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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE AGENTES

INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

EFEITO DA INIBIÇÃO DA ATIVAÇÃO DO NF-KB SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO NA MALÁRIA CEREBRAL E PULMONAR EXPERIMENTAL CAUSADA PELO

Plasmodium berghei

MICHELLI ERICA SOUZA FERREIRA

Belém-PA

2014

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EFEITO DA INIBIÇÃO DA ATIVAÇÃO DO NF-KB SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO NA MALÁRIA CEREBRAL E PULMONAR EXPERIMENTAL

CAUSADA PELO Plasmodium berghei

Belém-PA

2014

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitários do

Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Pará como

requisito para a obtenção do grau de

Doutora em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Sandro Percário

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EFEITO DA INIBIÇÃO DA ATIVAÇÃO DO NF-KB SOBRE O ESTRESSE OXIDATIVO NA MALÁRIA CEREBRAL E PULMONAR EXPERIMENTAL CAUSADA PELO

Plasmodium berghei

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade

Federal do Pará como requisito para a obtenção do grau de Doutora em Biologia

de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Livre-Docente Sandro Percário

Lab. de Pesquisa em Estresse Oxidativo, ICB-UFPA

Banca examinadora:

Prof. Dr. Jose Luiz Fernandes Vieira

Instituto de Ciências da Saúde/ ICS-UFPA

Profa Dra. Maria Fâni Dolabela

Instituto de Ciências da Saúde/ ICS-UFPA

Profa. Livre-Docente Dorotéia Rossi Silva Souza

Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto/FAMERP

Prof. Dr. Evonnildo Costa Goncalves

Instituto de Ciências Biológicas/ ICB-UFPA

Belém, 10 de fevereiro de 2014

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EPÍGRAFE

“A ciência humana de maneira nenhuma nega a existência de Deus. Quando considero

quantas e quão maravilhosas coisas o homem compreende, pesquisa e consegue

realizar, então reconheço claramente que o espírito humano é obra de Deus, e a mais

notável” (Galileu Galilei).

“A Ciência sem Religião é manca, a Religião sem a Ciência é cega” (Albert Einstein).

“Entendo por razão, não a faculdade de raciocinar, que pode ser bem ou mal utilizada,

mas o encadeamento das verdades que só pode produzir verdades, e uma verdade não

pode ser contrária a outra.”(Leibniz)

3

DEDICATÓRIA

Ao meu pai Pedro Rosildo e minha mãe Marizete por quem tenho amor, respeito,

admiração, pessoas especiais que são minha fonte de dedicação, inspiração, grande

exemplo de determinação, de caráter, de coragem e de vida.

Ao meu noivo Manoel Soares, amigo, companheiro e grande incentivador, alguém por

quem tenho profunda admiração, respeito e amor.

Aos meus irmão Marcelle e Michel que foram sempre companheiros e amigos em minha

vida profissional e pessoal.

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente agradeço a Deus por iluminar meus caminhos traçados.

Ao meu orientador Sandro Percário, minha fonte de inspiração e sabedoria, que me

orientou e ensinou de forma paciente e clara como fazer pesquisa e desempenhar o

papel de docente.

Ao meu pai, minha mãe e meus irmãos que sempre incentivaram e acreditaram em

minha atuação profissional.

Ao meu meu noivo que com muito carinho e paciência acompanhou e incentivou minha

jornada acadêmica.

Aos amigos do Laboratório de Pesquisas em Estresse Oxidativo (LAPEO), que formam

uma grande equipe e sempre estão prontos a ajudar uns aos outros. Em especial,

agradeço a Paula Laurindo, Ana Carolina Musa, Danilo Moreira, Marcela Figueira,

Amanda Vasconcelos, Rafael Quadros, Lângela, João, Aline e a todos os estagiários

que dedicaram seu tempo na realização dos procedimentos experimentais desse

trabalho.

Ao Laboratório de Neurociências da UFPA por ter fornecido a cepa de Plasmodium

berghei.

Ao Programa de Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários e seus docentes pela

inestimável contribuição científica.

Ao Instituto Evandro Chagas (IEC) pelo fornecimento dos animais de experimentação.

Ao Biotério UFPA, especialmente ao Sr. Amarildo e seus companheiros de trabalho pela

ajuda com os camundongos, pela amizade e carinho com que sempre me recebeu.

A todos os animais que precisaram sofrer eutanásia para a execução desse trabalho

científico.

Ao CNPQ pelo apoio financeiro por meio da bolsa e pelo incentivo a pesquisa.

5

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS 10

LISTA DE QUADROS E TABELAS 13

ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 15

RESUMO 17

ABSTRACT 18

1. INTRODUÇÃO 19

2. MALÁRIA 23

2.1. EPIDEMIOLOGIA 23

2.2. BIOLOGIA DO PARASITA 25

2.3. PATOGENIA 27

2.4. MALÁRIA GRAVE 29

2.5. MALÁRIA EXPERIMENTAL 33

3. ESTRESSE OXIDATIVO 34

3.1. ESTRESSE OXIDATIVO E MECANISMOS DE DEFESA ANTIOXIDANTE

36

4. MALÁRIA E O ESTRESSE OXIDATIVO 38

5. FATOR NUCLEAR-KAPPA B 40

5.1. CÁLCIO E ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO E DO NITROGÊNIO (ERON) NA ATIVAÇÃO DO NF-KB

43

5.2. ESTRESSE OXIDATIVO E NF-KB 45

5.3. NF-KB INDUZINDO OXIDANTES E ANTIOXIDANTES 47

6. MALÁRIA E O NF-KB 48

7. ÉSTER FENETIL DO ÁCIDO CAFEÍCO-CAPE 50

8. OBJETIVOS 52

6

8.1. GERAL 52

8.2. ESPECÍFICOS 52

9. MATERIAL E MÉTODOS 53

9.1. GRUPOS DE ANIMAIS 53

9.2. INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS CAMUNDONGOS 54

9.3. PESQUISA DO PARASITO NO SANGUE 55

9.4. HOMOGENEIZADO DE TECIDOS 56

9.5. INIBIÇÃO DO NF-KB 56

9.6. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE 56

9.6.1. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) 56

9.6.2. Determinação da Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH

58

9.7. DOSAGEM DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS)

60

9.8. AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE DA BARREIRA HEMATOENCEFÁLICA

61

9.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA 62

10. RESULTADOS 64

10.1. PARASITEMIA 64

10.2. SOBREVIDA DOS CAMUNDONGOS 68

10.3. DOSAGENS PULMONARES 70

10.3.1. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+ 70

10.3.2. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH 74

10.3.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 78

10.3.4. Estudo de Correlação para Amostras Pulmonares 82

10.3.4.1. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) versus Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC)

82

7

10.3.4.2. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH

83

10.3.4.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Parasitemia

84

10.3.4.4. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH e Parasitemia

85

10.3.4.5. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) e Parasitemia

86

10.4. DOSAGEM ENCEFÁLICAS 87

10.4.1. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+ 87

10.4.2. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH 92

10.4.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico 95

10.4.4. Estudo de Correlação para Amostras Encefálicas 99


99


100


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103

10.4.5. Avaliação da Permeabilidade da Barreira Hematoecencefálica 104

11. DISCUSSÃO 106

11.1. ACHADOS PULMONARES 107

11.2. ACHADOS ENCEFÁLICOS 109

12. CONSIDERAÇÕES FINAIS 114

13. CONCLUSÕES 115

14. REFERÊNCIAS 116

8

15. ANEXO 130

16. APÊNDICES 131

APÊNDICE 1- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 1 dia de infecção 131

APÊNDICE 2- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 1 dia de infecção

132

APÊNDICE 3- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 1 dia de infecção

133

APÊNDICE 4- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 1 dia de infecção

134

APÊNDICE 5- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo A após 5 dia de infecção.

135

APÊNDICE 6- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo B após 5 dia de infecção.

136

APÊNDICE 7- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo C após 5 dia de infecção.

137

APÊNDICE 8- Valores de TEAC, DPPH e MDA dos camundongos do grupo D após 5 dia de infecção.

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150

APÊNDICE 21- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo A nos dias de análise.

151

APÊNDICE 22- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo B nos dias de análise.

152

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Número de casos de malária por estado (UF) brasileiro. 23

Figura 2- Distribuição Geográfica da Malária. 24

Figura 3- Proporção de casos de malária por espécie registrados no Brasil em 2010.

25

Figura 4- Ciclo de vida do plasmódio no homem e no mosquito 27

Figura 5- Efeitos biológicos das espécies reativas no metabolismo normal e no patológico.

35

Figura 6- Ativação do NF-kB através da comunicação cruzada entre organelas.

44

Figura 7- Regulação redox do NF-kB. 47

Figura 8- Molécula do éster fenetil do ácido cafeico (CAPE). 50

Figura 9- Curva padrão da Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox através da redução do radical ABTS+

58

Figura 10- Curva padrão da capacidade antioxidante equivalente ao trolox através da redução do DPPH.

60

Figura 11- Curva padrão de Malondialdeido (MDA). 61

Figura 12- Camundongo após injeção do corante Azul de Evans 2%. 62

Figura 13- Progressão temporal da parasitemia dos camundongos infectados com o P. berghei e tratados com etanol 7,04%, grupo A (vermelho), e dos tratados com o CAPE, grupo B (roxo).

64

Figura 14- Percentual da sobrevida de todos os grupos de camundongos. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

68

Figura 15- Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) nos pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

70

Figura 16- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

74

11

Figura 17- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões dos camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

78

Figura 18- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo P. berghei. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

82

Figura 19- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo P. berghei. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

83

Figura 20- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

84

Figura 21- Correlações entre Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

85

Figura 22- Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

86

Figura 23- Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

87

Figura 24- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH em encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium

91

12

berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

Figura 25- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos dos camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

95

Figura 26- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

99

Figura 27- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

100

Figura 28- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

101

Figura 29- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

102

Figura 30- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

103

Figura 31- Encéfalo dos camundongos após injeção e 1h de circulação da solução azul de evans 2% nos dias de eutanásia.

105

13

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1- Número de hemácias a serem contadas a partir de uma estimativa inicial da parasitemia.

55

Quadro 2- Preparo dos pontos da curva padrão para análise do TEAC 57

Quadro 3-Preparo dos pontos da curva padrão para análise do DPPH 59

Quadro 4-Pontos da curva do MDA e absorbâncias 61

Tabela 1- Valores de parasitemia dos camundongos infectados em função do tempo de infecção

65

Tabela 2- Valores de p obtidos das correlações entre os subgrupos de camundongos para cada grupo isoladamente

66

Tabela 3- Valores de p referentes às correlações entre as parasitemias dos grupos de camundongos A e B

67

Tabela 4- Percentual de sobrevida de todos os grupos de camundongos de experimentação do presente trabalho

69

Tabela 5- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos pulmões de cada grupo de camundongos em função do tempo de infecção

71

Tabela 6- Valores de p das correlações das capacidade antioxidante equivalente ao trolox através da redução do radical ABTS+ nos pulmões entre os subgrupos de camundongos pertencentes aos grupos A, B, C e D. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

72

Tabela 7- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos pulmões entre os grupos de camundongos

73

Tabela 8- Valores da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões de cada grupo de camundongos

75

Tabela 9- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões, entre os subgrupos de camundongos

76

Tabela 10- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões entre os grupos de camundongos

77

Tabela 11- Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões dos camundongos em função do

79

14

tempo de infecção

Tabela 12- Valores de p referente à correlação das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os subgrupos de camundongos pertencentes aos grupos A, B, C e D. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inóculo de hemácias saudáveis).

80

Tabela 13- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os grupos de camundongos

81

Tabela 14- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos de cada grupo de camundongos em função do tempo de infecção

88

Tabela 15- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos

89

Tabela 16- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos entre os grupos de camundongos

90

Tabela 17- Valores da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos de cada grupo de camundongos

92

Tabela 18- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos

93

Tabela 19- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos entre os grupos de camundongos

94

Tabela 20- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos dos camundongos em função do tempo de infecção

96

Tabela 21- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos

97

Tabela 22- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os grupos de camundongos

98

15

ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ABTS 2,2 AZINO BIS (3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico sal ácido diamônio) ATP Adenosina trifosfato BAFFR Fator de ativação de células B BCR Receptor de células B BHE Barreira Hematoencefálica BKL Quinase linfóide B BTK Tirosina quinase de Bruton CAPE Ácido caféico éster fenetil CAT Catalase CDC Center for Disease Control cNOS Óxido nítrico sintase constitutiva COX Ciclooxigenase DATASUS Sistema de dados do Sistema Único de Saúde DNA Ácido desoxiribonucleico DPPH 2,2-Diphenyl-1-picryl-hidrazil ELISA Ensaio imunoenzimático ERK Quinase regulatória extracelular ERON Espécies Reativas do Oxigênio e do Nitrogênio ERN Espécies Reativas do Nitrogênio ERO Espécies Reativas do Oxigênio Fe Ferro FT Fator de transcrição G-CSF Fator de crescimento celular de granulócitos GM-CSF Fator de crescimento celular de granulócitos e macrófagos GSH Glutationa reduzida GSH-Px Glutationa peroxidase GSH-Rd Glutationa redutase H2O2 Peróxido de hidrogênio HI Hemácias infectadas HIV Vírus da imunodeficiência humana HO-

2 Hidroperoxila ICAM-1 Moléculas de adesão intracelular 1 IEC Instituto Evandro Chagas IKB Inibidor kappa B IKK IKB Kinase IFN Interferon IL Interleucina iNOS Óxido nítrico sintase induzível K2S2O4 Persulfato de potássio KH2PO4 fosfato monobásico de potássio MC Malária cerebral MCF-7 Células tumorais de glândulas mamárias de humanos MDA Malondialdeido MEKK MEK quinase MP Malaria pulmonar MS Ministério da Saúde NAC N-acetil cisteína

16

NADPH Fosfato de Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo reduzida NEMO Modulador essencial NF-kB NF-kB Fator Nuclear-Kappa B NIK Iindutor de quinase NF-kB NO Óxido Nítrico NOS Óxido nítrico sintase O2 Oxigênio Molecular O2

- Radical Superóxido OH. Radical Hidroxil OMS Organização Mundial de Saúde ONOO- Peróxinitrito P90RSK Proteína 90 ribossomal S6 quinase PGE2 Protaglandina E2 PKB Preoteína quinase B PKC Proteína quinase C PKR PMA

Preoteína quinase R Forbol miristrato-13 acetato

Q1 Primeiro quartil Q3 Terceiro quartil RE Retículo endoplasmático RHD Domínio homólogo Rel RI Radiação ionizante RL Radicais livres RNA Ácido riboxinucléico SARA Síndrome da Angústia Respiratória Aguda SIRT-1 Sirtuína 1 SOD Superóxido dismutase SYK Tirosina quinase do baço TCR Receptor de células T TEAC Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox TLR Receptor Toll-like TNF Fator de Necrose Tumoral TNFR Receptor para TNF TPL2 Progressão do tumor lócus 2 quinase TRAF Fatores associados ao TNFR Trolox Ácido 6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico UFPA Universidade Federal do Pará UV Ultra violeta WHO World Health Organization

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RESUMO

O estresse oxidativo é um desequilíbrio redox que já foi identificado com importante papel na patogenia da malária, com destaque nas formas graves da doença como no acometimento cerebral e no pulmonar. Em meio a doença e o estresse oxidativo uma partícula envolvida em vários processos fisiopatológicos é o fator de transcrição NF-kB, responsável pela transcrição de uma série de partículas que podem estar envolvidas no agravamento da doença. Utilizando modelo experimental murino infectado pelo Plasmodium berghei, realizou-se a avaliação da capacidade antioxidante total, peroxidação lipídica e permeabilidade da barreira hematocerebral. Ao promover a inibição do NF-kB constatou-se a diminuição da parasitemia dos camundongos no 15º e 20º dias após a infecção sem promover alteração na sobrevida. No tecido pulmonar poucas substâncias foram reativas ao ácido tiobarbitúrico no primeiro dia de análise e ocorreu o aumento da capacidade antioxidante a curto e longo prazo. No tecido encefálico o aumento da peroxidação lipídica ocorreu a longo prazo e a capacidade antioxidante aumentou de forma semelhante ao ocorrido no pulmão, além do prolongamento da manutenção da barreira hematoencefáfica com o uso do inibibor do NF-kB. Dessa forma concluímos que este fator de transcrição assim como o estresse oxidativo podem contribuir com o agravamento da malária.

Palavras-chave: malária, NF-kB, CAPE, estresse oxidativo, antioxidantes

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ABSTRACT

The oxidative stress is a redox imbalance that has been identified in some research

with an important role in malaria pathogenesis, especially in the severe form of the

disease, as in brain and lung malaria. In the middle of the disease and oxidative

stress a particle involved in several pathophysiological processes is the

transcription factor NF-kB, responsible for the transcription of a number of particles

that may be involved in the aggravation of the disease. Using an experimental mice

model infected with Plasmodium berghei, evaluation of total antioxidant capacity,

lipid peroxidation and disruption of blood-brain barrier was carried out. The

promotion of of NF-kB inhibition was found to decrease in parasitemia of mice at

15th and 20th days post infection without changes in the survival rate. In lung tissue

just a slight increase in thiobarbituric acid thiobarbituric reactive substances was

found on the first day of analysis and there was both short and long term increase of

antioxidant defenses. In brain tissue a long term lipid peroxidation increase was

found and antioxidant activity increased similarly to what happened in the lung, in

addition to prolonging the maintenance of the blood-brain barrier with the use of NF-

kB inhibitor. Thus we conclude that NF-kB, as well as oxidative stress, may

contribute to the worsening of malaria.

Keywords: malaria, NFkB, CAPE, oxidative stress, antioxidants

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1. INTRODUÇÃO

A malária é uma doença endêmica, febril, transmitida pelo mosquito do

gênero Anopheles, cujo agente etiológico é o protozoário do gênero Plasmodium,

que atinge mais de 100 países, 3,4 bilhões de pessoas vivem em áreas de risco

(CDC, 2010b). É classificada como a quinta causa de morte por doença infecciosa

no mundo, na África é a segunda maior causa de morte, depois do HIV (vírus da

imunodeficiência humana), sendo que a maioria dessas ocorre em crianças de até

cinco anos de idade (Saraiva et al., 2009; WHO, 2009a).

Em 2008 foram registrado 243 milhões de casos de malária em todo o

mundo (WHO, 2009a). Nas Américas ocorreram 572.000 registros, sendo o

Plamodium vivax responsável pela maioria, 77% (WHO, 2009b). No Brasil, durante

o período de 2009, foram notificados 306.908 casos, com predominância nas

seguintes regiões: Pará, Amazonas, Rondônia, Roraima, Amapá, Acre e Tocantins

(DATASUS, 2008; MS, 2009). Medidas de controle implantadas no ano de 2006

resultaram na redução de 43% de sua ocorrência até 2008. A doença ocorre em

regiões que favoreçam o desenvolvimento do mosquito e do parasito, áreas rurais

e nas periferias urbanas, associando-se à deficiência na atenção básica à saúde

em locais endêmicos (Ferreira, 2008; MS, 2009; WHO, 2009b).

Apesar da diminuição do número de notificação da malária nos últimos anos,

a doença ainda apresenta elevado risco de incidência e transmissão. De acordo

com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o Brasil, Colômbia, Costa Rica e

Peru, são regiões que apresentaram flutuações nos registros da doença durante o

período de 2000 a 2008 (WHO, 2009a).

Para controle da malária são utilizadas as seguintes intervenções: gestão

dos pacientes (diagnóstico e tratamento); prevenção da infecção através do

controle do vetor (uso de mosquiteiro e inseticidas) e da doença (administração de

antimaláricos). As últimas representam os alicerces para o controle e diminuição

dos gastos em saúde pública, pois são meios de prevenir casos graves e

conseqüente óbito, bem como eliminar as fontes de infecção para os mosquitos,

contribuindo assim, para a redução da transmissão (WHO, 2009a).

Mesmo diante de todo esse mecanismo de controle, o combate eficaz da

doença pode ser prejudicado, como se pode observar através do aparecimento de

cepas resistente a alguns antimaláricos em pacientes tratados com quinina,

20

cloroquina e artemisina (Walker et al., 2000; Baird, 2004). Estudos realizados por

Muñoz et al. (2006) sugerem resistência também à primaquina.

A ausência de conhecimento sobre o mecanismo completo de ação do

parasita no organismo humano dificulta a ação efetiva de antimaláricos, assim

como o controle dos sinais e sintomas característicos da malária, ressaltando as

suas formas severas, pulmonar e cerebral, que podem levar a morte de pacientes

acometidos pela doença causada pelo Plasmodium falciparum (Charoenpan et al.,

1990; Newton et al., 1997; Coban et al., 2006).

Recentemente, diversos pesquisadores vêm estudando o envolvimento de

agentes oxidantes alterando o equilíbrio redox em processos fisiopatológicos, como

já foi descrito em pacientes asmáticos, em portadores de ateroscleróticas, hipoxia

ou câncer (Gutierrez et al., 2010).

Nesse sentido, muitos discutem o envolvimento dos radicais livres, através

do estresse oxidativo, na patogenia da malária (Pablón et al., 2002; Huber et al.,

2002; Dondorp et al., 2003; Omodeo-Salé et al., 2003; Becker et al., 2004; Yazar et

al., 2004; Wilmanski et al., 2005; Kumar et al., 2005; Jaramillo et al., 2005; Sohail et

al., 2007).

Sabe-se que o processo infeccioso desta doença promove alterações na

produção de interleucina (IL)-12, IL-6, fator de necrose tumoral α (TNF- α) e IL-10,

e que de acordo com Wilmanski et al. (2005) as citocinas apresentam papel

importante no estímulo redox celular. Outro achado envolvendo ação oxidativa é a

peroxidação lipídica ocorrida em eritrócitos infectados e não infectados (Omodeo-

Salé et al., 2003).

