der Keimteile nach einem anderen Schema. Durch einen Querschnitt in HShe der Hirn-Neuralrohr-Grenze der Medullarplatte wurde der Keim in einen vorderen und hinteren Abschnitt geteilt, Der vordere Tell der Medullarplatte mit dem darunter liegenden dorsalen Mesoderm wurde mit einem Flachschnitt yore l~estkeim getrennt. Da w/ihrend der Gastrulation immer die pres. Chordaregion berfieksichtigt worden war, wurde aus diesem Teilstfick die junge Chorda, die sich schon deutlich vom angrenzenden Somitenmaterial abhebt, herausprEpariert. Bereich 2 ist ein kleines Gewebestfiek aus dem vorderen medianen Teil der Medullarplatte, das keinen Kontakt mit dem Neuralwulst h~t. Nach den Untersuehungen yon Jacobson (1959) am Axolotl entsprieht diese Region dem sp~teren Di- bzw. Mesencephalon. Als Bereich 3 diente ventrales Epidermismaterial, das praktisch in HShe des Querschnitts dem hinteren Restkeim entnommen wurde. In gleicher Querschnittsh6he wurde der Bereich 4 aus der kompakten Entodermmasse herausgestanzt.

Die Entnahme der Keimteile in den Schwanzknospenstadien erfolgte nach dem in Abb. 2 angegebenen Schema. Zur Pr/~paration des Bereiehs 2 wurde der Kopf mit einem in Augenh6he verlaufenden Querschnitt durchtrennt. Da es nur schwer m6glich ist, die EuBerst dfinne, aber feste Epidermis sauber vom darunter liegenden Neuralmaterial zu trennen, wurde der Bereieh 2 von innen her der linken H~Ifte des l\![esencephalon entnommen. Zur Isolierung der anderen Keimteile wurde ein zweiter Querschnitt zwischen Kiemenanlagen und Beinknospe gesetzt. Aus dem vorderen Teilstfick wurde in kranialer Richtung Bereich 1, ein Teil des Chorda-

6 K. Lohmann:

a b

c 3 d

~e ~f Abb. 1 a M . Topographie der en tnommenen Keimbereiche wi~hrend Gastrulat ion und Neuru-

lat ion

Ib4~

Abb. 2. Sehnittf i ihrung und Entnahmesehema in den Schwanzknospen-Stadien

strangs, herausgel6st. Wie in den Neurulastadien so erfolgte aueh hier die En tnahme der ventrMen Epidermis (Bereieh 3) und des kompakten Entoderms (Bereieh 4) aus dem hinteren l~estkeim.

Vom t tar r i sonstadium 25 an wurden im entodermMen Bereieh zwei Regionen gesondert betrachtet , und zwar Bereieh 4, der dem kompakten ventrMen Entoderm entsprieht, und Bereich 5, Material aus der Wand des Vorderdarms. Diese Unterseheidung seheint deshalb

Untersuehungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryonalentwieklung 7

TO 8 6

4 2 0 , I, ]f,,,,J II,, J ,, I,Ih ,I,,I,I,,,,,

G1 - - S - P h a s e 2

' ' ' ' ' '2 ' ' '8 ' ;2 ; , 22 24 26 28 30 3 34 36 3 48 AE 2c 4c

Abb. 3. Ein Karyogramm zur Bestimmung des DNS-Geha]tes yon G1-Kernen. Ordhlate: Anzahl der Kerne fiir einen bestimmten AE-Wert. Abszisse: relative DNS-Menge in Arbeits-

einheiten (AE)

angebraeht, weil es unklar ist, inwieweit die Zellen aus der kompakten Entodermmasse einer sp~teren Differenzierung oder Resorption unterliegen. Im Kopfdarmbereich linden sich dagegen vornehmlieh differenzierungsf~hige ZelIen.

2. Ermittlung des DNS-Gehaltes in schnellwachsenden Geweben

Es erhebt sich die Frage, wie man den DNS-Gehalt yon Zellen aus proliferie- renden Geweben fiberhaupt bestimmen kann, da ja die Zellen ihre DNS-Menge vor jeder Mitose verdoppeln. Hale (1966) h/~lt es n~mlieh aus diesem Grund fiir m6glieh, daf3 die Mehrzahl der zitierten Ausnahmen yon der Regel der DNS- Konstanz lediglieh auf eine Nichtberfieksichtigung der interphasischen DNS- Synthese zurtiekzuffihren ist. Falls es sieh nieht um ausdifferenzierte, nicht mehr teilungsf~hige Gewebe handelt, ist es daher eine zwingende Notwendigkeit, dieses Ph~nomen bei der Ermit t lung des normalen diploiden DNS-Gehaltes zu elimi- nieren. Dies ist in einer rasch waehsenden Zellpopulation dadurch m6glich, dab man den Vorgang der DNS-Synthese dutch Messen einer genfigend grol3en Anzahl yon Kernen aus einer homogenen, sich asynehron teilenden Zellpopulation und Aufzeichnung eines Karyogramms direkt sichtbar macht. In Abb. 3 wurde auf der Abszisse der DNS-Gehal t in Arbeitseinheiten (AE) und auf der Ordinate die Zahl der Kerne fiir jeden MeBwert aufgetragen. Es finder sich ein breites Spektrum yon Mel3werten, wobei sich die Minimal- und Maximalwerte (unter Beriicksiehti- gung einer methodiseh bedingten, geringffigigen Streuung) wie 1:2 verhalten. Dieses Verhs entsprieht der DNS-Verdopplung w/~hrend der Interphase. Wegen der rasehen Teilungsfolge in frtihembryonalen Zellen befinden sich die meisten Kerne in der DNS-Synthesephase, was dureh die Hs im Karyogramm zum Ausdruek kommt. Alle Zellkerne zwisehen den beiden Extremwerten ]iegen demnach in der S-Phase. Die Kerne mit dem niedrigsten DNS-Gehal t haben noeh nieht mit der DNS-Synthese begonnen und verharren somit noch in der G~-Phase, wohingegen die Kerne mit dem hSehsten Wert die Synthese bereits beendet haben nnd sieh in der G2-Phase befinden.

Mit Hi]fe eines solchen Karyogramms l~Lgt sieh somit auch ftir proliferierende Zellen der normale DNS-Gehalt (DNS-Menge der G~-Kerne) bestimmen. •blieher-

8 K. Lohmann:

weise wird der DNS-Gehalt yon G 1- bzw. G2-Kernen diploider Zellen mit 2 e und 4c bezeichnet. Diese Begriffe sollen bei der Bespreehung der Ergebnisse jedoeh nut dann verwendet werden, wenn die G 1- und G~-Werte auch tats/ichlich der diploiden bzw. tetraploiden DNS-Menge entspreehen. Wie sieh im Verlauf der vorliegenden Untersuehung herausstellte, ist die H/iufigkeitsverteilung in den Karyogrammen keineswegs immer gleieh. Sie kann vielmehr in den versehiedenen Keimbereichen sowie in Abh/ingigkeit vom Entwicklungsstadium stark variieren. Zur Bestimmung des DNS-Gehaltes w/ire es deshalb falseh, die Mei~werte ein- faeh zu mitteln, da Unterschiede in der H/iufigkeitsverteilung zwangsl/iufig zu unterschiedlichen Mittelwerten ffihren wiirden. Aussagen fiber die wahre DNS- Menge sind deshalb nur dann m6glieh, wenn die Karyogramme die interphasische DNS-Verdopplung erkennen lassen. G 1- oder G2-Werte k6nnen dabei naeh Belieben zur Ermittlung der (relativen!) DNS-Mengen herangezogen werden. Im folgenden basieren jedoch die Angaben fiber die DNS-Menge auf dem G1-Wert , da dieser in den meisten Karyogrammen durch eine gr61~ere H/iufigkeit besser gesiehert ist.

3. DNS-Gehalt in der Normogenese

a) Neuroektoderm

Messungen mit dem selbstgo~bauten Cytophotometer

In dieser Serie wurden die Verh/iltnisse im Neuroektoderm (Bereieh 2) vom sp/iten Blastula- bis Irfihen Neurulastadium (ttarrisonstadien 8 + bis 15) untersueht. In jedem Entwicklungsstadium wurde eine untersehiedliehe Anzah] Kerne gemessen. In Abb. 4 sind die hieraus gewonnenen Karyogramme in fortlaufender Entwicklungsreihe von oben nach unten angeordnet. In allen F/illen ist die interphasische DNS-Verdopplung zu erkennen. Bei Betraehtung der Abbildung f/illt zun/iehst auf, dal~ die Karyogramme untersehiedliche AE-Werte einnehmen. Dieser Unterschied wird um so deutlicher, wenn man die G 1- bzw. G2-Werte in den einzelnen Stadien miteinander vergleicht. Die niedrigsten Werte finder man in den Stadien 10, ] l a und 15, deren Karyogramme sieh praktisch nicht unterseheiden. In den dazwisehen liegenden Stadien sind dagegen die Werte erh6ht, wobei im Stadium 12b ein Maximum erreieht wird. Ebenso seheinen auch im Stadium 8 + h6here Werte vorhanden zu sein. Die niedrigen G1-Werte der Stadien 10, l l a und 15 (gestriehelte Linie) entsprechen, wie in den naeh- folgenden Untersuehungen gezeigt wird, dem definitiven DNS-Gehalt einer differenzierten, diploiden Zelle dieser Spezies. In allen anderen Stadien liegt die DNS-Menge demnach fiber dem normalen diploiden Wert. Besonders bedeutsam ist die Tatsaehe, daI3 auch in den Stadien mit erh6htem DNS-GehMt das DNS- Verdopplungsschema klar erha]ten bleibt.

Diese Befunde waren fiir unser Untersuehungsobjekt ein erster Hinweis auf eine m6gliche echte Ausnahme yon der DNS-Konstanz. Aus der Tatsaehe, dal~ die in einer bestimmten Entwicklungsphase stattgefundene DNS-Vermehrung wieder rfickg/ingig gemacht wird, kann geschlossen werden, daI~ diese DNS- Vermehrung mit bestimmten Entwicklungsvorg/ingen im Keim koordiniert oder sogar kausal verknfipft ist.


HARR. STAr:

8+-

10-

11a -

12a-

12b-

12c-

,I,,,,h,,lll,,I,Ih,,I,l,,,,I,,,,, h,,

l[,, I,,I,,,,,,,,,,,,,I,,,,,,,,i,, i fi,llh,lJ,,I,,,,Jl,I ,, h,l,,,

n=94

n=92

n =97

ill,,, II ,, ,,,,,,,,,,, I,,,ll Jl,,,I, n=86

,Jl,,i ,J,t,,l, ,, ,, , I,l,,ll,,,,, n =76

= 'llll il [Ihlll I

,hHl,illl,ll,,,I,IIihl 2c

,,,,,,,,,, ,,I,I, ,,,

,,I ,I I1, 4c

4 Z

0

. . . . . . . . . ~ ' i ~ ' ~ ' 38 42 46 50 54 58 62 66 70 76 0 84 92 6 AE

n~93

n=96

n=08

Abb. 4. Karyogramme aus dem Neuroektoderm (Messungen mit dem selbstgebauten Cyto- photometer). Ordinate: garrison-Stadien (sp~te Blastula bis friihe Neurula). Abszisse:

DNS-Gehalt in AE. Die gestrichelten Linien geben die 2c- bzw. 4c-DNS-Menge an

Messungen mit dem Mi]crodensitometer

W~thrend sich die Messungen mi t dem se lbs tgebau ten C y t o p h o t o m e t e r vornehml ich auf die Phase der Gas t ru la t ion beschr/~nkten, wurde in der zweiten

10 K. Lohmann:

20

24

25

I hJl[,,l[ [I ILII,,,,,,,,,, I, t,,,,

,[ll,,,,t,h,,,,,,I,,,,,,t,,,,,,, , [I,, ,,, ,, ,,,,,I

,I,t,ii,L,l,i,I,

I,I ii, i,i

2c

, i, I I,d,I , h,,i

i i , , , I I,I,, ildlt,,,

,,I,l,, I

iI,l,ll,I,Ll,t,,,,

I ,11,, Ih,,I , ,,

,11 ,i II II

n

i t I

I1,1 4c

n= 70

n= 70

n = 70

n = 70

n = 70

n = 70

n = 70

n = 50

, , i , , , , , , 0 , , , , ,

22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 AE

Abb. 5. Karyogr~mme aus dem Neuroektoderm (Bereich 2) fib" die St~dien 16--25 (mittlere Neurula bis frfihe Schwanzknospe)

Laichzeit der Untersuchungszeitraum bis znr friihen Embryobfldung erweitert (Harrison-Stadien 8 + bis 25). In den verschiedenen Entwicklungsstadien wurden jeweils 50--70 Zellkerne aus dem Neuroektoderm gemessen. Mit Ausnahme des Stadiums 8-[- (Ursache unbekannt) wird in allen Karyogrammen die DNS- Verdopplung gut siehtbar. Auch hier unterliegen die GI- und G2-Werte der gleichen Ver~nderung, wie wir sie schon in Abb. 4 gesehen haben: Zungchst DNS-Verminderung bis Stadium l l a , dann Anstieg mit einem Maximum in 12b und erneuter Abfall zum Stadium 15.

Die Karyogramme der Stadien 16--25 sind in Abb. 5 zusammengestellt. Wie im Stadium 15, entspricht auch im Stadium 16 der DNS-Gehalt der Gl-Kerne dem 2c-Wert. Darauf folgt in den Stadien 17, 18 und 19 eine s DNS- Vermehrung wie wghrend der Gastrulation. I m Stadium 20 liegen die G 1- und G~-Werte wieder etwas niedriger und erreichen im Stadium 21 ihre Ausgangs-

Untersuchungen zur Frage der DNS-Konstanz in der EmbryonMentwicklung 11

16'

17'

19

20

21

24

25

,, I1,, I I J l l , , , h , , , 1

,I,,, I I I,],, ,,I ,, t I

,I I

II I II,,] ][ ,, , ,, I I

111 ,I ,,, , , ,

I , h , ,, , . .

li, I . II I . l l I . , l l . i

I I n = 6 5 I ]

J l n = 5 0

n= 66

n= 65

n= 35

n= 35

n= 30 n

2c 4c

22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 AE

Abb. 6. Karyogramme aus der pr~s. Epidermis (Bereich 3) ffir die St~dien 16--25

werte, die bis zum Stadium 25 unver~ndert bleiben. (DaB das selbstgebaute Cytophotometer h6here AE-Werte liefert als das Mikrodensitometer, ist methodiseh bedingt und daher belanglos. Da die MeBwerte ohnehin nur relative Daten darstelten, interessieren lediglieh die U~terschiede zwischen den einzelnen Sta- dien.)

b) Pr/~sumptive Epidermis

Da sieh pr/~s. Epidermismaterial erst zu Beginn der Gastrulation vom Neuro- ektoderm abgrenzen l/~Bt, beginnt die Untersuehung dieses Bereiehs im Sta- dium l l a . Vergleieht man die Karyogramme der Stadien l l a bis 15 der pr~s. Epidermis mit den entspreehenden Karyogrammen des Neuroek~oderms, so sind die G 1- und G2-Werte ftir beide Bereiehe nahezu gleieh. In den Stadien 16--25 gibt es dagegen keine Ver/~nderung (Abb. 6), d.h. der DNS-Gehalt bleibt in diesem Zeitraum v611ig unvergndert. Der Weft der G1-Kerne entspricht dabei der diploiden DNS-Menge.

