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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE – UERN PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO - PROPEG

PROGRAMA MULTICÊNTRICO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR - PMBqBM

MARIA LÚCIA LIRA DE ANDRADE

EFEITO DO EXTRATO SALINO DE Dysphania ambrosioides (L.) Mosyakin &

Clemants SOBRE A INFECÇÃO IN VITRO POR Leishmania spp.

MOSSORÓ-RN

2018

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Maria Lúcia Lira de Andrade

EFEITO DO EXTRATO SALINO DE Dysphania ambrosioides (L.) Mosyakin

& Clemants SOBRE A INFECÇÃO IN VITRO POR Leishmania spp.

Tese apresentada a Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte como pré-requisito para a obtenção do título de Doutora em Bioquímica e Biologia Molecular. Orientadora: Dra Paula Vivianne Souza de

Queiróz Moreira

Co-Orientadora: Dra Leda Quercia Vieira

MOSSORÓ –RN

2018

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Maria Lúcia Lira de Andrade

EFEITO DO EXTRATO SALINO DE Dysphania ambrosioides (L.) Mosyakin

& Clemants SOBRE A INFECÇÃO IN VITRO POR Leishmania spp.

Tese apresentada a Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte como pré-requisito para a obtenção do título de Doutora em Bioquímica e Biologia Molecular. Orientadora: Dra Paula Vivianne Souza de

Queiróz Moreira

Co-Orientadora: Dra Leda Quercia Vieira

Aprovada em ____/___/___

BANCA EXAMINADORA

Profa Dra Paula Vivianne Souza de Queiróz Moreira (Orientadora) Universidade do Estado do Rio Grande do Norte – UERN

Profa Dra Michele Dalvina Correia da Silva Universidade Federal Rural do Semi-Árido – UFERSA

Prof. Dr. Micássio Fernandes de Andrade Universidade do Estado do Rio Grande do Norte – UERN

Profa Dra Dayseanne Araújo Falcão Universidade do Estado do Rio Grande do Norte – UERN

Profa Dra Grazielle Ribeiro Goes Universidade do Estado de Minas Gerais – UEMG

5

A quem me ensinou a estudar: Luzia Ferreira de Andrade

A quem me deu instrumentos: Benedito Ferreira de Andrade

A quem sempre esteve ao meu lado desde a primeira mitose: Maria

Luciana Lira de Andrade

A quem me deu uma nova vida: Guilherme Andrade Aires

Dedico.

6

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora Profa Dr

a Paula Vivianne, pela orientação e

confiança! Obrigada pela oportunidade!

À minha co-orientadora, Profa Dr

a Leda Vieira, por ter me recebido no

seu laboratório em todos os períodos que precisei realizar experimentos.

Pela orientação, pelos ensinamentos, pela disposição dos seus alunos para

me auxiliar. Serei sempre grata por Deus ter colocado a senhora no meu

caminho durante esse doutorado.

À Profa Dr

a Michele Dalvina, que desde a seleção pra eu entrar no

programa me ajudou com suas correções. Também abriu as portas do seu

laboratório para a realização de experimentos. E posso assim dizer, me

tornei sua admiradora e amiga.

À Profa Dr

a Graziele Goes, por ter contribuído grandemente com a

execução desse trabalho, ter me ensinado pacientemente cada

experimento no LAGI realizado. Um laço de carinho e respeito foi criado.

À equipe do LABCEMOL- UFERSA, por ter me ajudado quando

precisei. Principalmente ao Paulo e Carlos, por terem me assessorado no

inicio e no fim da tese, respectivamente.

À equipe do LAGI- UFMG, pelo carinho da acolhida de uma estranha

no laboratório. Por terem tornado o período longe da família e amigos, leve.

Todos estão guardados no meu coração.

À banca de qualificação: professores: Dayseanne Araújo e Micássio

Andrade pelas valiosas sugestões e contribuições para a tese.

À UERN, pela disponibilidade de bolsa para auxiliar no

desenvolvimento da tese.

7

Aos meus colegas de trabalho do curso de Educação Física, pela

compreensão por terem me liberado para realizar esse sonho profissional.

Ao meu cunhado Joao Paulo, pelas ideias, pelas correções e ajuda

durante a escrita da tese.

As minhas irmãs, Yara e Laine por terem cuidado do meu filho para

eu me dedicar aos estudos. A tranquilidade de saber que ele estava em

boas mãos tornou a minha ausência menos dolorosa.

Alan, Gino Júnior e Laila, obrigada por ser a companhia de Gui

quando estive ausente!

A meus irmãos, Yon, Yoná e Benedito Júnior, pelo amor e apoio.

As crianças que deixaram esse caminho mais colorido e alegre:

Luana, Heitor, Alice, Maitê, Yonzinho e Veiga.

E finalmente, agradeço ao meu marido, Marcio André, pelo apoio,

carinho, paciência, amor e incentivo nessa jornada. Por compreender a

minha ausência, e ocupar meu espaço com nosso filho enquanto estive

ausente estudando, por segurar as pontas enquanto estive fora. Uma das

lutas que juntos já conseguimos vencer! Essa conquista é nossa! Te amo!

A Deus, toda honra e toda glória na minha vida vem de Ti, meu Pai!

Obrigada por me amar e cuidar tão bem de mim!

8

“Boa sorte, firme e forte, vai com a força da mente. Vai sabendo que não há nenhum peso que você não aguente.

Vai na marra, vai na garra, vai em frente. E se agarra no seu sonho com unhas e dentes.”

Gabriel O Pensador e Itaal Shur

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RESUMO

O Brasil está entre os países com maior incidência de casos de leishmaniose no mundo. No Rio Grande do Norte, o índice de óbito é maior que a média nacional, indicando ser uma parasitose de caráter relevante nessa região. Diante desse contexto, tem sido estimulado o desenvolvimento de novas drogas que possam substituir ou complementar as terapias existentes atualmente. Nessa perspectiva, a avaliação experimental de preparações de plantas medicinais representa uma fonte potencial para a descoberta de novas drogas anti-leishmania. Visando selecionar planta(s) medicinal(is) com ação leishmanicida e, em seguida, compreender seu mecanismo de ação, a princípio foi realizado um estudo de bioprospecção in vitro com extratos salinos de plantas com atividade microbicida já relatada: Tabebuia aurea, Cassia fistula, Phyllantus niruri, Combretum leprosum e Dysphania ambrosioides. Foram avaliados o efeito citotóxico dos extratos salinos das plantas sobre promastigotas de Leishmania infantum e macrófagos peritoneais murinos, bem como o efeito estimulatório dos extratos sobre a produção de ROS pelos macrófagos. Nenhum extrato apresentou toxicidade em promastigotas. Contudo, os extratos de P. niruri e C. leprosum foram tóxicos para os macrófagos. O extrato salino de D. ambrosioides foi o único que estimulou a atividade de macrófagos, induzindo a produção de ROS sem apresentar toxicidade para estas células. Por isso, foi selecionado para a investigação quanto ao seu potencial leishmanicida. Com base nos resultados preliminares obtidos com o extrato de D. ambrosioides, sua ação tóxica sobre promastigotas de Leishmania major, bem como seu efeito na infecção in vitro por L. infantum, L. major e Trypanosoma cruzi também foram avaliadas. Para compreender seu mecanismo de ação, foi verificado seu efeito sobre a produção de NO, citocinas, e na infecção em macrófagos de camundongos Nox2 nocaute. O extrato foi tóxico para a forma promastigota de L. major. Ele também mostrou propriedades ativas significativas contra amastigotas intracelulares de L. infantum e L. major após infecção de macrófagos murinos in vitro. O extrato também foi eficaz contra a infecção de macrófagos por T. cruzi. O extrato se mostrou um potente indutor de ROS, contudo esse não parece ser seu mecanismo de ação. Adicionalmente, o extrato apresentou efeito imunomodulatório em macrófagos, estimulando a liberação das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e IL-6 e, em contrapartida, inibindo a produção do TNF-α. Um possível mecanismo de ação do extrato salino de D. ambrosioides é o efeito indutor de NO, observado nesse estudo. Esse trabalho indica o extrato salino de D. ambrosioides como uma promissora fonte de componentes anti-leishmaniais.

Palavras-chaves: Leishmaniose, extrato salino; macrófago; óxido nítrico e espécies reativas de oxigênio.