Fator importante no que diz respeito ao balanço redox no organismo humano

é a relação parasita-hospedeiro, onde a intensidade da patogenicidade, caso haja

desequilíbrio deste balanço, vai depender das concentrações locais das espécies

pró e antioxidantes, culminando com a produção de radicais lives e,

consequentemente levando ao estresse oxidativo, quando a ação antioxidante é

deficiente, através da inibição de sua atividade, ou por meio da produção de

radicais em quantidade superior a capacidade antioxidante com o intuito de debelar

a infecção (Ferreira & Matsubara, 1997; Vasconcelos et al., 2007).

Os radicais, como espécies reativas do oxigênio (ERO), do nitrogênio (ERN),

entre outras, podem ser produzida tanto pelo parasito como pelo hospedeiro

humano (Ferreira & Matsubara, 1997; Vasconcelos et al., 2007). Além do uso de

21

antimaláricos, como a primaquina, os quais parecem atuar através de mecanismo

oxidativo (Vale et al., 2009).

O organismo humano possui diversas fontes de espécies reativas, tais como

as mitocôndrias, peroxissomas, citoplasma e membrana de células, retículo

endoplasmático, fagócito, lisossoma e através da catálise por metais de transição,

como o ferro e cobre (Ferreira & Matsubara, 1997).

As ERO, radicais superóxido (O2-) e hidroperoxila (HO-

2) são produzidas a

partir do metabolismo do oxigênio molecular (O2). Segundo pesquisadores, tal

produção é catalisada na presença de metais, como o ferro (Fe), através das

reações de Fenton e de Haber-Weiss. Na malária o referido metal se torna

disponível durante o estágio eritrocítico do plasmódio, no qual o parasita realiza a

proteólise da hemoglobina obtendo nutrientes necessários para o seu metabolismo,

ocasionando a liberação de grande quantidade de grupos heme e moléculas de Fe

(Ferreira & Matsubara, 1997; Kumar et al., 2005; Lyaweh & Onigbinde, 2009; Circu

& Aw, 2010)

Outro radical livre que parece estar envolvido na doença é o óxido nítrico,

NO (Pablón et al., 2002; Huber et al. 2002; Dondorp et al., 2003; Omodeo-Salé et

al., 2003; Becker et al., 2004; Yazar et al. 2004, Pino et al., 2005). Este gás é

produzido com a finalidade de ação citotóxica e citostática contra microoganismos,

parasitas e células tumorais, que geralmente vem acompanhada de grande

produção de ERO. Citocinas e/ou endotoxinas estimulam a enzima NO sintase

induzível (i-NOS), que sintetiza NO a partir da oxidação da L-arginina (Pfeilschifter

et al., 2003; Shirley, 2005).

Na malária, entretanto seu papel ainda é controverso, alguns pesquisadores

afirmam que o acometimento cerebral da doença seja uma conseqüência da

produção de quantidades elevadas de NO para promover a morte dos parasitas

(Favre et al., 1997), enquanto outros defendem que a malária cerebral decorra de

uma baixa biodisponibilidade deste gás (Gramaglia et al., 2006).

Este gás em associação ao O2 ou O2-, origina poderosos oxidantes, N2O3 e

peróxinitrito (ONOO-), este último, na presença de íon hidrogênio origina o radical

hidroxila (OH.; Pfeilschifter et al., 2003; Shirley, 2005).

Outro componente que pode está envolvido na sinalização e expressão de

genes sensíveis a regulação redox da doença é o fator nuclear de transcrição

kappa B (NF-kB), o qual de acordo com Kriete & Mayo (2009) atua diante de

22

agentes infecciosos, ambientais, ativando genes pertencentes ao processo

inflamatórios e está envolvido no estresse, porém este mecanismo ainda não foi

ainda esclarecido.

O NF-kB encontra-se no citoplasma associado ao inibidor IKB, que diante de

sinalizações, como através de citocinas (IL-1 e TNF- α), grupo heme livre, espécies

reativas de oxigênio, NOS e moléculas de adesão, sofre fosforilação por ação da

IKB kinase (IKK) e proteólise, liberando, portanto o NF-kB, que migra para o núcleo

e se liga ao DNA, provocando a ativação e expressão de genes que podem estar

relacionado a defesa ou agravamento da doença (Arruda et al., 2004; Salminen et

al., 2008; Kriete & Mayo, 2009; Miller et al., 2010).

Considerando-se a elevada incidência de malária na região amazônica, a

produção de agentes oxidantes tanto pelo hospedeiro humano quanto pelo

parasito, e a ausência de conhecimento com relação aos mecanismos precisos da

regulação redox da transcrição gênica, se faz necessários estudos quantitativos e

qualitativos dos agentes oxidantes, capacidade antioxidante e o papel do fator

transcriptacional NF-kB na malária.

23

2. MALÁRIA

2.1. EPIDEMIOLOGIA

É uma doença endêmica, característica das áreas tropicais e subtropicais do

mundo, que apresenta como fatores determinantes para ocorrência a presença do

parasita, do mosquito (vetor) e do homem. Soma-se a estas as condições

climáticas regionais, principalmente as chuvas, que formam criadouros para o

inseto transmissor e a temperatura, cujos valores entre 20-30ºC, favorecem o seu

crescimento e o desenvolvimento do parasita no mosquito, exercendo assim,

importantes influências na distribuição geográfica da doença (Andrade, 2005;

Neves et al., 2007).

Em 2009 foram identificados 306.908 casos, com predominância na região

Norte, na qual os estados mais atingidos foram os seguintes: Amazonas, Amapá,

Rondônia, Acre e Pará, porém este demonstrou aumento (Figura 1) de

aproximadamente 44% com relação a 2008 (MS, 2009).

Figura 1- Número de casos de malária por estado (UF) brasileiro. Fonte: MS, 2009.

24

Em 2010 foram registrados casos de malária em 106 países do mundo

(Figura 2), a maioria destes no Continente Africano, em seguida no Sudeste

Asiático, região oriental do Mediterrâneo e Continente Americano (WHO, 2011a).

Figura 2- Distribuição Geográfica da Malária. Fonte: Adaptado de WHO, 2011a.

Nesse período no Brasil foram registrados 334.681 pacientes com malária,

destes 84,75% foram acometidos pelo P. vivax e 15,25% pelo P. falciparum (Figura

3), com 5451 casos de internação e 75 mortes causadas pela presença da doença

(WHO, 2011a).

No Brasil a distribuição da doença está associada à atividade exercida pela

população exposta, sendo frequente nos garimpeiros e trabalhadores envolvidos

nos projetos agropecuários e de colonização. Nas periferias das grandes cidades

como Belém e Manaus as más condições de habitação propiciam a ocorrência dos

focos epidêmicos (DATASUS, 2008).

25

Figura 3- Proporção de casos de malária por espécie registrados no Brasil em 2010. Fonte: WHO, 2011a.

De acordo com dados do World Malaria Report 2011, no período de 2000 a

2010 houve uma redução significativa de casos de malária na maioria dos países

do continente americano. No entanto, alguns desses como o Haiti apresentaram

aumento, acreditando-se que este resultado seja devido a não implementação de

métodos de controle da doença, prevenção e tratamentos, adequados (WHO,

2011b).

Em 2011 foram notificados no Brasil 267.045 casos da doença (WHO, 2013).

Mas recentemente, em 2012, foi estimado a ocorrência de 207 milhões de casos da

malária distribuidas no mundo com em torno de 627 mil mortes. Nesse ano a

estimativa no continente americano foi de 800,000 casos, sendo 0,1% ocasionando

como consequência o óbito do paciente infectado, principalmente crianças abaixo

de 5 anos de idade (WHO, 2013).

2.2. BIOLOGIA DO PARASITA

A doença é causada pelo protozoário do gênero Plasmodium, um organismo

unicelular que apresenta como hospedeiro intermediário o homem e definitivo o

mosquito, pertencente à ordem dos dípteros, família Culicidae, gênero Anopheles,

sendo a espécie Anopheles darlingi, a que se destaca na transmissão (Vale et al.,

2005; MS, 2005).

26

Há quatro espécies de plasmódios de maior prevalência que podem infectar

o homem: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale e o

Plasmodium malarie. O primeiro é responsável pela febre terçã maligna, o segundo

e o terceiro pela terçã benigna e o ultimo pela quartã cosmopolita (CDC, 2010a).

Destas, somente P. vivax e P. ovale são capazes de causar múltiplas recaídas da

malária após semanas ou meses da primeira infecção, característica que se

associa a presença da forma latente do protozoário no fígado (Deen et al., 2008).

O P. falciparum é a espécie responsável pela maioria dos casos letais. Seu

crescimento é favorecido em temperatura de 25°C, pois provocam o encurtamento

do ciclo, com esquizogonia em até 10 dias, aumentando assim a possibilidade de

transmissão. O período de incubação desta espécie varia de 9 a 14 dias,

entretanto, climas temperados e subtropicais provocam o prolongamento deste

período em algumas cepas (Andrade, 2005; CDC, 2010a).

O ciclo assexuado ocorre no homem (Figura 4), e se inicia durante o repasto

sanguíneo, quando o mosquito infectado inocula os esporozoitos no organismo

humano, os quais migram para o fígado onde realizam o ciclo exo-eritrocítico. Nas

células hepáticas, os protozoários sofrem diferenciação e passam para a forma

arredondada de criptozoítos, em seguida se multiplicam e se diferenciam em cerca

de 40.000 merozoítos (Bernan, 2004; Vale et al., 2005; CDC, 2010c).

Com a ruptura dos esquizontes hepáticos, os merozoitos migram para a

corrente sanguínea, onde iniciam o ciclo eritrocitário, degradam a hemoglobina

para a obtenção de aminoácido e síntese proteíca, através das enzimas produzidas

no vacúolo digestivo. A seguir, passam à forma amebóide intracelular de

trofozoítos, os quais evoluem até merozoítos, que irão infectar novos eritrócitos.

Neste momento, ocorre a diferenciação dos gametócitos que migram para a

periferia do organismo humano (Vale et al., 2005; CDC, 2010c).

Ao realizar a picada, o mosquito fêmea ingere os gametócitos juntamente

com o sangue humano, que ao alcançarem o estômago, realizam o ciclo sexuado

(esporogônia), no qual o microgameta se une ao macrogameta formando o zigoto,

que se torna móvel e alongado (oocineto) e invade o epitélio gástrico, originando o

oocisto, que sofre ruptura e libera numerosos esporozoítos, os quais migram para

as glândulas salivares do inseto, que durante o repasto serão inoculados no ser

27

humano, dando início a um novo ciclo do plasmódio (Bernan, 2004; Vale et al.,

2005; CDC, 2010c).

Figura 4- Ciclo de vida do plasmódio no homem no mosquito. Fonte: Adaptado do CDC, 2010c.

2.3. PATOGENIA

A malária pode ocorrer de forma assintomática ou com sinais e sintomas

clássicos, como febre, sudorese, cefaléia e dores musculares. A gravidade

depende da espécie de plasmódio presente e do estado imunológico do

hospedeiro. Outros sinais e sintomas podem ocorrer, tais como mal estar geral,

fadiga, mialgia, artralgia, dor abdominal, náuseas, vômito e diarréia. Também

podem ocorrer hepatoesplenomegalia, hipoglicemia e anemia (Bernan, 2004; MS,

2008; CDC, 2010c).

28

A fisiopatologia está relacionada ao ciclo do parasito no organismo, mais

precisamente à ruptura dos eritrócitos ao final da esquizogonia, quando ocorre a

liberação na corrente sanguínea de parasitas e pirógenos, resultando na patologia

e alterações orgânicas características da malária (Barsoum, 2000; Andrade, 2005;

CDC, 2010c). Nesse processo, acredita-se que os fatores determinantes são:

-A destruição dos eritrócitos (Barsoum, 2000);

-Toxicidade resultante da liberação de citocinas (Urquhart, 1994);

-Sequestro de eritrócitos parasitados na rede capilar (Barsoum, 2000);

-Lesão capilar por deposição de imunocomplexos (Mibei et al., 2005).

Um fator interessante acerca da destruição de eritrócitos é que a mesma não

está relacionada à presença do parasita no interior do eritrócito, pois foi identificado

que mesmo células que não contenham plasmódios também são alteradas no

indivíduo com a doença (Omodeo-Salé et al., 2003).

Quanto ao segundo fator citado, tem se observado que na doença aguda

ocorre o estímulo de células imunocompetentes com consequente liberação de

citocinas, estas que são moléculas protéicas essenciais para a comunicação

intercelular. Como já foi constatado, o pigmento malárico hemozoína estimulando

macrófagos e a interleucina 1 (IL-1), esta é capaz de alterar o equilíbrio do

hipotálamo, provocando elevação da temperatura, a qual possui duração

característica de acordo com cada espécie (Urquhart, 1994; Barsoum, 2000; Olivier

et al., 2014). No P. falciparum os acessos febris são repetidos em intervalos de 36

ou 48 horas, tal fato pode ocorrer devido sua ação em eritrócitos de qualquer idade;

o P. vivax e o P. ovale com intervalos de 48 h e invadem células jovens, enquanto

que o P. malariae em intervalos de 72 h, atuando em eritrócitos velhos (Barsoum,

2000; Malagón, 2005).

Além da produção do pigmento, ocorre a indução da liberação de fator de

necrose tumoral (TNF), IL-1, IL-6 e IL-8 em fagócitos e provavelmente em células

endoteliais. Outras citocinas parecem está envolvidas na inibição da

gliconeogênese, com efeitos principalmente sobre a placenta, conferindo assim a

gravidade da doença durante a gestação. Essas moléculas proteicas também já

29

foram identificadas provocando o aumento na produção de óxido nítrico pelos

leucócitos, músculo liso, microglia e endotélio vascular, radical livre que parece

está envolvido na complicação da malária grave e o coma (Clarck et al., 2004).

Com relação ao sequestro de eritrócitos tem se observado que este efeito

ocorre devido às alterações provocadas na superfície das células vermelhas

infectadas, ocasionando o fenômeno de citoaderência mediado por proteínas

expressas na superfície das células, formando protuberâncias ou knobs. Esse

fenômeno e formação de rosetas ocorrem principalmente em vênulas de órgão

vitais como cérebro, fígado e rins, trazendo consequências graves como a

obstrução da microcirculação, redução do fluxo de oxigênio e acidose láctica,

resultando assim nas seguintes complicações: malária cerebral, insuficiência renal

e hepatite (Clarck et al., 2004; Rug et al., 2006).

Outra alteração observada é a presença de imunocomplexos na

patogenicidade da doença, como se observou em pesquisa realizada em crianças

infectadas pelo P. falciparum e se identificou a presença desses complexos na

malária grave associada a anemia ou a complicação cerebral (Mibei et al., 2005).

A inibição de certos neurônios do hipotálamo anterior tem sido descrita, com

consequente vasoconstrição periférica, originando a sensação de frio (Andrade,

2005; CDC, 2010c).

2.4. MALÁRIA GRAVE

A malária grave ou complicada ocorre quando há o agravamento da doença

causada por falha em algum órgão ou anormalidade sanguínea ou metabólica,

como na malária cerebral, na pulmonar (MP), na hemólise severa, hemglobinúria,

coagulação anormal, baixa pressão arterial, hipoglicemia, hiperparasitemia e

insuficiência renal aguda (CDC, 2010d).

Essa forma da doença é ocasionada pelo P. falciparum, porém tem crescido

o número de casos da forma grave da doença provocada pelo P. vivax, além do P.

Knowlesi (Cox-Singh et al., 2008; WHO, 2012a). Geralmente a complicação ocorre

após 3-7 dias iniciado a febre, mesmo diante de tratamento e eliminação total do

parasita (Trampuz et al., 2003; WHO, 2012a).

30

O diagnóstico é realizado pela identificação das formas assexuadas do

parasita no esfregaço sanguíneo e a presença das seguintes características

clínicas e laboratoriais, que podem ocorrer de forma isolada ou em combinação

com outros sinais e sintomas assinalados na doença (WHO, 2012a; WHO, 2012b):

Características Clínicas:

-Alterações na consciência ou coma irreversível (escala de coma Glasgow >11

para adultos e aplica-se para crianças escala de coma Blantyre >3). Além dessas

alterações o paciente em coma pode apresentar hemorragia em sua retina;

-Abatimento físico, psíquico e fraqueza generalizada;

-Mais de 2 convulsões em 24h;

-Dificuldade respiratória;

-Colapso respiratório, pressão sistólica baixa (<70mmHg em adultos e <50mmHg

em crianças);

-Icterícia;

-Hemorragia;

-Edema pulmonar.

Características Laboratoriais:

-Hipoglicemia (<40mg/dL);

-Acidose metabólica (bicarbonato plasmático<15mmol/dL);

-Hemoglobinúria;

-Hiperparasitemia (>20%);

-Hiperlactatemia (<5mmol/L);

-Lesão renal aguda (creatinina<264µmol/L);

-Anemia normocítica severa (hemoglobina>5g/dL e hematócrito < 15% em adultos

e <20% em crianças).

31

Crianças, gestantes no segundo ou terceiro mês de gestação, pessoas de

área não endêmica, submetidas à esplenectomia ou imunodeprimidas possuem

grande risco de desenvolver a forma grave da doença quando o parasita se instala

no organismo das mesmas (WHO, 2012b).

Os antimaláricos de escolha no combate aos parasitas na malária

complicada são: artemeter, artesunado ou quinina. Medicamentos que devem ser

administrados de forma isolada imediatamente por via parenteral após cálculo da

dose de acordo com o peso (WHO, 2012b).

Com relação a malária cerebral (MC), ela pode atingir cerca de 0,01 a 16%

dos pacientes com P. falciparum e promover de 10 a 50% de letalidade dos

mesmos (Braga et al., 2004; Alves et al., 2007).

Crianças com essa forma da doença possuem dificuldade de se alimentar,

apresentam febre que variam de 37,5ºC a 41ºC, vômito e tosse são comuns,

ocasionalmente podem desenvolver diarréia. Esses são sinais geralmente gerados

anteriores ao coma, o qual persiste por mais de 30 min após a convulsão. Esta

antes ou depois do coma está assosiado à morbidade e sequelas da doença

(WHO, 2012b). Essa faixa etária quando em coma profundo apresenta reflexos e

movimentos anormais dos olhos. Além dessas caracteristicas clínicas também se

observa uma respiração profunda, mãos e pés frios ou pulso fraco. Cinco a 30%

das crianças que sobrevivem a MC têm alguma sequela neurológica (WHO,

2012b).

Em adultos com essa forma grave da doença comumente são observados

convulsões, alterações na retina, fechamento fixo da mandíbula, bruxismo e

hepatomegalia. Porém pode ocorrer também disfunção motora com a presença de

membros superiores e inferiores esticados, rigidez leve da nuca, formação de

becinho que pode ser evidenciado com o toque nos lábios, raramente o edema de

papila é identificado (WHO, 2012b).

Em qualquer faixa etária devem ser excluídas outras causas de alterações

neurológicas que acontecem na malária, como hipoglicemia e acidentes

vasculares, ou por outras doenças como meningite bacteriana e encefalite viral

(WHO, 2012b; Rodrigues et al., 2013).

32

O mecanismo de ação patogênica na MC ainda não foi totalmente elucidado,

acredita-se em duas teorias. A primeira baseia-se no fenômeno de citoaderência de

eritrócitos infectados e não-infectados na microvalulatura cerebral impedindo o

fluxo sanguíneo e consequente impedindo a condução de nutrientes e oxigênio

para as células cerebrais (Berendt et al., 1994). A segunda é fundamentada na

resposta exceciva do sistema imunológico através da liberação de citocinas pelas

células Th1 (Clark & Rockett, 1994).

Ambas as teorias têm sido demonstradas de grande importância, chegando-

se assim a uma terceira hipótese da ação comcomitante das duas na gênese da

doença (Van de Heyde et al., 2006).

Já a malária pulmonar possui uma incidência de 3 a 10% dos casos de

complicações da doença e letalidade em torno de 70% (Boulos et al., 1993).

Essa complicação da doença apresenta como caracteristica clínica em

crianças o desconforto respiratório caracterizado pela respiração profunda com

retração da parede torácica inferior, sintoma que quando ausente deve-se suspeitar

de acidose metabólica (WHO, 2012b).

Outra alteração observada ao nível dos pulmões é o edema pulmonar devido

ao aumento na permeabilidade capilar pulmonar que geralmente ocorre depois de

dias de tratamento em pacientes com melhora do quadro da doença e sem

parasitas na periferia do organismo, é caracterizado pelo aumento da frequência

respiratória e diminuição da pressão parcial de O2. Essa complicação da doença

pode evoluir para a síndrome da angústia respiratória aguda (SARA) devido ao

sequestro de eritrócitos parasitados no pulmão e liberação de citocinas, que pode

levar o indivíduo acometido pela doença a morte (WHO, 2012a; WHO, 2012b).

Acredita-se que a patogênese da malária pulmonar seja predominantemente

devido à resposta inflamatória após o tratamento, já que o aparecimento desta

forma grave da doença ocorre após cerca de 5 dias iniciado a adiministração de

medicamentos e ausência de parasitas periféricos no paciente (WHO, 2000).

Porém, Maguire et al. (2005) acreditam que a lesão pulmonar ocorra devido

a uma ação contínua sobre o pulmão progredindo de uma fase subclínica da

doença com obstrução de vasos sanguíneos pulmonares devido ao fenômeno de

33

citoaderêcia que persiste, promovendo alteração e disfunção da membrana

alvéolo-pulmonar, modificações que permanecem mesmo com depuração

parasitária devido ao tratamento, e assim promove o agravamento na malária

pulmonar com o desenvolvimento da SARA.