12 K. Lohmann:

8*"

11a

11b-

12a -

12b-

12c -

,, , , , , , , , , , I ,I ,I,, , i ,I,l,,,,, ,,

I

I1,11,,I,I ,I, , , ll d,, J, ~ ,,,I hi,

I I , l l l l I

,,, iI, ,,I,,J,,,

i

2c

n = 48

n = 72

n = 70

n= 47

n = 50

,, , ,,,I,I

,,,,I,,I ,I

,,,, I ,,I

,,,,,l,] ,,,l,, 4c

IIIII,I I I IIII

I II II

,11,,

,I

2

0

n = 70

n = 66

n = 60

n = 71

n = 70

22 24 26 28 3B 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58AE

Abb. 7. Karyogramme aus dem Chordamesoderm (Bereich 1) fiir die Stadien 8~ bis 15

c) Chordamesoderm

Ebenso wie im Neuroektoderm beginnt auch hier die Untersuchung im Sta- dium 8 + . Zu diesem Zeitpunkt ist allerdings der Chord~mesodermbereich noch nicht lokalisierbar, weshalb man in diesem Stadium lediglich yon R~ndzonen- material sprechen darf. Das Karyogramm dieses Stadiums (Abb. 7) weicht nun ebenf~lls wie in lgegion 2 vom DNS-Verdopplungsschem~ ab. In allen folgenden Entwicklungsstadien ist dagegen die Voraussetzung der erkennbaren DNS-Ver- dopplung erffillt. Auch im Mesoderm bleibt der DNS-Gehal t w~hrend der Ent- wicklung nicht konstant, sondern folgt offensichtlich demselben Schem~ wie die beiden Ektodermregionen. Die Karyogramme lassen n/imlich im 1. Tell eine deutliche DNS-Vermehrung erkennen, wobei das Maximum wieder im Stadium 12b auftritt. D~nn erfolgt bis zum Stadium 15 eine kontinuierliche Reduzierung tier DNS-Menge. Anhand der gestrichelten Linien, die die 2c- und 4c-DNS-Menge


20

21

25

, J I, ,I II i

i I '

~lllll I ,,,

,Jl,l, I ,,,I II

, I,,,,1,,,, ,,,,,

I Ill,I, ,11 ,,I 2c

J l , , , , , I , I1,1 , , I,

,, I,I , , ] 1 , I

I

, I , I , , , , I , ] 1 1 , I

IIII l l l l l n

, I , , I ,

I I I I I

I I I I n

I0-

8

6

4

2 I I I I I I I I I 0

4c

n= 70

n= 47

n = 55

n = 50

n = 38

,= 55

,= 72

i i , i i l = , , . . . . .

22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 AE

Abb. 8. Karyogrumme aus dem Chordumesoderm fiir die St~dien 16--25

angeben, erkennt m~n, dab bis einsehlie6lich Stadium 14 in allen Entwieklungs- phasen der DNS-Gehal t der G1-Kerne fiber dem 2c-Weft liegt. Die DNS-Menge in den Stadien 15, 16, 21 und 25 entsprieht dem diploiden Weft, w~hrend die Karyogramme der Stadien 17, 18, 19 und 20 eine zweite DNS-Zunahme anzeigen (Abb. 8).

d) Entoderm

I m Blastulastadinm sind die Entodermkerne uoch so gro6, dab sie mit dem 01immersionsobjektiv 100:1 nieht gemessen werden kSnnen, weshalb in dieser Serie ers~ mit Stadium 10 (frfihe Gastrula) begonnen wurde. (Die Untersuehung jfingerer Entwicklungsstadien erfolgte sp/s unter anderen und weniger gfinsti- fen Me6bedingungem) In den K~ryogrammen der Abb. 9 f~llt besonders die ungleiehe und andersartige H/iufigkeitsverteilung der Einzelme6werte auf. Dies

14 K. Lohmann:

10

lla

11b-

12a,

12b,

12c,

13

14

15

,,ll~ II

i i

II

,I

I1[

I II III

,,, ,,h l i i,hld,,,,hl,, I,dl,,, I

l l l l , , i , , , , , ,~lli~llh,

I I I u [ l l i l I ]1 [ u Ih

I Ill ,,,,, h i I, ,, I

1

lid

111 I I

I I I I I

L I , , , I , ,

2c

n ~ 58

, I

I

I I l i

~1, llid,, L I

, ,,,,h,,,h, Hi, i,i

I, ,,, I, ,ll I d,i,,,

, I,,I i, ,I ,, I IIIIII , ,, o: ~1 I , i

,i l, ,L,, hll ,, l, o,

n~ 70

n: 50

n= 70

n : 58

n: 70

4 c

, . , . , 0 . . . . . , , , , . . . . . .

22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 AE

Abb. 9. Karyogramme aus dem Entoderm (Bereieh 4) ffir die Stadien 10--15

ist ftir die Ermit t lung der Normalwerte der DNS ohne Belang, da trotz dieser ,,schiefen" Verteilung alle Karyogramme mit dem DNS-Verdopplungsschema i]bereinstimmen. I m Gegensatz zu den anderen Keimbereiehen t/tBt sich im Ektoderm die DNS-Menge der G2-Kerne wegen deren gr613erer tIgufigkeit siche- rer best immen als die der G1-Kerne.

In Ubereins~immung mit den anderen Regionen n immt aueh im Entoderm die DNS-Menge zum Stadium l l a zun~chst ab und steigt dann w~hrend der Gastrulation bis Stadium 12b wieder an. In der Folge ist eine stetige Abnahme der Werte bis zum Stadium 17 zu verzeiehnen. Die h6heren Werte im Stadium 19 deuten auf eine zweite kurzfristige DNS-Zunahme bin, die in den Stadien 20--25 wieder rtiekl~ufig ist. Die 2e-Werte lassen erkennen, dab im gesamten Unter- suehungszeitraum die DNS-Menge im Entoderm fiber dem definitiven Niveau der anderen Regionen liegt.


e) DNS-Gehal t in den Sehwanzknospenstadien

In dieser Serie wurde die Frage geprfift, zu welehem Zeitpunkt in den Ento- dermkernen der definitive DNS-Wert eingestellt wird. Zur Festlegung des dit.~loi- den Wertes dienten jeweils Zellkerne aus dem Mesencephalon, deren Karyogramme in den Stadien 25--32 keine Vergnderungen im DNS-Gehalt erkennen lassen. Die G1-Werte entsprechen generell dem 2 e-Wert. (Da eine exakte Messung des DNS-Gehaltes yon Spermien dieser Spezies wegen ihrer aberranten Form nicht m6glich ist, wurden diese Werte lediglich zur Prfifung des Ploidie-Grades herangezogen.)

Wie bereits erw/~hnt, liegt der DNS-Gehal t der Kerne aus dem kompakten ventralen Dotterentoderm (Bereich 4) im Stadium 25 noch deutlich fiber dem definitiven Wert. Dieser Befund konnte auch in der neuen Serie best/itigt werden. In den Stadien 28 and 31 n immt die DNS-Menge langsam ab und erreieht im Stadium 32 endgfiltig den diploiden Wert.

Aueh im Entoderm aus der Vorderarmregion (Bereich 5) ist die DNS-Menge der G1-Kerne im Stadium 25 noch deutlich erh6ht. Die DNS-Abnahme erfolgt in dieser Region offensichtlich etwas schneller als im ventralen Dotterentoderm, da bereits im Stadium 31 der definitive Wert eingestellt ist.

f) DNS-Gehal t in Morula und Blastula

Vom Blastula- zum Gastrulastadium (8-~ bis 11 a) ist aus den Karyogrammen eine deutliche Abnahme des DNS-Gehaltes zu ersehen. Deshalb war es wfin- schenswert, auch die Verh/~ltnisse in noch jfingeren Entwicklungsstadien zu untersuchen. Dies war jedoch, wie schon bei der Besprechung des Entoderms erw/ihnt wurde, wegen der enormen KerngrSBe nicht ohne weiteres mSglich. Die Messungen mul3ten deshalb mit einem schwgeheren Objektiv (45:1) durchgefiihrt werden, was grundsgtzlich andere Mel3bedingungen zur Folge hat. Daher sind die Mel3werte yon einer anderen GrSl3enordnung und folglich nicht direkt mit denjenigen der spgteren Stadien vergleichbar. Trotzdem konnte aber der Ansehlul3 dadurch erreieht werden, dab die Folgestadien, die ja bereits mit dem Immer- sionsobjektiv 100:1 gemessen worden waren, noeh zusgtzlich mit dem Objektiv 45:1 gemessen wurden. Auf diese Weise erhglt man einen Umreehnungsfaktor, mit dem die neuen Werte den alten weitgehend angenghert werden k6nnen.

I m animalen Bereich nimmt der DNS-Gehal t yon der Morula (Stadium 7) bis zur spgten Blastula (Stadium 8 + ) ab. Wghrend im Stadium 8 + die zu messenden Gewebestfieke, wie bisher in allen Fgllen, einem einzigen Keim ent- s tammten, mul]ten im Stadium 8 (frfihe Blastula) bereits zwei und im Stadium 7 (Morula) sogar drei Keime ausgewertet werden, um brauehbare Karyogramme zu erhalten. Demzufolge waren im Morulastadium in jedem Prgparat nur wenige intakte nnd damit me6bare Kerne vorhanden. Bei der Prgparation noeh jiin- gerer Furehungsstadien warden dutch die Isolierung ausnahmslos alle Zellkerne zerst6rt, was eine Bestimmnng des DNS-Gehaltes wghrend der Furehung leider unm6glich machte. In spgter angefertigten Mikrotomschnitten wurden wghrend der raseh verlaufenden Furchungsteilungen fiberhaupt keine echten Interphase- kerne gefunden. Das Chromatin behglt vielmehr einen weitgehend fgdigen Aspekt, wie man es normalerweise nut in sehr frfihen Prophasen beobachtet. Dies lg6t

16 K. Lohmann:

vermuten, dag die Furehungskerne ebenfalls eine sehr zarte Membran besitzen und deshalb meehanisch aul3erst labil sind.

Ausgehend yon hohen Werten in der Morula nimmt im vegetativen Bereich die DNS-Menge zur frfihen Blastula hin ab und bleibt dann bis zur frfihen Gastrula unver/indert. Eine betr/~ehtliche Verminderung erfolgt yon Stadium 10 zu Stadium l l a . Wahrend der DNS-Gehalt der Kerne aus der animalen H/~lfte yon der Morula zur frfihen Gastrula kontinuierhch abnimmt, verl/~uft die DNS- Abnahme im vegetativen Bereich mehr stufenfSrmig, was wahrseheinlieh mat der langsameren Teilungsgesehwindigkeit dieser Zellen zusammenhangt.

g) Vergleich der verschiedenen Keimbereiche

Die bisherigen Untersuchungen haben gezeigt, dab der DNS-Gehalt innerhalb eines Keimbereiehs nieht konstant bleibt, sondern in Abh/~ngigkeit vom Entwicklungsalter betr~chtlich variieren kann, wobei die Zeitsspanne zwischen den Stadien bisher unberiicksichtigt blieb. Aul3erdem gibt es wesentliche Unter- schiede zwisehen den Keimbereiehen. Im folgenden sollen nun die Veriinderungen im DNS-Gehalt wiihrend der Normogenese zusammenfassend beschrieben werden. Hierzu wurde in Abb. 10 auf der Ordinate die DNS-Menge (in AE) und auf der Abszisse die Entwicklungsstadien sowie die Stunden naeh der Besamung aufgetragen. Jeder Kurvenpunkt gibt den DNS-Gehalt der G1-Kerne des betreffenden Karyogramms an. Allerdings besteht die MSgliehkeit, da[3 die in den Kurven dargestellten Tendenzen phasen- und regionsspezifiseher Abweiehungen v o n d e r DNS-Konstanz in Wirklichkeit noeh deutlieher sind. (Eventuelle Versehiebungen der Kurvenpunkte in den beiden Achsen kSnnten z.B. dadureh bedingt sein, dab 1. nicht im Absorptionsmaximum gemessen werden konnte und da$ 2. nur ein Keim pro Stadium ausgewertet werden konnte, wobei h~ufig eine stundengenaue Altersbestimmung nieht m5g]ich ist.)

Die Untersuchung erstreekte sich fiber den Entwicklungszeitraum zwischen Morula- und gestrecktem Schwanzknospenstadium, wobei aus teehnischen Grtin- den eine kfinstliehe Unterteilung in drei Abschnitte vorgenommen werden muBte. Vom frfihen Gastrula- (Stadium 10) bis zum frfihen Sehwanzknospenstadium (Stadium 25) sind die Mel3werte der Kurvenpunkte identiseh mit den G1-Werten der Karyogramme. Zur Ermittlung der Kurvenpunkte im ersten und dritten Abschnitt erfo]gte eine Anpassung der AE mit Hilfe eines Umrechnungsfaktors.

In des Morula haben die Kerne der animalen und vegetativen Zellen den hSchsten DNS-Gehalt, der um 45 bzw. 54% Jibes dem diploiden West (22 AE) liegt. In den folgenden Stadien nimmt die DNS-Menge im animalen Bereich, dem pr/~s. Ektoderm, bis zum Beginn der Gastrulation kontinuierlich ab. Im vegetativen Bereich verlKuft dagegen die DNS-Abnahme nicht gleichfSrmig, sondern zeigt in den Stadien 8, 8~- und 10 ein deutliches Plateau. Im Stadium l l a entspricht die DNS-Menge im Neuroektoderm und in der pr~s. Epidermis dem diploiden Wert, w/~hrend Mesoderm um etwa 9 % und Entoderm um etwa 11% h6here Werte aufweisen. Ob die Kurvenabweichungen bei animalen und vegetativen Zellen im Morula- und friihen Blastulastadium (7, 8) signifikante DNS- Unterschiede bedeuten, kann anhand der Karyogramme nicht entsehieden werden, da die Anzahl der gemessenen Kerne nicht ausreicht, um den DNS-

AE

35

30

25

20 7

% "-

..,~ "\

,_

_._

1~If"

, \"

\, ,

\ \ \\ .

..

..

.

" "'

- .

..

.

i ...

......

:.

,_::

,, ~ .

......

......

......

.. ~

,:. ,.,

~,

, =~-

--,_

. ._

'-

~._.

.~_.

._

|'.~"

"-

8, .

....

t.o

.o.,.

.. 0.

.--.~

8.

8

I f

I 1

I I

I I

I I

1tit

I

I I

I I

I I

I 8

8+

10

11a

11b

12a1

2b12

c 13

14

15

16

19

20

21

2425

28

31

32

S

tad.

(Har

r.)

17

24

29

33

36

42

46

5052

56

61

66

73

76

78

81

9294

96

110

120

130

Std

. p.

f.(1

8 ~ )

Abb

. 10

. V

er~

nder

unge

n de

s D

NS

-Geh

~lt

es

w~

,hre

nd d

er

Em

bryo

gene

se.