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ABSTRACT

Brazil is among the countries with the highest incidence of cases of leishmaniasis in the world. In Rio Grande do Norte, the death rate is higher than the national average, indicating a relevant parasitic disease in this region. In this way, the development of new drugs that can replace or complement existing therapies has been stimulated. In this perspective, the experimental evaluation of herbal preparations represents a potential source of discovery of new anti-leishmania drugs. The present study aimed to select medicinal plant (s) with leishmanicidal action and to understand its mechanism of action, an in vitro bioprospecting study with saline extracts of plants with previously reported microbicidal activity was carried out: Tabebuia aurea, Cassia fistula, Phyllantus niruri, Combretum leprosum and Dysphania ambrosioides. The cytotoxic effects of saline extracts from plants on the cell viability of Leishmania infantum promastigotes and murine peritoneal macrophages was evalued, as well as the stimulatory effect of extracts on ROS production by the macrophages. No extract showed toxicity in promastigotes. However, extracts of P. niruri and C. leprosum were toxic to macrophages. The extract of D. ambrosioides was the only one that stimulated the activity of macrophages, inducing the production of ROS without presenting toxicity to these cells. Therefore, he was selected for research on his leishmanicidal potential. Based on the preliminary results obtained with the extract of D. ambrosioides, its toxic action on Leishmania major promastigotes as well as its effect on in vitro infection by L. infantum, L. major and Trypanosoma cruzi were also evaluated. To understand its mechanism of action, its effect on the production of NO, cytokines, and on macrophage infection of Nox2 knockout mice was verified. Saline extract was toxic to L. major promastigotes. It also showed significant active properties against intracellular amastigotes of L. infantum and L. major after infection of murine macrophages in vitro. D. ambrosioides saline extract was also effective against macrophages infected by T. cruzi. Saline extract has been shown to be a potent inducer of ROS, but this is not seem to be its mechanism of action. It was also observed that saline extract has an immunomodulatory effect on macrophages, stimulating the production of proinflammatory cytokines such as IL-1β and IL-6, and, on the other hand, inhibiting TNF-α. A possible mechanism of action of the D. ambrosioides saline extract is the inducing effect of NO, observed in this study. This work indicates the saline extract of D. ambrosioides as a promising source of anti-leishmanial components. Keywords: Leishmaniasis, saline extract; macrophage; nitric oxide; reactive oxygen species.

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LISTA DE FIGURAS.

Figura 1. Ciclo biológico do Leishmania spp..........................................17 Figura 2. Delineamento experimental.......................................................36 Figura 3. Viabilidade dos promastigotas de Leishmania infantum tratados com extratos salinos de plantas medicinais............................50 Figura 4. Viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos tratados com extratos salinos de plantas medicinais...........................................54 Figura 5. Produção de ROS por macrófagos estimulados com extratos salinos de plantas medicinais..................................................................57 Figura 6. Viabilidade dos promastigotas de Leishmania major tratados com extrato salino de Dysphania ambrosioides....................................60 Figura 7. Efeito leishmanicida in vitro do extrato salino de Dysphania ambrosioides em Leishmania spp...........................................................63 Figura 8. Produção de ROS por macrófagos tratados com extrato salino de Dysphania ambrosioides e infectados por Leishmania infantum.....................................................................................................66 Figura 9. Efeito leishmanicida in vitro do extrato salino de Dysphania ambrosioides em macrófagos de camundongos Nox2 nocaute infectados por Leishmania major............................................................68 Figura 10. Produção de NO2- por macrófagos infectados por parasitos do gênero Leishmania..............................................................................72 Figura 11. Produção de IL-1β por macrófagos infectados por Leishmania major e tratados com extrato salino de Dysphania ambrosioides..............................................................................................74 Figura 12. Produção de IL-6 por macrófagos infectados por Leishmania major e tratados com extrato salino de Dysphania ambrosioides..............................................................................................78 Figura 13. Produção de TNF-α por macrófagos infectados por Leishmania major e tratados com extrato salino de Dysphania ambrosioides..............................................................................................80 Figura 14. Produção de IL-10 por macrófagos infectados por Leishmania major e tratados com extrato salino de Dysphania ambrosioides..............................................................................................85 Figura 15. Índice de infecção in vitro de macrófagos por Trypanosoma cruzi.............................................................................................................87

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Sumário 1.0. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 15

1.1. Leishmaniose .................................................................................... 15

1.2. Interação parasito-hospedeiro ......................................................... 18

1.2.1. ROS e NO ........................................................................................ 22

1.3. Perfil epidemiológico ........................................................................ 23

1.4. Tratamento ......................................................................................... 24

1.5. Vias alternativas de combate à Leishmania ................................... 26

1.5.1. Plantas medicinais ......................................................................... 28

2.0. OBJETIVOS ........................................................................................... 33

3.0. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ...................................................... 36

4.0. METODOLOGIA .................................................................................... 38

4.1. Bioprospecção de plantas medicinais com efeito leishmanicida . 38

4.2. Obtenção dos extratos salinos ........................................................ 38

4.3. Obtenção e cultura de macrófagos ................................................. 39

4.4. Cultura de parasitos .......................................................................... 40

4.5. Infecção por Leishmania infantum e Leishmania major ................ 41

4.6. Infecção por Trypanosoma cruzi ..................................................... 41

4.7. Citotoxicidade dos extratos salinos de plantas medicinais em

macrófagos, promastigotas de Leishmania infantum e Leishmania major ..

...........................................................................................................................42

4.8. Atividade anti-protozoária do Dysphania ambrosioides ............... 43

4.9. Detecção de ROS em macrófagos murinos em resposta aos

extratos salinos de plantas medicinais. ....................................................... 44

4.10. Detecção de nitrito (NO2-) em macrófagos murinos tratados com

extrato salino de Dysphania ambrosioides .................................................. 45

4.11. Dosagem de citocinas ...................................................................... 46

4.12. Análise estatística ............................................................................. 47

5.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................. 49

Parte I - Bioprospecção de plantas medicinais com efeito leishmanicida 49

5.1. Viabilidade celular de promastigotas de Leishmania infantum

tratados com extratos salinos de plantas medicinais. ............................... 49

5.2. Viabilidade celular de macrófagos tratados com extratos salinos

de plantas medicinais. ................................................................................... 53

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5.3. Detecção de ROS em macrófagos tratados com extratos salinos

de plantas medicinais. ................................................................................... 57

Parte II – Avaliação da ação in vitro do extrato salino de Dysphania

ambrosioides na infecção murina por leishmaniose. ................................. 59

5.4. Viabilidade celular das promastigotas de Leishmania major

tratados com extrato salino de Dysphania ambrosioides .......................... 59

5.5. Efeito leishmanicida in vitro do extrato salino de Dysphania

ambrosioides em formas amastigotas de Leishmania spp. ....................... 61

5.6. Detecção de ROS em macrófagos tratados com extrato salino de

Dysphania ambrosioides ............................................................................... 65

5.7. Efeito leishmanicida in vitro do extrato salino de Dysphania

ambrosioides em macrófagos Nox2 nocautes infectados por Leishmania

major.......... ...................................................................................................... 68

5.8. Detecção de nitrito (NO2-) em macrófagos peritoneais murinos

infectados por Leishmania infantum ou Leishmania major e tratados com

extrato salino de Dysphania ambrosioides .................................................. 69

5.9. Efeito do extrato salino de Dysphania ambrosioides na produção

de citocinas em macrófagos murinos. ......................................................... 73

5.9.1. Produção da Interleucina 1β (IL-1β) ............................................. 73

5.9.2. Produção da Interleucina 6 (IL-6) ................................................. 76

5.9.3. Produção de Fator de necrose tumoral (TNF-α) .......................... 79

5.9.4. Produção de Interleucina 10 (IL-10) ............................................. 82

5.10. Índice de infecção in vitro de macrófagos peritoneais murinos

por Trypanosoma cruzi tratados com extrato salino de Dysphania

ambrosioides .................................................................................................. 85

6.0. CONCLUSÃO ........................................................................................ 90

7.0. PERSPECTIVAS .................................................................................... 93

8.0. REFERÊNCIAS ...................................................................................... 95

14

INTRODUÇÃO

15

1.0. INTRODUÇÃO

1.1. Leishmaniose

A leishmaniose é uma doença infecciosa e parasitária considerada no

âmbito mundial como uma doença endêmica de alta prioridade. Estima-se que

no mundo cerca de 700.000 a 1 milhão de novos casos e 20.000 a 30.000

mortes ocorram anualmente (WHO, 2018). Essa parasitose é causada por

protozoários do gênero Leishmania, que possui cerca de 20 espécies

conhecidas patogênicas para o homem (WHO, 2017), as quais infectam o

hospedeiro vertebrado por meio da picada por vetores fêmeas dos gêneros

Lutzomyia, no Novo Mundo, e Phlebotomus, no Velho Mundo (WHO, 2018).

Possui três formas de apresentação clínica: visceral, cutânea e mucocutânea

(WHO, 2017), sendo que o Brasil é um dos paises citados pela Organização

Mundial de Saúde como o de maior ocorrência de casos para as três formas de

leishmaniose (WHO, 2018).