2.5. MALÁRIA EXPERIMENTAL

Roedores como CBA/CAJ, C57BL/6, Swiss e DBA-2 têm sido utilizados

como modelo experimental da malária grave humana ocasionada pelo P.

falciparum, quando os camundongos são infectados pelo Plamodium berghei

ANKA, sendo os três primeiros como modelo da MC e os dois últimos em modelos

de desordem pulmonar na malária experimental (Epiphanio et al., 2010; Oakley et

al., 2011; Nacer et. al., 2012).

Em pesquisa realizada por Nacer et al. (2012) observou-se que os

camundongos Swiss e CBA/CAJ fêmeas com 3 semanas de idade (jovens)

infectados com 106 hemácias parasitadas por P. berghei ANKA desenvolveram os

sinais neurológicos da doença e 50% de parasitemia em torno do 5º ou 6º dia após

infecção, chegando ao óbito com valor maior que 60% da mesma. Nos exames

histopatológicos desses camundongos foram identificadas as clássicas marcações

da malária cerebral, petéquias, hemorragia e poucos leucócitos. Além da presença

de células sanguíneas infectadas impedindo o fluxo sanguíneo normal na

microvasculatura cerebral, levando a alteração do endotélio e quebra da barreira

hematoencefálica, essas são modificações semelhantes às observadas em

humanos.

Camundongos Swiss fêmea com 6-18 semanas de idade infectados com 105

-106 hemácias parasitadas pelo P. berghei via i.p. utilizados por Franke-Fayard et

al. (2005) apresentaram os sinais da MC entre o 5º e 10º dia após infecção e

identificaram o CD36 como um importante provável mediador associado ao

seqüestro de esquizontes no pulmão desses roedores.

Epiphanio et al. (2010) demonstraram que os camundongos DBA-2 são

excelentes modelos experimentais da desordem respiratória humana ocasionada

na malária grave, pois ao serem infectado pela P. berghei ANKA observaram que

após 6 dias de infecção via i.p. (106-107 hemácia parasitas) que esse tipo de

34

camundongo desenvolveu dispnéia, obstrução das vias aéreas, hipoxemia,

hemorragia pulmonar e edema. Características não observadas nos experimentos

realizados no C57BL/6, o qual é muito utilizado como modelo de MC.

Estudos recentes demonstraram o efeito da suplementação com

antioxidantes sobre ambas as formas grave da doença em camundongos Swiss

machos infectados P. berghei ANKA via i.p., 107 hemácia parasitas (Warwick et al.,

2013). Assim como esses pesquisadores, Desowitz & Barnwell (1980) utilizaram

esses tipos de roedores (fêmeas) em seus experimentos para testar a ação do

efeito de vacina indutora da imunidade contra a malária.

Através desses dados de modelos experimentais observou-se que os

mesmos são amplamente utilizados como uma ferramenta para desvendar o

mecanismo de ação do parasita e assim desenvolver drogas ou vacinas para o

combate eficaz contra a malária.

3. ESTRESSE OXIDATIVO

3.1. ESTRESSE OXIDATIVO E OS MECANISMOS DE DEFESA ANTIOXIDANTE NO ORGANISMO

Os radicais livres são átomos ou moléculas que apresentam número ímpar

de elétrons na última camada eletrônica, devido a um processo de oxirredução,

logo, apresentam-se instáveis e altamente reativos, com a capacidade de captar

um elétron para obter estabilidade. Como exemplo desses há o radical O2- e o NO,

assim como radical hidroxila, hidroperoxila e peroxinitrito. O peróxido de hidrogênio

(H2O2) apesar de não possuir elétrons desemparelhados é considerado agente

oxidante devido produzir OH● (Ferreira & Matsubara, 1997; Vasconcelos et al.,

2007).

Tais moléculas instáveis podem ser obtidas durante os processos

metabólicos normais, sendo que, o organismo humano apresenta as seguintes

fontes endógenas dessas, a membrana celular, através da síntese de

prostaglandinas, lipoxigenase e o fosfato de nicotinamida adenina dinucleotídeo

reduzida (NADPH); o citoplasma através da xantina oxidase, hemoglobina,

riboflavina, catecolaminas, metais de transição (Ferro e Cobre); retículo

endoplasmático e lisossomas através do citocromo P450 e enzimas hidrolíticas;

mitocôndria no transporte de elétrons da cadeia respiratória e peroxissoma por

35

meio de oxidases e flavoproteínas. Outra fonte de ERO são os fagócitos que atuam

como primeiro mecanismo de defesa contra microrganismos, os quais estão

envolvidos na resposta não específica e na reação inflamatória. Enquanto que são

como fontes exógenas os raios ultravioleta (UV), outras radiações ionizantes,

quimioterápicos e xenobióticos, além de outras (Ferreira & Matsubara, 1997;

Chaves et al., 2000; Vasconcelos et al., 2007; Wells et al., 2009).

As ERO e ERN no organismo estão envolvidas em processo de produção de

energia, regulação do crescimento, sinalização intercelular e síntese de diversas

substâncias. No entanto, quando a quantidade de radicais excede a capacidade

antioxidante do organismo, originam o estado de estresse oxidativo (Figura 5), no

qual a agressão celular se torna eminente, esta pode ocorrer através de danos ao

ácido nucléico, proteínas, lipídeos e carboidratos. Dessa forma encontra-se

relacionada a várias patologias, tais como, câncer, hipóxia, artrite, doenças do

coração, choque hemorrágico, patologias semelhantes à doença vascular,

inflamatória e desordens neurológicas, assim como no envelhecimento celular,

podendo causar o agravamento destas (Ferreira & Matsubara, 1997; Barreiros et

al., 2006; Vasconcelos et al., 2007; Gutierrez et al., 2010).

Figura 5- Efeitos biológicos das espécies reativas no metabolismo normal e no patológico. Fonte: Adaptado de Ma et al., 2010.

36

Durante a produção normal de oxiradicais o organismo responde através da

ação de defesas antioxidantes, as quais podem ser divididas em enzimáticas e não

enzimáticas, o primeiro grupo é composto de superóxido-dismutase (SOD),

catalase (CAT), glutationa-peroxidase (GSH-Px) e glutationa-redutase (GSH-Rd), e

no segundo a vitamina A, C e E, bilirrubina, proteínas quelantes como a albumina,

ferritina e ceruloplasmina, dentre outros (Aguiar et al., 2006; Vasconcelos et al.,

2007; Bartosz, 2009).

A SOD é uma enzima que realiza a dismutação do radical superóxido a H2O2

e O2. Existem três tipos desta enzima no organismo humano: SOD-cobre-zinco

(SOD-Zi/Cu) no citosol, SOD-manganês (SOD-Mn) na mitocôndria e a SOD -

extracelular (Barreiros et al., 2006; Bartosz, 2009; Ma, 2010).

Já a CAT catalisa a redução do peróxido a água e oxigênio, assim como a

GSH-Px, a qual requer a presença de glutationa, esta que em seguida se torna

oxidada e será reduzida através do NADPH em reação catalisada pela GSH-Rd

(Barreiros et al., 2006; Bartosz, 2009).

A vitamina C encontra-se no organismo na forma de ascorbato e atua na

redução de metais como o Fe e Cu. A vitamina E atua doando elétrons a radicais

hidroxilas impedindo, portanto, a peroxidação lipídica. No entanto, o -caroteno é o

principal carotenoide fonte de vitamina A, que age na redução em baixas

concentrações de oxigênio (Barreiros et al., 2006; Bartosz, 2009).

Com relação à bilirrubina, é um pigmento formado a partir da degradação da

hemoglobina em processos oxidativos (Vasconcelos et al., 2007; Aguiar et al.,

2006).

4. MALÁRIA E O ESTRESSE OXIDATIVO

Diversos pesquisadores vêm observando o envolvimento de alterações

redox na malária, através da produção de radicais livres (RL) pelo hospedeiro

humano com atividade antiplasmódica, com a finalidade de debelar a doença,

assim como a existência de defesas antioxidantes pelo Plasmodiun sp. (Barsoum,

2000; Fritsche et al., 2001; Omodeo-Salé et al., 2003; Jaramilo et al., 2005;

Wilmanski et al., 2005, Yeo et al., 2009). Tais espécies reativas também são

produzidas por antimaláricos como a primaquina e derivados da artemisina,

promovendo a oxidação de células, ação que pode está envolvida na terapêutica

37

do medicamento (Bolchoz et al., 2002; Ittarat, 2003; Vale et al., 2009; Ferreira et

al., 2011).

De acordo com Fritsche et al. (2001) os radicais livres como o NO, O2. e

OONO- são as principais moléculas responsáveis pela ação tóxica de macrófagos

estimulados por citocinas contra o parasita. Estudo realizado por Greve et al.

(1999) já fornecia dados que sugeriam tal importância dos RL gerados em

granulócitos como primeira linha de resposta imunológica e defesa contra P.

falciparum. Esta ideia é compartilhada por Boutlis et al. (2003), já que acredita que

o aumento desses RL contribui para a tolerância da doença em adultos

assintomáticos de áreas endêmicas.

Além deste, estudos recentes demonstram o envolvimento do estresse

oxidativo na parede do miocárdio assim como no aumento da pressão pulmonar

em crianças com malária severa, devido à hemólise intravascular e diminuição na

produção de NO com consequente efeito cardiopulmonar (Janka et al., 2010).

Tal produção de RL ocorre em grande quantidade durante o ciclo

eritrocitário, o qual inicia com a invasão dos merozoítos hepáticos nos eritrócitos,

em seguida ocorre formação de esquizontes em forma de roseta e posterior ruptura

das hemácias, com a liberação dos merozoítos sanguíneos e toxinas maláricas, as

quais induzem a liberação de citocinas que vão atuar em outras células como as

endoteliais, além dos antígenos que estimulam o linfócito T, que secretam interfern

gama (IFN-γ) e outras citocinas, induzindo a produção destas em outras células,

como os monócitos (Miller et al., 1994).

Neste ciclo ocorre a degradação da hemoglobina no vacúolo digestivo do

parasita para a obtenção de aminoácidos da globina, este evento resulta na

produção de metemoglobina, ânions superóxidos e peróxidos, com ação oxidante

em lipídios e proteínas. Ambas as reações são catalisadas na presença de um

metal de transição, como o ferro do grupo heme (Mashima et al., 2002; Schwarzer

et al., 2003)

Estudos realizados por Potter et al. (2005) demonstraram a produção de RL

pelo parasita, pois utilizou camundongos knockout para o gene da enzima NADPH

oxidase, importante para a produção de espécies reativas do oxigênio e do

nitrogênio (ERON) em fagócitos, o que impediu a progressão da parasitemia para

todas as espécies de Plasmodium testadas (P. yoelii, P. chabaudi K562, P. berguei

ANKA, P. berguei K173 e P. Vinckei vinckei) quando comparado com animais

38

normais para a referida enzima. Os autores sugeriram que o aumento dos RLs

esteja associado ao parasita e não a explosão respiratória de fagócitos.

Das et al. (1990) identificaram tal ação através de estudo em pacientes com

malária, nos quais se constatou altos níveis do marcador de peroxidação lipídica,

malondialdeído, quando comparados ao controle, sendo que a deficiência de

ribovlavina, vitamina importante na conversão GSH-oxidada para a forma reduzida,

favorece a hemólise e oxidação de lipídios contribuindo com o aumento do número

de parasitas, ocasionando agravamento da doença. Omodeo-Salé et al. (2003)

relataram que tal ação oxidante nos lipídeos ocorre nos eritrócitos infectados assim

como nos não infectados, acelerando a senescência das células vermelhas.

Outro fator importante encontrado com relação à produção de radical livre é

a síntese de óxido nítrico. Esta molécula derivada do nitrogênio é sintetizada a

partir da ação enzimática da NOS sobre o aminoácido L-arginina, produzindo NO e

citrulina. Isoformas desta enzima já foram identificadas e classificadas em duas

categorias, a forma constitutiva (cNOS) e a induzível (iNOS), esta é produzida em

macrófagos e outras células ativadas por citocinas com função de promover a

morte de patógenos (Dusse et al., 2003; Vasconcelos et al., 2007).

No entanto, seu papel ainda é controverso, pois alguns pesquisadores

afirmam que o acometimento cerebral da doença seja uma consequência da

produção de quantidades elevadas de NO para promover a morte dos parasitas,

enquanto outros defendem que a MC decorra de uma baixa biodisponibilidade

deste gás (Maneerat et al., 2000; Gramaglia et al., 2006; Cabrales et al., 2011). A

síntese dessa molécula também foi identificado em mosquito Anopheles infectado

com P. falciparum (Akman-Anderson et al., 2007)

Corroborando a primeira hipótese da ação do NO, Cabrales et al. (2011)

através de análise microscópica cerebral de camundongos infectados com P.

berghei recebendo suplementação de NO, concluíram que esta protege os

camundongos contra a MC, melhorando a microcirculação no cérebro e diminui a

patologia vascular.

Maneerat et al. (2000) em pesquisa realizada com pacientes tailandeses

adultos com MC detectou a enzima iNOS através da marcação imonohistoquímica

em neurônios, astrócitos, microglias e células endoteliais, sendo que esta foi

intensa nos macrófagos próximos aos anéis hemorrágicos. Adicionalmente,

apresentou associação positiva entre a expressão de iNOS e alterações

39

histopatológicas, sugerindo que essa enzima possa contribuir para o

desenvolvimento da MC, com a evolução do quadro do paciente para coma,

convulsões e morte.

Divergindo dessa hipótese, Gramaglia et al. (2006) demonstraram em estudo

realizado em camundongos iNOS ou eNOS knockout infectados com Plasmodium

berghei ANKA, que estes não diferem quanto a parasitemia e mortalidade quando

comparados ao controle, sugerindo que o NO não influencia na parasitemia, porém

quando submeteu os animais infectados a três doses diárias de um doador de NO

observou que eles passaram a ter um tempo de vida maior e proteção contra MC,

concluindo que a produção diminuída do agente oxidante contribui para a

ocorrência da MC experimental.

Semelhante achado foi observado em estudos realizados por Astey et al.

(1996) em crianças africanas com malária, nestas são percebidos baixos níveis de

nitratos e nitritos na MC e a concentração urinária e a plasmática das moléculas

foram identificadas inversamente proporcionais a severidade da doença.

De acordo com Yeo et al. (2009) e Omodeo-Salé et al. (2010) a diminuição

das concentrações de NO na malária pode está relacionada ao grupo prostético

heme livre oriundo da hemólise provocada pelo plasmódio.

O primeiro grupo de pesquisadores referente a esta teoria demonstrou

através de estudos realizados em pacientes com MC que a hemólise está

relacionada com aumento da severidade da doença e diminuição na

biodisponibilidade de NO, com consequente aumento da parasitemia e ativação

endotelial. Omodeo-Salé et al. (2010) identificaram significante impedimento no

transporte de L-arginina de forma dose-dependente em eritrócitos tratadas com

heme livre, o que contribui para a produção reduzida de NO na malária severa.

Fritsche et al. (2001) são mais específicos em suas pesquisas, através das

quais demonstram que o Fe tem um papel importante no metabolismo da iNOS,

pois na cocultura de macrófagos e eritrócitos de camundongos infectados com P.

falciparum e prévio tratamento da mesma com Fe, observou que após estimulação

dessa com citocinas ocorreu diminuição dos níveis de NO e aumento da

parasitemia, enquanto que a mesma cultura diante de um quelador de metais

proporcionou aumento de NO e diminuição da parasitemia, concluindo que a

adição de um quelador na terapia contra a malária aumentaria a disponibilidade de

NO e morte do parasita.

40

Além do NO, outras espécies reativas podem ser produzidas por células

vasculares, através de enzimas como as ciclooxigenase (COX), as quais já foram

identificadas na malária. De acordo com Ball et al. (2004) as isoformas COX-1 e

COX-2 foram expressas no cérebro de camundongos com e sem MC, sendo que

os que foram tratados com celocoxibe, inibidor da COX-2 e, consequentemente,

da produção de prostaglandina E2 (PGE2), apresentaram os sinais da MC precoce,

sugerindo que a COX-2 possui efeito protetor na malária experimental.

Estudos realizados por Perkins et al. (2005) atribuem mais precisamente a

ação protetora contra MC à PGE2, através de estudos realizados em crianças

infectadas e assintomáticas de áreas endêmicas, as quais possuíam altos níveis

dessa prostaglandina, enquanto que as crianças que manifestaram a MC

apresentaram baixos níveis da mesma. Semelhante achado foi obtido por Xiao et

al. (1999), além de que diante da ação da aspirina, ocorreu aumento de leucotrieno

e rápida ocorrência de MC, supondo que este eicosanóine provoque o detrimento

desta forma grave da doença.

5. FATOR NUCLEAR-KAPPA B

O NF-kB é um fator transcricional (FT) descoberto devido a sua interação

com a cadeia leve de imunoglobulinas, sendo seus primeiros experimentos

realizados em células B, por isso tal denominação, como um FT se liga ao DNA e

regula a expressão de genes (Ghosh et al., 1998; Haddad, 2002).

Este FT está presente em organismos eucariontes, é considerado um dos

principais reguladores que atua diante de agentes infecciosos, estresse celular,

mecanismo de sobrevivência em infecções agudas, regulando genes envolvidos na

resposta inflamatória e imunológica (Kriete & Mayo, 2009).

Esse fator nuclear é composto por duas subfamílias, NF-kB e Rel, ambas

com a porção N-terminal de 300 aminoácidos conservada, denominada domínio

homólogo Rel (RHD), região de ligação ao DNA, dimerização e interação com os

membros da família do inibidor Kappa B, IKB (Ghosh et al., 1998; Haddad, 2002;

Gilmore, 2006).

A primeira subfamília possui os seguintes membros, p105 (NF-kB1) e p100

(NF-kB2) e a segunda o cRel, p65 (Rel A) e Rel B. As proteínas NF-kB se tornam

ativas através dos seus respectivos encurtamento, p105 a p50 e p100 a p52,

porém em geral, de forma isolada não são ativadores de transcrição, por isso

41

formam homodímeros ou heterodímeros com a família Rel, p50/p65, p50/c-rel,

p65/p65 e p65/c-rel entre outros (Gilmore, 2006). De acordo com O’Dea &

Hoffmann (2010) são quinze os possíveis dímeros formados, proporcionando uma

diversidade combinatória que contribui para a regulação de diferentes genes.

Além desta diversidade pode ocorrer diferentes associações entre os

dímeros e os Inibidores kappa B, como exemplo o p65:p50 que pode se ligar a

quatro tipo de inibidores, os quais são ativados em resposta a um estímulo

específico (O’Dea & Hofmann, 2010).

Porém, algumas de suas combinações atuam inativando ou reprimindo

expressões gênicas, como os homodímeros p50/p50 e a p52/p52, efeito que pode

ser devido à falta do domínio C-terminal de transativação, responsável por ativação

do gene sensível ao NF-kB (Ghosh et al., 1998).

Os dímeros são formados pela união da porção C-terminal, porém tanto esta

porção como a N-terminal se ligam a uma sequência consenso contendo 9 ou 10

pares de base do DNA (sítio KB), a qual possui uma grande quantidade de

variações de base (5’-GGGRNWYYCC-3’; R por A ou G; N, qualquer nucleotídeo;

W, A ou T; Y, C ou T). Sendo que o dímero mais frequente é o heterodímero

formado pela p50 associado a p65, o qual se encontra inativo através do IkB

(Kretz-Remy et al., 1996; Ghosh et al., 1998; Gilmore, 2006).

O inibidor assim como o FT possui uma família de proteínas, composta por

proteínas clássicas, IkBα, IkBβ e IkBε, e proteínas não clássicas, IkBγ e IkBδ, estas

são proteínas de alto peso molecular e por isso denominadas “IkBsome” . Ambas

as classes possuem em comum a presença repetida da proteína “ankyrin”,

responsável pela interação entre proteínas (Ghosh et al., 1998; Salminen et al.,

2008; O’Dea & Hofmann, 2010).

O IkBα se liga predominantemente ao dímero p50:RelA enquanto que o

segundo ao p50:cRel, o IkBε somente ao homo e heterodímero p65 e cRel (Ghosh

et al., 1998).

Diante de um estímulo o IkB quinase (IkK), IKKα e/ou IKKβ, provoca a

fosforilação do IkB e induz a proteólise, liberando portanto o fator nuclear, que se

transloca para o núcleo e se liga ao DNA, provocando a ativação e expressão de

genes (Kumar et al., 2004; Salminen et al., 2008; Kriete & Mayo, 2009; Ma, 2010;

Miller et al., 2010).

42

Tal proteólise envolve o processo de ubiquinação e ação do proteossoma

26, pois a proteína ubiquitina irá marcar a proteína indesejada, IKB fosforilada, para

que ela seja degradada pelo proteossoma, este processo também está envolvido

no encurtamento das p100 e p105, através da degradação da porção C-terminal,

evento que pode ser responsável pelo direcionamento da via de ativação, canônica

ou não canônica (Kretz-Remy et al., 1996; Hay et al., 1999; O’Dea & Hofmann,

2010).

Os principais caminhos de ativação do fator ocorrem através da via canônica

e a não canônica, ambos caracterizados pela presença da IkK, porém a primeira

ocorre através da ativação do receptor para TNF (TNFR), Interleucina 1, receptor

Toll-like (TLR), os de células B (BCR) e os de células T (TCR), e é realizada

através do modulador essencial NF-kB (NEMO) associado a uma das formas de

quinase, que irá fosforilar as proteínas IkB clássicas ou IkBγ associadas ao NF-kB,

ativando a transcrição de genes, entre os quais estão os que expressão IkBα, IkBε,

p105, p100, cRel e RelB (Hayden & Gosh, 2004; Gilmore, 2006; Yates & Górecki,

2006; O’Dea & Hoffmann, 2010).