Ord

inat

e:

rela

tive

r D

NS

-Geh

~lt

in

AE

. A

bszi

sse:

Ent

wic

klun

gsst

~di

en

sow

ie

Stu

nd

en

nac

h

Bes

~m

ung.

E

nto

der

m

(Ber

cich

4),

bis

Sta

diu

m 8

+:

vege

tati

ver

Ber

eich

. ~

,Cho

rdam

esod

erm

(B

erei

ch 1

). ..

....

...

Neu

roek

tode

rm

(Ber

eJch

2),

~b

Sta

diu

m 2

5:

~Teu

ra]z

elle

n (M

esen

ceph

ulon

). �

9 ....

...

pr~s

. E

pide

rmis

(B

erei

ch]3

), b

is S

tad

ium

8+

: ~

nim

~le

r B

erei

ch.

--.

---

Vo

rder

dar

mw

~n

d (

Ber

eich

5)

r %

O

O

ffq

18 K. Lohmann:

Gehalt mit ausreichender Genauigkeit zu bestimmen. Wahrscheinlieh ist aber dieser Unterschied nieht real.

lm Verlau] der Gastrulation (ab Stadium 11a) er]olgt in allen Keimbereichen eine gleichsinnige DNS-Zunahme mit einem Maximum im mittleren DotterpfropL stadium (12b). Im Harrisonstadium 12b liegt die DNS-Menge der Zellkerne im Neuroektoderm und in der pr~s. Epidermis um 13%, im Chordamesoderm um 27 % und im Entoderm sogar um 34% fiber dem diploiden Wert. In dcr Folge nimmt bis zur frfihen Neuruta (Stadium 15) die DIqS-Menge in allen Bereichen ab. Im AusmaG und im Verlauf der DNS-Abnahme bestehen ]edoch betr~eht- fiche Unterschiede. W~hrend im Ektoderm und Mesoderm der DNS-Gehalt zwischen den Stadien 12b und 12c bereits stark abnimmt, ist die Verminderung in den Entodermkernen nut geringfiigig. Innerhalb des Ektoderms nimmt die DNS-Menge in der priis. Epidermis zuns starker ab als im Neuroektoderm, bleibt ]edoch dann bis Stadium 14 unver~ndert. Die h6heren Werte im Neuro- cktoderm werdcn zwischen Stadium 13 und 14 reduziert, so dab nun pr~s. Epi- dermis und Neuroektoderm wieder gleiche Werte haben. Im Stadium 15 erreichen beide Ektodermbereiche zum zweitenma] in der Entwicklung den diploiden Wert. Die Mesodermkerne erreiehen nach einer kontinuierliehen DlqS-Verminderung ab Stadium 12e im Stadium 15 erstmals den definitiven DNS-Wert. Im Ento- derm erfolgt die DNS-Verminderung im Gegensatz zu der kontinuierlichen DNS- Vermehrung mehr stufenfSrmig mit einem vorls Minimum im Stadium 15, welches aber noch etwa 16% fiber dem 2c-Wert liegt. Besondere Erw~hnung verdient die Tatsache, dal~ im Mesoderm w~hrend dieser Entwicklungsphase (Stadium 12b bis 15, HShepunkt der Gastrulation bis Beginn der Neurulation) die gr6gten quantitativen DNS-Ver~nderungen auftreten, n~tmlich eine Redu- zierung des Maximalwertes um fast 25%. W~hrend das Mesoderm bis zum mittleren Dotterpfropfstadium (12 b) weitgehend dem Entoderm angeglichen ist, nghert es sich dann mehr und mehr dem Ektoderm.

Gegen Ende der Neurulation, etwa beim SehluB des Neuralrohrs, t r i t t im Entoderm, Mesoderm und Neuroektoderm, nicht aber in der pr~s. Epidermis, eine zweite, kurzfristige DNS-Vermehrung auf. Das Ausmag dieser DNS-Zunahme betr~gt in den drei Bereicheu einheitlieh etwa 9 % und untcrseheidet sich dadureh yon der ersten DNS-Vermehrung wghrend der Gastrulation. Wegen des hSheren Ausgangswertes liegt das DNS-Maximum im Entoderm immer noch etwa 25% fiber dem diploiden Weft.

Die beiden DNS-Vermehrungsphasen unterscheiden sich abet nieht nur qnan- titativ, sondern auch qualitativ wesentlich voneinander. Die Zeitspanne der ersten DNS-Vergnderung (Zu- und Abnahme) umfaBt etwa 30 Std und erstreekt sich fiber die gesamte Gastrulation. Demgegenfiber erfolgt die zweite DNS- Ver~nderung in nur 8 Std gegen Ende der Neurulation. Der steile Verlauf der Ektodermkurven zwischen den Stadien 12a und 12e ls jedoch erkennen, dab auch bier der Itauptteil der DNS-Zunahme in annghernd gleichem Zeitraum (6 Std) und AusmaB erfolgt. Diese Ubereinstimmung trifft abet nicht ffir Meso- derm und Entoderm zu.

Naeh der zweiten DNS-Zunahme wird im Stadium 21 im Neuroektoderm zum drittenmal und im Mesoderm zum zweitenmal der Wert des definitiven DNS-Gehaltes eingestellt. Zu diesem Zeitpunkt liegt abet die DNS-Menge im


Entoderm noch etwa 13% fiber dem 2c-Weft, n immt jedoch in den folgenden Stadien allm/~hlieh ab. Bis znr frtihen Sehwanzknospe (Stadium 25) bleibt der DNS-Gehal t der iibrigen Keimbereiche unver/~ndert, w/~hrend das Entoderm noeh etwa 9 % mehr enth~lt.

I m dritten Entwicklungsabsehnitt ist der DNS-Gehal t der ~Neuroektoderm- kerne bis zum Stadium 32 (Embryo fast gestreekt) vSllig konstant. Diese MeB- werte repr/~sentieren den normalen, diploiden DNS-Gehalt der Spezies und stellen daher auch die Bezugswerte ftir das Entoderm dar. Wie die obere Kurve zeigt, behalten die Kerne des ventralen Dotterentoderms bis Stadium 28 ihren hSheren DNS-Geha]t. Erst dann ist eine Reduzierung zu verzeiehnen, bis im Stadium 32 erstmals der definitive Wert eingestellt wird. Die Zellkerne aus der Vorderdarm- wand haben im Stadium 25 denselben DNS-Gehalt wie die Kerne aus der ventralen Entodermmasse. In der Folge n immt die DNS-Menge jedoeh raseh ab und erreieht zwisehen Stadium 28 und 31 den diploiden Wert. Demnaeh wird im organologiseh differenzierten Entoderm der Endwert sehne]ler eingestellt als in der Masse des ventralen Dotterentoderms.

h) Untersuchungen zur Frage der Re~litat der DNS-Veranderungen

Weft dutch die Entnahme der verschiedenen Keimblattbereiehe der Keim zerstSrt wird, mul3te fiir jedes Entwicklungsstadium tin neuer Keim verwendet werden. Demnaeh basiert jeder Kurvenpunkt auf Mei~ergebnissen yon einem anderen Keim. Es w/~re deshalb mSglieh, zumal jeder Kurvenpunkt nur dureh einen einzigen Fall belegt ist, dal3 die besehriebenen DNS-Ver~nderungen w~h- rend Gastrulation und Neurulation gar nicht real sind, sondern lediglieh individuelle Sehwankungen im DNS-Gehal t der verschiedenen Keime widerspiegeln.

DaB die mit dem selbstgebauten Cytophotometer gemessenen Ver~nderungen im DNS- Geh~rlt w~hrend der Gastrulation rnit einem ganz anderen 1Vfel3ger/s und an neuem Eima~erial voll best~tigt wurden, spricht al]erdings sehr gegen Zufallsbefunde. Ebenso sprechen die Kurvenbilder selbst gegen zufallsbedingte Individualschwankungen: Bei der groBen Zahl yon Kurvenpunkten (= Individuen) wiirden keine Kurvenzfige Init ldar erkennbaren Tendenzen, sondern in jedem Fall ,,Zickzacklinien" auftreten, well nur diese mit Zuf~lligkeiten za erkl~ren wEren.

Um diese Frage aber t rotzdem experimentel] zu prfifen, wurde versueht, die DNS-Ver~Lnderungen im Neuroektoderm eines einzelnen Keimes nachzuweisen. Zu diesem Zweek wurde aus einer jungen Gastrula ein kleines Stfiekehen Neuro- ektoderm entnommen und die Wunde dureh vorsiehtiges Zusammensehieben der R~nder schnell wieder geschlossen. I m zu erwartenden Maximum der DNS- Vermehrung wurde dann ein zweites Ektodermstfick herausgesehnitten. Da jedoch nieht bekannt ist, ob und in weleher Weise der Eingriff die Entwicklungs- geschwindigkeit beeinfluBt und mSglieherweise das Maximum versehiebt, wurde dasselbe Experiment parallel an mehreren Keimen durehgeffihrt, wobei jeweils die zweite Entnahme zu einer etwas anderen Zeit erfolgte. AuBerdem wurde so erreicht, dab auch der Zeitraum vor und naeh dem zu erwartenden Maximum erfaBt wurde. Bei der zweiten Entnahme wurde besonders darauf geaehtet, dab nieht aueh Zellen aus dem verheilten Wundbereich entnommen warden. Ebenso wurde jedem Keim aueh ein drittes Gewebestfiek w~hrend der Neurulation entnommen, wieder zu etwas verschobenen Zeiten. Die histochemische Aufarbeitung der drei Pr~parate eines Keimes erfolgte jeweils im selben Arbeitsgang.

2*

20 K. Lohmann:

Die Karyogramme der drei photometrisch ausgewerteten Fglle lassen die interphasisehe DNS-Verdopplung klar erkennen. Die G1-Werte sind daher leieht zu bestimmen. Im ersten Keim (Nr. 10) sind diese in den drei Karyogrammen gleich und weisen somit keine Ver~nderungen im DNS-Gehalt auf. Die Karyo- gramme des zweiten Keims (Nr. 16) best~tigen aber sehr gut die DNS-Zunahme w/~hrend der Gastrulation (Stadium 12a). Im dritten Keim (Mr. 5) enth/tlt nicht das mittlere, sondern das letzte Karyogramm (Stadium 17) die h6heren DNS- Werte. Damit wird offensiehtlieh die zweite DNS-Vermehrung w~hrend der Neurulation angezeigt. Da sowohl das erste als aueh das zweite Maximum etwas Irtiher liegen als in der Hauptserie (vgl. Abb. 10; 12a statt 12b; 17 statt 19), ist anzunehmen, dag die zustgndigen zellphysiologisehen Prozesse infolge der wiederholten Wundsetzung besehleunigt wurden. Damit erkl/~rt sich aueh die Tatsaehe, dab im Keim Nr. 10 keine DNS-Ver~nderungen gefunden wurden; denn bier erfolgte die zweite Entnahme im Stadium 12b, also nach dem tat- sgehliehen Maximum.

Aufgrund dieser Befunde aus dem Neuroektoderm erseheint der SehluB berechtigt, dab generell die Untersehiede zwisehen den Entwieklungsstadien nieht durch individuelle Variabilit/~t der Keime bedingt sind, sondern reale DNS- Ver~inderungen w~ihrend der Normogenese darstellen.

4. Exlglantationsexperimente

a) Unbeeinflugte Aufzueht der Isolate

In Anlehnung an I-Ioltfreter (1938), der dureh Explantationsexperimente die untersehiedliehen Differenzierungsleistungen der versehiedenen Keimbereiehe untersucht hat, soll in den folgenden Experimenten gepriift werden, ob die oben besehriebenen DNS-Ver~nderungen aueh im isolierten Keimmaterial auftreten und damit als autonome zellphysiologisehe Phgnomene der jeweiligen Keimregion zu betraehten sind.

Als die ersten Explantationsversuehe gemaeht wurden, lagen vorerst nur die mit dem selbstgebauten Cytophotometer gewonnenen Me6ergebnisse vor. Diese hatten ergeben, dal~ der DNS-Gehalt im Neuroektoderm mit beginnender Gastru- lation vermehrt und gegen Ende der Gastrulation w i d e r reduziert wird. Die zeitlich enge Korrelation dieser DNS-Zunahme mit der prim/tren embryonalen Induktion legte es nahe, beide Ph/tnomene in ursgehliehem Zusammenhang zu sehen.

Es sollte deshalb die Frage geklgrt werden, ob undeterminiertes Blastula- ektoderm bereits die F/~higkeit besitzt, zus/~tzliehe DNS zu synthetisieren, oder ob diese F~higkeit erst wghrend der Gastrulation erworben wird.

Im Blastulastadium 8 + wurde aus der animalen tI/~lfte ein gr6Beres Stiiek Ektoderm isoliert und in zehn kleine Stiicke zerteilt. Die Gewebestiickehen eines Keimes wurden jeweils zusammen als Explantate in eine Kultursehale gebraeht und untersehiedlieh lange aufgezogen. Das Zersehneiden der Explantate in die entspreehende Anzahl Einzelstiiekehen gesehah immer unmittelbar naeh der Isolation. Die Zeitspanne zwisehen Isolation und Probeentnahme war deshalb ftir die Explantate grog genug, um sieh yon dem operativen Eingriff zu erholen und gegebenenfalls verletzte Zellen aus dem Gewebeverband zu elimi- nieren.

Untersuchunge~ zur Frage der DNS-Kons~anz in der Embryonalentwieklung 21

Naeh versehiedenen Zeiten wurde jeweils ein Stfiekehen entnommen und zu einem Prgparat verarbei~et. Die Entwieklungsstadien, denen die Explantate zur Zeit der Fixierung entspraehen, wurden anhand gleiehaltriger Kontrollkeime bestimmt. Die histoehemisehe Aufarbeitung erfolgte wiederum in einem Arbeits- gang.

Die Karyogramme der isolierten Ektodermstfiekehen zeigen in allen F~llen die interphasisehe DNS-Verdopplung an, ein klarer Beweis dafiir, dab aueh im Explantat die Zellteilung ungest6rt ablguft und damit die Vitalit~t des Gewebes roll erhalten bleibt. Vergleieht man die G1-Wer~e in den einzelnen Stadien, so wird in guter ~)bereinstimmung mit der Normogenese eine DNS-Vermehrung im H6hepunkt der Gastrulation (Stadium 12a und 12b) siehtbar.

Damit ist erwiesen, dag die wghrend der Gastrulation im Ektoderm beobaehteten DNS-Vergndernngen unabh~ngig yon Einflttssen aus benaehbarten Keim- regionen aueh antonom ablaufen k6nnen. Demnaeh besteht Iceine ursiichliche Beziehung zwischen embryonaler Indulction und DNS-Zunahme im Elctoderm. (Dieser Befund wurde sp/~ter durch dis umfassendere Untersuchnng der Normo- genese, in der fiir alle Bereiche eine DNS-Zunahme nachgewiesen wurde, best/~- tigt.)

Eine zweite DNS-Ver/~nderung, dis im Ganzkeim gegen Ende der Neurula- tion (um Stadium 19) stattfindet, seheint abet in den frfih isolierten Explantaten zu fehlen. Allerdings wissen wir aus den Ganzkeimversuehen (Abb. 10), dag diese zweite Vergnderung (auger im Entoderm und Mesoderm) nur im Neuro- ektoderm, nieht abet in der pr/~s. Epidermis auftritt. In dieser Entwieklungs- phase unterseheiden sieh demzufolge die beiden Ektodermbereiehe ganz wesentlieh. Die folgenden Experimente sollten die Frage prfifen, ob vielleieht im ~lteren isolierten Ektoderm neben der ersten aueh die zweite DNS-Vermehrung start- finder.