A leishmaniose cutânea (LC) é causada por variadas espécies de

Leishmania: Leishmania major, Leishmania mexicana, Leishmania

amazonensis, Leishmania braziliensis e Leishmania guyanensis (Loeuillet,

Bañuls e Hide, 2016; Scott e Novais, 2016); é caracterizada por lesões

cutâneas e úlceras em partes expostas do corpo (WHO, 2017). A leishmaniose

mucocutânea, se espalha nas mucosas do nariz, boca e garganta, levando a

desfiguração facial extensa (Steverding, 2017). A leishmaniose visceral (LV),

causada pelo complexo Leishmania donovani: L. donovani, no Velho Mundo e

Leishmania infantum (syn Leishmania chagasi), no Novo Mundo (Assche et al.,

2011); é a forma mais grave de leishmaniose, e indivíduos acometidos pela

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doença podem apresentar: hepatoesplenomegalia, febre alta, pancitopenia,

emagrecimento, edema e estado de debilidade progressivo, levando à

caquexia (Jamieson et al., 2007). Em indivíduos não tratados, torna-se fatal em

mais de 95% dos casos (WHO, 2017). Estima-se que entre 50.000 a 90.000

novos casos de LV ocorrem a nível mundial a cada ano (WHO, 2017).

O protozoário Leishmania spp. possui em seu ciclo de vida duas formas

possíveis (Figura 1), as quais consistem em parasitos na forma promastigota,

encontrada em vetores, e na forma amastigota, presente nos mamíferos

(Murray et al., 2005). A forma promastigota é transmitida pela picada por

flebotomíneos. Dentro do hospedeiro vertebrado, macrófagos e outros

fagócitos fagocitam-na, ocorrendo a fusão com o lisossomo, resultando no

fagolisossomo. Neste, as promastigotas transformam-se em amastigotas. Essa

forma inicia o processo de reprodução no interior do fagolisossomo até

promover o rompimento do macrófago e a liberação dos parasitos no

interstício, sequenciando na infecção de outros macrófagos (Tewary et al.,

2004). A forma amastigota se desenvolve para promastigota no intestino do

vetor, após a ingestão de sangue de um mamífero infectado (Handman e

Bullen, 2002). Estes se transformam em promastigotas pró-cíclicos, os quais

possuem baixa motilidade; posteriormente, diferenciam-se em longas

promastigotas nectomonada, com motilidade maior (Rogers et al., 2002),

sequenciando na forma leptomonada e, finalmente, na forma promastigota

metacíclica, infectante em mamíferos (Dostálová e Volf, 2012).

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Figura 1. Ciclo biológico de Leishmania ssp. A Leishmaniose é transmitida pela picada por flebotomíneos fêmeas infectados. Os flebótomos liberam as promastigotas de sua probóscide durante o repasto sanguíneo. No sangue, as promastigotas são fagocitados por macrófagos e outros tipos de células fagocíticas mononucleares. No interior da célula, eles transformam-se em amastigotas que se multiplicam por divisão simples e seguem infectando outras células fagocíticas mononucleares. O ciclo finaliza quando flebótomos são infectados pela ingestão de células infectadas durante o repasto sanguíneo. Neles, as amastigotas se transformam em promastigotas, se desenvolvem no intestino e migram para a probóscide. Fonte: CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (CDC).

Embora a infecção inicial, a princípio, possa não resultar em sintomas

clínicos, o parasitismo da Leishmania no hospedeiro pode persistir num curso

crônico, seja de forma local ou difusa, para tecidos mucocutâneos ou órgãos

viscerais, resultando na doença propriamente dita (WHO, 2017). Apenas um

pequeno conjunto de pessoas infectadas reativas ao teste de Montenegro com

o parasito Leishmania desenvolve doença clínica (Jamieson et al., 2007).

18

1.2. Interação parasito-hospedeiro

Todos os parasitos do gênero Leishmania são intracelulares obrigatórios

que infectam as células da linhagem mononuclear fagocítica de seus

hospedeiros vertebrados, nos quais existem na forma amastigota (Alexander e

Russell, 1992). Inicialmente, na transmissão dos parasitos pela picada do

flebotomíneo, eles encontram principalmente os neutrófilos e sobrevivem a

eles. Essa infecção dos neutrófilos é transitória e, após a apoptose dessas

células, os parasitos podem subsequentemente infectar macrófagos (Peters e

Sacks, 2009). Ao fagocitar neutrófilos apoptóticos infectados, os macrófagos

desenvolvem de forma mais lenta a resposta protetora Th1. Essa internalização

de forma indireta do parasito permite sua sobrevivencia e multiplicação no

macrófago, além disso, a fagocitose de neutrófiilos infectados resulta na

liberação da citocina anti-inflamatória TGF-β (Van Zandbergen et al., 2004).

Entretanto, é no macrófago, precisamente nos fagolisossomos, que o parasito

permanece ao longo da infecção. As células infectadas são rompidas, liberando

amastigotas que serão novamente fagocitadas por macrófagos.

Ao entrar em contato com os macrófagos, o protozoário do gênero

Leishmania realiza interações célula-célula, por meio de ligantes presentes na

sua superfície celular que interagem com biomoléculas da célula de defesa.

Sua fixação desencadeia o recrutamento de receptores para melhorar o

processo de internalização (Handman e Bullen, 2002; Ueno e Wilson, 2012).

Dentre os receptores na superfície dos macrófagos envolvidos na fagocitose do

parasito, destacam-se: os receptores de complemento (CR, do inglês,

Complement Receptor), cuja atuação se dá através da ativação da cascata do

complemento via gp63 da Leishmania (Mosser e Edelson, 1987); os receptores

19

de manose (MR, do inglês, Manose Receptor), que se ligam às manoses

distribuídas na superfície do parasito, resultando em sua fagocitose (Pearson e

Wilson, 1986) e os receptores de fibronectina (FnR, do inglês, Fibronectin

Receptor) que, por meio dos motivos semelhantes a fibronectina presentes na

gp63, promovem a adesão da promastigota ao macrófago (Brittingham et al.,

1999).

O parasito por sua vez, apresenta ligantes na superfície celular, os quais

incluem: a metaloprotease gp63, lipofosfoglicanos, proteofosfoglicanos e

glicolipídios. Parte dessas moléculas está relacionada à ligação aos

macrófagos, além de atuarem como fatores de virulência (Atayde et al., 2016).

Ao entrar em contato com a Leishmania spp., os macrófagos são ativados e

passam a fagocitar e destruir o parasito. Para tanto, uma gama de processos

intracelulares se iniciam; entre estes, a ativação de enzimas de degradação,

tais como proteases, nucleases , fosfatases, lipases, esterases e enzimas de

geração de radicais oxidativos e óxido nítrico (NO, do inglês: Nitric Oxide)

(Assche et al., 2011).

Camundongos têm sido utilizados para compreender a imunologia do

hospedeiro infectado por Leishmania. O modelo mais conhecido é a infecção

por L. major, apresentando perfis de susceptibilidade tais como os da linhagem

BALB/c, quando são infectados (Fonseca et al., 2003; Scott e Scharton, 1994),

ou de resistência, tais como os das linhagens C57BL/6, C3H/HeJ e CBA, que

são capazes de controlar a infecção pelo parasito (Fonseca et al., 2003). Tais

quadros são estabelecidos a partir de subpopulações de células auxiliares

TCD4 de camundongos infectados com L. major, com base no seu perfil de

citocinas, podendo ser caracterizadas como Th1 ou Th2 (Mosmann, Cherwinski

20

e Bond, 1986). Esse modelo é válido apenas em camundongos e para algumas

cepas de L. major (Anderson et al., 2005).

A imunidade à Leishmania é dependente do desenvolvimento da resposta

Th1, que se inicia com a produção das citocinas IL-12 (interleucina 12) e IFN-ɣ

(interferon-ɣ). A IL-12 é produzida por células apresentadoras de antígeno e

células dendríticas (Muller et al., 1989), e atua sinergicamente com a IL-18

(interleucina 18) (Xu et al., 1998), induzindo a expansão do receptor de IL-12

via STAT-4 (do inglês: Signal Transducer and Activator of Transcription 4)

desencadeando a diferenciação em células TCD4 Th1 (Zhu, Yamane e Paul,

2009).

O IFN-ɣ é uma das principais citocinas desse perfil, eficaz na ativação dos

macrófagos, resultando na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS,

do inglês: Reactive Oxygen Species) e NO, moléculas responsáveis pelos

mecanismos de defesa inato contra Leishmania (Scott e Novais, 2016). Os

macrófagos secretam rapidamente TNF-α em resposta à estimulação de LPS e

outras moléculas de patógenos, que então age de maneira autócrina para

melhorar a indução de iNOS (do ingles: inducible Nitric Oxide Synthase)

(Olekhnovitch e Bousso, 2015). Outras citocinas que compartilham

propriedades pró-inflamatórias também são agrupadas nesse perfil, como por

exemplo, a IL-1β e IL-6, o que resulta em uma maior heterogeneidade nesse

grupo (Martinez e Gordon, 2014).