Quando essa via utiliza o TNFR, IL-1 ou TLR promove a ação de quinases e

modificação dos membros de fatores associados ao TNFR (TRAF). No entanto

quando essa via usa o BCR ou o TCR, a ativação do NF-KB ocorre por meio de

uma cascata de fosforilação envolvendo a quinase linfóide B (BKL), tirosina

quinase do baço (SYK), tirosina quinase de Bruton (BTK), família de quinase-src

p56-lck (Lck) e p59-fyn (Fyn) e cadeia de proteína quinase associada ao ξ (ZAP70),

todas levam a ativação da proteína quinase C-β (PKC-β) e PKC-θ, resultando na

ativação do FT kappa B (Hayden & Gosh, 2004; Yates & Górecki, 2006).

Por outro lado, a segunda via é ativada por meio do receptor da linfotoxina-β

(LT- βR), do fator de ativação de células B (BAFFR) e o de ativação do NF-KB

(RANK; Hayden & Gosh, 2004; Yates & Górecki, 2006).

Ao serem ativados os receptores dessa via conseqüentemente ocorre a

ação da TRAF subseqüente atuação do indutor de quinase NF-kB (NIK), o qual

fosforila dois resíduos de serina do complexo formado por 2 IkKα,

consequentemente este realiza a fosforilação da p100 associado à RelB, formando

o complexo p52:RelB que migra para o núcleo e, entre outras expressões, provoca

o aumento da p52 a partir da produção de p100 (Gilmore, 2006; Yates & Górecki,

2006; O’Dea & Hoffmann, 2010).

43

Porém, uma atípica via também já foi descrita, a qual ocorre através de

“ativadores atípicos”, como EROS, raios UV, metais e as isquemias (Hayden &

Gosh, 2004; Janssens & Tschopp, 2006; Yates & Górecki, 2006).

De acordo com O’Dea & Hofmann (2010) a regulação do sistema de

sinalização NF-kB ocorre em duas escalas, uma ocorre a síntese de proteínas NF-

kB e formação de dímeros, outra através da regulação da atividade dos dímeros via

degradação do IkB e resíntese do mesmo.

Agonistas deste fator nuclear incluem a IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α, moléculas do

complexo de histocompatibilidade em resposta imune, ERON, grupo heme livre,

radiação ultravioleta, lipopolissacarídeos bacterianos, proteínas de transativação

viral, RNA (ácido ribonucleotídeo) de dupla fita, esfingomielina, ionóforo de cálcio e

células de adesão. A expressão deste TF tem sido observada em tecidos de

camundongos, músculo cardíaco, cérebro, órgãos linfóides, e mucosa gástrica,

pulmão, fígado, cartilagem e artérias coronarianas, tanto de humanos como de

animais (Barchowsky et al., 1996; Ghosh et al., 1998; Arruda et al., 2004; Kriete &

Mayo, 2009; Kim et al., 2010).

Várias quinases que atuam nessa fosforilação já foram identificadas, como a

NIK, a proteína quinase R (PKR), a proteína 90 ribossomal S6 quinase (p90RSK),

as MEKs kinase (MEKK) 1, 2 e 3, a proteína quinase B (PKB ou Akt) e progressão

do tumor locus 2 quinase, TPL2 (Bowie & O’Nell, 2000; Salminen et al., 2008; Ma,

2010). Algumas das classes de genes induzidos pelo FT são os que expressam

citocinas como o TNF (α ou β), IFN (β ou γ) e IL, quimiocinas, fatores de

crescimento, moléculas imunoreguladoras, moléculas de adesão celular, proteínas

de resposta à fase aguda, genes sensíveis ao estresse, SOD-Mn, receptores de

superfície celular, reguladores de apoptose viral, fatores de transcrição, fatores que

controlam o crescimento, enzimas entre outros (Guo et al., 2003; Kumar et al.,

2004).

5.1. CÁLCIO E ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO E DO NITROGÊNIO (ERON) NA ATIVAÇÃO DO NF-KB.

Um caminho diferente de ativação do NF-kB durante a infecção aguda

envolvendo ERON foi descrito por Kriete & Mayo (2009), através do qual prepõem

a comunicação cruzada entre duas organelas, retículo endoplasmático (RE) e

mitocôndria, provocando tal ativação. Pois, durante a infecção viral ocorre síntese

44

de muitas proteínas no RE, processo que demanda elevada energia, sendo esta

obtida através do efluxo de cálcio realizado pelo RE para o recrutamento da

mitocôndria, que absorve o metal e fornece ATP (adenosina trifosfato), através da

cadeia de transporte de elétrons, a qual além de energia tem como produto ERON

(Figura 6).

Figura 6- Ativação do NF-kB através da comunicação cruzada entre organelas. Fonte: Kriete & Mayo, 2009.

O aumento na síntese protéica pode ter como consequência uma overdose

de Ca++ e ERON, as quais ativam o FT que, para proteger as organelas da ação

oxidativa, pode ativar genes que expressam enzimas antioxidantes. Logo, o cálcio

pode ser importante segundo mensageiro envolvido na produção de ERON e

ativação do FT (Kriete & Mayo, 2009).

Tal aumento nos níveis do Ca++ e ativação do FT foi observado em estudo

realizado por Berchtold et al. (2007), os quais sugeriram que os agentes

genotóxicos como a camptotecina e etoposide, inibidores da topoisomerase I e II,

aumentam a quantidade de cálcio intracelular, provocando a formação do complexo

composto por NEMO, Ran-GTP e receptor nuclear de exportação, que ativam o

fator.

45

Semelhante achado com relação à elevação dos níveis do Ca++ foi

observado diante da ação genotóxica da radiação ionizante (RI) produzindo ERON

(Todd & Mikkelsen, 1994; Mikkelsen & Wardman, 2003).

De acordo com O’Dea et al. (2008), tal agente genotóxico pode ativar o FT

por duas vias, uma em que o estresse ativa a IKK, que fosforila o IKB acoplado ao

FT, este agora livre migra para o núcleo, enquanto que a outra via ocorreria através

da diminuição da síntese de IKBα, através da fosforilação do fator de iniciação

eucariótica-2α (eIf-2α) provocada pela RI, diminuindo portanto o IKBα livre e o

acoplado ao FT.

5.2. ESTRESSE OXIDATIVO E NF-KB

As ERON são componentes vitais para o mecanismo de sinalização celular

via oxigênio e nitrogênio, desempenham a expressão de genes envolvidos na

produção de energia, transferência de O2, diferenciação celular e combate ao

próprio RL através de estímulo da produção de antioxidantes. Entre o sinal via O2 e

a expressão de genes um dos principais fatores de transcrição sensível às

alterações do estado redox o NF-kB (Haddad, 2002; Martindale & Holbrook, 2002;

Borowski, 2006; Bubici et al., 2006).

Ainda não se tem o exato conhecimento de como tais espécies reativas

regulam o fator nuclear. Sabe se que a natureza do estímulo e o tipo de célula

podem influenciar na ação de ERON sobre o fator (Bubici et al., 2006).

Diversos pesquisadores vêm demonstrando a ação de antioxidantes, como a

L-cisteína, GSH, Mn-SOD, a N-acetil-L-cisteína (NAC), vitamina C, a E, o α-

tocoferol entre outros, na inibição do fator nuclear (Mihm et al., 1991; Staal et al.,

1993; Suzucki & Packer, 1993; Cho et al., 1998; Islam et al., 1998; Manna et al.,

1998; Sen et al., 1996). A ação inibitória já foi identificada sobre o estímulo do fator

através do TNF-α, LPS, IL-1β, forbol miristato-13 acetato (PMA), cicloheximida e

H2O2 (Bubici et al., 2006).

A inibição pode ocorrer em vários níveis da cascata de sinalização do TF: no

citoplasma bloqueando a estimulação do fator, interferindo em alguma das fases de

ativação (fosforilação, ubiquitinação ou proteólise), ou no núcleo impedindo a

ativação da transcrição (Droger et al., 1994; Bubici et al., 2006; O’Dea et al., 2008).

Já foram demonstrados que os antioxidantes podem atuar através de três

formas, inibindo a fosforilação, a degradação do IKB ou ligação do TF ao DNA. Cho

46

et al. (1998) demonstraram que a glutationa inibiu a ativação do NF-kB impedindo a

fosforilação e degradação do IKBα em células endoteliais de camundongos.

Enquanto que, Schubert et al. (2002) identificaram em pesquisa realizada

em células endoteliais bovina a inibição da ativação de transcrição utilizando a

NAC (N-acetil cisteína), porém sem provocar a fosforilação ou a degradação do

IKBα. Semelhante achado foi observado por Natarajan et al. (1996) que, através da

análise do éster fenetil do ácido caféico (CAPE), o qual possui estrutura

semelhante ao flavonóide, relataram que o CAPE atua impedindo a ligação do TF

ao DNA, ação atribuída ao agente redutor ditiotreitol, uma vez que o estado redox

do núcleo é importante para ativação da transcrição via NF-kB.

De acordo com Bowie & O’Nell (2000) o estado redox celular pode

influenciar na atividade do NF-kB através de 4 formas: (1) H2O2 ativando

diretamente o TF; (2) ativação através de estímulos como IL-1 ou TNF aumentando

o estresse oxidativo intracelular; (3) antioxidantes inibindo o estresse estimulado;

(4) enzimas oxidantes e antioxidantes modulando o estado redox na célula.

No entanto, para O’Dea et al. (2008) a regulação do NF-kB pelo estresse

pode ocorrer através das seguintes maneiras: (1) degradação do IkB livres ou IkB

acoplada ao NF-kB; (2) inibindo a resíntese do IkB; (3) através da IKK induzindo a

degradação do IKB e migração do NFkB para o núcleo.

Contudo, Droger et al. (1994) observou que a regulação do TF pode ocorrer

em duas condições: No citoplasma o estado oxidativo favorece a ativação e

translocação do TF para o núcleo, caso tal condição estiver presente no núcleo

desfavorece ligação do fator ao DNA, entretanto nesta localização o estado

reduzido favorece tal ligação.

A partir destes conceitos pode ser observado que o estado redox pode atuar

em vários níveis da cascata de sinalização do FT NF-KB como consta na figura 7.

47

Figura 7- Regulação redox do NF-kB.

5.3. NF-KB INDUZINDO OXIDANTES E ANTIOXIDANTES

Diversos estudos vem demonstrado citocinas e endotoxinas induzindo a

produção de NO via sinalização NF-kB (Bereta et al., 1995; Gilad et al., 1998;

Katsuyama et al., 1998; Lee et al., 2009). Além deste agente oxidante outros são

produzidos pela enzima COX-2, que possui mesma via de síntese (Li et al., 2007;

Chiu & Lin, 2008). No entanto, antioxidantes como a MnSOD também podem ser

produzidos pela sinalização envolvendo o fator de transcrição (Borrás et al., 2006).

Estudos realizados por Chiu & Lin (2008) revelaram o efeito provocado pelo

alcalóide esteroidal denominado tomatodino, que inibiu a expressão da enzima

48

responsável pela síntese de NO a iNOS e COX-2 induzida por LPS em macrófagos

murino, suprimindo a fosforilação do IkB-α e ativação do TF. Através desse achado

se ressaltou a importância desta via de sinalização para estudo de quimioterápicos

com ação anti-inflamatória.

A ação inibitória da expressão da iNOS via NFkB, foi observada em

pesquisa realizada com a melatonina, neuro-hormônio produzido pela glândula

pineal que estimula o sono e possui função antioxidante diante de radicais

hidroxilas e peroxinitritos, em células semelhantes às anteriormente citadas sob

estímulo da mesma endotoxina (Gilad et al., 1998).

Lee et al. (2009) identificaram que a inibição da expressão do NO pode ser

provocada também pelo resveratrol, que ativa a Sirtuína 1 (SIRT-1), esta promove

a desacetilação do NF-kB, prevenindo a citotoxidade provocada por citocinas e

consequente produção de NO.

Adicionalmente, Bereta et al. (1995) demonstraram que glicosídios cardíacos

inibidores da enzima Na+/K+ ATPase estimulam a expressão de iNOS em células

endoteliais de cérebro murino através do dímero NF-kB.Este dímero está envolvido

na expressão da iNOS mRNA em células do músculo liso diante do estímulo da IL-

1β (Katsuyama et al., 1998).

No entanto, Borrás et al. (2006) em seus experimentos observaram o

envolvimento do FT e produção de antioxidante, através da atividade da genisteína,

isoflavona da soja, classificada como fonte alternativa na reposição hormonal

através da ligação ao receptor-β do estrogênio, pois possui ação antioxidante

através da indução da expressão da enzima MnSOD em células tumorais de

glândulas mamárias de humanos (MCF-7) através do TF.

A partir destes dados é possível observar o envolvimento da via de

sinalização NF-kB na expressão de agentes oxidantes e antioxidantes.

6. MALÁRIA E O NFKB

Durante o processo patológico o sistema imunológico monta uma rede de

defesa, através de sinalizações que comunicam o estado de lesão e infecção. Uma

maneira de induzir tal sistema é através de mensageiros como citocinas, algumas

induzem a proliferação e diferenciação de células específicas, como a IL-2 em

linfócitos T, GM-CSF em macrófagos e G-CSF em granulócitos. Outras induzem a

49

resposta de fase aguda, IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α, diante de infecções virais e ainda

outras induzem a produção de anticorpo a partir de linfócito B, sendo que o TF

comum na produção de todas essas diferentes moléculas é o NF-kB (Ghosh et al.,

1998).

Neste contexto, alguns pesquisadores vêm demonstrando o envolvimento

deste TF na malária, principalmente as subunidades p50 e p65 envolvidas na

expressão de quimiocinas, citocinas pró-inflamatórias, moléculas de adesão e

NOS, em diferentes tipos de células (Jaramillo et al., 2003; Jaramillo et al., 2005;

Tripathi et al., 2006; Torgler et al., 2008; Tripathi et al., 2009).

Alguns resultados de estudos realizados em macrófagos de camundongos

sugerem que a hemozoina, em ação sinérgica com o IFN-γ, induza a expressão de

iNOS e produção de NO via fosforilação da quinase regulatória extracelular (ERK-

1/2) e ativação do NF-kB. A expressão de quimiocinas nessas células pode ocorrer

tanto pela fosforilação da ERK1/2 como pela produção de estresse oxidativo

celular, ativando o TF que realiza a transcrição de genes (Jaramillo et al., 2003;

Jaramillo et al., 2005).

Estudos em hepatócitos de camundongos indicam que a ativação do fator

nuclear pode ocorrer devido a ruptura destas células que é provocada pelos

esporozoitos, liberando fatores citosólicos que se ligam a receptores Toll/IL-1, que

recrutam proteínas adaptadoras, como a MyD88, com consequente ativação do

IKK, o qual fosforila o IKB-α, liberado o NF-KB que ativa a expressão de iNOS e

produção de NO nas células hepática, provocando a redução da infecção das

células (Torgler et al., 2008).

No entanto, estudos realizados por Delic et al. (2010) em camundongos

knockout para o aminoácido taurina e infectados pelo P. chaboud, observaram que

o aminoácido é importante na proteção contra a infecção do parasita, já que, na

ausência da taurina se identificou o aumento da parasitemia e expressão hepática

da IL1-, TNF-, iNOS, NF-kB e receptor de vitamina D, moléculas que podem está

envolvidas na patogênese da doença.

Outras pesquisas demonstram que células endoteliais do cérebro humano

quando expostas aos eritrócitos infectados com P. falciparum induzem a expressão

de moléculas de adesão intracelular 1 (ICAM-1) via NF-kB, molécula que pode

contribuir com o sequestro de células na malária cerebral (Tripathi et al., 2006). Em

modelo experimental semelhante se identificou a expressão de quimiocinas,

50

CCL20, CXCL1, CXCL2 e citocinas IL-6 e IL-12 através do fator de transcrição, as

quais se encontram elevadas no endotélio cerebral exposto aos eritrócitos

contendo o plasmódio (Tripathi et al., 2009).

7. ÉSTER FENETIL DO ÁCIDO CAFÉICO-CAPE

O éster fenetil do ácido cafeico-CAPE (Figura 8) possui estrutura relacionada

ao ácido 3,4-dihidroxicinâmico, é um componente semelhante aos flavonoides e

com diversas propriedades biológicas, entre as quais estão: antioxidante (Ozguner

et al., 2005a), anti-inflamatória (Michaluart et al., 1999), anticarcinogênico (Cheen

et al., 2001), antiviral e imunomodulador (Grunberger et al., 1988).

Figura 8- Molécula do éster fenetil do ácido cafeico (CAPE). Fonte: Natarajan et al.,1996.

Além dessas diversas atividades, este composto é considerado como um

potente inibidor específico do Fator nuclear kappa B (Natarajan et al., 1996). O qual

pode ser ativado por citocinas inflamatória, produtos bacteriano, estresse oxidativo,

mitógenos e luz ultravioleta (Lu et al, 2004; Ghosh et al., 1998; Kriete & Mayo,

2009; Kim et al., 2010; Grilli et al., 1993).

Estudos em histiócitos humano realizados por Natarajan et al. (1996)

demonstraram que a ativação do NF-kB estimulada por agentes inflamatórios como

TNF e éster de forbol, além da ceramida, peróxido de hidrogênio e ácido ocadáico,

foi bloqueada pelo uso do CAPE de forma dose-tempo dependente e específica. Já

que, ao utilizar o CAPE diante de outros fatores de transcrição (AP-1, Oct-1 e

TIFIID) não se observou tal ação.

Outro efeito importante já relatado do Inibidor foi sua ação em camundongos

pré-tratados com CAPE 1mg/kg via i.p., pois inibiu a ação inflamatória induzida pelo

51

LPS, assim como a ativação do NF-KB, infiltração das células pulmonares,

hemorragia na medula renal e diminuição da metaloproteínase-9 (Jung et al.,

2008).

Acredita-se que este inibidor específico seja um composto que atue sobre

grupos sulfidrilas do FT kappa B, pois ao utilizar o agente redutor L-1-tosilamido-2-

feniletil-clorometilcetona se observou a reversão da ação bloqueadora, inibindo

assim a translocação da subunidade p65 para o núcleo, sem possuir qualquer

efeito sobre o inibidor IKBα (Natarajan et al., 1996).

Com relação à ação antioxidante do inibidor, foi demonstrado seu feito

protetor diante do estresse oxidativo provocado no miocárdio. Pois, pesquisas em

roedores realizadas por Ozgumer et al. (2005b) demonstraram que a radiação do

telefone (900HZ) promove o aumento de NO e MDA, além de diminuir a atividade

da SOD, CAT e GSH-Px no coração, alterações que foram revertidas pela

administração do CAPE (10µM/mL/Kg, i.p.), prevenindo assim o danos oxidativos

no tecido.

A mesma concentração do CAPE foi utilizada em estudos realizados por

Pekmez et al. (2010). No qual observou que ratos expostos à fumaça apresentaram

as seguintes alterações bioquímicas: elevação do ácido úrico sérico, nitrogênio da

urina e do sangue, SOD, GSH-Px, NO e MDA renal, além de mudanças

histopatológicas dos rins. Essas alterações foram prevenidas através da

administração i.p. do CAPE.

Este composto além de ação protetora sobre o dano oxidativo provocado no

miocárdio (Ozgumer et al., 2005b) e no rim (Pekmez et al, 2010), previne a

isquemia-hipóxica neonatal em cérebro murino tratado com CAPE, nos quais se

observou a inibição da caspase1 e a 3, iNOS, produção de NO, neurotoxidade e

morte de neurônios (Wei et al, 2004).

Essa espécie reativa do nitrogênio também foi inibida pelo CAPE em estudo

recente realizado por Abduljawad et al. (2013), pois ao tratar com o inibidor em dias

alternados os camundongos com diabetes constataram a inibição do NO, IL-1β,

IFN-γ, além da diminuição da glicose. Outro fator analisado nessa pesquisa foi o

efeito anti-angiogênico que foi identificado pela diminuição da metaloproteinase-9,

angiopoietina e níveis de endostatina.

Shen et al. (2008) identificaram em estudos in vitro utilizando células

endoteliais que a deficiência de zinco promove o aumento da ligação do FT ao

52

DNA e expressão de COX-2, esta foi inibida através do uso do CAPE. Logo,

observa-se que o CAPE é um importante inibidor do fator nuclear kappa B com

ação antioxidante.

8. OBJETIVOS

8.1. GERAL

Verificar o efeito da inibição da ativação do NF-kB sobre as alterações oxidativas e

da capacidade antioxidante na malária experimental cerebral e pulmonar causada

pelo P. berghei.

8.2. ESPECÍFICOS

Verificar a parasitemia dos camundongos infectados com P. berghei, controles e

naqueles que são inibidos à ativação do NF-kB;

Avaliar o efeito da inibição da síntese do NF-kB sobre a ação oxidativa dos

lipídios no pulmão e cérebro de camundongos com alterações da malária;

Verificar a defesa antioxidante no cérebro e pulmão de infectados com P.

berghei;

Avaliar possíveis correlações entre a oxidação de lipídios e a atividade

antioxidante diante do efeito da inibição do NF-kB no cérebro e pulmão de

infectados com P. berghei;

Analisar o efeito da inibição do NFkB sobre a permeabilidade da barreira

hematoencefálica.

Avaliar a ação oxidativa e a capacidade antioxidante sobre a permeabilidade da

barreira hematoencefálica.

53

9. MATERIAL E MÉTODOS

9.1. GRUPOS DE ANIMAIS

Foram utilizados 275 camundongos machos da raça Swiss com 10 semanas

de idade (adultos), procedentes do Biotério do Instituto Evandro Chagas (IEC) -

Belém/PA. Os animais foram mantidos em gaiolas no Biotério do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará (UFPA), à temperatura

ambiente (25 ± 3°C) com ciclo claro/escuro de 12 horas, tratados com alimentação

e água “ad libitum”. Vinte e cinco foram usados para a passagem da cepa e o

restante dividido randomicamente em 4 grupos, como segue:

Grupos A: No qual os animais foram inoculados com o P. berghei e tratados com

meio de diluição do NF-KB.