Junges, nieht unterlagerte8 Gastrulaelctoderm wnrde im Stadium 10 isoliert und in kleine Stiieke gesehnitten. Die Karyogramme lassen wiederum eine DNS- Zunahme im Stadium 12b, vielleieht aueh in 12a, erkennen. In den folgenden Stadien 15--22, die mit Sieherheit den Bereieh einer eventuellen zweiten DNS- Vermehrung umfassen, ist der DNS-Gehalt wieder reduziert nnd weist (ebenso wie das Blastulaektoderm) keinerlei Ver~nderungen mehr auf. Demnach ist nieht- induziertes Gastrnlaektoderm nur zur ersten, nieht aber zur zweiten I)NS-Ver- /mderung bef/~higt und verh~lt sieh damit ebenso wie die prgs. Epidermis in situ.

Aufgrund der guten lJbereinstimmung der Explantationsexperimente mit den Verh~ltnissen in der Normogenese war zu erwarten, da[3 im Explantat yon induziertem Ektoderm aueh die zweite DNS-Vermehrung stattfinden wfirde. Deshalb wurde unterlagertes Ektoderm im Stadium 12c explantiert und aufgezogen. Tag- s~ehlich lassen die Karyogramme zwisehen den Stadien 15 und 21 eine deutliche DNS-Zunahme erkennen. Dieser Untersehied zwisehen induziertem und nieht- induziertem Ektoderm zeigt, dab die zweite DNS-Vermehrung im Neuroelctoderm gegen Ende der Neurulation vonder Neuralindulction abhiingig ist.

Das Chordamesoderm (Organisatorbereieh) ist im Gegensatz zum Ektoderm zu autonomen Differenzierungen bef/~higt. Daher war es interessant zu priifen, ob die DNS-Ver~nderungen in diesem Keimbereieh ebenfalls autonom ablaufen, ohne Beeinflussung dureh den Ganzkeim.

22 K. Lohmann:

11b-

12a-

12b.

12c -

15

17

i I

' 1 I II i

'1 I

, . I ,I,

, I,I

I,I, i IZ ,

I I I I I

, ],1 ,,,I, II

I I I i l

I IIII. I

,,I,I, ,, ,I il,,I i

II I" , l l l l , Ih ,, I

I

I ' I i i,I ,ll, I,

I1' I I ,HI, ~1]1

i' ,,I,, ,,I,H ,,,11 I I

I, I,, ,,I,,1' i I

I ' I,,,,. tl,I;i, i

n=45

n=41

n=42

n=42

n=43

n = 50

n = 4 4

n = 50

n = 43

, , . . , , , , , , .

16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 AE

Abb. 11. Karyogramme yon explantiertem Entoderm einer frflhen Gastrula

Die Isolation des Organisatormaterials erfolgte im Stadium 10. Wieder wird, wie in der Normogenese sowie bei den explantierten Ektodermbereichen, um das Stadium 12b eine DNS-Zunahme vermerkt, die zum Stadium 15 bin wieder riickg/ingig gemacht wird. Die zweite DNS-Zunahme erfo]gt zwar nicht, wie erwartet, im Stadium 19, sondern wird mit einer gewissen VerzSgerung erst im Stadium 21 deutlich sichtbar. I m Prinzip entsprechen somit die Ver~nderungen im DNS-Gehalt des exp]antierten Organisatorbereichs durchaus den Verh/~ltnissen in der Normogenese sowie im explantierten induzierten Ektoderm.

Ebenso wie der Organisatorbereich ist auch das Entoderm der Gastrula als Explanta t zu autonomen (und zwar streng herkunftsgem/~Ben) Differenzierungen bef/~higt. In den folgenden Versuchen sollte deshalb auch fiir dieses Keimmaterial gepriift werden, ob die in der Normogenese auftretenden DNS-Ver/inderungen auch im Explanta t auftreten und demnach mit der autonomen Differenzierung korreliert sind.


Aus einer Iriihen und einer spgten Gastrula (Stadium 10 bzw. 12e) wurde Entoderm isoliert. Die einzelnen Explantate wurden untersehiedlieh lange (das letzte bis Stadium 21 = E n d e der Neurulation) aufgezogen und dann pr/~pariert. (Eine Isolation des Entoderms v o r Stadium 10 wurde unterlassen, da die dotter- reiehen Zellen meistens disaggregierten.)

Die Megwerte der ersten Serie sind in Abb. 11 zusammengefagt. (Die Karyo- gramme der 2. Serie sind nieht abgebildet.) In allen Karyogrammen findet sieh ein gutes 1:2-Verhgltnis der DNS-Werte. Beim Vergleieh der G1-Werte in den versehiedenen Entwieklungsstadien lassen sieh in beiden Serien weder im Ver- lauf der Gastrulation noeh gegen Ende der Neurulation irgendwelehe Ver/~nderungen im DNS-Gehalt feststellen. Diese v611ige Konstanz der DNS-Werte im explantierten Entoderm steht damit im krassen Gegensatz zu den betr~ehtliehen DNS-Vergnderungen im Ganzkeim. Dieser Befund ist gerade im zweiten Entwiek- lungsabsehnitt besonders tiberrasehend, da im gleiehen Zeitraum die hohen DNS- Werte im Entoderm des Ganzkeims stark abnehmen.

b) Versuehe mit Aetinomyein D

Mit der Einffihrung des Antibiotikums Aetinomyein D (AMD) in die experi- mentelle Embryologie war es mSglieh geworden, Entwicklungsvorg~nge unter dem Aspekt der genetisehen Aktivit/~t zu untersuchen. Bekanntlieh hemmt AMD die DNS-abh/~ngige t~NS-Synthese und bloekiert somit den Vorgang der Tram skription. Der Einflug dieses Antibiotikums auf die Entwieklung yon Amphibien- keimen ist von einer l~eihe von Autoren (zusammengefagt u.a. bei Denis, 1966) untersueht worden. Dabei stellte sieh immer wieder heraus, dag die Entwieklung zun~ehst v611ig normal weiterl~uft, dann aber im Verlauf der Gastrulation stag- niert und dag sehlieglieh die Keime zugrunde gehen. Diese ersten Experimente sind an Ganzkeimen gemaeht worden, bei denen die ,,surface coat" (Holtfreter) eine schleehte Penetration des AMD verursaeht. Um /iberhaupt Wirkungen zu erzielen, wurden deshalb sehr hohe Konzentrationen verwendet. Aus diesem Grunde wiederum blieb es hgufig fraglich, ob der Entwieklungsstillstand der spezifischen Inhibitorwirkung oder der hohen Toxizit~t des Antibiotikums zuzuschreiben ist. Um diese Sehwierigkeit zu umgehen, wurden die Untersuehun- gen an isolierten Keimteilen fortgeffihrt. Hierbei stellte Tiedemann (unverSff.) lest, dab schon bei einer Konzentration yon 2,5 ~g/ml keine RNS-Synt.hese mehr stattfindet und die Differenzierung der Gewebe vollstgndig gehemmt ist.

Die Entwieklungshemmung ws der Gastrulation war wegen der hier auftre~enden beaehtliehen DNS-Ver~nderungen fiir unsere Fragestellung yon besonderem Interesse. Da anzunehmen ist , dab der phasenspezifisehen DNS- Vermehrung eine entsprechende Synthese yon m-RNS und Enzymen vorgeschal- tet ist, sollte in den folgenden Experimenten geprtift werden, ob und in welchem MaBe AMD die interphasisehe DNS-Synthese und die w/~hrend der Gastrulation beobaehteten DNS-Vers beeinflugt.

Die Versuehe wurden ausschlieBlich an Explantaten yon Gastrulaektoderm durehgefiihrt. Die Konzentration des AMD (Serva) betrug in An]ehnung an Tiedemann u. Mitarb. (1967) 1 bzw. 2 ~g/ml Steinberg-LSsung, in der die Explain

24 K. Lohmann:

IIL

12a'

12b'

12c'

15

19

I1, I

II li

Ii,ll,I 'll,I i

,,'lhl, t

' =l I I

,I ,ll, ' I , I, ,I, I I I

IIII II II

I I I I

II,

,,I I,I

1

I I,

,,=[

III II

I,III

I,[ I,

I

II

Illl I

I I I I I I I

I I I

II dl l I I I

I I I I I

I I I

I l l l ,

I1,1, i

I I I n=40

n= 64

n=50

n= 49

n= 53

n= 66

n= 52

~=53

n =47

n =49

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 AE

Abb. 12. Karyogramme yon expl~ntiertem Ektoderm einer friihen G~strula, welches unter Einwirkung yon Actinomycin D aufgezogen wurde

tare aufgezogen wurden. Vor der Herstel lung der Ausstrichpr/tparate wurden die Gewebestficke grfindlich in AMD-freier Kulturfifissigkeit gewaschen.

E/stoderm einer friihen Gastrula wurde im Stadium 10 explantiert und die einzelnen Gewebestfickchen unter Dauereinflufi yon AMD unterschiedlich lang aufgezogen. Der Untersuehungszei t raum erstreckte sich v o n d e r frithen Gastrula


(Stadium 10) bis zur sp/~ten Neurula (Stadium 19) (Abb. 12). Auch hier lassen alle Karyogramme die interphasische DNS-Verdopplung klar erkennen. Dies steht in vollem Einklang mit den unbeeinflul3ten Explantaten und beweist, dug die DNS-Synthese whhrend der Interphase auch unter AMD-Einwirkung un- gestSrt abl/iuft. Aul3erdem konnte auch durch mikroskopische Beobachtung festgestellt werden, dub die Zellen der AMD-Explantate sich normal teilen, dub ihre Zahl ebenso zunimmt und ihre Gr6ge ebenso abnimmt wie in den Kontroll- explantaten. Hinsiehtlich der DNS-Synthese und der Teilungsfrequenz lassen sieh also keine Untersehiede zwisehen behandelten und unbehandelten Explan- taten aufzeigen, aueh nieht w~hrend und naeh der Gastrulation. Eine Ausnahme maeht aber die zusditzliche DNS-Vermehrung im Verlauf der Gastrulation. W~h- rend in den unbehandelten Explantaten der DNS-Gehalt in den Stadien 12a und 12b deutlich vermehrt und danaeh wieder auf den Ausgangswert reduziert wird, bleibt er in den AMD-Explantaten yon Stadium 11 b an v611ig unver/indert. Die DNS-Abnahme zwischen Stadium 10 und 11 b stimmt mit den unbeeinfluft- ten Explantaten fiberein. Dabei ist zu berfieksichtigen, dug die AMD-Behand- lung zwar unmittelbar nach Explantation einsetzt, die Kerne des Karyogramms 10 aber noeh unbeeinfluBt waren. Demzufolge verhindert A M D die wiihrend der Gastrulation au/tretende DNS- Vermehrung im Ektoderm, was die eingangs erwKhnte Vermutung einer Beteiligung spezifischer mRNS an diesem Proze$ sttitzt. Die Zeitspanne zwisehen Explantation und dem zu erwartenden Maximum der DNS- Zunahme betr/~gt ca. 17 Std. Da in diesem Versueh die Zellen w/ihrend der gauzen Zeit mit AMD behandelt wurden, kann natfirlieh nieht entsehieden werden, ob das Ausbleiben der DNS-Vermehrung auf der spezifischen AMD-Wirkung (Tran- skription) oder auf einer allgemeinen Hemmwirkung beruht.

Um eine eventuelle Sch/~digung der Zellen dutch eine fiberm/il~ig lunge AMD- Behandlung zu vermeiden, wurden junge Gastrulaektoderm-Explantate zun/ichst in reiner Kulturl6sung aufgezogen. 5 Std vor dem erwarteten DNS-Maximum wurden die Explantate in AMD-haltige Kulturflfissigkeit umgesetzt und weiter kultiviert. Da sic sich in der Zwischenzeit nieht zu einem loekeren Zellhaufen, sondern zu einer winzig kleinen, aber soliden Hohlkugel entwiekelt hatten, wurden sic mit einer feinen Glasnadel durchstoehen, damit das AMD auch yon innen her an die Zellen herankommt. Die Aufzucht erfolgte dann bis zum Stadium 14.

Auch in dieser Serie ist eine absolute DNS-Konstanz in den einzelnen Ent- wieklungsstadien festzustellen. Die Tatsaehe, dug aueh eine kurzzeitige Appli- kat ion yon AMD (5 stat t 17 Std) die DNS-Vermehrung w/thrend der Gastrula- tion verhindert, macht es wahrscheinlieh, daft dies tats~chlich auf der spezifisehen AMD-Wirkung beruht.

I~duziertes Neuroektoderm wurde im Stadium 12e explantiert und unter Dauereinflu[3 von AMD kultiviert. Dabei sollte festgestellt werden, ob auch die zweite DNS-Vermehrung gegen Ende der Neurulation dureh AMD verhindert wird.

In allen F/~llen lassen die Karyogramme eine ungest6rte DNS-Synthese erkennen. Darfiber hinaus zeigen die G1-Werte eine deutliehe Erh6hung des DNS- Gehaltes im Stadium 18 an, wKhrend die DNS-Menge in den Stadien 20 und 21 w i d e r dem Ausgangswert (Stadium 15) entsprieht. Dieses Experiment, welches

26 K. Lohmann:

in drei ausgewerteten Fallen fibereinstimmende Resultate lieferte, zeigt, dab AMD die DNS-Vermehrung im induzierten Neuroektoderm nieht unterbindet.

c) Versuehe mit Puromycin

Puromycin ist ebenso wie AMD ein Morphogenesehemmer. W~hrend AMD die l~NS-Synthese, d.h. die Transkription der genetischen Information, hemmt, bloekiert Puromyein die Proteinsynthese (Translation). Es hatte sieh gezeigt, dab AMD die DNS-Vermehrung im Verlauf der Gastrulation verhindert, was aui eine notwendige Synthese spezifiseher mRNS hindeutet. Mit ttilfe yon Puro- myein sollte die hier anschlieBende Frage gepriift werden, n~mlieh, ob fiir die zuss DNS-Vermehrung eine Neusynthese spezifiseher Enzyme erforderlich ist. Wenn ja, wfirde man erwarten, dab diese DNS-Vermehrung in Gegenwart yon Puromyein unterbleibt. Wenn nein, mfigte die DNS auch in den Puromyein- behandelten Explantaten phasenspezifisch vermehrt werden. In den folgenden Experimenten wurde Puromyein (Serva) in drei verschiedenen Konzentrationen angewendet: 2; l0 und 20 ~tg/ml (Ansevin, 1965).