O perfil de susceptibilidade é caracterizado pela infecção crônica, em que

ocorre o desenvolvimento da resposta Th2, distinguida pela produção de

citocinas, como IL-4, IL-5 e IL-13, e pela proliferação do parasito (Mougneau,

Bihl e Glaichenhaus, 2011). A fase crônica é caracterizada pela produção de

21

IL-10 a partir de células TCD4, macrófagos, células dendríticas e outras células

do sistema imune (Ouyang et al., 2011; Saraiva e O’garra, 2010).

Uma característica importante é que a IL-10 também é produzida quando

a resposta imunológica é Th1; sua importância nesse contexto, se dá no

controle sobre o excesso de ativação, regulando a resposta inflamatória

prejudicial ao hospedeiro (Anderson et al., 2005; Cope et al., 2011; Saraiva e

O’garra, 2010). A produção de NO é inibida pelas citocinas do padrão Th2

(Cunha, Moncada e Liew, 1992), que passam a direcionar a arginina para a

sintese de L-ornitina, através do estímulo da arginase. A L-ornitina, por sua

vez, pode ser usada por parasitos para gerar poliaminas que contribuem para a

sua proliferação (Iniesta et al., 2002).

Apesar do paradigma Th1 x Th2 ter explicado a imunidade adaptativa por

décadas, um novo subconjunto de células T foi descrito recentemente,

caracterizado pela produção de IL-17 (Park et al., 2005), cuja atuação na

infecção contra microorganismos vem sendo investigada (Veerdonk et al.,

2009). Sua função é protetiva na leishmaniose murina causada por L. infantum

(Nascimento et al., 2015) e L. braziliensis (Vargas-inchaustegui, Xin e Soong,

2008), atuando em conjunto com IFN-ɣ em ambas as infecções. Na

leishmaniose humana causada por L. donovani a IL-17 apresentou ter papel

complementar na proteção contra a infecção (Pitta et al., 2009). Entretanto, a

atuação da resposta Th17 está relacionada com a imunopatologia da infecção

murina por L. major (Anderson et al., 2009; Kostka et al., 2009). Classificadas

como células Th17, elas atuam no perfil inflamatório e são induzidas pela ação

da IL-6 em sinergia com o TGF-β (do inglês: Transforming Growth Factor β)

(Bettelli et al., 2006).

22

1.2.1. ROS e NO

A depender do hospedeiro infectado e da espécie de Leishmania, a

produção de citocinas determinará a resposta predominante no curso da

infecção. Quando a resposta é direcionada para o perfil de proteção, os

macrófagos trabalham no sentido da eliminação do parasito por mecanismos já

descritos: produção de ROS e NO. A produção basal de ROS ocorre

imediatamente no processo de fagocitose em neutrófilos e macrófagos não

ativados (Dinauer e Newburger, 1993; Nathan e Shiloh, 2000). Contudo, essa

produção é insuficiente para a eliminação dos parasitos (Nacy et al., 1981),

pois estudos apresentaram que, in vivo, no interior dos macrófagos, o parasito

Leishmania spp consegue sobreviver e se reproduzir sob condições oxidativas,

por meio de um sistema antioxidante (Fairlamb e Cerami, 1992; Roma et al.,

2016; Romão et al., 2006). Entretanto, ao passo que IFN-ɣ é produzido, a

explosão respiratória é aumentada em macrófagos humanos, resultando em

uma maior redução de parasitos (Novais et al., 2014). Isso ocorre porque os

macrófagos podem ser preparados para o aprimoramento da explosão

respiratória pelo estímulo de citocinas. Essa pré-ativação não ativa a NADPH

oxidase (complexo enzimático necessário para gerar ROS), mas potencializa

sua atividade quando os macrófagos são ativados por IFN-ɣ e TNF-α (Sasada,

Pabst e Johnston Jr, 1983; Tsunawaki e Nathan, 1984).

No entanto, ROS não são tão necessárias no controle da doença, pois

camundongos deficientes em componentes do complexo NADPH oxidase

(Phox nocaute) ainda podem controlar a infecção por L. braziliensis (Rocha et

al., 2007) e o crescimento de L. amazonensis (Carneiro et al., 2017; Roma et

al., 2016). Este efeito provavelmente deve-se ao NO, produto da iNOS, enzima

ativada pelo IFN-ɣ em sinergia com TNF-α (Liew, Li e Millot, 1990), exercendo

23

papel importante na diminuição de amastigotas intracelulares (Bogdan,

Rollinghoff e Diefenbach, 2000).

A citotoxicidade do NO resulta da sua ação direta ou da sua reação com

outros compostos liberados durante o processo inflamatório. A base bioquímica

para a ação direta do NO consiste na sua reação com metais presentes nas

enzimas do seu alvo (James, 1995). Indiretamente, a toxicidade do óxido nítrico

é resultante da reação do óxido nítrico com o ânion superóxido (O2-) para

produzir o poderoso e tóxico oxidante peroxinitrito (ONOO-) (Beckman e

Koppenol, 1996), que promove nitração parasitária, com efeito citotóxico eficaz

para os parasitos (Linares et al., 2001; Augusto et al., 1996).

Na leishmaniose visceral, além da defesa por meio de ROS e NO, existe a

formação de granuloma no fígado, constituído por um núcleo de células de

Kupffer parasitadas e externamente por linfócitos e variáveis quantidades de

células imunes (Murray, 2001). Os granulomas atingem a maturação completa

em 2-4 semanas após infecção e a carga parasitária hepática rapidamente

diminui em até 8 semanas após a infecção (Murray, 2001; Squires et al., 1990).

Esse processo é orquestrado pelas citocinas mediadoras da resposta Th1, que

conseguem resolver a infecção hepática por meio desse mecanismo (Murray,

1997; Taylor e Murray, 1997).

1.3. Perfil epidemiológico

De forma geral, no Brasil a leishmaniose detém um perfil epidemiológico

subordinado à variação climática, biológica e social; características inerentes

de cada região diversificam a distribuição da doença (Maia-Elkhoury et al.,

2008). De acordo com um estudo realizado por Alvar e colaboradores (2012)

24

em conjunto com a Organização Mundial de Saúde, o Brasil está entre os

países que apresentam índices altos de leishmaniose, e mediante os achados

em cerca de 100 países, os dados ainda são escassos para estimar o real

impacto da leishmaniose no mundo e enfatizar a importância de pesquisas

voltadas à sua prevenção e tratamento.

No período entre 1980 e 2005, foram registrados 59.129 casos de

leishmaniose visceral no Brasil, sendo 82,5% na Região Nordeste (Maia-

Elkhoury et al., 2008). Mais recentemente, no ano de 2016, foram registrados

3200 casos de LV, sendo 47,6% de ocorrência no Nordeste (Brasil, 2017). De

forma mais alarmante, a leishmaniose tegumentar no Brasil chegou ao número

de 12.690 casos novos no ano de 2016, sendo a maior incidência na região

Norte (Brasil, 2016). Barbosa (2013) aponta um panorama de caráter

endêmico da leishmaniose no Estado do Rio Grande do Norte, e essa realidade

é agravada devido ao índice de letalidade especificamente no município de

Mossoró ser superior à média nacional, tendo ascendido entre os anos de 2009

e 2011 (Leite e Araújo, 2013).

1.4. Tratamento

Até o momento, não existe nenhuma vacina licenciada contra a

leishmaniose humana e, embora várias vacinas tenham avançado para os

ensaios clínicos, a maioria ainda está em pesquisa e desenvolvimento

(Gillespie et al., 2016). Seu tratamento deve se basear em drogas selecionadas

com base nos fatores de risco, características do paciente, áFrea geográfica e

espécie de Leishmania (Lindoso et al., 2012). Em geral, o tratamento clássico

da leishmaniose requer a administração de drogas tóxicas e mal toleradas. No

25

entanto, a resistência parasitária reduz consideravelmente a eficácia dos

medicamentos convencionais. As drogas são tóxicas e não possuem a

capacidade de eliminar o parasito, como por exemplo, os antimoniais

pentavalentes (Lindoso et al., 2012; Tiuman et al., 2011) que representam a

primeira linha de medicamentos utilizada principalmente no Brasil (Brazil,

2009): seu mecanismo de ação se dá no metabolismo da forma amastigota,

inibindo enzimas como as envolvidas na glicólise e β-oxidação (Chan-Bacab e

Peña-Rodríguez, 2001), e na defesa antioxidante do parasito (Ariyanayagam e

Fairlamb, 2001; Wyllie, Cunningham e Fairlamb, 2004). Quando o tratamento

não tem efeito (Rodrigues et al., 2006; Rojas et al., 2006; Singh, 2006), ou

quando há restrições, há a possibilidade do uso de outras drogas, tais como

formulações de anfotericina B (Sundar et al., 2010), atuante na redução da

permeabilidade da membrana celular do parasito (Saha et al., 1986; Soares-

bezerra et al., 2004). Estas têm sido efetivas contra diferentes espécies de

Leishmania, exibindo alta eficácia e baixa toxicidade; contudo, o valor do

tratamento com essa droga é elevado (Lindoso et al., 2012).