Os animais do Grupo A foram subdivididos em subgrupos I-V; com n = 15

cada: Os animais do subgrupo I foram submetidos à eutanásia após 24h da

infecção; Os animais do subgrupo II foram submetidos à eutanásia após 5 dias da

infecção; Os animais do subgrupo III foram submetidos à eutanásia após 10 dias

da infecção; Os animais do subgrupo IV foram submetidos à eutanásia após 15

dias da infecção; Os animais do subgrupo V foram submetidos à eutanásia após 20

dias da infecção;

Grupos B: Neste grupo os animais foram inoculados com o P. berghei e tratados

com o inibidor da ativação do NF-kB.

Os animais do Grupo B foram subdivididos em subgrupos VI-X com n = 15

cada: Os animais do subgrupo VI foram submetidos à eutanásia após 24h da

infecção; Os animais do subgrupo VII foram submetidos à eutanásia após 5 dias da

infecção; Os animais do subgrupo VIII foram submetidos à eutanásia após 10 dias

da infecção; Os animais do subgrupo IX foram submetidos à eutanásia após 15

dias da infecção; Os animais do subgrupo X foram submetidos à eutanásia após 20

dias da infecção;

Grupos C: Neste grupo os animais foram tratados apenas com o inibidor da

ativação do NF-kB.

54

Os animais do Grupo C foram subdivididos em subgrupos XI-XV com n = 15

cada: Os animais do subgrupo XI foram submetidos à eutanásia após 24h de

inoculação do inibidor; Os animais do subgrupo XII foram submetidos à eutanásia

após 5 dias da inoculação; Os animais do subgrupo XIII foram submetidos à

eutanásia após 10 dias da inoculação; Os animais do subgrupo XIV foram

submetidos à eutanásia após 15 dias da inoculação; Os animais do subgrupo XV

foram submetidos à eutanásia após 20 dias da inoculação;

Grupos D: Correspondem aos animais controles negativos (sham), os quais foram

submetidos à mesma ambientação e procedimentos técnicos realizados no grupo A

e B, com exceção da inoculação pelo protozoário e inibição do NF-kB, apenas com

inoculação de hemácias não infectadas. Esse grupo foi subdividido em 5 subgrupos

(XVI-XX) com n = 10 cada, submetidos à eutanásia nos mesmos tempos dos

animais dos subgrupos A, B e C.

Foram utilizados 5 camundongos de cada subgrupo (24h, 5, 10, 15 e 10

dias) pertencente ao grupo A, B, C e D para a análise da permeabilidade

hematocerebral. Exceto para os que tiveram o número reduzido dos camundongos

devido à infecção, nos quais se utilizou 1/4 do valor total de camundongos

sobreviventes. O uso dos animais foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa

Animal-UFPA, onde se obteve o seguinte registro 125-13 (Anexo)

9.2. INDUÇÃO DA MALÁRIA NOS CAMUNDONGOS

Inicialmente foi feita a inoculação intraperitoneal de hemácias infectadas (HI)

pelo Plasmodium berghei ANKA fornecida pelo Laboratório de Neurociências da

UFPA em camundongos Balb-c. Posteriormente ao atingirem uma parasitemia em

torno de 10% foi feita a coleta de sangue e infecção de 106 HI nos camundongos

Swiss em estudo de acordo com procedimentos descrito adiante (Percário, 1994;

Scardoeli et al., 1996).

Após 10 dias de infecção do camundongo Balb-c foi feita a determinação do

percentual de hemácias parasitadas (vide tópico 9.3 Determinação da Parasitemia)

para verificar se está ideal (5-15% de HI) para o preparo do inóculo dos

camundongos a serem estudados. Observou-se a faixa ideal, em seguida realiza-

se o corte transversal da ponta da cauda do animal e coleta de duas gotas de

55

sangue em tubo de ensaio contendo 2 mL de citrato de sódio 3,8%. Desta solução

são retirados 20 µL para a contagem de hemácias total na câmara de neubauer em

cinco quadrantes do quadrante mediano maior da câmara em microscópio óptico

(Olympus, CX2) num aumento de 400 vezes. O valor total desta contagem deve ser

multiplicado pelo fator de correção (fc = 50.000), assim o valor obtido reflete a

quantidade de hemácias em 1 ml da solução. E por fim realiza-se o ajuste da

solução para que a mesma tenha 1x106 HI através de sua diluição no meio RPMI

1640 (Sigma Aldrich, Cat # R5886) e soro bovino fetal (Invitrogen, Cat # 12657029)

com base no número de camundongos a serem infectados e sua massa corporal

(Peters, 1965; 1967).

9.3. PESQUISA DO PARASITA NO SANGUE

A contagem de hemácias infectadas pelo P. berghei nos camundongos foi

realizado em amostras sanguíneas obtidas dos animais por punção da veia caudal

no dia de eutanásia (1, 5, 10, 15 e 20 dias de infecção), para preparação de

esfregaço sanguíneo em lâmina para microscópio, depois de seco em temperatura

ambiente o esfregaço foi fixação com metanol (Dinâmica, Cat # 1230) por 2 min e

corado com o reagente de Gyemsa (Merk, Cat #1092041022) por 10min.

Posteriormente foi feita a lavagem da lâmina corada em água corrente. Após a

secagem dessa lâmina efetuou-se a contagem de HP em microscópio óptico

(Olympus, CX2) com aumento de 100X utilizando o óleo de imersão de acordo com

o quadro 1 abaixo.

Quadro 1- Número de hemácias a serem contadas a partir de uma estimativa inicial da parasitemia

% de Parasitemia Nº de Hemácias a serem contadas

0 10.000

<6 5.000

6-10 2.000

11 a 20 1.000

>20 300

Nº=número; %=percentual

56

9.4. HOMOGENEIZADO DE TECIDOS

Depois da retirado dos pulmões e encéfalo do animal, ambos os órgãos

foram lavados com solução fisiológica 0,9% e secos (NaCl; CAAL, Cat # 16825;

mais H2O destilada). O lado direito do pulmão e do cérebro foram submetido à

disrupção e preparação do homogeneizado de tecido. Este foi realizado da

seguinte forma, se acrescenta inicialmente a cada órgão separadamente a

solução salina fosfato PBS na proporção de 1:10 (massa:massa) e realiza-se

cortes nos mesmo com uma tesoura, em seguida são processados no disrruptor

de células ultra-sônico (UNIQUE). Durante este processo os recipientes contendo

as amostras são colocados em um béquer com gelo para evitar que o calor

gerado no processo danifique as amostras.

9.5. INIBIÇÃO DO NFKB

Para a inibição do fator nuclear kappa B foi utilizado o éster fenetil do ácido

caféico (CAPE, Calbiochem, Cat # 211200), componente ativo isolado da própolis

de colmeias de abelhas solúvel em etanol (50 mg/mL, Dinâmica, Cat # 1336).

Inicialmente o inibidor foi preparado em etanol 100% e posteriormente a solução

de inoculação em PBS na concentração de 1 mg/Kg peso do camundongo,

obtendo assim uma solução final de 7,04% de etanol em PBS. Foi realizado 5 dias

de pré-tratamento e tratamento dos camundongos até o dia da eutanásia em dias

alternados através de injeção i.p. de 200 µL ± 40 g de peso do camundongo (Jung

et al., 2008; Abduljawad et al. 2013).

9.6. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE

9.6.1. Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC)

A capacidade antioxidante foi determinada no homogeneizado de cada

órgão pelo método TEAC baseado no radical cátion ABTS+ produzido pela reação

entre o 2,2.-azinobis-3-etilbenzotiazolina-ácido-6-sulfônico-diamônio (ABTS; Sigma,

Cat # A1888 ) com persulfato de potássio (K2S2O8; Sigma, Cat # P5592), ambos

preparados em PBS. Esse radical é um cromóforo de coloração verde/azul, com

absorbância máxima nos comprimentos de onda 645, 734 e 815 nm em

Espectrofotômetro (Biospectro, SP-22) UV-visível (Re,1999).

57

O cromóforo é reduzido e perde a sua coloração tempo-dependente da

concentração de antioxidantes e duração da reação, mudança mensurada por

espectrofotometria a 734 nm durante um determinado intervalo de tempo. Assim, a

extensão da descoloração equivalente a inibição do radical cátion ABTS+ é

determinada como a atividade antioxidante total da amostra, sendo então calculada

a sua relação com a reatividade do Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-

tetrameticromono-2-carboxílico; Sigma, Cat # 23881-3) como padrão (Re,1999).

Este foi utilizado para o preparo de uma solução 2,5 mM, a partir do qual

preparou-se diluições sucessiva de acordo com o quadro 2 e se obteve a curva

padrão (Figura 9), desta se obteve a seguinte equação da reta TEAC=(ABS-

0,0235)/0,4905, onde ABS é igual a absorbância, sob as mesmas condições,

através do qual são fornecidos resultados finais expressos em milimolar por litro

(mM/L), método adaptado de Re (1999).

Para as amostras não quantificadas no dia da dosagem dos pontos da

curva, fez-se a correção utilizando fator de correção dosando-se apenas um ponto

da curva.

Quadro 2- Preparo dos pontos da curva padrão para análise do TEAC

Tubo Padrão de Trolox 2,5mM (µl)

PBS (µl) Concentração de Trolox (mM)

A 5000 0 2,5

B 4000 1000 2,0

C 3000 2000 1,5

D 2000 3000 1,0

E 1000 4000 0,5

F 0 5000 0

58

Figura 9- Curva padrão da Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox através da redução do radical ABTS+

9.6.2. Determinação da Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH

O método é baseado na redução do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila

(DPPH), que apresenta coloração violeta e absorção em torno de 515-517nm em

Espectrofotômetro UV-visível (Biospectro, SP-22). Pois, a atividade antioxidante

(AAO) de substâncias contidas na amostra é medida através da interação de

antioxidantes da mesma com o DPPH, resultando na formação irreversível do

produto hidrogenado (hidrazina) que é incolor. Assim, a extensão da inibição e

conseqüente descoloramento do DPPH é determinado como a capacidade

antioxidante da amostra, a qual é calculada em comparação com a reatividade do

antioxidante Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrameticromono-2-carboxílico; Sigma,

Cat # 23881-3) como padrão (Blois, 1958).

Para o ensaio foi utilizado o homogeneizado de cada órgão de acordo com o

método adaptado de Blois (1958), no qual foi preparada uma solução de DPPH a

0,1 mM em etanol (Dinâmica, Cat # 1336). Em cada tubo foi colocado 950 µL da

solução DPPH 0,1 mM, 50µL da amostra para completar um volume final de 1mL.

Após um período de 30 minutos em banho-maria a 37°C, foram feitas as leituras

das absorbâncias em 517 nm. Os valores de absorbâncias obtidos foram

subtraídos da absorbância inicial do DPPH.

59

As concentrações foram obtidas a partir da equação da reta da curva padrão

(Figura 10) do Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrameticromono-2-carboxílico;

Sigma, Cat # 23881-3) realizadas com a concentrações contidas no quadro 3, nas

mesmas condições das amostras e os resultado obtidos foram multiplicados pelo

fator de diluição 10. Os Resultados finais são expressos em milimolar por litro

(mM/L).

Quadro 3- Preparo dos pontos da curva padrão para análise do DPPH

Tubo Solução de Trabalho de Trolox

(µl)

PBS (µl) Concentração Final (mM de Trolox)

A 0 1000 0 (BRANCO)

B 50 950 0,125

C 100 900 0,250

D 150 850 0,375

E 200 800 0,500

F 250 750 0,625

G 300 700 0,750

60

Figura 10- Curva padrão da capacidade antioxidante equivalente ao trolox através da redução do DPPH.

9.7. DOSAGEM DAS SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO (TBARS)

O lipídio sofre ação oxidativa denominada peroxidação lipídica que é

avaliada através da dosagem do Malondialdeído (MDA), este que reage com duas

moléculas do ácido tiobarbitúrico (TBA, Sigma, Cat # T5500), em pH baixo (2,5), o

qual foi aferido no pHmetro digital (Hanna) e temperatura elevada, para formar o

complexo TBA-MDA-TBA, de cor rósea e absorção máxima em 535 nm (Khon &

Livesedge, 1944).

O procedimento técnico foi realizado de acordo com fundamentos de Kornn

& Livesedge (1944), adaptados por Percário et al. (1994), método que consiste no

preparo inicial do fosfato monobásico de potássio (KH2PO4 75 mM, Synth, Cat #

35210) em água acidificada até o pH 2,5. Esta solução é utilizada na preparação do

(TBA 10 nM). Adiciona-se 250 l de amostra à 500 l da solução de ácido

tiobarbitúrico 10 nM. Em seguida leva-se ao banho-maria (95ºC x 60 min); após a

incubação deixa-se esfriar a temperatura ambiente; adiciona-se 2,0 ml de álcool n-

butílico (Dinâmica, Cat # 1171), homogeneiza-se bem em vórtex e posteriormente

submete-se a centrifugação a 2500 rpm por 15 min; coleta-se 1,0 ml do

sobrenadante para leitura espectrofotométrica a 535 nm.

Ultilizou-se como padrão a solução padrão do MDA (1,1,3,3,

tetrahidroxipropano; Sigma, Cat # T9889) nas concentrações do quadro 4 abaixo,

61

através das quais se obteve as absorbâncias para a contrução da curva padrão

(Figura 11).

Quadro 4-Pontos da curva do MDA e absorbâncias.

Solução de MDA (nM/mL)

ABS (média)

7,5 0,137

15 0,247

30 0,515

60 0,974

100 1,637

Figura 11- Curva padrão de Malondialdeído (MDA).

9.8. AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE DA BARREIRA HEMATOECENCEFÁLICA

A permeabilidade da barreira hematoencefálica foi avaliada de acordo com

procedimentos técnicos descritos por Herbas et al. (2010) com modificações,

através do qual se pode visualizar a impregnação do corante azul de Evan (2%,

Dinâmica, Cat # 1186) no tecido cerebral.

62

Pois, o corante se liga a proteína albumina, proteína plasmática, e durante o

extravasamento sanguíneo dos vasos se a barreira endotelial não estiver

preservada o complexo corante-proteína migra para o tecido, corando o mesmo em

azul coloração perceptível ao olho nu (Gehlen et al., 2004).

Esse corante foi preparado em PBS com pH = 7.2 nos referidos dias de

eutanásia de cada grupo. O volume de injeção da solução foi calculado de acordo

com o peso do camundongo (4 mL/kg peso). Após 20 min da anestesia injetou-se

na veia lateral da cauda a solução corante; 1h depois da circulação da solução

corante no organismo do camundongo (Figura 12) realizou-se a anestesia do

mesmo. Posterior a 20 min foi feita a eutanásia por exaguinação e dissecação do

cérebro para a visualização da impregnação do Azul de Evans no mesmo a olho nu

(Herbas et al., 2010).

Figura 12- Camundongo após injeção do corante Azul de Evans 2%.

9.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos foram tabulados em planilhas elaboradas para este

estudo no programa Microsoft Office Excel 2013. Inicialmente foi realizada a

determinação dos valores discrepantes de cada parâmetro com base nos quartis

(Outliers), o qual utiliza em seu cálculo o intervalo interquartil determinado pela

diferença entre o terceiro quartil (Q3) e o primeiro quartil (Q1), chamado de dj.

63

Considera-se todo valor menor que Q1- 3/2 dj ou maior que Q3+ 3/2 dj, como

sendo discrepante ou outliers. Para testar a normalidade e a homocedasticidade

das variáveis foram aplicados o Kolmogorov-Smirnov e Teste de Levene.

Quando as médias das amostras foram identificadas normais foi efetuado a

comparação das mesmas pela aplicação dos teste paramétrico, Análise de

Variância (ANOVA) e na ausência de nulidade entre a diferença das médias entre

as variáveis dos grupos estudados foi aplicado o teste de Tukey. Quando

detectada a diferença estatisticamente significante entre os pontos da mediana

aplicou-se o teste de Dunn´s. Já para as amostras que não apresentaram

normalidade foi aplicado o teste não-paramétrico Kruskal Wallis.

Além desses, foi empregada a correlação de pearson na estimativa das

correlações entre os diversos resultados obtidos no estudo. Foram atribuídas

intensidades de correlação, sendo até 0,30 (r < 0,30) uma fraca correlação, entre

0,31 e 0,70 (0,31 < r < 0,70) moderada correlação e entre 0,71 e 1,00 (0,71 < r <

1,00) uma forte correlação, o sinal de positivo (+) ou negativo (-), do valor da

correlação indica se a relação entre as variáveis é diretamente proporcional ou

inversamente proporcional, respectivamente.

Para aplicação dos testes estatísticos ANOVA Dois Fatores e Kruskal Wallis

foi utilizado o programa SigmaStat versão 3.5 e para o cálculo de correlações o

SPSS versão 17.0. O nível de significância aceito nas análises foi de 5% (p

0,05).

64

10. RESULTADOS

10.1. PARASITEMIA

Na figura 13 pode ser observado a progressão da parasitemia dos camundongos

infectados e tratados com etanol 7,04% e dos que além do parasita foram tratados

com o inibidor. As médias dos percentuais da parasitemia estão dispostos na

tabela 1.

Em ambos os grupos infectados (A e o B) ocorreu aumento exponencial da

parasitemia (p< 0,001). Com diferença significativa entre os dois grupos no 15º (p=

0,02) e 20º (p< 0,001) dias após a infecção.

Figura 13 - Progressão temporal da parasitemia dos camundongos infectados com o P. berghei e tratados com etanol 7,04%, grupo A (vermelho), e dos tratados com o CAPE, grupo B (roxo).

65

Tabela 1 - Valores de parasitemia dos camundongos infectados em função do tempo de infecção.

Grupos PARASITEMIA (%)

N 1dia N 5dias N 10dias N 15dias N 20dias

A 15 0,07 ±0,87

15 1,27 ±0,52

13 2,01 ±0,40

5 12,32 ±4,1

3 45,95 ±28,58

B 15 0,10 ±0,15

15 1,38 ±0,95

12 2,61 ±0,77

5 1,94 ±0,78

4 18,24 ±12,09

A = Grupo de animais não tratados com CAPE e infectados com P. berghei. B = Grupo de animais tratados com CAPE e infectados com P. berghei. N = Número de animais por grupo de dias.

Nas análises entre os subgrupos pertencentes aos grupos A e B observou-se os

seguintes valores de p nas correlações (Tabela 2):

66

Tabela 2 - Valores de p obtidos das correlações entre os subgrupos de camundongos infectados para cada grupo isoladamente

Grupos Comparação P *

A

20º vs. 1º

20º vs. 5º

20º vs. 10º

20º vs. 15º

15º vs. 1º

15º vs. 5º

15º vs. 10º

10º vs. 1º

10º vs. 5º

5º vs. 1º

< 0,001

< 0,001

< 0,001

< 0,001

0,004

0,021

0,045*

0,913

0,997

0,989

B

20º vs. 1º

20º vs. 5º

20º vs. 10º

20º vs. 15º

15º vs. 1º

15º vs. 5º

15º vs. 10º

10º vs. 1º

10º vs. 5º

5º vs. 1º

< 0,001

< 0,001

< 0,001

< 0,001

1,84

0,831

0,987

0,999

1,000

0,987

A = Grupo de animais não tratados com CAPE e infectados com P. berghei. B = Grupo de animais tratados com CAPE e infectados com P. berghei. vs. = versus. * Obtido por teste de Tukey

67

Na análise das parasitemias entre os grupos A e B foi identificado apenas

correlação significativa após 15º e 20º de infecção (Tabela 3).

Tabela 3- Valores de p* referentes às correlações entre as parasitemias dos grupos de camundongos A e B

A = Grupo de animais não tratados com CAPE e infectados com P. berghei. B = Grupo de animais tratados com CAPE e infectados com P. berghei.

d = dias após infecção. *= obtido por teste de Tukey. vs.= versus.

Comparação P *

1d 5d 10d 15d 20d

A vs. B 0,991 0,967 0,828 0,02* <0,001

68

10.2. SOBREVIDA DOS CAMUNDONGOS A sobrevida (%) de todos os grupos de camundongos é demonstrada na figura

14. Os valores percentuais obtidos estão dispostos na tabela 4.

Figura 14 - Percentual da sobrevida de todos os grupos de camundongos. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

69

Tabela 4 - Percentual de sobrevida de todos os grupos de camundongos de experimentação do presente trabalho

(A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

DIAS SOBREVIDA (%)

N A N B N C N D

0 75 100,00 75 100,00 75 100,00 50 100,00

1 75 100,00 75 100,00 75 100,00 50 100,00

2 60 100,00 60 100,00 60 100,00 40 100,00

3 60 100,00 60 100,00 60 100,00 40 100,00

4 60 100,00 60 100,00 60 100,00 40 100,00

5 60 100,00 60 100,00 60 100,00 40 100,00

6 45 100,00 45 100,00 45 100,00 30 100,00

7 45 100,00 45 100,00 45 100,00 30 100,00

8 45 100,00 45 100,00 45 100,00 30 100,00

9 43 95,55 38 84,44 45 100,00 30 100,00

10 40 88,89 34 75,55 45 100,00 30 100,00

11 21 70,00 16 53,33 30 100,00 20 100,00

12 19 63,33 14 46,66 30 100,00 20 100,00

13 17 56,67 11 36,66 30 100,00 20 100,00

14 13 43,33 10 33,33 30 100,00 20 100,00

15 11 36,66 10 33,33 30 100,00 20 100,00

16 4 26,66 5 33,33 15 100,00 10 100,00

17 4 26,66 5 33,33 15 100,00 10 100,00

18 4 26,66 5 33,33 15 100,00 10 100,00

19 3 20,00 5 33,33 15 100,00 10 100,00

20 3 20,00 4 26,66 15 100,00 10 100,00

70

10.3. DOSAGENS PULMONARES

10.3.1. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+

Na figura 15 observa-se o comportamento da capacidade antioxidante

equivalente ao trolox nos pulmões dos grupos de estudo nos dias de eutanásia. Os

valores das médias do TEAC estão presentes na tabela 5 e os de p referentes às

correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 6 e entre grupos na tabela

7.