Gastrulaektoderm wurde im Stadium 10 explantiert und unter DauereinfluB von Puromyein untersehiedlieh lange (das letzte Stiickchen bis Stadium 19) aufgezogen. Alle Isolate bildeten sehr bald kleine Hohlkugeln, deren Zellen mit zunehmendem Alter deutlich kleiner wurden. AuBerlich lie~en sieh die Explan- tare selbst bei der hSchsten Konzentration yon 20 ~g/m] nieht yon den Kon- trollen unterseheiden. Im Gegensatz zur AMD-Behandlung wurde bei der Aus- wertnng der Karyogramme keine DNS-Konstanz, sondern ebenso wie in den unbeeinfluBten Kontrollexplantaten die phasenspezifische DNS-Zunahme im Stadium 12b gefunden. Demnach hat Puromycin selbst bei einer Konzentration yon 20 ~g/ml lceinen Ein/lu[3 au[ die DNS-Veriinderungen wiihrend der Gastrula- tion.

Unterlagertes E]ctoderm einer spgten Gastrula wurde im Stadium 12e isoliert und ebenfalls unter Dauereinflug yon Puromycin kultiviert. Hierbei zeigte sich, dab induziertes Ektoderm gegeniiber Puromycin wesentlich empfindlieher ist als nicht-induziertes Ektoderm. Bei einer Konzentration yon 20 ~g/ml waren nach etwa 15 Std (Stadimn 15) die Zellen vollst~ndig disaggregiert. Erfolgte die Aufzueht bei einer Konzentration yon 10 ~g/m], so trat naeh etwa 22 Std (Sta- dium 16) eine merkliehe Aufloekerung des Zellverbandes ein. Eine solche Wh~kung war bei einer Konzentration yon 2 ~g/ml erst nach ca. 30 Std (Stadium 21) zu verzeichnen. Diese Konzentration ffihrte jedoeh nieht zu einer vSlligen Anfl6sung des Ze]lverbandes. Der VergMeh mit den Kontro]lexp]antaten ergab, dab Puro- myein die Zellteilung im induzierten Ektoderm offensichtlich verz6gert, da die Zellgr6Be in den beeinfluBten Isolaten weir weniger sehnell abnimmt als in den Kontrollen. Wegen der deutliehen Sch~digung der Zellen bei hSheren Konzen- trationen wurde nur die Behandlung mit 2 ~g/ml ausgewertet. Dabei wurde zun~chst eine Rednziernng der DNS-Menge in den Stadien 13--15 und dann ein Anstieg in Stadium 18 verzeiehnet. Dies stimmt gut mit den Ver/~nderungen in der Normogenese fiberein. Demzufolge wird aueh im induzierten Ektoderm der Verlauf der DNS-Ver~nderungen dutch Puromycin (unter diesen Bedingun~ gen) nieht beeinfluBt.

Untersuchungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryon~lentwicklung 27

D. Diskussion

1. Feulgen-Weft und DNS-Gehalt Wie die vorliegenden Untersuchungen zeigen, lassen sich mittels Cytophoto-

metrie auch in dem dynamischen Geschehen yon Entwicklungsprozessen ~ul3erst geringffigige Ver~nderungen in der St~rke der Feulgen-Reaktion yon Zellkernen nachweisen. Da dies bei der Besprechung der Befunde genere]l als Vergnderungen im DNS-Gehalt interpretiert ~4rd, soll daran erinnert werden, dal3 ja nicht DNS, sondern nur der F/~rbegrad der Feulgen-Reaktion gemessen wird. Dieser Hin- weis ist deshalb bedeutsam, weft nahezu alle bisherigen Mitteilungen fiber Abwei- chungen yon der l~egel der DNS-Konstanz auf Feulgen-photometrischen Mes- sungen beruhen. Dabei erhebt sich prinzipie]l die entscheidende Frage, ob die Sti~rke der Feulgen-Reaktion fiberhaupt der DNS-Menge proportional ist.

Atkin und Richards (1956) berichteten, dab reife menschliche Leukozyten etwa 10% weniger DNS enthielteu als andere somatisehe Zellen. Dies wurde von einer Reihe von Autoren aufgegriffen und als m6gliches Beispiel ffir DNS- Inkonstanz diskutiert (zusammengefal3t bei Hale, 1963, 1966). Doch Cooper u. Mitarb. (1963) konnten bereits nachweisen, dai~ die bei der Leukozytenreifung auftretende Reduzierung der Feulgen-Werte nicht auf Pyknose und DNS-Verlust, sondern wahrscheinlich auf die zunehmende Kondensierung des Chromatins zurfickzuffihren ist. Denn bei der Kultivierung kleiner Lymphozyten mit Phyto- Haemagglutinin vergrSl3ern die Zellen ihr Kern- und Plasmavolumen und sind nach einiger Zeit wieder in der Lage, DNS zu synthetisieren, wobei nun die Feulgen-Werte wieder dem normalen diploiden Wert entsprechen.

Ein anderes Beispiel daffir, dab physiko-chemische Ver/~nderungen der Chroma- tinstruktur den Ausfall der Feulgen-t~eaktion beeinflussen k6nnen, wurde yon Gledhill u. Mitarb. (1966) mitgeteilt. Sie fanden im Verlauf der Bullen-Spermio- histogenese (runde Spermatide bis zum ejakulierten Spermium) eine drastische Abnahme der Feulgen-Intensit~t um etwa 50%, w~hrend die UV-Absorption und damit die DNS-Menge vSlli9 unveri~ndert blieb. Gleichzeitig wurde ffir die Kernproteine eine zunehmende Basizit/it und eine Verdoppelung des Arginin- Gehaltes festgestellt. Diese Befunde, zusammen mit dem Verlust an negativen Protein-Phosphatgruppen, deuten darauf hin, dab die DNS-Proteinbindungen w~hrend der Spermienreifung fester werden, wodurch eine diehtere Paekung des Chromatins in den reifen Spermien bewirkt wird.

Dieses Problem ist in jfingster Zeit yon Noeske (1969) am Beispiel der Leuko- zyten wieder aufgegriffen worden. Er fund wiihrend der Granulozytopoese in mehreren Versuchsreihen eine Abnahme der Feulgen-Werte um 10--16%. Wurde abet die Feulgen-Reaktion nach vorheriger Extraktion der ss Kern- proteine mit 0,1 n HC1 (3 Std bei 30 ~ C) durchgefiihrt, so konnten keine unter- sehiedlichen Feulgen-Werte mehr gemessen werden. Daraus wird geschlossen, dal3 die basischen Kernproteine das l~esultat der Feulgen-Reaktion beeinflussen. Im Gegensatz dazu erzielte Gareia (1969) eine Erh6hung der Feulgen-Werte um 7--12%, wenn zuvor die Leukozyten mit hypotonischen Medien behandelt wurden (wodureh der Kerndurchmesser um 26--38 % zunimmt). Die Steigerung der F~rbeintensitiit bei Vergr613erung des Kernvolumens erreichte bei einem Dureh- messer yon 10--12 ~ ein Maximum, w~hrend yon da an keine Erh6hung der

28 K. Lohmann:

Feulgen-Werte mehr m6glieh war. Daher erseheint es zumindest fraglieh, ob die yon Noeske besehriebene Erh6hung der Feulgen-Werte tatsgehlieh auf den Verlust yon basisehem Protein zuriiekzufiihren ist. Ebensogut k6nnte eine dutch die relativ lange Salzs/turebehandlung bedingte Aufloekerung und Quellung der Kernstrukturen die Ursaehe sein.

Die Frage naeh dem Einflnit der basisehen Kernproteine auI die Feulgen- Reaktion wurde erneut yon Vaughn und Loey (1969) gestellt. Sie untersuehten bei der Krabbe Emerita analoga die Spermiogenese, in deren Verlauf die urspriing- lieh normale tiistonmenge sukzessive vollst/tndig abgebaut wird. Ftir alle untersuehten Reifungsstadien waren Feulgen-Wert, I-Iydrolysekurve und Feulgen- Absorptionskurve konstant. Dies widersprieht sehr stark der Annahme, dal3 in vivo der Ausfall der Feulgen-Reaktion dureh den Histongehalt der Kerne beein- Ilugt werde.

Die Befunde yon Gareia, Vaughn und Loey (1.e.) sowie die dort ausfiihrlich diskutierten/tlteren Ergebnisse anderer Autoren maehen es sehr wahrseheinlieh, dal3 die Iiir reife Leukozyten und Bullenspermien beriehteten Diskrepanzen zwisehen DNS-Gehalt und Feulgen-Wert materialbedingte Sonderf/tlle darstellen. Die Differenzierung dieser Zelltypen, die mit einer extremen Kondensation des Chromatins verbunden ist, fiihrt zu teilungsunf/thigen, kurzlebigen Zellen.

Obwohl aufgrund umfangreieher Literaturbefunde keine Zweifel dariiber bestehen konnten, dab bei den in der vorliegenden Arbeit untersuehten extrem groBen nnd sehr locker strukturierten Zellkernen Feulgen-Wert und DNS-Menge direkt proportional sind, wurden dennoeh die yon Noeske (1.c.) erhobenen Ein- w/tnde fiir dieses Material naehgepriift. Znn/tehst sollte festgestellt werden, inwie- welt die basisehen Kernproteine dutch HC1-Behandlung hydrolysiert bzw. extra- hiert werden. Zur Darstellung der bas. Proteine diente die Fastgreen FCF- Pufferf/trbung naeh Alfert und Gesehwind (1953). Identisehe Pr/tparate (gleieher Keimbereieh und gleiehes Entwieklungsstadium) wurden behandelt:

a) mit 5 n HC1 (30 min bei 20~ entspreehend der von uns angewendeten Feulgen-Hydrolyse,

b) mit 0,1 n HC1 (3 Std bei 30~ gem/tit der yon Deiteh (1965) und Holtz- man (1965) angegebenen Methode zur Histonextraktion, die aueh Noeske (1. e.) verwendete.

Als Mait fiir die Proteinextraktion wurde der Verlust an Aeidophilie, d.h. an ]?/trbeintensit/tt, eytophotometriseh bestimmt. Die Messung der unbehandelten Kontrollpr/tparate ergab fiir die bas. Proteine dasselbe Verdopplungsschema, wie es fiir die DNS bereits ausfiihrlieh besehrieben mlrde. Dies steht in Einklang mit Befunden von Bloeh und Godman (1955), die naehgewiesen haben, dag parallel zur DNS-Replikation aneh der Gehalt an bas. Protein verdoppelt wird. Die Kontrollwerte liegen zwisehen 26 und 52 AE. In den mit Salzs/ture vor- behandelten Pr/tparaten ist das Verdopplungssehema gest6rt. Ftir a) wurden Werte von 7--25 AE und fiir b) yon 9--28 AE gemessen. Darans geht hervor, dal3 die Feulgen-Hydrolyse mit 5 n HC1 in gleieher Weise extrahierend wirkt wie die oben angegebene Extraktionsmethode fiir bas. Proteine. Beide Verfahren wurden aueh an Froschblut- und M/tuseleberausstriehen getestet, wobei einheitlieh ein vollst/tndiger Verlust an Aeidophilie verzeiehnet wurde (Vahs, unverSff.).


(Warum in den Kernen der embryonalen Gewebe die Aeidophilie naeh Salzs~ure- behandlung nieht restlos versehwindet, ist unbekannt.)

Der Einflug der s/turel6sliehen Kernproteine auf die Feulgen-Reaktion wurde sowohl an embryonalen Kernen aus versehiedenen Entwieklungsstadien mit untersehiedliehen Feulgen-Werten als aueh an Frosehblut- und M/tuseleberausstriehen geprfift. Dabei konnte in keinem Fall naeh vorheriger Proteinextraktion eine Erh6hung der Feulgen-Werte festgestellt werden. Vielmehr wurden gegenfiber den Kontrollen geringffigig niedrigere Werte gemessen. Parallelprgparate, mit denen unmittelbar naeh der Proteinextraktion ohne zuss I-Iydrolyse die Feulgen-Reaktion durehgeffihrt wurde, zeigten sehwaehe Rotf/~rbung. Das beweist, dag bereits w/~hrend der Vorbehandlung DNS hydrolysiert wurde (Vahs, unverSff.).

Aueh Deiteh u. Mitarb. (1968) konnten ffir kleine Lymphozyten nach vorheriger Histonextraktion keine Steigerung der Feulgen-Werte naehweisen, sondern stellten infolge gesteigerter ttydrolyseempfindliehkeit einen frfiher einsetzenden DNS-Verlust und somit eine naehteilige Verschiebung der Hydrolyse- kurve fest.

Die bier besproehenen Ergebnisse anderer Autoren sowie die eigenen Naeh- prfifungen lassen den Sehlug zu, dag der Ausfall der Feulgen-Reaktion nieht yon der tIistonmenge, sondern lediglieh in Ausnahmeffi~llen yon der Kondensa- tion und Paekung des Chromatins in Abh~ngigkeit yon der KerngrSge beeinflugt wircl. Wfirden die Einw/tnde yon Noeske (1. e.) aueh ffir die embryonalen Systeme der vorliegenden Untersuehungen gelten, so ware naeh Extraktion der basisehen Proteine eine Nivellierung der Feulgen-Werte in den versehiedenen Entwiek- lungsstadien zu erwarten. Dies ist abet nieht der Fall.

Diese Befunde geben damit eine volle I~eehtfertigung ffir die Gleiehsetzung yon Feulgen-Wert und DNS-Menge.

2. DNS-Inkonstanz als Ausdruc]c unterschiedlicher Genaktivitiit

Es konnte gezeigt werden, dab in der frfihen Embryogenese yon Triturus vulgaris der DNS-Gehalt der Zellkerne (DNS-Menge der G1-Kerne ) keineswegs konstant, sondern stadien- und regionsspezifisch ver~nderlich ist. Damit ist die eingangs gestellte Frage naeh der Existenz particller DNS-Vermehrung zu bejahen, w/ihrend die Theorie vonde r DNS-Konstanz zumindest nicht allgemein- gfiltig ist.

Die hervorsteehendsten Eigenschaften dieser DNS-Ver~tnderungen sind ihre klare Stadien- und Regionsspezifit~t, was sowohl in den beiden Serien der Normo- genese als auch in den versehiedenen Explantationsexperimenten erkennbar ist. Deshalb liegt die Vermutung nahe, dab die in der mittleren bis sp~ten Gastrula und ebenso in der sp~ten Neurula ermittelte DNS-Vermehrung Ausdruck einer gesteigerten Genaktivit~t in bestimmtcn Keimbereichen ist. Diese Annahme findet eine wesentliehe Stiitze in der engen Korrelation der beiden DNS-Ver- mehrungsphasen mit grundlegenden cytologischen, entwieklungsphysiologischen und bioehemischen Ver/inderungen im Keim.