A pentamidina, usada na clínica em casos não responsivos aos

antimoniais pentavalentes, atua inibindo as enzimas ornitina descarboxilase e a

espermidina sintetase, interferindo na síntese de poliaminas, resultando na

deficiência de moléculas importantes para o parasito (Bacharach et al., 1979;

Soares-bezerra et al., 2004). A miltefosina foi registrada em 2002 como a

primeira droga antileishmanial oral seguindo a fase III (Sundar et al., 2002), seu

mecanismo de ação ainda não está bem estabelecido (Soares-bezerra et al.,

2004), contudo estudos demonstraram que o composto atua diretamente no

parasito inibindo a síntese de lipofosfoglicano (LPG) e glicoproteína 63 (gp63)

26

em parasitos por ele tratados (Lux et al., 2000), e indiretamente através do

sistema imunitário, via receptor do fator de plaquetas (Gangalum et al., 2015).

Dentre os efeitos colaterais identificados, foram detectados vômitos e diarreia,

aumento da uremia e creatininemia (Fischer et al., 2001).

A atenção de pesquisadores tem se voltado à busca da melhor

compreensão acerca desse parasito, pois o entendimento sobre o ciclo de vida,

quais mecanismos regem a interação protozoário-vetor, bem como quais

respostas imunológicas são ativadas ao longo da infecção em mamíferos, são

questões substanciais para que as perspectivas de uma efetiva intervenção em

prol da profilaxia/tratamento sejam alcançadas.

1.5. Vias alternativas de combate à Leishmania

Produtos naturais de origem vegetal (extratos brutos, frações, compostos

isolados e óleos essenciais) têm sido a base para pesquisa de compostos

antiparasitários, em especial, para tratar a leishmaniose (Barros, N. B. et al.,

2013b). Essa realidade se deu a partir do impulso de pesquisadores que

utilizam tais recursos como fontes para descoberta de novos medicamentos

(Tiuman et al., 2011).

Para a investigação da ação terapêutica de plantas medicinais, seja por

meio de extratos ou de compostos isolados, faz-se necessário um estudo

minucioso de sua composição química, toxicidade e seu mecanismo de ação

(Rates, 2001). A princípio, em todo o processo que abrange a extração,

variadas partes de plantas e solventes de diferentes polaridades são utilizados

para a análise da atividade biológica (Beutler, 2009). Os extratos ativos

produzidos são sequencialmente fracionados e suas frações submetidas a

27

métodos de isolamento. Cada fração deve ter sua atividade biológica e sua

toxicidade analisadas (Desoti et al., 2011).

É importante enfatizar que o estudo in vitro é apenas o passo inicial para

comprovar a eficácia e segurança de plantas medicinais para aplicação no

tratamento de leishmaniose. Ademais, deve ser levado em consideração que a

eficácia de um composto isolado ou de um extrato é subordinada à

sensibilidade das espécies de Leishmania a este, ao estado imunitário do

hospedeiro, bem como as propriedades farmacocinéticas do composto isolado

ou dos constituintes do extrato (Croft, Sundar e Fairlamb, 2006).

O reconhecimento do uso extensivo de fitoterapia em leishmaniose em

regiões endêmicas renova o interesse na avaliação cientifica de remédios à

base de plantas usados na medicina tradicional como fontes de potenciais

drogas leishmanicidas. Nesse sentido, numerosos estudos têm sido

direcionados para plantas medicinais (Braga et al., 2007; Ferreira et al., 2004;

Rocha et al., 2005).

Tais plantas, em sua maioria, a princípio são utilizadas no tratamento para

leishmaniose de forma empírica pela população, tais como Anacardium

occidentale, Solanum americanum e Dysphania ambrosioides (França, Lago e

Marsden, 1996; Monzote et al., 2014). A partir de então, o campo científico

tenta delinear os reais efeitos que plantas, extratos ou compostos isolados de

fontes naturais podem exercer sobre o agente patogênico da leishmaniose. Iwu

e colaboradores (1994) avaliaram mais de 20 espécies pertencentes a diversas

famílias taxonômicas e constataram significante atividade contra leishmaniose.

Bezerra e colaboradores (2006) verificaram atividade leishmanicida em plantas

28

da flora maranhense, selecionadas a partir do uso popular no tratamento de

úlceras.

Estudos mais específicos avaliam efeitos leishmanicidas in vitro, como o

de Oubada e colaboradores (2014), que verificou a ação leishmanicida do

extrato de folhas de Calophyllum brasiliense e de Calophyllum rivulare contra

as formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, respectivamente.

Em pesquisas realizadas com L. braziliensis, o extrato etanólico de folhas de

Eugenia uniflora, conhecida como pitanga, bastante utilizada como alimento e

na medicina tradicional, promoveu inibição de 65% do crescimento de

promastigotas, em testes in vitro, a uma concentração de 100 μg/mL; contudo,

apresentou citotoxicidade em níveis elevados em linhagens de fibroblastos

(Santos et al., 2013). Também foi observada atividade antiparasitária de extrato

de folhas e frações hexânicas de Piper arboreum (pariparoba) em

promastigotas de L. braziliensis (Figueredo et al., 2014). Em ensaios in vivo,

Gupta e colaboradores (2010) verificaram que o extrato bruto dos frutos da

Momordica charantia (melão-de-são-caetano), administrado em modelo de

hamster de leishmaniose visceral, apresentou eliminação de 100% dos

parasitos numa dose de 300 mg/kg de peso corporal.

1.5.1. Plantas medicinais

As espécies do gênero Phyllanthus têm sido utilizadas na medicina

tradicional para a sua ampla gama de atividades farmacológicas como

antimicrobianas, antioxidantes, anticancerígenas, antiinflamatórias,

antiplasmodiais, antivirais, diuréticas e hepatoprotetoras (Kaur, Kaur e Sirhindi,

2017). Sua atividade microbicida já foi observada em microorganismos dos

29

gêneros: Neisseria, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Escherichia,

Staphylococcus, Streptococcus, Bacteroides, Enterococcus, Salmonella,

Shigella e Candida (Bodhankar, Pachori e Kulkarni, 2015). As demais plantas

propostas para o estudo apresentam trabalhos publicados referentes à sua

ação contra a leishmaniose. A C. fistula é uma planta pertencente à família

Leguminosae, cujas folhas, flores, frutas, cascas e raiz são usadas para o

tratamento de várias doenças (Agnihotri e Singh, 2013). Jaffary e

colaboradores (2008) avaliaram a eficácia do extrato fervido e do extrato

hidroalcoólico dessa planta no tratamento tópico da leishmaniose cutânea, e

observaram uma porcentagem de cura 40% e 36% nos pacientes tratados,

respectivamente. O uso das espécies do gênero Tabebuia no tratamento contra

doenças infecciosas é extensivo na medicina tradicional da América Latina

(Jiménez-González, Veloza e Sepúlveda-Arias, 2013). Por exemplo, a

Tabebuia serratifolia, planta amplamente utilizada para o tratamento de

leishmaniose cutânea, apresentou extratos em hexano, clorofórmio e

hidroalcoólicos com efeitos contra L. infantum (González-Coloma et al., 2012).

Plantas da família Combretaceae são amplamente utilizadas na medicina

tradicional, em que pesquisas já têm estabelecido que alguns extratos ou

compostos purificados apresentam atividades biológicas diversas, tais como:

antiviral, antibacteriana, antiprotozoária e analgésica (Asres et al., 2001;

Fyhrquist, 2007; Pereira, 2013; Teles et al., 2011). A literatura também já

aponta um lupano-triterpeno isolado a partir de C. leprosum com atividade

contra L. amazonensis, podendo ser utilizado como ferramenta no estudo de

novas drogas leishmanicidas (Teles et al., 2011, 2015).