Figura 15 - Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) nos pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

71

Tabela 5- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) nos pulmões de cada grupo de camundongos em função do tempo de infecção

GRUPOS TEAC PULMÃO (mM/L)


A 10 1,01 ±0,25

10 0,94 ±0,12

10 0,94 ±0,03

3 0,70 ±0,35

2 1,298 ±0,001

B 10 1,12 ±0,24

10 1,20 ±0,17

10 0,89 ±0,17

3 0,86 ±0,10

2 2,00 ±0,11

C 10 1.24 ±0,08

10 1,12 ±0,02

10 0,84 ±0,10

10 0,89 ±0,23

10 0,91 ±0,07

D 10 0,84 ±0,38

10 0,86 ±0,03

10 0,67 ±0,07

10 0,68 ±0,07

10 0,56 ±0,06

Valores expressos como média±desvio-padrão. A= grupo de animais tratados com etanol 7,04% e infectados com Plasmodium berghei; B= grupo tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C= animais tratados com CAPE e não infectado com P. berghei; D= grupo Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

72

Tabela 6- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos pulmões, dentro dos subgrupos de camundongos

* obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus.

Comparação P *

A B C D

20º vs. 1º 0,667 0,959 0,002 0,125

20º vs. 5º 0,127 1,000 0,204 0.096

20º vs. 10º 0,189 O,113 0,938 0,909

20º vs. 15º 0,006 0,176 0,995 0,918

15º vs. 1º 0,013 0,251 < 0,001 0,731

15º vs. 5º 0,285 0,056 0,088 0,670

15º vs. 10º 0,452 1,000 0,994 1,000

10 vs. 1º 0,590 0,114 < 0,001 0,634

10º vs. 5º 1,000 0,009* 0,041 0,563

5º vs. 1º 0,377 0,880 0,719 1,000

73

Tabela 7- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos pulmões, entre os grupos de camundongos

*= obtido por teste de Tukey. vs.= versus. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

Comparação P *

1 d 5 d 10 d 15 d 20 d

A vs. B 0,996 0,019 0,976 0,701 0,953

A vs. C 0,288 0,255 0,848 0,449 0,052

A vs. D 0,068 0,845 0,186 0,999 < 0,001

B vs. C 0,436 0,876 0,969 0,999 0,099

B vs. D 0,048 0,007 0,249 0,613 < 0,001

C vs. D < 0,001 0,090 0,403 0,349 0,006

74

10.3.2. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH

O comportamento da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos

pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia está presentes na

figura 16. Os valores das médias dessa capacidade estão presentes na tabela 8 e

os de p das correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 9 e entre os

grupos na tabela 10.

Figura 16- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

75

Tabela 8- Valores da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões de cada grupo de camundongos

GRUPOS DPPH PULMÃO (mM/L)


A 10 3,58 ±0,26

10 3,42 ±0,77

10 3,91 ±1,79

3 2,36 ±0,86

2 6,24 ±0,35

B 10 3,23 ±1,09

10 4,30 ±0,87

10 3,60 ±1,023

3 4,14 ±0,86

2 4,14 ±2,13

C 10 5,11 ±0,87

10 4,62 ±0,55

10 3,88 ±1,01

10 3,37 ±1,40

10 4,64 ±0,99

D 10 2,14 ±2,03

10 3,545±1,24

10 2,49 ±0,24

10 4,80 ±1,08

10 3,79 ±0,94

Valores expressos como média ± desvio-padrão. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

76

Tabela 9- Valores de p das comparações para capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões, entre os subgrupos de camundongos

*= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis). vs.= versus.

Comparação P*

A B C D

20º vs. 1º 0,021* 0,705 0,866 0,146

20º vs. 5º 0,009* 1,000 1,000 0,999

20º vs. 10º 0,067 0,947 0,537 0,741

20º vs. 15º 0,001* 1,000 0,101 0,471

15º vs. 1º 0,463 0,711 0,007* 0,004*

15º vs. 5º 0,557 0,999 0,116 0,350

15º vs. 10º 0,252 0,949 0,905 0,060

10º vs. 1º 0,983 0,961 0,100 0,805

10º vs. 5º 0,906 0,673 0,575 0,863

5º vs. 1º 0,998 0,199 0,839 0,234

77

Tabela 10- Valores de p das comparações para capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos pulmões entre os grupos de camundongos


Comparação P*

1d 5d 10d 15d 20d

A vs. B 0,911 0,269 0,953 0,183 0,148

A vs. C 0,024 0,068 1,000 0,410 0,228

A vs. D 0,102 0,997 0,397 0,016 0,029

B vs. C 0,001 0,910 0,950 0,769 0,892

B vs. D 0,267 0,583 0,671 0,757 0,946

C vs. D <0,001 0,272 0,343 0,132 0,389

78

10.3.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

A figura 17 mostra a concentração das substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico nos pulmões dos grupos de camundongos ao longo dos dias de

infecção. Os valores das médias das substâncias que reagiram com o ácido estão

dispostos na tabela 11 e os de p valores das correlações entre os subgrupos de

cada grupo estão contidos na tabela 12 e entre os grupos na tabela 13.

Figura 17- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões dos camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

79

Tabela 11- Concentração de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões dos camundongos, em função do tempo de infecção

GRUPOS TBARS PULMÃO (nM/mL)


A 10 36,27 ±14,6

10 13,40 ±5,19

10 26,55 ±13,3

3 26,41 ±5,45

2 12,40 ±2,43

B 10 12,27 ±5,71

10 11,37 ±5,16

10 13,32 ±13,35

3 28,16 ±3,27

2 8,291 ±1,67

C 10 10,62 ±4,80

10 10,57±5,44

10 25,65 ±17,72

10 25,56 ±19,85

10 19,48 ±8,18

D 10 42,21±12,3

10 27,18 ±6,03

10 25,3 ±11,97

10 25,3 ± 12,81

10 24,43 ±10,31

*= obtido por teste de Tukey. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

80

Tabela 12- Valores de p das comparações para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os subgrupos de camundongos


Comparação P*

A B C D

20º vs. 1º 0,037 0,981 0,399 0,101

20º vs. 5º 1,000 0,992 0,367 1,000

20º vs. 10º 0,509 1,000 0,735 1,000

20º vs. 15º 0,063 0,158 0,727 0,568

15º vs. 1º 0,625 0,173 0,024 0,004

15º vs. 5º 0,360 0,125 0,018 0,497

15º vs. 10º 1,000 0,08 1,000 0,497

10º vs. 1º 0,459 0,953 0,028 0,132

10º vs. 5º 0,183 0,979 0,022 1,000

5º vs. 1º <0,001 1,000 1,000 0,199

81

Tabela 13- Valores de p das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos pulmões entre os grupos de camundongos


Comparação P*

1d 5d 10d 15d 20d

A vs. B <0,001 0,976 0,035 0,997 0,974

A vs. C <0,001 0,939 0,999 0,999 0,830

A vs. D 0,782 0,214 0,988 0,403 0,533

B vs. C 0,988 0,998 0,019 0,982 0,396

B vs. D <0,001 0,104 0,056 0,296 0,168

C vs. D <0,001 0,078 1,000 0,270 0,838

82

10.3.4. Estudo de para Amostras Pulmonares


Os gráficos de correlação entre TBARS e TEAC das amostras pulmonares dos

grupos de estudos são demonstrados na figura 18. Esta contém a análise

comparativa da correlação em cada grupo. Entre todos os grupos (r=-3148;

p=0,0003) e no grupo C (r= -0,6780; p< 0,0001) foram identificadas correlações

moderadas. Enquanto que os grupos A (r = -0,0139; p= 0,9429), B (r=-0,0932; p=

0,6180) , ou D (r=-0,2053; p=0,3471) não apresentaram correlação.

Figura 18- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo P. berghei. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

r=-0,3148 p=0,0003

83


A figura 19 mostra os gráficos de correlação de TBARS e DPPH nas

amostras pulmonares dos grupos de estudos. Não foi observada nenhuma

correlação nos grupos analisados.

Figura 19- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH em amostras pulmonares de camundongos infectados pelo P. berghei. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

r=-0,1599 p=0,0737

84


A figura 20 mostra os gráficos de correlação de TBARS nas amostras

pulmonares e parasitemia dos grupos de camundongos infectados pelo P. berghei.

Os gráficos apresentam a análise comparativa da correlação em cada grupo. Como

pode ser observado, não houve correlação entre os parâmetros analisados.

Figura 20- Correlações entre Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

r=-0,1453 p=0,2765

85


A figura 21 mostra os gráficos de correlação de TBARS nas amostras

pulmonares e Parasitemia dos camundongos. O gráfico apresenta a análise

comparativa da correlação em cada grupo. Foi identificada uma correlação

moderada (r= 0,3339; p= 0,104) na análise comparativa dos grupos A e B, assim

como na análise apenas do grupo A (r= 0,4607 p= 0,0136) e ausência de

correlação no grupo B (r= 0,1049 p= 0,5811).

Figura 21- Correlações entre Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

86


Na figura 22 consta os gráficos de correlação de TEAC nas amostras

pulmonares e Parasitemia dos camundongos. Após análise foi identificado

ausência de correlação pra todos os grupos (r= 0,1072; p= 4229), grupo A (r=

0,1931; p= 0,3343) e o B (r= 0,0272; p=0,8842).

Figura 22- Correlações entre Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras pulmonares pertencentes aos camundongos infectados pelo P. berghei e a parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

r=0,1072 p=0,4229

87

10.4. DOSAGENS ENCEFÁLICAS

10.4.1. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical ABTS+

Na figura 23 observa-se o comportamento da capacidade antioxidante

equivalente ao trolox nos encéfalos dos grupos de estudo nos dias de eutanásia.

Os valores das médias do TEAC estão presentes na tabela 14 e os de p referentes

às correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 15 e entre grupos na

tabela 16.

Figura 23- Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) em encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

88

Tabela 14- Valores da capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos de cada grupo de camundongos em função do tempo de infecção

GRUPOS TEAC ENCÉFALO (mM/L)


A 10 0,772 ±0,10

10 0,588 ±0,07

10 0,530 ±0,11

3 0,555 ±0,14

2 0,699 ±0,16

B 10 0,811 ±0,10

10 0,578 ±0,03

10 0,573 ±0,12

3 0,671 ±0,11

2 0,761 ±0,17

C 10 0,947 ±0,23

10 0,705 ±0,13

10 0,584 ±0,08

10 0,527 ±0,06

10 0,769 ±0,16

D 10 0,293 ±0,08

10 0,417 ±0,02

10 0,408 ±0,06

10 0,376 ±0,14

10 0,499 ±0,02

(A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

89

Tabela 15- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos


Comparação P*

A B C D

20º vs. 1º 0,948 0,975 0,018 0,118

20º vs. 5º 0,794 0,210 0,816 0,926

20º vs. 10º 0,481 0,198 0,017 0,826

20º vs. 15º 0,728 0,912 <0,001 0,605

15º vs. 1º 0,085 0,472 <0,001 0,837

15º vs. 5º 0,995 0,810 0,028 0,978

15º vs. 10º 0,999 0,785 0,870 0,995

10º vs. 1º 0,004 0,002 <0,001 0,605

10º vs. 5º 0,899 1,000 0,263 1,000

5º vs. 1º 0,018 0,002* <0,001 0,526

90

Tabela 16- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante equivalente ao trolox nos encéfalos entre os grupos de camundongos


Comparação P*

A B C D

A vs. B 0,915 0,999 0,919 0,676 0,952

A vs. C 0,018 0,192 0,846 0,987 0,893

A vs. D <0,001 0,141 0,397 0,224 0,271

B vs. C 0,098 0,155 0,998 0,324 1,000

B vs. D <0,001 0,193 0,109 0,01 0,04

C vs. D <0,001 0,002 0,068 0,153 0,003

91

10.4.2. Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH

O comportamento da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos

encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia está presentes na

figura 24. Os valores das médias dessa capacidade estão presentes na tabela 17 e

os de p das correlações entre os subgrupos de cada grupo na tabela 18 e entre

grupos na tabela 19.

Figura 24- Capacidade antioxidante através da redução do DPPH em encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de eutanásia. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

92

Tabela 17- Valores da capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos de cada grupo de camundongos.

GRUPOS DPPH ENCÉFALO (mM/L)


A 10 1,89 ±0,37

10 0,83 ±0,26

10 0,91 ±0,27

3 1,85 ±0,67

2 1,67 ±0,35

B 10 1,30 ±0,29

10 0,94 ±0,37

10 2,00 ±0,85

3 1,69 ±0,73

2 2,94 ±0,70

C 10 2,08 ±0,20

10 1,86 ±0,39

10 2,04 ±0,70

10 1,84 ±0,58

10 2,17 ±0,67

D 10 0,98 ±0,22

10 1,26 ±0,37

10 2,09 ±0,45

10 1,59 ±0,32

10 1,43 ±0,31


93

Tabela 18- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos


Comparação P*

A B C D

20º vs. 1º 0,984 <0,001 0,997 0,645

20º vs. 5º 0,190 <0,001 0,633 0,981

20º vs. 10º 0,330 0,049 0,979 0,232

20º vs. 15º 0,994 0,019 0,407 0,950

15º vs. 1º 1,000 0,765 0,768 0,276

15º vs. 5º 0,019* 0,157 0,998 0,719

15º vs. 10º 0,061 0,892 0,798 0,726

10º vs. 1º 0,002* 0,046 1,000 0,01

10º vs. 5º 0,998 <0,001 0,935 0,069

5º vs. 1º <0,001 0,521 0,906 0,915

94

Tabela 19- Valores de p das comparações para a capacidade antioxidante através da redução do DPPH nos encéfalos entre os grupos de camundongos


Comparação P*

1d 5d 10d 15d 20d

A vs. B 0,059 0,967 <0,001* 0,976 0,028*

A vs. C 0,853 <0,001* <0,001* 0,997 0,570

A vs. D 0,014* 0,400 <0,001* 0,964 0,938

B vs. C 0,017* <0,001* 0,999 0,989 0,083

B vs. D 0,701 0,642 0,990 1,000 <0,001*

C vs. D 0,004* 0,125 0,998 0,979 0,039*

95

10.4.3. Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico

A figura 25 demonstra a concentração das substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico nos encéfalos dos grupos de camundongos nos dias de análise. Os

valores das médias das substâncias que reagiram com o ácido estão dispostos na

tabela 20 e os de p valores das correlações entre os subgrupos de cada grupo

estão contidos na tabela 21 e entre os grupos na tabela 22.

Figura 25- Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos dos camundongos em função do tempo de infecção. A (vermelho): tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; B (roxo): tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; C (azul): tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; D (verde): Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

96

Tabela 20- Concentração das Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos dos camundongos em função do tempo de infecção

GRUPOS TBARS ENCÉFALO (nM/mL)


A 10 78,68 ±20,7

10 68,14 ±6,73

10 44,65 ±23,1

3 66,58 ±20,01

2 30,40 ±0,30

B 10 80,39 ±9,21

10 71,40 ±6.05

10 54,92 ±14,48

3 66,50 ±5,01

2 29,16 ±8,83

C 10 92,78 ±20,4

10 71,54 ±6,44

10 60,11 ±19,80

10 78,33 ±5,99

10 70,55 ±10,55

D 10 57,48 ±23,3

10 61,76 ±8,15

10 48,85 ±16,78

10 26,67 ±10,64

10 39,29 ±5,52


97

Tabela 21- Valores de p das comparações para as Substâncias Reativas ao Ácido

Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os subgrupos de camundongos


Comparação P*

A B C D

20º vs. 1º <0,001 <0,001 0,011 0,345

20º vs. 5º 0,011 <0,001 1,000 0,195

20º vs. 10º 0,735 0,076 0,552 0,865

20º vs. 15º 0,054 0,018 0,827 0,737

15º vs. 1º 0,716 0,624 0,267 0,018

15º vs. 5º 1,000 0,986 0,897 0,008

15º vs. 10º 0,216 0,766 0,103 0,163

10º vs. 1º <0,001 0,006 <0,001 0,882

10º vs. 5º 0,029 0,128 0,492 0,679

5º vs. 1º 0,549 0,691 0,022 0,992

98

Tabela 22- Valores de p das comparações para as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) nos encéfalos entre os grupos de camundongos


Comparação P*

1d 5d 10d 15d 20d

A vs. B 0,995 0,965 0,562 1,000 1,000

A vs. C 0,140 0,966 0,190 0,648 0,003

A vs. D 0,045 0,891 0,964 0,003 0,883

B vs. C 0,285 1,000 0,883 0,643 <0,001

B vs. D 0,034 0,680 0,885 0,003 0,800

C vs. D <0,001 0,693 0,511 <0,001 0,003

99

10.4.4. Estudo de Correlação para Amostras Encefálicas


Os gráficos de correlação de TBARS e TEAC das amostras encefálicas dos

grupos de estudos estão demonstrados na figura 26. Esta contém a análise

comparativa da correlação em cada grupo. Foi observada correlação moderada na

entre todos os grupos (r=-0,564; p= 0,0001), grupo B (r= 0,405; p= 0,0262) e C (r= -

0,551; p= 0,0002). E ausência de correlação nos grupo A (r=-0,432; p= 0,215) e

grupo D (r=-0,032; p= 0,8920).

Figura 26- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

r=0,564 p<0,0001

100


A figura 27 mostra os gráficos de correlação de TBARS e DPPH nas

amostras encefálicas dos grupos de estudos. O gráfico apresenta a análise

comparativa da correlação em cada grupo. Foi observada ausência de correlação

entre todos os grupos e na análise do grupo A, enquanto que o grupo B (r= 0,23;

p= 0,031) apresentou correlação moderada, e o C (r= 0,23; p= 0,031) e o D (r=

0,18; p= 0,002) fraca.

Figura 27- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de estudo. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei; (C) tratado com CAPE e não infectado com P. berghei; (D) Controle Negativo (inoculo de hemácias saudáveis).

101


A figura 28 mostra os gráficos de correlação de TBARS de amostras

encefálicas e parasitemia dos grupos de estudos. O gráfico apresenta a análise

comparativa da correlação em cada grupo. Observou-se que na comparação entre

grupos (r=-0,4202; p= 0,0001) e no grupo A (r= 0,4048; p= 0,0293) há uma

correlação moderada. O grupo B (r=-0,756; p<0,0001) possui uma forte correlação

para os parâmetros analisados.

Figura 28- Correlação entre as Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

r=-0,4202 p=0.0001

102


Os gráficos de correlação do DPPH e Parasitemia das amostras encefálicas

dos grupos de estudos são demonstrados na figura 29. Esta contém a análise

comparativa da correlação em cada grupo. Identificou-se após a análise que há

correlação moderada para todos os grupos infectados (r= 0,3947; p= 0,002) e de

forma isolada, o grupo A (r= 0,4491; P= 0,0112) e o B (r= 0,5302; p= 0,037).

Figura 29- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Através da Redução do Radical DPPH de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

r=0,3947 p=0,002

103


A figura 30 mostra os gráficos de correlação da parasitemia e TEAC nas

amostras encefálicas dos grupos de estudos. Os gráficos apresentam a análise

comparativa da correlação em cada grupo. Não foi identificado correlação na

análise entre os grupos e de forma isolada.

Figura 30- Correlação entre a Capacidade Antioxidante Equivalente ao Trolox (TEAC) de amostras encefálicas dos grupos de estudo infectados e a Parasitemia. (A) tratado com etanol 7,04% e infectado com Plasmodium berghei; (B) tratado com CAPE e infectado com Plasmodium berghei.

r=-0,0166 p=0,8975

104

10.4.5. Avaliação da Permeabilidade da Barreira Hematoecencefálica

Na figura 31 estão presentes as fotos dos encéfalos demonstrando o

comportamento da barreira hematoencefálica (BHE) nos grupos de estudos. Os

grupos que apresentaram quebra da barreira através da impregnação da solução

de azul de evans foram os grupos parasitados A após 10 dias de infecção e o B no

15º dia após de ser infectado.

Os camundongos do grupo A de 20 dias não resistiram à injeção e/ou circulação

da solução corante.

105

Figura 31- Encéfalo dos camundongos após injeção e 1h de circulação da solução azul de evans 2% nos dias de eutanásia.

A24h A5 dias A10 dias A15 dias

B24h B5 dias B10 dias B15 dias B20 dias

C24h C5 dias C10 dias C15 dias C20 dias

D24h D5 dias D10 dias D15 dias D20 dias

Grupo A

Grupo B

Grupo C

Grupo D

106

11. DISCUSSÃO

Para avaliar o efeito do NF-kB sobre o estresse oxidativo gerado durante a

malária cerebral e pulmonar experimental causada pelo P. berghei no presente

trabalho foi utilizado o CAPE, inibidor específico do NF-kB, de acordo com

procedimentos descritos no tópico de material e métodos.

No decorrer da coleta das amostras foi feita a anotação dos óbitos para

posterior análise da sobrevida. Enquanto que nos dias de eutanásia foram

determinadas as parasitemias dos camundongos e avaliado a quebra da barreira

hematoencefálica de todos os grupos. Em seguida para analisar o papel do

estresse oxidativo no modelo proposto utilizou-se métodos que quantificam a

peroxidação lipídica (TBARS), a capacidade antioxidante por meio da redução do

radical ABTS+ (TEAC) e capacidade antioxidante através da redução do radical

DPPH. Tais dados foram comparados entre si.