Elektronenmikroskopisehe Untersuehungen von Karasaki (1959) sowie Eakin und Lehmann (1963) zur Ektodermdifferenzierung bei Triturus pyrrhoga8ter, Tr. alpestris und Xenopus laevis lassen w~thrend der Morphogenese tiefgreifende

30 K. Lohmann:

Vergnderungen der Cytoarehitektur erkennen, die sich auf versehiedene Zell- konstituenten, wie z.B. Mitoehondrien, endoplasmatisches t{etikulum und Golgi- Apparat beziehen. Gegen Ende der Gastrulation wird das endoplasmatisehe Retikulum st/~rker kondensiert, wobei die ursprfinglieh grobe Struktur der einzelnen Elemente wesentlieh feiner wird. Die Zahl der Mitoehondrien, die bevor- zugt in Kernn/~he liegen, wird vermehrt und ihre innere Oberfl/~ehe dutch Ver- mehrung der Cristae vergr6gert. Ein typiseh ausgebildeter Golgi-Komplex ist jedoeh erst naeh abgesehlossener Gastrulation zu linden. Deutliehe strukturelle VerKnderungen werden aueh im Zellkern siehtbar. In den Furehungs- und Bla- stulastadien ist in den Interphasekernen noeh kein Nukleolus naehweisbar (Kara- saki, 1959, 1965). Hay und Gurdon (1967), Nakamura und Isoya (1968) sowie Jacob (1969) haben in diesen frfihen Stadien lediglieh sog. prim/~re Nukleolen besehrieben, die einen rein fibrillgren Aspekt zeigen. Die Bildung typiseher Nukleolen beginnt im Gastrulastadium mit einer zunehmenden Kondensation feiner Granula und erstreekt sieh bis zum frfihen Schwanzknospen-Stadium. Doeh bereits in der sp/~ten Gastrula haben die Nukleolen ihren dutch eine fibril- 1/~re und eine granul/~re Phase eharakterisierten Feinbau.

Diese Befunde deuten an, dag wghrend der Gastrulation, und zwar vor allem in der zweiten tt/ilfte, sowohl die Neuroektoderm- als aueh die pr~s. Epidermis- zellen der Cytodifferenzierung unterliegen. Die Bildung der Nukleolen in diesem Zeitraum wurde aueh fiir Mesodermzellen nachgewiesen (Karasaki, 1965). In den Entodermkernen yon Xenopus treten dagegen die Nukleolen erst im Neurula- Stadium auf (Woodland und Gurdon, 1968). Da im Verlauf der Gastrulation in allen Keimbereiehen eine betr/~ehtliehe DNS-Zunahme mit einem Maximum im mittleren Dotterpfropf-Stadium naehgewiesen wurde, ist es wahrseheinlieh, dag bier nieht nur eine zeitliehe Korrelation, sondern aueh ein ursgehlieher Zusammenhang zwisehen DNS-Vermehrung und beginnender Cytodi[ferenzierung besteht.

Vergleieht man den Verlauf der DNS-Vermehrung mit den morphogenetisehen Ver/~nderungen des Keimes, so ist mit fortsehreitender Invagination ein konti- nuierlieher Anstieg des DNS-Gehaltes zu verzeiehnen. Die zeitlieh enge Ver- knfipfung dieser DNS-Zunahme mit der embryonalen Induktion des ZNS I/~gt zungehst einen kausalen Zusammenhang vermuten. Eine solehe Beziehung besteht aber sieher nieht, da auger im induktionsabh~ngigen Neuroektoderm auch in der pr~s. Epidermis, im Chordamesoderm und im Entoderm ein gleiehsinniger Anstieg der DNS-Menge erfolgt. Dies wiederum kann so gedeutet werden, dag die Gastrulation nieht nur fiir das induzierende und reagierende System, sondern ffir den ganzen Keim eine Phase h6ehster genetiseher Aktivit/~t darstellt. In der sp~ten Gastrula verliert das Ektoderm bekanntlieh die F/~higkeit, auf pri- mate Induktionsreize zu reagieren. Dieser Kompetenzverlust stimmt zeitlieh mit dem Maximum der DNS-Zunahme fiberein. In diesem Stadium wird das ursprfinglieh pluripotente Ektoderm determiniert. Eine solehe Korrelierung yon Kompe- tenzverlust, Determination und Maximum der DNS-Vermehrung ist allerdings nut im Ektoderm m6glieh, da die Keimbereiehe mit autonomer Differenzierungs- leistung schon bedeutend friiher determiniert sind.

Gegen Ende der Neurulation finder in allen Regionen mit Ausnahme der prgs. Epidermis eine zweite kurzfristige Steigerung des DNS-Gehaltes start. Ffir diesen Zeitpunkt liegen keine elektronenmikroskopisehen Befunde fiber markante Ver-

Untersuehungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryonalentwicklung 31

gnderungen in der Ultrastruktur der Zellen vor. Das Maximum der DNS-Zunahme liegt etwa im Stadium des Neuralrohrsehlusses. In der nun beginnenden Embryo- bildung folgt auf die weitgehend beendeten Gestaltungsbewegungen der pr/~s. Keimbl/~tter die organologisehe Differenzierung. Man darf deshalb vermuten, dab der erh6hte DNS-Gehalt der spaten Neurula mit der einsetzenden OrgandiHeren- zierung verknfipft ist. Diese Annahme wird dutch die Feststellung gestiitzt, dag die Epidermiskerne in dieser Phase keine Vermehrung der DNS-Menge erfahren. Die eytologisehe Differenzierung der pr/~s. Epidermiszellen ist, wie die elektronenmikroskopisehen Untersuehungen zeigen, sehon in der frfihen Neurula praktiseh abgesehlossen. Da nun die Epidermis keine vergleiehbaren organologisehen Differenzierungen durehmaeht, liegt die Vermutung einer Korrelation zwisehen DNS-Vermehrung und Organdifferenzierung sehr nahe.

W/~hrend eytologisehe und entwieklungsphysiologisehe Kriterien nut indirekte Schlfisse fiber bereits stattgefundene Ver/~nderungen der Genaktivit/~t zulassen, ist es dureh eine Bestimmung der RNS-Syntheseraten m6glieh, Zeitpunkt und Ausmag genetiseher Aktivierung unmittelbar festzustellen. Altere Untersuehungen versehiedener Autoren (Ubersieht u.a. bei Tiedemann, 1967) hatten ergeben, dag wahrend Furehung und Blastula die l~NS-Menge pro Keim nahezu konstant bleibt, dann abet im Verlauf yon Gastrulation and Neurulation stetig ansteigt. Hierbei handelt es sieh natfirlieh vornehmlieh um Ribosomen-RNS, da diese ja den weitaus gr6Bten Anteil der Gesamt-RNS ausmaeht. Die Auftrennung in einzelne Fraktionen ergab jedoeh, dag bei Xenopus bereits in den Furehungs- stadien sog. heterogene RNS (wahrseheinlieh mRNS) synthetisiert wird (Brown und Littna, 1964), w/thrend die Synthese ribosomaler RNS erst im Gastrula- Stadium einsetzt. Woodland und Gurdon (1968) stellten allerdings lest, dag im Entoderm (Xenopus) die Synthese von finNS einige Stunden spgter, ngmlieh in der Neurula, beginnt. Eine spontane Aktivierung der Synthese yon mRNS und transfer-RNS wurde yon Baehvarova u. Mitarb. (1966) und Baehvarova and Davidson (1966) in der mittleren his spgten Blastula naehgewiesen. In einer Zeitspanne yon nut einer Stunde war eine etwa 20faehe Steigerung der Synthese- rate zu verzeiehnen.

Diese Betraehtungen sind deshalb yon Interesse, weft hier bezfiglieh der Syntheseraten einzelner I~NS-Fraktionen eine ebenso klare Regions- und Phasen- spezifit~t erkennbar ist wie im Falle der DNS-Ver/tnderungen. Die wohl nahe- liegendste Erkl/trung fiir die letzteren besteht daher in der Annahme einer Icausalen Beziehung zwischen DNS-Zunahme und RNS-Synthese. In diesem Fall wfirde eine Erh6hung des DNS-Gehaltes durch eine multiple, selektive Replikation bestimmter Gene (bzw. DNS-Absehnitte)zustande kommen. Mit Hilfe eines derartigen Meehanismus vermag die Zelle die Matrizen fiir bestimmte messenger zu ver- mehren und so in kfirzester Zeit eine bedeutende Anh~ufung yon Genprodukten zu erzielen. Dag gerade der Synthese yon Ribosomen-RNS eine besondere Bedeu- tung zukommt, wird aueh dadureh unterstriehen, dab der Nukleolus-Organisator ein polyeistroniseher Komplex ist, h~ dem viele identisehe Gene ffir 18S- und 28 S-RNS (bei Xenopus je etwa 450 pro Chromosomensatz) alternierend hinter- einander angeordnet sind (Brown und Weber, 1968).

In der Prophase der ersten Reifungsteilung linden sieh in den Ooeytenkernen versehiedener Amphibien-Spezies mehrere hundert bis tausend Nueleoli mit ringf6rmig angeordneter DNS (Miller, 1966). Mit IIilfe der t~NS-DNS Hybridi-

32 K. Lohmann:

sierungstechnik untersuehten Brown und Dawid (1968), welehe DNS-Fraktion aus Oocytenkernen und somatisehen Kernen der ribosomalen I~NS komplementgr ist. Dabei konnten sie eindeutig nachweisen, dab aussehlieglieh die Nukleolen- DNS mit rRNS Hybrid-Komplexe bildet. Demnaeh ist die Nukleolen-DNS Ms eine partielle Replikation des Nukleolus-Organisators zu verstehen. Die multiple t~eplikation der rgNS-Gene finder im Pachyt/~n, also noch vor der Ausbildung der Lampenbiirstenehromosomen, stat t (Gall, 1968).

Dieses Ph/~nomen einer exzessiven Vervielfachung des Nukleolus-0rganisators ist offensichtlieh kein SonderfM1, sondern tr i t t mSglicherweise immer dann auf, wenn in der friihen Embryogenese keine gibosomen-l~NS synthetisiert wird und der Keim daher aus dem Pool der Eizelle ,,leben" mug. Bei Insekten sind derartige Multiplikationen des Nukleolenbi]dungsortes von Lima de Faria u. Mitarb. (1966, 1969) sowie Kunz (1969) besehrieben worden. Einen direkten Beweis erbraehten Gall u. Mitarb. (1969), ebenfMls dureh I~NS-DNS Hybridisierungsversuehe.

DaB der Mechanismus einer partiellen DNS-Vermehrung nieht nur auf die Phase der Oogenese besehr/~nkt ist, sondern auch w/thrend der IndividuMentwiek- lung vorkommen kann, zeigen die sot. DNS-Puffs der Sciariden. Im Verlauf der Metamorphose findet an bestimmten Stellen der Speieheldriisenehromosomen eine exzessive DNS-Vermehrung start (Crouse, 1968; Crouse und Keyl, 1968). W/~hrend die Nukleolen-DNS extraehromosomale DNS darstellt, die nieht in das Genom miteinbezogen wird, bleibt die in den DNS-Puffs synthetisierte DNS Bestandteil der betreffenden Chromosomenloei.

Die engen Beziehungen zwisehen Nukleolenbildung, beginnender rRNS- Synthese und DNS-Vermehrung fiihren zu der Annahme, dab w/~hrend der Gastrulation, s wie in der Oogenese, die Gene des Nukleolenbildungsortes zweeks Steigerung der Transkriptionskapazit~t multipel repliziert werden. Diese Korre]ation besteht jedoch nieht fiir das Entoderm, da naeh Woodland und Gurdon (1.e.) die Synthese yon rRNS hier erst im Neuru]a-Stadium einsetzt. Dies ist aber ein Hinweis dafiir, dab nieht nur der Nukleolus-Organisator, sondern auch andere Gene selektiv vervielfaeht werden k6nnen. In der spgten Neurula dagegen sind bisher nur im Entoderm Ver/inderungen der Syntheserate bestimmter RNS-Fraktionen beschrieben worden, so dab die DNS-Zunahme im Neuro- ektoderm und Chordamesoderm nieht mit der Vermehrung bestimmter Gene korreliert werden kann. Wegen der einsetzenden Organdifferenzierung ist vielmehr mit der Replikation solcher Gene zu rechnen, die in den versehiedenen Bereichen fiir die Synthese spezifischer Gewebsproteine verantwortlich sind. Gestiitzt wird diese Vermutung durch die Tatsaehe, dag in der Epidermis, die in diesem Zeit- raum keine organologische Differenzierung durchmacht, aueh keine Steigerung des DNS-GehMtes festzuste]len ist. Da aber aueh im Entoderm zu dieser Zeit keine vergleiehbaren Differenzierungen ablaufen, h/~ngt bier die DNS-Vermehrung wahrscheinlieh rnit der beginnenden Synthese der l~ibosomen-l~NS zusammen.

Betrachtet man die (in den Kurven der Abb. 10 dargestellten) DNS-Ver/~nderungen unter dem Aspekt einer direkten Beziehung zwisehen DNS-GehMt und RNS-Syntheserate, so w/~re vor Mlem in den jiingsten Entwieklungsstadien (Morula und Blastula) mit einer besonders starken l~NS-Synthese zu reehnen. Hierfiir gibt es abet in der Literatur keinerlei Itinweise. Nun besitzen bekanntlich die Eier vieler Spezies z.T. ganz erheb]iche Mengen an eytoplasmatiseher DNS

Un~ersuchungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryonalentwicldung 33

(bei Xenopus z.B. etwa die 500faehe Menge eines diploiden somatisehen Kerns, Dawid, 1965), fiber deren Besehaffenheit und Lokalisation widerspriiehliehe Angaben vorliegen. So stellt naeh Dawid (1966) der weitaus gr613te Anteil der eytoplasmatisehen DNS Mitoehondrien-DNS dar, wghrend Braehet und Ficq (1965) sowie Hanoeq-Quert iern. Mitarb. (1968) eytoplasmatisehe DNS vornehmlieh in den Dotterplgttehen naehwiesen. Da die DNS-Menge pro Embryo wghrend Furehung und Blastula nieht entspreehend der Zellvermehrung ansteigt, sondern nahezu konstant bleibt oder nut geringffigig vermehrt wird (~bersieht bei Chen, 1960), wurde vermutet, dal3 DNS aus dem Cytoplasma-Pool in den Kern transferiert and dort zur lgeplikation verwendet wird. Obwohl dies bisher nieht naehgewiesen wurde, wfirde doeh ein soleher l~[eehanismus die hohen DNS-Werte in Morula und Blastula verstgndlieh maehen. Diese Interpretation bietet sieh aueh deshalb an, well die I{eduzierung der DNS-Menge gerade bis zu dem Zeitpunkt erfolgt, yon dem an (bei Triturus helveticus, Tr. alpestris and Tr. crista,tus) eine Zunahme des DNS-Gehaltes gemgB der Mitoserate stattfindet (Chen 1. e.). Die zeitliehe Versehiebung der DNS-Abnahme im animalen and vegetativen Pol wird offenbar dutch die langsamere Teilungsgesehwindigkeit der vegetativen Zellen bedingt.

Zum Stadium l l a bin nimmt die DNS-Menge im Ektoderm bis anf den diploiden Weft ab, wohingegen der DNS-Gehalt im Organisatorbereieh und im Entoderm deutlieh erh6ht bleibt. Wghrend der Verlauf der Mesodermkurve nach der Gastrulastion dem Ektoderm angegliehen ist, finden sieh im Entoderm welter- bin hohe DNS-Werte. In diesem Zusammenhang interessieren die bioehemischen Untersuehungen von Woodland und Garden (1968) fiber die Syntheseraten yon sigNS und rRNS im Entoderm und im l~estkeim w~hrend der Embryogenese yon Xenopus : In allen beriieksiehtigten Entwieklungsstadien wurde im Entoderm eine bedeutend (seh/~tzungsweise 5--10mal) h6here Syntheserate yon sRNS pro Zelle festgestellt als in Zellen anderer t~egionen. Die Synthese ribosomaler RNS beginnt dagegen nieht, wie im I~estkeim, im Gastrula- Stadium, sondern erst in der Neurula, erreieht abet dann ebenfalls hShere Werte. tteterogene I~NS, die weder zur sRNS- noeh zur rgNS-Frakt ion geh6rt, sondern wahrseheinlieh reigNS enthglt, wird yon der Morula an in grSl3erem Umfang synthetisiert, wobei wiederum im Entoderm die h6ehste Syntheserate gefunden wurde.