30

O uso de D. ambrosioides em particular sobre a leishmaniose tem sido

comum em áreas endêmicas, onde a terapia consiste na administração oral ou

tópica de preparações vegetais (Patrício et al., 2008). Em um inquérito

realizado por França e colaboradores (1996) com uma centena de pacientes

de área endêmica de leishmaniose tegumentar (região nordeste do Brasil), D.

ambrosioides foi uma das plantas mais citadas dentre quarenta e nove

espécies utilizadas para o tratamento da ulceração da pele causada por

espécies de Leishmania. Pesquisas no Nordeste do Brasil apresentaram efeito

do extrato hidroalcoólico de D. ambrosioides sobre a ativação dos macrófagos,

induzindo tanto a produção de NO como a produção de peróxido de hidrogênio

e aumentando, desta forma, a capacidade de recrutamento de macrófagos

(Cruz et al., 2007). Entretanto, o mesmo grupo observou que o tratamento

subcrônico com o extrato induziu alterações no nível de ureia e no aumento de

peso dos rins em camundongos Swiss (Pereira et al., 2010). Mais

recentemente, Monzote e colaboradores (2014) verificaram que o óleo

essencial de D. ambrosioides apresentou efeitos contra as formas

promastigotas e amastigotas de Leishmania, por outro lado, os principais

constituintes do óleo essencial causam significante toxicidade em células de

mamíferos (Gadano et al., 2002; Monzote et al., 2009).

Nessa perspectiva, o desenvolvimento de novas drogas que possam

substituir ou complementar as terapias existentes atualmente têm sido

incentivado (Tiuman et al., 2011). Preparações ou biomoléculas de plantas têm

sido amplamente empregadas em ensaios in vitro e in vivo na busca de

respostas pertinentes à leishmaniose e seu tratamento. O presente estudo

levanta a possibilidade de uso de algumas plantas medicinais no combate à

31

leishmaniose por meio de seus extratos salinos. Essa forma de utilização se

assemelha ao uso popular das plantas (infusão) de forma eficaz, tornando

viável o seu uso terapêutico, e principalmente, que não cause prejuízos ao

hospedeiro.

32

OBJETIVOS

33

2.0. OBJETIVOS

Mediante a literatura e a linha de investigação do grupo de pesquisa do

Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LABCEMOL), que trabalha com a

caracterização e aplicações biotecnológicas de moléculas bioativas de plantas

medicinais do Semiárido Nordestino, o presente estudo se propôs a avaliar a

atividade leishmanicida do extrato salino de D. ambrosioides in vitro.

Para atingir este objetivo, foi desenvolvida a seguinte abordagem

experimental:

Realizar a bioprospecção de plantas medicinais (Phyllanthus niruri,

Cassia fistula, Tabebuia aurea, Combretum leprosum e D.

ambrosioides) com atividade leishmanicida;

Verificar a ação tóxica do extrato salino de D. ambrosioides em

parasitos causadores de diferentes formas de apresentação da

doença (promastigotas de L. major e L. infantum);

Analisar a toxicidade do extrato salino de D. ambrosioides em

macrófagos murinos;

Avaliar a ação do extrato salino de D. ambrosioides de forma

profilática e terapêutica na infecção por L. infantum;

Verificar a capacidade do extrato de modular a produção de ROS e

NO dos macrófagos;

Verificar o espectro de ação do extrato salino de D. ambrosioides

na família Trypanosomatidae, por meio da análise do índice de

infecção de Trypanosoma cruzi;

34

Analisar a ação imunoestimulatória do extrato salino de D.

ambrosioides na produção de citocinas em macrófagos murinos.

35

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

36

3.0. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Figura 2. Delineamento experimental. Esquema-síntese do raciocínio e procedimentos metodológicos executados durante o desenvolvimento do presente estudo.

37

METODOLOGIA

38

4.0. METODOLOGIA

O presente trabalho foi cadastrado no Sistema Nacional de Gestão do

Patrimônio Genético e do conhecimento Tradicional Associado (SisGen), com o

número do registro A688CAE.

4.1. Bioprospecção de plantas medicinais com efeito

leishmanicida

Para a realização da bioprospecção de plantas medicinais com efeito

leishmanicida, foram utilizadas: T. aurea (MOSS7118), C. fistula, P. niruri

(MOSS3014), C. leprosum (MOSS10195) e D. ambrosioides (MOSS14993). As

amostras em estudo passaram pelos seguintes procedimentos metodológicos:

Obtenção do extrato salino

Dosagem do teor proteico

Teste de citotoxicidade em promastigotas de Leishmania e

macrófagos murinos

Efeito sobre a produção de ROS

Os procedimentos utilizados são descritos com mais detalhes nos tópicos

seguintes.

4.2. Obtenção dos extratos salinos

As amostras foram coletadas nas cidades de Abreu e Lima (PE), Apodi

(RN), Mossoró (RN) e Russas (CE), identificadas e registradas no Herbário da

Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA). Para a obtenção dos

extratos salinos, foram realizados os mesmos procedimentos para todas as

espécies estudadas: as folhas de cada planta em estudo foram desidratadas

em temperatura ambiente do laboratório (24 °C) e submetidas à trituração para

39

a produção de farinha. Foi realizada uma extração de cada farinha em solução

de NaCl 0,15 M (a temperatura ambiente do laboratório, durante 16 horas, sob

agitação constante). Após extração, o material foi filtrado e submetido à

centrifugação refrigerada (8228 g, a 4 °C); o precipitado foi desprezado e o

sobrenadante denominado de extrato salino. A quantificação de proteínas foi

procedida segundo Lowry e colaboradores (1951), utilizando uma curva padrão

de albumina sérica bovina.

4.3. Obtenção e cultura de macrófagos

Os macrófagos utilizados para a realização dos experimentos in vitro

foram obtidos a partir de camundongos C57BL/6 e camundongos Nox2 nocaute

como descrito por Goes e colaboradores (2016). Os camundongos C57BL/6

foram obtidos do Centro de Bioterismo do ICB (UFMG, Belo Horizonte, MG,

Brasil) e os camundongos Nox2 nocaute foram obtidos de Jackson Laboratory

(Greenville, NJ, USA) e mantidos no Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia

(UFMG). Foram injetados na cavidade peritoneal dos camundongos, 2 mL de

tioglicolato de sódio (a 3% em água destilada), estimulando o processo

inflamatório. Após o período de 96 horas, os macrófagos foram colhidos com

PBS, centrifugados a 300 g por 10 minutos a 4 °C; o precipitado foi

ressuspendido em 2 mL de DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium,

Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de SFB (Soro

Fetal Bovino, Cultilab, Campinas, Brasil), 1 % de penicilina-estreptomicina e 2

mM de glutamina (Sigma Aldrich). Uma alíquota foi retirada para a contagem

de células em câmara de Neubauer e, posteriormente, as células foram

cultivadas em placas de 24, 48 ou 96 poços, nas concentrações 5 x 105 ou 1 x

40

106, de acordo com o ensaio a ser realizado. As culturas foram incubadas a 37

°C, em estufa com atmosfera úmida contendo 5 % de CO2, durante 2 horas.

Após a aderência das células, as placas foram lavadas com DMEM e mantidas

em estufa úmida para utilização nos ensaios experimentais.

4.4. Cultura de parasitos

Promastigotas de L. infantum e L. major foram cultivadas em meio LIT (Do

inglês: Liver Infusion Tryptose) suplementado com hemina (Sigma

Aldrich, Milwaukee, EUA) na concentração de 4 mg/mL e o pH ajustado para

7,28, 10% v/v de SFB (Cultilab, Campinas, Brasil) e 1% de

penicilina/estreptomicina, sendo mantidas em estufa B.O.D. a 25 °C e

repicadas a cada três dias, até no máximo 10 repiques (Gangalum, P. R. et al.,

2015)

A cultura de T. cruzi foi realizada como descrito por Goes e colaboradores

(2016). Formas tripomastigotas foram obtidas do sobrenadante de culturas de

células LLC-MK2 (células epiteliais de rim de macaco Rhesus) infectadas pelo

parasito. As células foram cultivadas em frascos de cultura de células de 75cm2

em DMEM suplementado com 2% de SFB, 1% de penicilina/estreptomicina, 3,7

mg/L de bicarbonato de sódio (Sigma Aldrich) e 2 mg/L de Hepes (Sigma

Aldrich) a 37 °C. Após adesão das células e formação de uma monocamada

com aproximadamente 80% de confluência, frascos destinados apenas ao

cultivo das células LLC-MK2 foram lavados com PBS (salina tamponada com

fosfato 0,01 M, pH 7,3) e submetidos à dissociação química das células por

0,25 % de tripsina/EDTA (Gibco, Grand Island, NY, EUA). As células obtidas a

partir dessa dissociação foram ressuspendidas em DMEM e repassadas para

41

novos frascos. Após uma semana, quando a confluência de 80 % foi

novamente alcançada, esses frascos foram utilizados para manutenção

semanal desse cultivo e para a obtenção dos parasitos.

Para a obtenção dos parasitos, as células LLC-MK2 foram infectadas com

5 x 106 tripomastigotas e mantidas em estufa a 37 °C, em atmosfera úmida

contendo 5 % de CO2. Após 48 horas, as células foram lavadas para a

remoção dos parasitos extracelulares e o meio de cultura foi trocado a cada

dois dias. Após sete dias de infecção, formas tripomastigotas liberadas das

células infectadas foram coletadas no sobrenadante e purificadas.