A partir dos resultados obtidos observou-se que os grupos A e B, infectados,

apresentaram um comportamento semelhante até o 10º dia após infecção. Porém,

no 15º (p= 0,02) e 20º (p< 0,001) dia ocorreu uma diminuição significativa da

parasitemia no grupo em que foi feito a inibição do NF-kB em comparação ao

grupo A. Sugere-se que o fator de transcrição pode estar envolvido na reprodução

do parasita no organismo murino. Pesquisas realizadas em cultura de células

indicam que o NF-kB atua estimulando a produção de moléculas inflamatórias e

de adesão na malária cerebral, sendo assim a presente pesquisa corrobora com o

envolvimento do fator de transcrição, porém atuando na proliferação do parasita

(Tripathi et al. 2006; 2009).

No que tange a sobrevida, observou-se diferença percentual acentuada

entre os grupos A e B a partir 10º dia de infecção, indicando que o CAPE

antecipou a diminuição da sobrevida dos camundongos, comportamento que não

se manteve ao longo do período após a infecção, já que no último dia de análise a

diferença entre ambos foi de 6,66%. Resultados diferentes foram obtidos por

Nacer et al. (2012), em semelhante experimento os camundongos eram levados

ao óbito no quinto dia após infecção.

107

A discussão advinda dos resultados da sobrevida e a diminuição da

parasitemia provocada pela a inibição do NF-kB corroboram com achados de

Maguire et al. (2005), que observaram em pacientes com malária a presença da

oclusão de vasos pulmonares devido ao sequestro de células vermelhas e

brancas que promovem o impedimento da função da barreira alvéolo-pulmonar,

desenvolvendo assim as complicações pulmonares após iniciado o tratamento e

clearence parasitário. Dessa forma sugere-se que a complicação da doença não

ocorra devido ao aumento efetivo do número de parasitas do organismo, e sim

outros mecanismos de ação desencadeados pela presença do Plasmodium.

Ao ser analisado o início de óbito no presente experimento foi identificado o

mesmo para os grupos A e B, a partir do nono dia após infecção com parasitemia

em torno de 45%, resultados que diferem de estudos realizados por Nacer et al.

(2012), que fizeram experimentos utilizando mesmo tipo de camundongo infectado

por P. berghei e morreram no quinto dia após infecção, porém com quase o dobro

da quantidade de parasitas (80%).

11.1. ACHADOS PULMONARES

No que diz respeito aos achados pulmonares, observou-se entre os

subgrupos de cada grupo que os valores da capacidade antioxidante equivalente

ao trolox nos pulmões que o grupo A apresentaramu uma diminuição no 15º dia (p=

0,013), seguido de um aumento no 20º dia (p= 0,006). Sugere-se a alteração inicial

seja devido a presença do parasita estimulando o sistema imune a produzir radicais

livres para combater o patógeno, consumindo a defesa antioxidante, seguido de um

estímulo tardio na produção da defesa antioxidante (van de Crommenacker et al.,

2012).

Diante da inibição do NF-kB e a infecção pelo parasita, a capacidade

antioxidante apresentou diminuição apenas do 5º para o 10º dia (p= 0,009),

mantendo o estado redox nos outros dias analisados. Entretanto, na ausência do

NF-kB, a diminuição da capacidade foi progressiva a partir do 5º dia (p= 0,041)

indicando que o fator de transcrição pode estar envolvido na codificação de

enzimas antioxidantes, como já citado por Kumar et al. (2004).

Esses resultados diferem dos achados no grupo D, em que não foi

observada alteração da capacidade antioxidante, indicando que a inoculação de

108

hemácias não promove alteração da ação antioxidante do organismo murino. Os

dados dos grupos sugerem que a presença do parasita, do inibidor e do meio

etanólico de diluição do fator promovem alterações na capacidade antioxidante.

Esta quando analisada entre grupos foi identificado comportamento

semelhante com relação aos grupos infectados (A e B) em relação ao grupo D (<

0,001) após 20 dias de infecção, ratificando a alteração redox na presença do

parasita com níveis mais elevados de defesa com a inibição do NF-kB e infecção

pelo Plasmodium (1,999 mM/L).

No que diz respeito ao outro método de avaliação da capacidade

antioxidante através da redução do radical DPPH, observou-se valores maiores da

atividade antioxidante em longo prazo no grupo A após 20 dias de infecção (Tabela

6), resultado semelhante ao encontrado no uso do TEAC, corroborando com a ideia

de indução de defesa antioxidante na presença do parasita de forma tardia.

Já os grupos tratados com inibidor do NF-kB tiveram alteração da ação

contra radicais após 15 dias de infecção de forma contrária, no C teve diminuição

da capacidade antioxidante (p= 0,007), e no D a aumento (p= 0,004), indicando que

o inibidor promova a diminuição da produção de defesa contra os radicais,

resultado semelhante ao obtido no uso ABTS+, com antecipação da diminuição da

atividade antioxidante no 10º dia, permanecendo o raciocínio de inibição da

codificação de moléculas antioxidantes (Kumar et al., 2004). No grupo D ocorreu

aumento da defesa antioxidante após 15 dias, sugerindo-se a presença de estresse

oxidativos induzida pela inoculação de hemácias.

O método utilizando o radical ABTS+ pareceu mais sensível com capacidade

de detectar pequenas quantidades (0,0564 mM/mL) e adequado para a análise da

atividade antioxidante dos diferentes grupos de estudo, já que através do mesmo

pode se ter uma inferência mais racional dos resultados.

Após 24h de experimento e análise utilizando o DPPH no grupo contendo só

inibidor teve capacidade antioxidante mais elevada que os outros grupos em

estudo, infere-se dessa forma que o tempo de tratamento não é suficiente para

efetiva inibição do NF-kB. A referida elevação foi identificada no grupo A após 15

dias, sugerindo que o parasita possa induzir o estresse oxidativos e demanda de

109

defesa para o combate do mesmo, e após 20 dias de infecção o consumo das

moléculas antioxidantes, diferente dos achados com o método utilizando o ABTS+,

neste só foi identificado elevação no 20º dia, nos dois grupos infectados.

Com relação à peroxidação lipídica, observou-se que ocorre diminuição da

mesma após 5 (p > 0,001) e 20 (p= 0,037) dia de infecção nos camundongos

infectados pelo P. berghei e tratados com o meio de diluição do NF-kB. Após 5 dias

de infecção na presença apenas do inibidor os níveis de lipídios oxidados

aumentaram (p< 0,05) sugerindo novamente que a inibição do NF-kB está

relacionada com a expressão de antioxidante e consequente aumento da

disponibilidade de radicais sobre ação nos lipídios.

A inoculação de hemácias promoveu uma diminuição da peroxidação lipídica

após 15 dias de inoculação da mesma (p= 0,004), sem alterações nos outros dias

analisados. Acredita-se que essa diminuição seja devido à adaptação posterior às

hemácias acrescidas no organismo do camundongo diminuindo assim a quantidade

de lipídios oxidados.

Na análise da oxidação de lipídeos do tecido pulmonar entre grupos

observou-se que ocorreu uma inibição aguda da ação oxidativa (p > 0,001) nos

grupos tratados com inibidor (Figura 17), indicando que o inibidor pode atuar

impedindo a ação oxidativa promovida pela presença do parasita ou da hemácia.

Na análise entre TBARS e TEAC foi observada correlação moderada

negativa para todos os grupos (r = -0,3148; p< 0,003) e no Grupo C (r = -0,6780; p<

0,001), sugerindo-se assim que na inibição do NF-kB no organismo murino sem

agente infeccioso a tendência de ocorrer um aumento da capacidade antioxidante

promovendo assim a diminuição dos radicais endógenos, por isso a correlação é

negativa.

Na análise entre TBARS e DPPH não foi observada correlação significativa

nos grupos infectados, assim como na comparação da peroxidação com a

parasitemia.

Já na correlação DPPH e parasitemia identificou-se correlação moderada

entre os grupos A e B (r = 0,3339; p= 0,104) e na análise apenas do grupo A (r =

0,4607 p= 0,0136). Esses resultados sugerem uma tendência da elevação da

110

parasitemia promover maior produção de antioxidantes, comportamento também

encontrado na análise isolada do grupo A, já que teve a referida correlação.

Diferente da análise do método utilizando ABTS+, em que não houve correlação

com a parasitemia.

11.2. ACHADOS ENCEFÁLICOS

Nas análises do TEAC em cada grupo observou-se que a capacidade

antioxidante teve diferença significativa nos grupos A e B, pois em ambos foi

observado diminuição após 5 e 10 dias de infecção com relação ao primeiro dia.

Sugerindo que na presença do parasita promova a diminuição da defesa

antioxidante nos referidos períodos. No grupo C a diminuição foi semelhante aos

grupos anteriores e se estendeu ao 15º e seguinte aumento no 20º dia após

infecção. Alterações que ocorrem nesse grupo provavelmente devido à solução de

etanol a 7,04% (Tabela 15).

Os subgrupos do grupo D tiveram semelhante comportamento nas amostras

encefálicas e nas pulmonares, ou seja, sem alteração da capacidade antioxidante

através da redução do radical ABTS+. Indicando que a presença de hemácias não

promove alteração da capacidade antioxidante ao longo da progressão da doença.

Na análise da referida capacidade antioxidante entre grupos foi identificado

que após 24h da infecção os grupos A e B (p= 0,915) apresentaram

comportamento semelhante, ou seja, níveis elevados de TEAC devido à presença

do parasita e/ou inibidor CAPE. Houve significância estatística entre os grupos A e

C (p= 0,018) e entre A e D (p< 0,001), refletindo a diferença aguda da doença no

grupo A com níveis de TEAC maiores que os do grupo de D e menores que o C, as

alterações indicam que a presença do parasita induzir a capacidade em níveis

menores de quando foi usado o inibidor de forma isolada no camundongo.

Além desses resultados também foi constatado que valores

significantemente elevados entre os grupos B (p< 0,001) e C (p< 0,001), em

comparação ao D. Ou seja, a inibição do NF-kB após 1 dia de infecção promove

elevação da capacidade antioxidante a níveis maiores que a capacidade de

camundongos contendo o inoculo de hemácias.

111

Após 5 dias de infecção entre o grupo C e D (p= 0,002) ocorreu um aumento

níveis de TEAC que pode ter sido ocasionado pela presença do inibidor. Este

raciocínio também de aplica após 15 dias de infecção, porém na presença

concomitante do parasita (B vs. D; p= 0,01). No 20º dia de análise observou-se que

os dois grupos contendo o inibidor (B e C) tiveram elevadas concentrações de

TEAC (p< 0,05) em comparação ao grupo inoculado com hemácia (D), assim esses

resultados sugerem que a ausência da ação do NF-kB promova um aumento na

capacidade antioxidante de forma aguda e tardia.

No uso do outro método de capacidade antioxidante através da redução do

DPPH observou-se que na análise dos subgrupos pertencentes ao grupo A ocorreu

diminuição da defesa contra os radicais após dez dias de infecção. Resultados que

diferem na análise entre 5º e 15º dias (p< 0,001) para o mesmo grupo, em que se

identificou um aumento. Sugere-se que o aumento ocorra devido à ação oxidativa

provocada pelo parasita em longo prazo induzindo a produção endógena de

antioxidantes.

Já o grupo B desenvolveu uma ação acentuada da capacidade antioxidante

após 10 e 20 dias de infecção com relação aos outros dias de análise, esta que

pode ter sido ocasionada devido à inibição do FT (Tabela 18). Já o aumento dessa

capacidade foi identificado após 10 dias de injeção da solução de hemácias no

grupo D (p= 0,01).

Na avaliação entre grupos foi observado após 24h de infecção níveis

semelhantes de redução do radical DPPH nos grupos A e C (p= 0,059), e elevados

em comparação ao grupo D (Tabela 19). Elevação também observada no grupo

tratado apenas com o inibidor em relação ao B. Dessa forma credita-se que os

níveis elevados seja devido à ação etanólica em ambos os grupos e que a

presença do parasita produzindo produz radicais que diminuem a disponibilidade

de moléculas antioxidante.

Este efeito também parece ter ocorrido no quinto dia após infecção quando

comparamos os grupos contendo parasita com o que foi tratado apenas com o

inibidor (p< 0,001). No dia seguinte de análise os grupos contendo inibidor e o D

tiveram comportamento semelhante com níveis elevados de defesa antioxidante

(p< 0,001). Os achados indicam que o NF-kB apesar de promover a codificação de

112

moléculas antioxidantes não é a principal via de produção das mesmas, porém é

um fator de transcrição que se inibido diminui o comprometimento na malária.

O uso crônico do inibidor promoveu aumento da atividade antioxidante na

presença do parasita, assim como o uso do inibidor isolado em comparação ao

grupo inoculado com hemácias (p< 0,001). Os grupos parasitados tiveram um

comportamento diferente, quando na presença apenas do parasita observou-se

maiores níveis de capacidade antioxidante (p< 0,028). Identificou-se com esses

dados que o NF-kB pode ser uma via parcial da produção de antioxidantes.

No que diz respeito à ação oxidativa sobre os lipídios encefálicos,

identificou-se diferença significante entre os subgrupos do grupo A nas correlações

seguintes: 1º e 20º dia (p< 0,001) após infecção, 5º e 20º dia (p= 0,011), 1º e 10º

dia (p< 0,001) e 5º e 10º (p= 0,029). Todas as comparações refletem em uma

diminuição da peroxidação lipídica que possa ter sido ocorrida devido o aumento

da produção de antioxidante frente à presença do parasita no organismo dos

camundongos. Comportamento semelhante foi observado no grupo B, porém com

ausência de correlação entre 5º e 10º (p= 0,128), e presença entre 15º e 20º dia

(p= 0,018), reforçando a suposição feita anteriormente. Essa mesma diminuição foi

observadas nos grupos C e D em determinados períodos de infecção (Tabela 21).

Essas reduções da peroxidação foram também notadas na análise entre

grupos em diferentes períodos (Tabela 22). Resaltando que o grupo com hemácias

teve as menores quantidades de peroxidação no primeiro dia após infecção se

mantendo também no 15º dia de análise. Diferente do identificado no 20º dia, em

que a peroxidação promovida pelo parasita parece ter sido neutralizada, já que os

grupos infectados tiveram os menores níveis de MDA, assim como o grupo controle

inoculado com hemácias.

Diante da correlação dos parâmetros analisados foi observada correlação

moderada positiva entre TBARS e TEAC para todos os grupos, B e no C. Dessa

forma foi observado que na presença de lipídio oxidado deve haver produção de

antioxidantes no tecido cerebral impedindo o dano oxidativo (Figura 26),

principalmente na presença do inibidor.

113

Comportamento também observado na correlação entre peroxidação lipídica

e a capacidade antioxidante através da redução do radical ABTS+, porém de forma

moderada (r = 0,4339 e p= 0,0165) na presença do parasita e sem ação do NF-kB

e fraca (r = 0,3092 e p= 0,0410) quando tratado apenas do o inibidor.

Diferentes resultados foram encontrados na análise da parasitemia em

comparação ao TBARS, pois ocorreu uma diminuição da peroxidação lipídica com

o aumento da quantidade de parasitas. Esta relação foi fraca para os grupos

infectados e de forma isolada no A, enquanto que no B foi forte, indicando que o

inibidor promove a diminuição da ação oxidativa promovida pelo parasita.

Em comparação ao DPPH, a parasitemia demonstrou correlação moderada

em todas as análises realizadas. Sugerindo que no aumento da parasitemia ocorre

o estímulo da capacidade antioxidante independente da presença do inibidor

(Figura 20).

Observou-se com relação à quebra da barreira hematoencefálica que a

mesma ocorreu de forma mais precoce no 10º dia de infecção no grupo A infectado

e sem tratamento com o inibidor, pois na presença do mesmo a quebra foi

observada após 15 dias da infecção do camundongo e tratamento com o CAPE.

Achados semelhantes aos observados por Baptista et al. (2010) que ao tratarem

camundongos com pirimetamina observou a impregnação do tecido cerebral em

torno do 13º ou 15º dia após infecção.

No dia em que houve a quebra da barreira hematoencefálica no grupo A foi

constado uma baixa concentração de defesa antioxidante utilizando o radical DPPH

em comparação ao grupo com inibidor e infetado com P. berghei (p< 0,001).

Sugerindo que o NF-kB não é a principal via de estimulação de defesa antioxidante

e que este fator de transcrição pode está envolvido na codificação de outras

moléculas envolvidas no agravamento da doença.

No grupo B de 15 dias de infecção observou-se que a defesa utilizando o

ABTS+ se manteve em comparação ao grupo D (p= 0,01). Dessa forma, apesar de

baixa em comparação ao início da análise acredita-se que a capacidade

antioxidante pode ter contribuído no grupo B para o prolongamento da integridade

114

da barreira hematoencefálica, porém não suficiente para o impedimento total da

disrupção da BHE.

No que tange a ação oxidativa dos lipídios observou-se diminuição da

peroxidação lipídica ao longo do período de análise nos grupos infectado. Com

destaque para o primeiro dia, dessa forma essa ação oxidativa de lipídio parece

fazer parte do processo inicial da doença, com níveis igualmente elevados nos

grupos A (p= 0,045) e B (p= 0,034) em comparação ao D. Sugerindo que o inibidor

não seja efetivo contra a ação oxidativa de lipídio, no entanto pode atuar no

combate de outras formas de dano oxidativos, como a ação sobre DNA,

carboidratos e proteínas (Ma et. al., 2010).

Diferentes dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

encontradas no presente projeto, Omodeo-Salé et al. (2003) identificaram elevadas

concentrações de peroxidação lipídica em células humanas infectadas pelo

Plasmódio.

12. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Apesar das diferenças estatísticas encontradas não podemos afirmar que a

inibição do fator de transcrição NF-kB ocorreu de forma efetiva. Esta análise será

posteriormente realizada por meio do ensaio imunoenzimático (ELISA) realizado

para determinação da atividade do FT, através do “NF-kB Pathway Activation

InstantOne™ ELISA” (eBiociensce®), projetado para determinar a proteína NFkB

p65 (Ser536), IkB (Ser32/36), e Ikk (Ser176/180) em homogenado celular.

115

13. CONCLUSÕES

Os achados referentes à parasitemia apontam que diante da inibição do fator

de transcrição kappa B ocorre uma diminuição da parasitemia a partir do 10º

dia de infecção dos camundongos sem alterar a sobrevida.

A avaliação da inibição do NF-KB para os achados pulmonares apontaram

para a inibição da ação oxidativa sobre os lipídios após 24h, diferente dos

achados encefálicos em que tal inibição ocorreu em longo prazo.

Os achados pulmonares apontam para uma ação aguda e em longo prazo

da inibição do NF-kB promovendo aumento da capacidade antioxidante.

Comportamento semelhante aos achados encefálicos.

A inibição do NF-kB aumenta a capacidade antioxidante e diminui a ação

oxidativa sobre lipídio nas amostras encefálicas.

A avaliação da inibição do NF-kB demonstrou um efeito tardio da quebra da

barreira hematoencefálica diante do impedimento da ação do NF-kB.

A capacidade antioxidante prolonga a integridade da barreira

hematoencefálica, mas sem ação efetiva contra a peroxidação de lipídeos.