Da in den vorliegenden Untersuehungen im gesamten Untersuehungszeitraum der DNS-Gehalt im Entoderm betr~ehtlieh h6her ist als in den fibrigen Keim- bereiehen, 1/i[~t sieh unsere Interpretation gut mit den an Xenopus gewonnenen Befunden in Einklang bringen. Allerdings ist die Bedeutung einer verstgrkten I~NS-Synthese im Entoderm ffir die Entwieklung des Keimes noeh unklar. Bemerkenswert erseheint jedoeh, dab die hShere DNS-Menge der Entodermkerne gerade dann reduziert wird, wenn die Differenzierung entodermaler Strukturen einsetzt. Dies wird aus der sehnelleren Abnahme des DNS-Gehaltes in den Kernen aus der Vorderdarmwand gegentiber den Kernen aus dem kompakten ventralen Entoderm ersiehtlieh.

Die Explantationsexperimente sollten die Frage beantworten, inwieweit die DNS-Vergnderungen mit den Differenzierungsleistungen der verschiedenen gegionen korreliert sind. Im nicht-induzierten Gastrulaektoderm konnte nur die erste, nieht aber die zweite DNS-Vermehrung der sp/~ten Neurula nachgewiesen

3 Wilhelm l~oux' Archiv , Bd. 169

34 K. Lohmann:

werden. Induziertes Ektoderm dagegen liiBt auch in diesem Stadium eine deutliche DS~S-Zunahme erkennen. I m isolierten Organisatorbereich wurde sowohl die erste als auch die zweite DNS-Vermehrung beobachtet. - - Hinsichtlich der Erh6- hung des DS~S-GehMtes in der spiiten ~Teurula st immen diese Befunde in der Tat mit den unterschiedlichen Differenzierungspotenzen der verschiedenen Keim- bereiche fiberein. Bekanntlich ist nut das induzierte Ektoderm zu einer organo- logischen Diiferenzierung befiihigt, w~hrend nicht-induziertes Ektoderm ]ediglich atypische Epidermis bildet. Demgegenfiber ist der Organisatorbereich in der Lage, sich autonom zu mesodermMen Strukturen zu diiferenzieren. Damit finder die Annahme, dab die zweite DNS-Zunahme im 5~euroektoderm und Chordamesoderm mit der Organdifferenzierung verknfipft ist, eine starke Stfitze. AuBerdem beweist die gute ~bereinst immung der Befunde aus den Explantationsexperimenten mit denen aus der Normogenese, daI~ die beschriebenen DS~S-Vers gut reproduzierbar und damit real sind.

V611ig unerwartete Ergebnisse lieferten jedoch die Messungen an isoliertem Entoderm, das ebenfMls autonome Entwicklungspotenzen besitzt. Ffir dieses KeimmateriM konnte im Isolationsversuch weder die erste noch die zweite DNS- Vermehrung nachgewiesen werden. Vielmehr zeichneten sieh die einzelnen Isolate durch eine absolute DNS-Konstanz aus. Da die DNS-Veriinderungen im Ento- derm offenbar durch den Ganzkeim reguliert werden, darf man vermuten, dab der hohe DNS-GehMt und auch die verst~rkte RINS-Synthese nicht ausschlieBlich der Realisierung der entodermMen Differenzierungen dienen, sondern darfiber hinaus ffir die Entwicklung des ganzen Keimes yon grol~er Bedeutung sind. Eine solche Sonder- und Vorrangstellung des Entoderms in der frfihen Embryogenese wird durch die Untersuchungen yon Nieuwkoop (1969) deutlich gemacht: Ver- einigt man ira frfihen Blastula- Stadium Material vom vegetativen (prgs. Entoderm) und yore animMen Pol (prgs. Ektoderm), so erfolgt iiberraschenderweise eine nahezu normale Entwicklung, obwohl das Kombina t keinerlei RandzonenmateriM und daher auch keinen prgs. Organisator enthglt. I t ieraus wurde geschlossen, daI~ nicht der Organisatorbereich, sondern das Entoderm der primgre embryonale Determinator ist, der seinerseits erst die Bildung des mesodermalen Organisators ,,induziert '~ (und zwar aus Ektodermmaterial) .

Actinomycin D verhindert in einer Konzentration yon 1 und 2 >g/ml die zusgtzliche D~TS-Vermehrung wghrend der Gastrulation, wghrend die DS~S- Replikation und aueh die Zellteilung ungest6rt ablaufen. Da jedoch in Kulturen von differenzierten Geweben dutch AMD die DNS-Synthese generell und damit auch die Mitose blockiert wird (Mittermayer u. Mitarb., 1968; Epifanova, 1969), mul~ man annehmen, dal~ die zellphysiologischen Prozesse wghrend der Pro- liferation embryonaler Zellen durch langlebige talONS gesteuert werden. Das Ausbleiben der phasenspezifischen DNS-Zunahme wiire deshalb am einfachsten mit einer Blockierung der erforderlichen Neusyuthese yon mR~NTS zu erkliiren. Es ist aber ebensogut denkbar, dal~ AMD nicht nur indfi~ekt fiber eine Hemmung der Transkription wirkt, sondern die DNS-Synthese unmittelbar am DS~S- Molekfil inhibiert. Diese Vermutung stiitzt sich vor allem darauf, dal~ nur die erste, nicht aber die zweite DNS-Vermehrung durch AMD unterdrfickt wird. Man kann ngmlich schwerlich annehmen, daI~ nur die DNS-Vermehrung wghrend der Gastrulation, nicht aber die gegen Ende der Neurulation, auf die Synthese


yon tuRNS und spezifischer Enzyme angewiesen sei. Die unterschiedliche AMD- Empfindlichkeit ist deshalb ein Itinweis daf~r, dal~ zumindest im Ektoderm w/~h- rend Gastrulation und Neurulation jeweils verschiedene Gene partiell repliziert werden.

Die biologische Wirksamkeit yon Actinomyein D beruht auf seiner F/~higkeit, mit der DNS (und zwar spezifisch mit Guanin) Komplexe zu bilden (l~bersicht bei Reich u. Mitarb., 1967; Waring, 1968). Die festeste Bindung erfolgt an n~tiver, doppelstr/~ngiger DNS, wobei die Menge an gebundenem AMD vom Guanin- Gehalt der DNS abh/~ngt. Aufgrund der Basenzusammensetzung yon Ribosomen- I%NS schlossen Wallace und Birnstiel (1966), dab rRNS-Gene (rDNS) etwa 63% Guanylss und Cytidyls~ure enthalten, w~hrend der Anteil dieser Nukleotide in der Gesamt-DNS nut etwa 40 % betr/~gt. Man darf deshalb annehmen, da~ am Nukleolenbildungsort wegen des hier betr/~chtlich h6heren Guanin-Gehaltes eine bevorzugte Bindung yon AMD erfolgt. Wie Reich u. Mitarb. (1. c.) nachwiesen, bewirkt die Bindung des AMD eine Stabilisierung der DNS gegenfiber thermiseher Denaturierung. Diese Stabilisierung hs jedoch wesentlich vom Verh~ltnis AMD:DNS ab und bedeutet, da{~ die Auftrennung der DNS-Doppelhelix in die beiden Einzelstr/~nge verhindert wird. Da nun ffir die Repiikation zumindest eine lokale Trennung der Einzelstr~nge erforderlich ist, erscheint es nicht welter ver- wunderlich, dal~ in den Fallen, in denen die Strangtrennung durch AMD verhindert wird, auch die DNS-Synthese gehemmt ist (Reich, 1. c.). - - Unsere Befunde lassen sich deshalb am besten mit der Annahme erkl~ren, dab die zuss DNS-Vermehrung w~hrend der Gastrulation eine partielle Replikation yon rDNS darstellt, die wegen des hohen Guanin-Gehaltes dieser Gene durch AMD blockiert werden kann.

Die Puromycin-Experimente sollten die Frage kl~ren, ob ffir die partielle DNS-Replikation eine Neusynthese spezifischer Enzyme erforderlieh ist oder nicht. Da unter nnseren Versuchsbedingungen Puromycin die zus~tzliche DNS- Vermehrung in gar keiner Weise beeinflu{3t, ist diese Frage zu verneinen. Somit liefern diese Ergebnisse weitere Anhaltspunkte daffir, dab die Verhinderung der DNS-Zunahme im Verlauf der Gastrulation dutch AMD nicht prim/~r auf die Unterdriickung der Transkription, sondern in der Tat auf eine direkte Hemmung der DNS-Synthese zurfickzuffihren ist.

Obwohl diese Befunde mit unserer Vorstelinng in vollem Einklang stehen, bedfirfen sie einer besonders kritischen Betrachtung. Bekanntlich enthalten frfihembryonale Zellen einen betr~chtlichen Vorrat an RNS, u.a. tuRNS [wahrscheinlich in m~skierter Form (,,Informosomen") (Spirin, 1966)], so dai] ffir die Entwickinng zun~chst keine RNS-Synthese notwendig ist, wie u.a. anhand entkernter Eier bewiesen werden konnte. Bei vSlliger Blockierung der Protein- synthese dagegen ist eine normale Entwicklung nieht denkbar, da zumindest naeh der Furchung ( : - Aufteilung sehon vorhandenen Materials auf die Blastomeren) fiir die weitere Zellvermehrung eine Neusynthese der versehiedensten Struktur- proteine unerl~131ich ist. Die Anwendung yon Proteinsynthese-Hemmern bei schnellwachsenden Geweben ist deshalb hSchst problematisch, da einerseits bei zu hohen Konzentr~tionen die Entwieklung sehr bald zum Stillst~nd kommt und andererseits bei niedrigeren Konzentrationen nicht die Gew~thr einer ausreichenden Hemmung gegeben ist. Naeh Grunz (1969) unterdrfickt Puromyein selbst bei der

3*

36 K. Lohm~nn:

h5chsten yon uns angewendeten Konzentration (20 ~g/ml) die Proteinsynthese in Axolotl-Keimen nur zu 66 %. Sollte dies auch for Triturus vulgaris zutreffen, so bleibt es fraglich, ob die Puromycin-Versuehe zur Sttitzung der oben entwiekelten Vorstellungen herangezogen werden kSnnen.

Da proliferierende Zellen w~hrend der Interphase ihren D~S-Gehal t ver- doppein, wurde stets besonders erw~hnt, dab dies aueh in allen Karyogrammen klar zum Ausdruek kommt. Fiir benaehbarte Entwicklungsstadien, die sieh in ihrem D~S-Gehal t unterseheiden, ist diese Feststellung aber keineswegs selbst- verst~ndlich, sondern sie wirft die Frage auf, in weleher Phase des Zellzyklus diese zusi~tzliche DNS synthetisiert wird. Wiirde die Synthese ausschlieBlieh in der S-Phase erfolgen, so m~iBte eine multiple partie]le Replikation zuerst in einem gesteigerten DNS-Gehalt der G~-Kerne zum Ausdruck kommen. Erst naeh der vollzogenen Mitose w~re dann aueh in dell G1-Kernen eine erh5hte DNS-Menge zu erwarten. Eine derartige Verschiebung innerhalb der Karyogramme unmittelbar vor den Stadien mit erh6htem DNS-Gehalt konnte jedoeh nieht festgestellt werden. Deshalb ist anzunehmen, daB die Synthese zu~tzlicher D N S sehon in der Gl-Phase des Zellzyklus beginnt und unabhiingig ist yon der normalen interphasischen DNS-Verdopplung (Lohmann und Vahs, 1969). Ob m6glicherweise bereits in der Telophase DNS synthetisiert wird, geht aus unseren Untersuchungen nicht hervor, da aus technischen Grtinden nur vereinzelt Mitosestadien gemessen werden konnten. Dennoch ist diese MSglichkeit nicht vSllig auszuschlieBen: Kiefer und Mittermayer (1968) stellten an Gewebekul~urzellen sehon in der Telo- phase eine l%NS-Synthese yore gleichen Ausma~ wie in der Gl-Phase lest. Die Entstehung der Oocyten-Nukleolen im Pachytgn der ersten meiotischen Prophase ist dagegen ein direkter Hinweis daftir, daft eine lokale DNS-Vermehrung tat- sgchlich auch auBerhalb der normalen Replikationsphase auftreten kann. Him sichtlich der l%eduzierung der DNS-Menge gelten ghnliche Uberlegungen, nut mit umgekehrtem Vorzeiehen: Auch hier wgre eine Verschiebung innerhalb der Karyogramme zu erwarten, wenn die zusgtzliche DNS lediglieh dureh die Folge der Mitosen herausverdtinnt wtirde. Die Befunde, dab in den verschiedenen Keimbereichen die Abnahme des DNS-Gehaltes sehr unterschiedlieh verlguft, lassen vielmehr eine strenge Regelung erkennen. In einer friihen Phase des Zell- zyklus wird die DNS-Menge anscheinend um einen bestimmten Betrag reduziert und der verbleibende Rest in der S-Phase mitrepliziert. Auf diese Weise erfolgt eine sukzessive Verminderung der DNS-Menge bis auf den definitiven Wert.

Diese Feststelinng, daB die DRTS-Vergnderungen wghrend der Embryogenese reversibel verlaufen, lgBt eine weitere Parallele zur Nuldeolen-Bildung in der Oogenese vermuten: Die vielen Kopien des Nukleolus-Organisators verbleiben ngmlich nieht am Entstehungsort, sondern werden vom Chromosom abgelSst und sind als ringfSrmige D~S in den Nukleolen nachweisbar. Damit ist die Gewghr gegeben, dab eine partielle Replikation nicht auch gleichzeitig das Genom vet- gndert. Diese Forderung gilt natfirlich in gleicher Weise lfir die DIxTS-Vergnderun- fen in der frtihen Embryonalentwicklung. Denn wie die Kerntransplantations- experimente yon Gurdon (1968) beweisen, sind Determinations- und Differen- zierungsvorggnge nicht mit irreversiblen Vergnderungen des Genoms verknfipft.

Eine ausgezeichnete Interpretationsm6glichkeit fiir die schrittweise verlaufende Vermehrung und Reduzierung der DINS-Menge bieten die Chromosomen-Modelle

Untersuchungen zur Frage der DNS-Konstanz in der EmbryonalentwicMung 37

von Keyl (1965) und Whitehouse (1967): Die 2-, 4-, 8- oder 16real hSheren DNS- Mengen in einigen Banden der Speicheldrfisenchromosomen yon Chironomus thummi thummi gegenfiber den homologen Qucrscheiben der Un te r a r t piger wird mit der A n n a h m e erkl~trt, dal3 die Querscheiben ringf6rmige Replikat ionsein- hei ten darstellen, in denen im Verlauf der Evolu t ion lokalc DNS-Verdopplungen s ta t tgefunden haben. - - Die Schleifen der Lampenbi i r s tenchromosomen werden hente als serielle Dupl ika t ionen identischer Gene aufgefagt (Mastergen-Sklaven- gen-Hypothese naeh Callan, 1967). Aufgrnnd yon I~ekombinat ionsdaten n i m m t Whitehouse (1. e.) an, dab die Genkopien ringf6rmig angeordnet sind u n d vor der meiotisehen Paa rung dureh einen Crossover-Meehanismus zwisehen dem ersten und letzten Gen vom Chromosom abgel6st werden kSnnen. Ubertr/~gt m a n diese Modelle auf die frfihe Embryogenese, so sind die beschriebenen DNS-Veriinde- rungen einerseits als lokale Verviel/achung von Genen und andererseits als partielle Eliminierung identischer Genkopien zu verstehen.