4.5. Infecção por Leishmania infantum e Leishmania major

Para a infecção dos macrófagos por espécies do gênero Leishmania,

foram utilizadas promastigotas de L. infantum ou L. major cultivadas em LIT. As

culturas foram centrifugadas a 2.000 g, a 4 °C por 15 minutos, e os

precipitados foram ressuspendidos em 1 mL de DMEM. Uma alíquota foi

retirada e diluída no formol para a contagem de parasitos em câmara de

Neubauer. A quantidade de parasitos utilizada para as infecções foi na

proporção de 5:1 de macrófagos. Os parasitos foram incubados por 4 horas

com os macrófagos previamente cultivados. Após incubação, as placas foram

lavadas com DMEM três vezes para a retirada de parasitos livres (Gangalum et

al., 2015).

4.6. Infecção por Trypanosoma cruzi

Para a infecção dos macrófagos com o parasito T. cruzi, foram utilizadas

tripomastigotas obtidas do sobrenadante de cultura de células LLC-MK2

42

infectadas: o sobrenadante coletado foi centrifugado a 800 g, por 10 minutos a

4 °C, e mantido por 2 horas e;m estufa a 37 °C, em atmosfera úmida contendo

5% de CO2, resultando na separação das tripomastigotas, que nadam para o

sobrenadante do tubo, separando-se dos restos celulares que permanecem

nos sedimentos. Em seguida, o sobrenadante contendo as tripomastigotas foi

coletado e centrifugado a 2000 g, por 15 minutos a 4 °C; o precipitado foi

ressuspendido em 2 mL de DMEM e, a partir deste, uma alíquota foi retirada

para a quantificação dos parasitos em câmara de Neubauer. A quantidade de

tripomastigotas utilizada nos ensaios de infecção foi na proporção de 5:1 de

macrófagos. Os parasitos foram incubados com os macrófagos previamente

cultivados por 2 horas; após incubação, as placas foram lavadas com meio

DMEM três vezes para a retirada de parasitos livres (Goes et al., 2016).

4.7. Citotoxicidade dos extratos salinos de plantas medicinais em

macrófagos, promastigotas de Leishmania infantum e

Leishmania major

Para analisar a citotoxicidade dos extratos em promastigotas de L.

infantum e em macrófagos peritoneais murinos, foi utilizado o método de MTT,

conforme descrito por Mosmann (1983). Essa técnica quantifica a atividade

mitocondrial por meio da formação de cristais de formazana, resultantes da

redução do MTT {brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]} pela

atividade da succinato desidrogenase.

Macrófagos peritoneais e promastigotas de L. infantum foram incubados

com os extratos salinos em diferentes concentrações (obtidas a partir de

diluição seriada, com uma concentração inicial de 500 µg/mL), mantidos em

43

estufa úmida contendo 5% de CO2, e estufa B.O.D., respectivamente, a 37 °C

por 72 horas. Após incubação, as placas de cultura dos macrófagos foram

lavadas com PBS para retirar todo o extrato; em seguida, nas placas de

macrófagos e promastigotas foram adicionados em cada poço 100 µl de MTT

(1 mg/mL), as placas foram revestidas com papel alumínio e mantidas em

estufa por 4 horas. Em seguida, foram adicionados 80 μL de DMSO

(dimetilsulfóxido) para solubilização dos cristais de formazana, formados a partir da

redução do MTT nas mitocôndrias das células viáveis. As placas foram agitadas

durante 5 minutos e então a presença de formazana foi lida em leitor de

microplacas, a 590 nm.

Para verificar se o extrato salino de D. ambrosioides possui efeito tóxico

na forma promastigota de L. major, estes foram incubados por 48h em estufa

B.O.D., a 37 °C, com o extrato salino de D. ambrosioides em diferentes

concentrações (obtidas a partir de diluição seriada, com uma concentração

inicial de 500 µg/mL). Após incubação, uma alíquota de cada poço foi retirada e

a contagem de parasitos viáveis foi realizada em câmera de Neubauer, no

microscópio óptico.

4.8. Atividade anti-protozoária do Dysphania ambrosioides

Foi verificada a ação profilática do extrato salino de D. ambrosioides em

resposta à infecção por L. infantum. Macrófagos cultivados em placas de 24

poços (com lamínulas) foram incubados com extrato salino (300 μg/mL), por 24

horas. Após incubação, as células em cultivo foram lavadas para a retirada do

excesso de extrato, infectadas com L. infantum (conforme descrito

44

anteriormente) e mantidas em estufa úmida, por 48 horas. Após incubação, as

lamínulas foram coradas e o índice de infecção foi calculado.

Nesse experimento, também foi avaliada a ação medicamentosa do

extrato salino de D. ambrosioides. As culturas de macrófagos foram

inicialmente infectadas por L. infantum, L. major ou T. cruzi. Após tempo de

infecção seguido de lavagens para a retirada dos parasitos livres, os

macrófagos foram tratados com o extrato salino (300 μg/mL) e mantidos em

estufa por 48 horas. Logo após incubação, o índice de infecção foi calculado.

De acordo com o objetivo, também foram utilizados macrófagos de

camundongos Nox2 KO ou macrófagos de camundongos WT tratados com

apocinina (300 μM), um inibidor da NADPH oxidase, que foi adicionado 30

minutos antes da infecção, logo após infecção e uma vez ao dia durante todo o

período de incubação. Após incubação, o índice de infecção foi calculado.

Após o período de incubação dos ensaios de infecção em placas de 24

poços contendo lamínulas, estas foram coradas utilizando o sistema de

coloração hematológica Panótico Rápido (Laborclin, Pinhais, PR, Brazil). O

número de amastigotas e macrófagos infectados foi determinado pela

contagem de pelo menos 300 células por amostra. Os resultados foram

expressos como índice de infecção (% de células infectadas x Nº de

amastigotas/Nº total de células) (Goes et al., 2016).

4.9. Detecção de ROS em macrófagos murinos em resposta aos

extratos salinos de plantas medicinais.

Para avaliar a ação dos extratos salinos na produção de ROS por

macrófagos murinos, foi realizado o ensaio de luminometria (Goes et al.,

45

2016). A cultura de macrófagos em placa de 96 poços branca/opaca foi obtida

como descrito previamente; as células foram ressuspendidas em meio RPMI

1640 (do inglês: Roswell Park Memorial Institute) sem vermelho fenol, foi

adicionado a cada poço 0,05 mM de luminol e, em seguida, as células foram

incubadas com os extratos salinos (300 μg/mL). A leitura foi realizada

imediatamente após a incubação das células com os estímulos durante 90

minutos, com intervalos de 2 minutos entre cada leitura. A produção de ROS foi

expressa como unidade relativa de luz, representada pela intensidade de luz

gerada durante a reação entre ROS e luminol.

Outro experimento foi realizado para avaliar a produção de ROS, sendo

esse, em particular, somente com macrófagos incubados com o extrato de D.

ambrosioides (300µg / mL). Além da incubação com o extrato, posteriormente,

os macrófagos foram infectados com promastigotas de L. infantum e então

também submetidos à avaliação da produção de ROS. Como controle positivo

para a produção de ROS, foram utilizados poços com Zimosan (1 x107

partículas), um ativador da explosão respiratória.

4.10. Detecção de nitrito (NO2-) em macrófagos murinos tratados

com extrato salino de Dysphania ambrosioides

Foi inferida a produção de óxido nítrico em macrófagos infectados (ou

não) por L. infantum ou L. major e incubados com o extrato salino de D.