116

14. REFERÊNCIAS

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130

15. ANEXO

131


TEAC DPPH MDA Animal Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão Cérebro Pulmão

1 0,924 1,189 2,458 3,373 44,50 37,31 2 0,672 1,016 1,307 3,316 43,37 16,06 3 0,855 0,819 1,864 3,488 88,37 41,37 4 0,437* 1,104 1,514 3,831 88,56 21,87 5 0,798 0,655 2,322 1,064 68,87 57,12 6 0,572 1,344 1,643 4,596* 77,06 26,18 7 0,803 1,049 2,043 3,330 90,75 53,18 8 0,758 1,394 1,629 3,795 94,50 34,81 9 0,773 0,977 1,764 2,458 105,56 22,06

10 0,790 1,410 2,208 3,953 85,25 52,75 Média 0,772 1,096 1,875 3,584 78,68 36,27

DP 0,101 0,247 0,374 0,268 20,72 14,68 Q1 0,758 0,987 1,632 3,352 70,92 23,09 Q3 0,803 1,305 2,167 3,813 90,20 49,90 DJ 0,045 0,318 0,534 0,461 19,28 26,81

2/3DJ 0,067 0,477 0,801 0,691 28,92 40,21 Q1-3/2DJ 0,690 0,510 0,830 2,660 42,00 -17,12 Q3+3/2DJ 0,871 1,782 2,968 4,505 119,12 90,12

DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos

132



1 0,792 0,977 1,364

3,581 76,43 8,06 2 0,839 1,061 1,450 3,223 67,93 8,12 3 0,864 0,607 0,813 2,058 72,75 2,31 4 0,810 1,425 1,149 2,680 76,81 12,25 5 0,832 1,333 1,214 3,652 77,31 13,25 6 0,904 1,197 1,650 2,866 86,37 12,75 7 0,986 1,295 1,686 1,514 93,12 13,31 8 0,358* 1,145 1,428 4,703 34,37* 20,93 9 0,921 0,995 0,935 4,761 92,43 19,31 10 † † † † † †

Média 0,811 1,115 1,299 3,226 80,39 12,25 DP 0,180 0,244 0,298 1,093 9,21 5,71 Q1 0,810 0,995 1,149 2,680 75,51 8,12 Q3 0,904 1,295 1,450 3,652 87,89 13,31 DJ 0,093 0,299 0,300 0,972 12,37 5,18

2/3DJ 0,140 0,449 0,450 1,458 18,56 7,78 Q1-3/2DJ 0,670 0,545 0,699 1,221 56,95 0,34 Q3+3/2DJ 1,045 1,744 1,900 5,111 106,45 21,09

DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável *= pontos excluidos †= Animal falecido antes do dia da coleta

133



1 0,853 1,251 1,836 4,131 66,87 14,31 2 0,739 1,191 0,549* 5,933 69,75 6,18 3 0,871 1,366 0,356* 6,362 63,87 10,56 4 0,775 1,232 1,893 5,283 104,68 18,56 5 1,102 1,344 2,215 5,061 105,18 6,18 6 1,129 1,230 3,209* 5,898 104,00 16,31 7 0,912 1,089 2,322 4,067 83,43 4,31 8 1,123 1,179 3,280* 5,411 111,43 10,25 9 1,369 1,235 1,965 5,204 121,93 ND 10 0,596 1,314 2,251 3,760 96,68 8,93

Média 0,947 1,243 2,080 5,111 92,78 10,62 DP 0,230 0,082 0,206 0,873 20,43 4,88 Q1 0,794 1,201 1,911 4,364 73,17 6,1875 Q3 1,118 1,298 2,242 5,776 105,06 14,31 DJ 0,323 0,097 0,330 1,412 31,89 8,12

2/3DJ 0,485 0,146 0,496 2,118 47,83 12,18 Q1-3/2DJ 0,309 1,054 1,415 2,245 25,33 -6 Q3+3/2DJ 1,604 1,445 2,738 7,895 152,89 26,50

DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada *= pontos excluidos

134



1 0,221 0,942 1,149 1,614 46,18 ND 2 0,204 0,533 0,685 0,327 85,56 33,25 3 0,278 1,460 0,928 5,419 24,75 53,56 4 0,352 0,752 1,149 2,622 59,43 30,00 5 0,4005 0,533 1,686* 0,692 71,50 52,06

Média 0,292 0,844 0,978 2,135 57,48 42,21 DP 0,085 0,384 0,221 2,039 23,38 12,31 Q1 0,221 0,533 0,867 0,692 46,18 32,43 Q3 0,352 0,942 1,149 2,622 71,50 52,43 DJ 0,130 0,408 0,282 1,930 25,31 20,00

2/3DJ 0,196 0,612 0,423 2,896 37,96 30,00 Q1-3/2DJ 0,025 -0,078 0,443 -2,203 8,21 2,43 Q3+3/2DJ 0,548 1,554 1,573 5,519 109,46 82,43


135



1 0,625 ND 2,015* 3,009 96,68* 17,18 2 0,633 0,853 0,420 2,823 75,06 ND 3 0,510 0,850 1,035 3,552 70,81 17,00 4 0,721 1,001 0,799 2,622 69,75 21,31 5 0,655 1,093 0,670 4,525 74,31 13,25 6 0,577 1,059 1,056 3,852 30,37* 11,56 7 0,553 1,057 1,278 4,339 64,56 16,00 8 0,608 0,970 0,556 3,709 64,68 12,00 9 0,480 0,717 0,892 2,058 54,50 4,06 10 0,518 0,880 0,727 3,738 71,43 8,25

Média 0,588 0,942 0,826 3,423 68,14 13,40 DP 0,074 0,124 0,268 0,779 6,73 5,19 Q1 0,526 0,853 0,670 2,869 64,65 11,56 Q3 0,631 1,057 1,035 3,824 72,15 17,00 DJ 0,104 0,203 0,364 0,954 7,50 5,43

2/3DJ 0,157 0,305 0,547 1,431 11,25 8,15 Q1-3/2DJ 0,369 0,548 0,123 1,437 53,40 3,40 Q3+3/2DJ 0,788 1,362 1,582 5,256 83,40 25,15


136



1 0,518 1,057 1,049 3,638 68,25 7,00 2 0,565 1.197 1,049 4,425 74,31 10,93 3 0,618 1,459 1,629 4,274 75,18 7,18 4 0,605 1,096 0,663 4,153 61,81 10,12 5 0,588 1,265 1,121 3,738 63,06 14,87 6 0,623 1,456 1,064 3,481 79,37 13,87 7 0,442* 1,032 0,885 5,247 66,87 6,37 8 0,546 1,007 1,764* 4,639 73,18 13,37 9 0,554 1,051 0,642 4,739 74,18 23,00 10 0,590 1,330 0,306 4,625 77,75 7,00

Média 0,578 1,195 0,934 4,296 71,40 11,37 DP 0,035 0,174 0,373 0,555 6,05 5,16 Q1 0,554 1,052 0,663 3,842 67,21 7,04 Q3 0,605 1,313 1,064 4,636 74,96 13,75 DJ 0,051 0,261 0,400 0,793 7,75 6,70

2/3DJ 0,076 0,391 0,600 1,190 11,62 10,05 Q1-3/2DJ 0,477 0,661 0,062 2,651 55,59 -3,00 Q3+3/2DJ 0,682 1,705 1,664 5,826 86,59 23,80


137



1 0,629 1,092 2,444 4,160 100,12* 5,25 2 0,978 ND 2,301 3,674 76,87 6,75 3 0,534 0,985* 2,000 4,532 98,06* 19,37 4 0,623 1,117 1,385 4,589 79,50 7,12 5 0,712 ND 1,300 5,554 74,18 6,75 6 0,673 1,125 1,979 4,432 68,93 8,43 7 0,667 1,101 1,478 4,632 65,87 14,43 8 1,024* 1,135 2,108 4,217 66,00 20,06 9 0,804 1,359* 1,986 5,240 62,75 10,18 10 0,727 1,169 1,593 5,118 78,25 7,37

Média 0,705 1,123 1,857 4,615 71,54 10,57 DP 0,127 0,027 0,394 0,559 6,44 5,44 Q1 0,629 1,105 1,507 4,271 65,96 6,84 Q3 0,727 1,132 2,081 4,997 77,21 13,37 DJ 0,098 0,027 0,573 0,725 11,25 6,53

2/3DJ 0,147 0,040 0,860 1,088 16,87 9,79 Q1-3/2DJ 0,482 1,064 0,646 3,182 49,09 -2,95 Q3+3/2DJ 0,874 1,173 2,942 6,085 94,09 23,17


138



1 0,449 0,922 0,942 4,553 24,5* 29,68 2 0,386 1,366 1,793 5,111 51,31 27,93 3 0,420 0,544 0,992 2,301 61,12 16,81 4 0,541 0,852 1,521 3,288 71,06 29,06 5 0,445 0,603 1,042 2,494 63,56 32,43*

Média 0,417 0,857 1,258 3,549 61,76 25,87 DP 0,029 0,326 0,378 1,243 8,15 6,08 Q1 0,403 0,603 0,992 2,494 58,67 25,15 Q3 0,433 0,922 1,521 4,553 65,43 29,21 DJ 0,029 0,319 0,529 2,059 6,76 4,06

2/3DJ 0,044 0,478 0,793 3,089 10,14 6,09 Q1-3/2DJ 0,359 0,124 0,198 -0,594 48,52 19,06 Q3+3/2DJ 0,477 1,400 2,315 7,643 75,58 35,31


139



1 0,476 1,118* 0,677 6,520 29,68 17,12 2 0,440 0,897 0,971 3,516 14,00 33,43 3 † † † † † † 4 0,380 0,942 0,613 1,822 82,12 ND 5 † † † † † † 6 0,615 0,952 1,307 5,504 39,62 42,56 7 0,607 0,951 1,135 3,616 53,06 30,43 8 0,380 0,812* 0,763 2,458 49,43 9,18

9 † † † † † † 10 † † † † † †

Média 0,529 0,936 0,911 3,906 44,65 26,55 DP 0,111 0,026 0,274 1,792 23,18 13,31 Q1 0,449 0,931 0,699 2,723 32,17 17,12 Q3 0,613 0,951 1,094 5,032 52,15 33,43 DJ 0,163 0,019 0,395 2,309 19,98 16,31

2/3DJ 0,245 0,029 0,592 3,464 29,97 24,46 Q1-3/2DJ 0,204 0,901 0,106 -0,741 2,19 -7,34 Q3+3/2DJ 0,859 0,981 1,687 8,497 82,13 57,90


140



1 0,556 0,979 0,870 4,096 52,00 3,56 2 0,561 0,289* ND ND 40,93 ND 3 0,436 0,966 3,202 4,553 55,56 ND 4 0,686 1,083 2,816 4,732 67,50 39,81* 5 † † † † † † 6 0,751 0,918 2,444 3,953 63,68 6,12 7 0,696 0,961 1,714 3,288 36,50 7,37 8 † † † † † † 9 0,448 0,746 1,207 2,086 44,25 12,25

10 0,451 0,560 1,721 2,444 78,93 10,81 Média 0,573 0,887 1,996 3,593 54,92 8,02

DP 0,125 0,175 0,853 1,023 14,48 3,52 Q1 0,450 0,832 1,460 2,866 43,42 6,12 Q3 0,688 0,972 2,630 4,324 64,64 10,81 DJ 0,238 0,140 1,169 1,458 21,21 4,68

2/3DJ 0,357 0,210 1,753 2,188 31,82 7,03 Q1-3/2DJ 0,092 0,621 -0,292 0,677 11,59 -0,90 Q3+3/2DJ 1,046 1,183 4,383 6,513 96,46 17,84


141



1 0,621 0,922 1,600 3,867 36,31 9,43 2 0,445 0,655 1,164 2,715 37,75 41,81 3 0,440 0,915 1,907 5,140 61,43 37,31 4 0,630 0,931 2,701 3,087 75,93 8,68 5 † † † † † † 6 0,534 0,776 2,479 3,702 66,68 5,87 7 0,630 0,713 1,085 4,289 69,37 52,06 8 0,636 0,878 3,109 2,344 78,12 7,87 9 0,687 0,925 1,721 4,811 31,68 30,31 10 0,626 0,888 2,544 4,997

83,75 37,50

Média 0,584 0,845 2,035 3,883 60,11 25,65 DP 0,089 0,103 0,708 1,015 19,80 17,72 Q1 0,534 0,776 1,600 3,087 37,75 8,68 Q3 0,636 0,922 2,544 4,811 75,93 37,50 DJ 0,102 0,146 0,943 1,723 38,18 28,81

2/3DJ 0,154 0,219 1,415 2,585 57,28 43,21 Q1-3/2DJ 0,379 0,557 0,184 0,502 -19,53 -34,53 Q3+3/2DJ 0,791 1,142 3,960 7,396 133,21 80,71

DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável †= Animal falecido antes do dia da coleta

142



1 0,407 0,677 2,501 2,522 64,56 42,75 2 0,375 0,607 1,407 2,801 29,12 16,31 3 0,323 0,631 1,922 2,222 32,25 14,87 4 0,476 0,767 2,472 4,467* 58,06 20,06 5 0,459 0,444* 2,122 2,401 60,25 32,50

Média 0,408 0,671 2,085 2,487 48,85 25,30 DP 0,062 0,070 0,450 0,243 16,78 11,97 Q1 0,375 0,625 1,922 2,356 32,25 16,31 Q3 0,459 0,700 2,472 2,592 60,25 32,50 DJ 0,084 0,074 0,550 0,235 28 16,18

2/3DJ 0,126 0,111 0,825 0,353 42 24,28 Q1-3/2DJ 0,248 0,514 1,096 2,002 -9,75 -7,96 Q3+3/2DJ 0,585 0,811 3,298 2,946 102,25 56,78


143



1 † † † † † † 2 † † † † † † 3 † † † † † † 4 † † † † † † 5 † † † † † † 6 0,724 1,064 2,222 2,766 89,50 20,12 7 † † † † † † 8 0,479 0,361 2,265 1,357 57,68 29,31 9 † † † † † † 10 0,460 0,671 1,071 2,944 52,56 29,81

Média 0,554 0,698 1,853 2,356 66,58 26,41 DP 0,147 0,352 0,677 0,869 20,01 5,45 Q1 0,470 0,516 1,646 2,061 55,12 24,71 Q3 0,602 0,867 2,243 2,855 73,59 29,56 DJ 0,131 0,351 0,597 0,793 18,46 4,84

2/3DJ 0,197 0,527 0,895 1,190 27,70 7,26 Q1-3/2DJ 0,272 -0,011 0,751 0,870 27,42 17,45 Q3+3/2DJ 0,800 1,394 3,139 4,046 101,29 36,82


144



1 † † † † † † 2 † † † † † † 3 0,765 0,765 0,842 3,180 71,06 30,62 4 0,546 0,977 2,208 4,875 67,31 24,12 5 0,703 0,843 2,008 4,346 61,12 29,75 6 † † † † † † 7 † † † † † † 8 † † † † † † 9 † † † † † † 10 † † † † † †

Média 0,671 0,862 1,686 4,134 66,50 28,16 DP 0,112 0,107 0,737 0,867 5,01 3,52 Q1 0,625 0,804 1,425 3,763 64,21 26,93 Q3 0,734 0,910 2,108 4,610 69,18 30,18 DJ 0,109 0,106 0,682 0,847 4,96 3,25

2/3DJ 0,164 0,159 1,024 1,271 7,45 4,87 Q1-3/2DJ 0,460 0,645 0,400 2,492 56,76 22,06 Q3+3/2DJ 0,898 1,070 3,132 5,882 76,64 35,06


145



1 0,349* 0,519 0,756 1,471 37,12* 51,75 2 0,532 0,557 2,158 3,066 73,18 44,12 3 0,570 0,850 2,229 1,214 78,81 37,25 4 0,440 0,807 2,429 4,239 89,43 48,62 5 0,513 0,688 1,478 ND 75,12 38,06 6 0,639 1,072 1,993 4,861 83,12 7,31 7 0,457 1,120 2,308 4,496 58,62* 7,68 8 0,497 1,003 2,179 3,609 74,12 7,31 9 0,547 1,114 1,936 4,897 74,50 7,31 10 0,541 1,064 0,928 2,465 101,81* 6,18

Média 0,526 0,879 1,839 3,369 78,33 25,56 DP 0,059 0,230 0,587 1,405 5,99 19,85 Q1 0,497 0,718 1,593 2,465 74,31 7,31 Q3 0,547 1,070 2,217 4,496 80,96 42,60 DJ 0,049 0,352 0,623 2,030 6,65 35,29

2/3DJ 0,074 0,528 0,935 3,046 9,98 52,94 Q1-3/2DJ 0,423 0,189 0,657 -0,580 64,32 -45,63 Q3+3/2DJ 0,622 1,599 3,153 7,542 90,95 95,55


146



1 0,149 0,705 1,264 4,196 19,68 27,87* 2 0,321 0,734 1,764 5,590 29,18 14,12 3 0,411 1,110* 2,036 5,826 85,81* 11,81 4 0,537 ND 1,292 ND 40,62 ND 5 0,460 0,592 1,600 3,581 17,18 12,50

Média 0,376 0,677 1,591 4,798 26,67 12,81 DP 0,148 0,075 0,325 1,084 10,64 1,18 Q1 0,321 0,648 1,292 4,042 19,06 12,15 Q3 0,460 0,719 1,764 5,649 32,04 13,31 DJ 0,139 0,070 0,471 1,607 12,98 1,15

2/3DJ 0,209 0,106 0,707 2,410 19,47 1,73 Q1-3/2DJ 0,112 0,542 0,584 1,631 -0,41 10,42 Q3+3/2DJ 0,669 0,826 2,472 8,060 51,52 15,04


147



1 † † † † † † 2 † † † † † † 3 † † † † † † 4 † † † † † † 5 † † † † † † 6 0,813 1,285 1,586 5,983 30,25 14,12 7 † † † ND † † 8 0,568 1,291 1,757 6,484 29,81 10,68 9 † † † † † † 10 † † † † † †

Média 0,699 1,288 1,671 6,234 30,03 12,40 DP 0,161 0,004 0,121 0,353 0,30 2,43 Q1 0,642 1,286 1,629 6,109 29,92 11,54 Q3 0,756 1,289 1,714 6,359 30,14 13,26 DJ 0,114 0,003 0,085 0,250 0,21 1,71

2/3DJ 0,171 0,004 0,128 0,375 0,32 2,57 Q1-3/2DJ 0,471 1,282 1,500 5,733 29,59 8,96 Q3+3/2DJ 0,927 1,294 1,843 6,734 30,46 15,84

DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada †= Animal falecido antes do dia da coleta

148


DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada †= Animal falecido antes do dia da coleta


1 0,568 1,071 ND 5,612

34,93

6,37 2 † † † † † †

3 † † † † † † 4 † † † † † † 5 † † † † † † 6 0,085 ND 3,431 ND 19,00 ND 7 † † 3,266 † † † 8 † † † † † † 9 0,801 1,261 ND 5,118 33,56

9,06

10 0,911 1,266 2,136 1,693 ND 9,43 Média 0,760 1,199 2,944 4,141 29,16 8,29

DP 0,174 0,111 0,704 2,134 8,83 1,67 Q1 0,685 1,166 2,701 3,406 26,28 7,71 Q3 0,856 1,264 3,348 5,365 34,25 9,25 DJ 0,171 0,097 0,647 1,959 7,96 1,53

2/3DJ 0,257 0,146 0,970 2,939 11,95 2,29 Q1-3/2DJ 0,428 1,019 1,730 0,466 14,32 5,42 Q3+3/2DJ 1,113 1,411 4,319 8,304 46,20 11,54

149



1 0,482 0,847 1,621 5,161 77,50 43,68* 2 0,620 1,290* 1,764 6,620 72,75 26,00 3 0,761 0,894 1,807 3,688 64,62 20,62 4 0,750 0,850 2,065 3,903 64,31 37,06 5 0,838 0,900 2,780 4,131 73,43 9,37 6 0,968 0,906 3,595* 4,053 79,75 16,81 7 0,885 1,014 1,879 3,695 82,31 19,81 8 0,960 0,841 2,501 5,040 ND 18,18 9 0,848 0,929 2,379 5,840 72,75 12,06 10 0,574 1,032 1,257 4,303 47,56 15,43

Média 0,768 0,913 2,165 4,643 70,55 19,48 DP 0,164 0,069 0,673 0,991 10,55 8,18 Q1 0,652 0,850 1,775 3,940 64,62 15,43 Q3 0,876 0,929 2,471 5,131 77,50 20,62 DJ 0,223 0,078 0,695 1,190 12,87 5,18

2/3DJ 0,335 0,118 1,043 1,785 19,31 7,78 Q1-3/2DJ 0,317 0,731 0,732 2,154 45,31 7,65 Q3+3/2DJ 1,211 1,047 3,514

6,917 96,81 28,40


150



1 0,571 0,571 1,528 3,974 36,37 20,75 2 0,624 0,624 1,149 4,811 33,50 40,43 3 0,474 0,474 1,135 2,708 41,25 28,68 4 0,622* 0,622 1,893 4,303 46,06 16,75 5 0,525 0,525 1,457 2,751 76,18* 15,56

Média 0,498 0,563 1,433 3,709 39,29 24,43 DP 0,025 0,064 0,312 0,942 5,52 10,31 Q1 0,484 0,526 1,149 2,751 35,65 16,75 Q3 0,515 0,622 1,528 4,303 42,45 28,68 DJ 0,031 0,096 0,379 1,551 6,79 11,93

2/3DJ 0,046 0,144 0,568 2,327 10,19 17,90 Q1-3/2DJ 0,437 0,381 0,581 0,424 25,46 -1,15 Q3+3/2DJ 0,562 0,766 2,097 6,631 52,64 46,59


151

APÊNDICE 21- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo A nos dias de análise.

PARASITEMIA (%) Animal 24h 5 dias 10 dias 15 dias 20 dias

1 0,143 0,657 † 15,5 7,76 2 0,172 ND 1,78 15 † 3 0 ND 1,837 13 † 4 0,146 1,778 † † † 5 0 1,86 2,117 7,6 † 6 0 ND 2,089 † 40,408 7 0 1,217 2,49 † † 8 0,178 0,781 † † 69,212 9 0 ND 3,833* 6,7 †

10 0 1,48 1,543 † † 11 ND 2,09 1,66 † † 12 0 0,594 † † † 13 0,182 ND 1,821 † † 14 0 0,985 ND † † 15 0,19 1,237 2,791 16,13 66,451

Média 0,072214286 1,2679 2,1961 12,32166667 45,95775 DP 0,087376 0,524892 0,690747 4,150568 28,58089 Q1 0 0,832 1,79025 8,95 32,246 Q3 0,1655 1,7035 2,39675 15,375 67,14125 DJ 0,1655 0,8715 0,6065 6,425 34,89525

2/3DJ 0,24825 1,30725 0,90975 9,6375 52,34288 Q1-3/2DJ -0,24825 -0,47525 0,8805 -0,6875 -20,0969 Q3+3/2DJ 0,41375 3,01075 3,3065 25,0125 119,4841

DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada *= pontos excluidos †= Animal falecido antes do dia da coleta

152

APÊNDICE 22- Valores da parasitemia dos camundongos do grupo B nos dias de análise.

PARASITEMIA (%) Animal 24h 5 dias 10 dias 15 dias 20 dias

1 0 0,094 2,66 † 25,232 2 0,541 0,371 2,91 † † 3 0,264 0,627 4,34* 0,99 † 4 0,137 ND 3,12 2,4 † 5 0 8,309* ND 1,64 † 6 0,098 ND 2,34 † † 7 0 6,903* ND † 0,13 8 0 2,3 ND † 23,32 9 0 2,787 3,93 † †

10 0,152 1,255 2,56 † † 11 0 2,414 ND † † 12 0,181 1,151 ND † † 13 0 ND 1,29 2,74 † 14 0 ND 2,05 † † 15 0,488* 1,45 ND ND 24,266

Média 0,124066667 2,514636364 2,8 1,9425 18,236375 DP 0,180054 2,675074 0,928332 0,784023 12,09779 Q1 0 0,889 2,34 1,4775 17,52188 Q3 0,1665 2,6005 3,12 2,485 24,5075 DJ 0,1665 1,7115 0,78 1,0075 6,985625

2/3DJ 0,24975 2,56725 1,17 1,51125 10,47844 Q1-3/2DJ -0,24975 -1,67825 1,17 -0,03375 7,043438 Q3+3/2DJ 0,41625 5,16775 4,29 3,99625 34,98594

DP= Desvio Padrão Q1= primeiro quartil Q3= terceiro quartil DJ= Q3-Q1 Q1-3/2DJ= mínimo valor aceitável Q3+3/2DJ= máximo valor aceitável ND= amostra não determinada *= pontos excluidos †= Animal falecido antes do dia da coleta

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