Literatur

Alfert, M., Geschwind, J. J. : A selective staining method for the basic proteins of cell nuclei. Proc. nat. Acad. 8ci. (Wash.) 39, 991--999 (1953).

Ansevin, K. D. : The effects of RNA synthesis inhibition and protein synthesis inhibition on embryonic induction and cell differentiation in Rana pipiens. J. Morph. 117, 171--184 (1965).

Arold, 1~., Sandritter, W.: Zytophotometrische Bestimmungen des DNS-Gehaltes yon Zell- kernen des Nebennierenmarkes, der Nebennierenrinde und der 8childdriise unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Histochemie 10, 88 97 (1967).

Atkin, N.B., t~ichards, B.M.: Deoxyribonucleic acid in human tumors as measured by microspectrophotometrie of Feulgen stain: A comparison of tumors arising at different sites. Brit. J. Cancer 10, 769--786 (1965).

Bachvarova, P~., Davidson, E. H. : Nuclear activation at the onset of amphibian gastrulation. J. exp. Zool. 163, 285--296 (1966).

- - - - PAlfrey, V. G., Mirsky, A.E. : Activation of P~NA synthesis associated with gastrulation. Proc. nat. Aead. Sci. (Wash.) 55, 358--365 (1966).

Bloch, D.P., Godman, G.C. : A microspectrophotometric study of the synthesis of DNA and nuclear histone. J. biophys, biochem. Cytol. 1, 17--28 (1955).

B6hm, N. : EinfluB der Fixierung und der Siiurekonzentration auf die Feulgen-I-Iydrolyse bei 28 ~ C. Histochemie 14, 201--211 (1968).

Boivin, A., Vendrely, I~., Vendrely, C. : L'acide d~soxyribonucl~ique du noyau cellulaire, d@ositaire des caract~res h~r~ditaires. C.t~. Acad. Sci. (Paris) 226, 1061--1063 (1948).

Brachet, J., Ficq, A. : Binding sites of l~C-actinomycin in amphibian oocytes and an auto- radiography technique for the detection of cytoplasmic DNA. Exp. Cell t~es. 38, 153--159 (1965).

Brown, D.D., Dawid, I.B.: Specific gene amplification in oocytes. Science 160, 272--280 (1968).

- - Littna, E. : RNA synthesis during the development of Xenopus laevis the South African Clawed Toad. J. melee. Biol. 8, 669--687 (1964). Weber, C.S.: Gene linkage by RNA-DNA hybridization: I. Unique DNA sequences homologous to 4S RNA, 58 RNA and ribosomal RNA. J. molec. Biol. 34, 661--697 (1968).

Callan, H. G. : The organization of genetic units in chromosomes. J. Cell 8ci. 2, 1--7 (1967). Chen, P. 8. : Changes in DNA and I~NA during embryonic urodele development. Exp. Cell

Res. 21, 523--534 (1960). Cohn, N.S., Duijn, P. van: Constancy of DNA content in adrenal medulla nuclei of cold-

treated rats. J. Cell Biol. 33, 349--354 (1967).

38 K. Lohmann:

Cooper, E.H., Barkhan, P., Hale, A. J. �9 Observations on the proliferation of human leucocytes cultured with phytohaemagglutinin. Brit. J. Haemat. 9, 101--111 (1963).

Cronse, :H. V. : The role of ecdysone in DNA-puff formation and DNA synthesis in the polytene chromosomes of Sciara coprophila. Proc. nat. Aead. Scfl (Wash.) 61, 971--978 (1968).

- - Key], H.-G.: Ex t r a replications in the ,,DNA~puffs ~ of Sciara coprophila. Chromosoma (Berl.) 25, 357--364 (1968).

Dawid, I. B. : Deoxyribonucleic acid in amphibian eggs. J. molec. Biol. 12, 581--599 (1965). - - Evidence for the mitoehondrial origin of the frog egg cytoplasmic DNA. Proc. nat. Acad.

Sei. (Wash.) 56, 269--276 (1966). Decosse, J .J . , Aiello, N. : Feulgen hydrolysis: effect of acid and temperature. J. Histochem.

Cytochem. 14, 601--604 (1966). Deeley, E.M. : An integrating mierodensitometer for biological cells. J. sci. Instrum. 32, 263--

267 (1955). Deitch, A.D." A cytophotometric method for the estimation of histone and non-histone

protein. J. Histoehem. Cytochem. 13 17--18 (1965). - - Wagner, D., l~ichart, I~.M.- Conditions influencing the intensity of the Feulgen reaction.

J. Histochem. Cytochem. 16, 371--379 (1968). Denis, :H. : Activit6 des g~nes au cours du d6veloppement embryonnaire. Liege: Edit. Desoer

1966. Eakin, I~.M., Lehmann, F.E." An electronmicroscopic study of developing amphibian ecto-

derm. Wilhelm Roux' Arch. Entwickl.-Mech. Org. 150, 177--198 (1957). Emanuelsson, H.: Photometric estimation of the relative amount of DNA in early chick

embryos. Aeta physiol, seaM. 52, 197--210 (1961). Epifanova, O.I. : Effects of actinomycin D andpuromyein on the mitotic cycle in synchronized

cell culture. Exp. Cell Res. 58, 401--410 (1969). Fox, D.P. : Some characteristics of the cold hydrolysis technique for staining plant tissues by

the Feulgen reaction. J. Histochem. Cytoehem. 17, 266--272 (1969). Gall, J. G. : Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis.

Proe. nat. Aead. Sci. (Wash.) 60, 553--560 (1968). - - MacGregor, H.G., Kidston, M.E.: Gene amplification in the oocytes of dytiscid water

beetles. Chromosoma (Berl.) 26, 169--187 (1969). Garcia, A.M. : Studies on deoxyribonucleic acid in leukocytes and related cells of mammals.

VI. The ~eulgen-deoxyribonueleic acid content of rabbit leukocytes after hypotonic treatment. J. Ilistochem. Cytochem. 17, 47--55 (1969).

Gledhill, B.L., Gledhill, M.P., P~igler, t~., Jr., l~ingertz, N.I~. : Changes in deoxyribonucleo- protein during spermiogenesis in the bull. Exp. Cell Res. 41, 652--665 (1966).

Graumann, W.: Zur Standardisierung des Schiff'sehen geagens. Z. wiss. Mikr. 61, 225--226 (1963).

Grunz, H.: Hemmung der Reaggregation dissoziierter Amphibienzellen durch Inhibitoren der RNS- und Proteinsynthese. Wilhelm R oux' Archiv. 163, 184--196 (1969).

Gurdon, I. B. : Transplanted nuclei and cell differentiation. Scient. Amer. 219, 24--35 (1968). :Hale, A. J. : The leukocyte as a possible exception to the theory of deoxyribonucleic acid

constancy. J. Path. Bact. 85, 311--326 (1963). - - In : Introduction to quantitative cytochemistry, p. 183. NewYork: Academic Press 1966. :Hanocq-Quertier, J., BMtus, E., Ficq, A., Brachet, J. : Studies on the DNA of Xenopus laevis

oocytes. J. Embryo]. exp. Morph. 19, 273--282 (1968). Hay, E.D., Gurdon, J .B. : Fine structure of the nucleolus in normal and mutant Xenopus

embryos. J. Cell Sci. 2, 151--162 (1967). Holtfreter, J. : Differenzierungspotenzen isolierter Teile der Urodelengastrula. Wilhelm Roux'

Arch. Entwickl.-)/[ech. Org. 138, 522--656 (1938). Holtzman, E. : A cytoehemical study of the solubilities of the histones of fixed Necturus liver.

J. IIistochem. Cytochem. 13, 318--327 (1965). Jacob, J . : Changes in nucleolar nltrastrueture during amphibian development. Exp. Cell

Res. 54, 281--284 (1969). Jacobson, C. O. : The localisation of the presumptive cerebral regions in the neurula plate of the

Axolotl larva. J. Embryol. exp. Morph. 7, 1--21 (1959).


Jones, K.W., Elsdale, T. R. : The culture of small aggregates of amphibian embryonic cells in vitro. J. Embryol. exp. Morph. l l , 135--154 (1963).

Karasaki, S. : Electron microscopic studies on cytoplasmic structures of ectoderm cells of the Triturus embryo during the early phase of differentiation. Embryologia (Nagoya) 4, 247-- 272 (1959).

- - Changes in the fine structure of the nucleus during early development of the ectoderm cells of the Triturus embryo. Embryologia (Nagoya) 4, 273--282 (1959).

- - Electron microscopic examination of the sites of nuclear t~NA-synthesis during amphibian embryogenesis. J. Cell Biol. 26, 937--958 (1965).

Keyl, H.G.: Duplikationen yon Untereinheiten der chromosomalen DNS wKhrend der Evolution yon Chironomus thummi. Chromosoma (BEE.) 17, 139--180 (1965).

Kiefer, G., Mittermayer, Ch.: RNA-Synthese im Zellzyklus. Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 849, 1250 (1968).

Kunz, W. : Die Entstehung multipler Oocytennukleolen aus akzessorischen DNS-KSrpern bei Gryllus domesticus. Chromosoma (Berl.) 26, 41--75 (1969).

Lima de Faria, A., Birnstiel, M., Jaworska, H.: Amplification of ribosomal cistrons in the heterochromatin of Acheta. Genetics 61 (Suppl.) 145--159 (1969).

- - Moses, M. J. : Ultrastructure and cytochemistry of metabolic DNA in Tipula. J. Cell Biol. 30, 177--194 (1966).

Lison, L., Pasteels, M. : ]~tudes histophotometrique sur la teneur en ADN des noyaux au cours du d6veloppement embryonnaire chez l'oursin. Arch. Biol. (Libge) 62, 1--20 (1951).

Lohmann, K., Vahs, W.: Cytochemischer Nachweis phasen- und regionsspezifischer Ver- /inderungen des DNS-Gehaltes wghrend der Embryogenese yon Triturus vulgaris. Experien- tia (Basel) 25, 1315--1316 (1969).

Miller, O.L.: Structure and composition of peripheral nucleoli of salamander oocytes. Nat. Cancer Inst. Monogr. 23, 53--66 (1966).

Mirsky, A.E., Ris, I-I.: Variable and constant components of chromosomes. Nature (Lond.) 1 6 3 , 666--667 (1949).

Mittermayer, Ch., Kaden, P., Sandritter, W., Trommershaeuser, U. : Initiation of DNA synthesis in a system of synchronized L-cells: Effect of actinomycin D. Histochemie 14, 113--122 (1968).

Moore, B. C. : DNA in diploid and androgenetic amphibian embryos. J. Morph. 101, 227--274 (1957).

Nakamura, 0., Isoya, T. : Nuc]eoli in the morula and the blastula of Triturus pyrrhogaster. Proc. Jap. Acad. 44, 522--527 (1968).

Nieuwkoop, P. D. : The formation of the mesoderm in urodelean amphibians. I. Induction by the endoderm. Wilhelm Roux' Archly 162, 341--373 (1969).

Noeske, K.: Diskrepanzen yon Feulgen-Wert und DNS-Gehalt. Histochemie 2{}, 322--327 (1969).

Pele, S.R. : Labelling of DNA and cell division in so-called non-dividing tissues. J. Cell Biol. 22, 21--28 (1964).

-- Biological implications of DNA-turnover in higher organisms. Aeta histochem. (Jena), Suppl. 8, 41--52 (1968).

l~eieh, E., Cerami, A., Ward, D. C. : In: Antibiotics I, Berlin-Heidelberg-New York: Springer 1967.

Roels, H.: ,,Metabolic" DNA: A cytochemical study. Int. Rev. Cytol. 19, 1--34 (1966). Sampson, M., Katoh, A., Hotta, Y., Stern, H.: ~r labile deoxyribonucleic acid.

Proc. nat. Acad. Sci. (Wash.) 50, 459--463 (1963). -- Davies, D.D. : Synthesis of a metabolically labile DNA in the maturing root cells of

Vicia/aba. Exp. Cell Res. 43, 669--673 (1966). Spirin, A.S.: On ,,masked" forms of messenger RNA in early embryogenesis and in other

differentiating systems. In: Curr. Top. in Developmental Biology I (1966). Stich, H.: Variations of the deoxyribonucleic acid content in embryonal cells of Cyclops

strenuus. Exp. Cell Res. 26, 136--143 (1962). Tiedemann, I-I.: UnverSffentlichte Ergebnisse, zit. in H. Tiedemann: Embryonale Induk-

tion und Differenzierung I%NS- und Proteinstoffwechsel in Triturusembryonen. Bull. schweiz. Akad. reed. Wiss. 22, 89--96 (1966).

40 Lohmann: Untersuchungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryonalentwicklung

Tiedemann, H. : Molekulare Grundlagen der Differenzierung bci h5heren Organismen. Um- schau 9, 269--274 (1967).

- - Born, J., Ticdemann, H.: Embryonale Induktion und Hemmung der Ribonukleins~ure- Synthese durch Actinomycin D. Z. Naturforsch. 22b, 469--659 (1967).

Vahs, W. : Ein extrem leistungsfi~higes Cytophotometer ffir den sichtbaren Spektralbereich. Mikroskopic 24, 356--361 (1970).

- - UnverSffentlichtc Ergebnisse (1970). Vaughn, J.C., Locy, P~. D. : Changing nuclear histone patterns during development. III. The

deoxyribonucleic acid content of spermatogenic cells in the crab Emerita analoga. J. Histochem. Cytochcm. 17, 591--600 (1969).

Viola-Magni, M. P. : An analysis of DNA loss and synthesis in tile rat adrenal medulla nuclei upon cold stimulation. J. Cell Biol. 30, 213--225 (1966).

Wallace, H , Birnstiel, M.L.: Ribosomal cistrons and the nuclcolar organizer. Biochim. biophys. Acta (Amst.) 114, 296--310 (1966).

Waring, M. J. : Drugs which affect the structure and function of DNA. Nature (Lond.) 219, 1320--1325 (1968).

Whitehouse, H.L.K.: A cycloid model for the chromosomes. J. Cell Sci. 2, 9--22 (1967). Woodland, H.R., Gurdon, J. B. : The relative rates of synthctis of DNA, sl~NA and rP~NA

in the endoderm~l region and other parts of Xenopus laevis embryos. J. Embryo]. exp. Morph. 19, 363--385 (1968).

Dr. Klaus Lohmann Zoologisches Institut der Universit~it D-50O0 KSln 41, Weyertal 119 Deutschland

Untersuchungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryonalentwicklung

Documents

Transcript of Untersuchungen zur Frage der DNS-Konstanz in der Embryonalentwicklung