ambrosioides, por meio da detecção de nitrito. Utilizou-se placas de cultura de

96 poços, em que macrófagos murinos (1 x 106 por poço) foram estimulados

com interferon- (BD, San Diego, CA, USA) e lipopolissacarídeo de Salmonella

enterica (Invitrogen, San Diego, CA, USA) (IFN-ɣ/LPS) (Goes et al., 2016), uma

46

combinação que induz a expressão de iNOS em macrófagos dentro de

algumas horas. Após o estímulo, os macrófagos foram mantidos em estufa por

16 horas overnight, e em seguida, infectados com promastigotas de L. infantum

ou de L. major conforme descrito anteriormente; os macrófagos foram tratados

com extrato salino de D. ambrosioides (300 µg/mL) e mantidos em meio de

cultura, em estufa por 48 horas. Após incubação, o sobrenadante de cada poço

de cultivo foi recolhido (50 µL) e a determinação da produção de NO foi

realizada de forma indireta, pela dosagem de seu metabólito nitrito, por meio da

reação de Griess (Green et al., 1982): em uma placa de 96 poços, foram

colocadas as amostras (50 μL/poço) e o padrão nitrito de sódio (250 μM), que

foi diluído sucessivamente (1:2) nos poços posteriores. Poços em branco

consistiram apenas de meio RPMI completo. Em seguida, foram adicionados

100μL de solução de Griess em todos os poços ocupados da placa. A placa foi

mantida no escuro por 10 minutos e a densidade ótica foi determinada por

leitura em espectrofotômetro a 540 nm (Microplate Spectrophotometer System,

modelo SPECTRAmax 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

4.11. Dosagem de citocinas

Para verificar o efeito do extrato salino de D. ambrosioides na produção

de citocinas, macrófagos (1 x106 por poço) de camundongos C57BL/6 em

placas de 48 poços foram infectados com promastigotas de L. major, conforme

descrito anteriormente. Em seguida, os macrófagos infectados foram tratados

com extrato salino de D. ambrosioides (300 µg/mL) e mantidos em meio de

cultura, em estufa por 72 horas. Após incubação, o sobrenadante de cada poço

de cultivo foi recolhido (50 µL) e a determinação da produção das citocinas IL-

47

1β, TNF-α (após 24 horas), IL-6 e IL-10 foi realizada pelo método ELISA (do

inglês: Enzyme Linked Immunosorbent Assay), utilizando kits comerciais BD

(Biosciences). A densidade ótica foi determinada por leitura em

espectrofotômetro a 450 nm (Microplate Spectrophotometer System, modelo

SPECTRAmax 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

4.12. Análise estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados

obtidos foram analisados por meio de comparação das médias e desvios-

padrão. Para comparação de vários grupos, utilizou-se o teste ANOVA e, para

verificar as diferenças significantes entres os grupos, foi realizado o teste de

Tukey considerando 5 % de probabilidade. Para verificar diferenças entre dois

grupos, aplicou-se o teste t de Student para amostras não pareadas. As

diferenças foram consideradas significativas quando p

48

RESULTADOS E DISCUSSÃO

49

5.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Parte I - Bioprospecção de plantas medicinais com efeito leishmanicida

O Brasil possui uma grande biodiversidade vegetal, com elevado

potencial quanto a efeitos biológicos. Em adição a esse fato, existe uma

riqueza de conhecimento tradicional e muitas espécies vegetais são utilizadas

pela comunidade para prevenir ou tratar doenças (Cartaxo, Souza e

Albuquerque, 2010). Pensando nisso, o presente estudo teve como objetivo

detectar fontes naturais (vegetais) com atividade leishmanicida. E para tanto, a

princípio, foram verificadas algumas atividades biológicas que pudessem

caracterizar as espécies vegetais em estudo como potenciais fontes

leishmanicidas.

Após a obtenção dos extratos salinos, foi realizada a dosagem proteica.

As concentrações obtidas foram: T. aurea (11,31 mg/mL), C. fistula (10,77

mg/mL), P. niruri (19,7 mg/mL), C. leprosum (57,3 mg/mL) e D. ambrosioides

(7,17 mg/mL). As concentrações utilizadas nos experimentos foram calculadas

a partir da quantidade de proteínas presente nos extratos.

5.1. Viabilidade celular de promastigotas de Leishmania

infantum tratados com extratos salinos de plantas

medicinais.

Para avaliar se os extratos salinos obtidos de diferentes plantas

medicinais (P. niruri, C. fistula, T. aurea, C. leprosum e D. ambrosioides)

possuíam efeito citotóxico sobre promastigotas de L. infantum, foi utilizado o

ensaio com MTT com promastigotas dessa espécie. Esse teste consiste em

detectar a atividade mitocondrial de células viáveis por meio da densidade ótica

50

0

0,4

85

0,9

7

1,9

53,9

7,8

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15,6

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C . le p ro s u m ( g /m L )

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(%

)

D

E

(D.O.) ( Meerloo, Kaspers e Cloos, 2011), fazendo-se um comparativo da D.O.

de células tratadas com o extrato em estudo, e de células não tratadas.

0

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T . a u re a ( g /m L )

Via

bil

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os

(%

)

A B

C

Figura 3. Viabilidade das promastigotas de Leishmania infantum tratadas com extratos salinos de plantas medicinais. O efeito citotóxico dos extratos de plantas medicinais (A: C. fístula; B: P. niruri; C: T. aurea; D: C. leprosum e E: D. ambrosioides) sobre promastigotas de L. infantum foi avaliado através do ensaio colorimétrico utilizando o MTT. Promastigotas em placas de cultivo foram incubados com os extratos em diferentes concentrações (0,485-500 µg/mL). Após incubação por 72 h, o MTT foi adicionado. Após nova incubação (por 3 h, a 37 °C), o, DMSO foi adicionado,

51

as placas foram agitadas e a absorbância foi medida a 540 nm. O experimento foi realizado uma vez em triplicata. Análise estatística: os dados foram analisados por ANOVA seguida do pós-teste de Tukey (p

52

moléculas podem intervir em seus efeitos (Oliveira, 2014). Assim como para a

maioria dos efeitos biológicos, a ação leishmanicida de uma planta pode ser

evidenciada ou não a depender de seus constituintes moleculares e, em

especial, da forma de obtenção da amostra avaliada. Por exemplo, extratos

obtidos a partir de solventes diferentes, os quais selecionam grupos de

moléculas a partir de características químicas, possuem diferentes frações de

compostos solúveis com atividades biológicas diferentes.

A literatura reporta, por exemplo, a fitoquímica dos extratos metanólico,

etanólico, óleos essenciais e infusão de D. ambrosioides (Barros, L. et al.,

2013; Hou et al., 2017; Jesus et al., 2017; Monzote et al., 2014b; Shah e Khan,

2017). Em seu óleo essencial, há altos níveis de terpenos, especificamente o

ascaridol, óxido cariofileno, carvacrol (Monzote et al., 2006) e seu isômero timol

(Dembitsky, Shkrob e Hanus, 2008). Isoascaridol, p-cimeno, α-terpineno e

limoneno (Cavalli et al., 2004; Kandpal, Prasoon e Joshi, 2016) encontram-se

presentes principalmente também no óleo essencial, cuja constituição química

tem sito largamente relatada na literatura, em particular a presença de

monoterpenos como β-mirceno, cis-β-ocimeno e seu isomero trans, já isolados

das folhas de D. ambrosioides (Singh et al., 2008). Chiasson (2003) observou

a presença de nerol e carvona e, em uma publicação posterior, Omidbaigi,

Sefidkon e Nasrabadi (2005) encontraram o geraniol e a pinocarvona. Ambos

os estudos verificaram a composição do óleo essencial. A presença de poliol

monoterpenos (Hou et al., 2017) e monoterpenos altamente oxigenados

(Ahmed, 2000) também foi observada em extratos etanólicos de D.

ambrosioides. Quatro hidroperóxidos monoterpenos foram isolados da parte

aérea da planta, e suas atividades biológicas contra tripanosomatídeos foram

53

determinadas no mesmo estudo (Kiuchi et al., 2002). Os ácidos orgânicos

também têm sido relatados, como ácido esteárico (Shah e Khan, 2017),

oxálico, quínico, málico, ascórbico, cítrico, fumárico e succínico, identificados

nos extratos de etanol e infusão de D. ambrosioides (Barros, L. et al., 2013;

Gupta, La e Behari, 1971). As presenças de escopoletina (cumarina) e piperina

(alcaloide) foram observadas recentemente pela primeira vez nessa espécie

(Shah e Khan, 2017).

Apesar dos achados na literatura, para compreender a fitoquímica de uma

determinada espécie vegetal, deve-se levar em consideração que a

composição química das amostras pode diferir acentuadamente dependendo

do tipo de extração, uma vez que diferentes sistemas de solventes são

capazes de extrair diferentes compostos de uma mesma fonte natural

(Sasidharan et al., 2011). A região geográfica de coleta da amostra é um ponto

a ser considerado, uma vez que também pode interferir na constituição do

extrato (Chan-Bacab et al., 2003).

5.2. Viabilidade celular de macrófagos tratados com extratos

salinos de plantas medicinais.

A relação entre a citotoxicidade de um composto e sua atividade biológica

é fundamental para a análise de sua aplicação em terapias (Freshney, 2000). É

necessário que, além de apresentar efeito contra o parasito, a amostra em

estudo não cause prejuízos as células do hospedeiro. Para avaliar se os

extratos salinos das plantas medicinais em estudo apresentam toxicidade sobre

os macrófagos, foi realizado o teste de viabilidade celular utilizando o MTT

(Figura 4).

54

C . f is tu la ( g /m L )

Via

bil

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cró

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os

(%

)

0

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*

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T . a u re a ( g /m L )

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)

A B

C

Figura 4. Viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos tratados com extratos salinos de plantas medicinais. A potencial citotoxicidade dos extratos de plantas medicinais (A: C. fístula; B: P. niruri; C: T. aurea; D: C. leprosum e E: D. ambrosioides) sobre macrófagos foi avaliada através do ensaio colorimétrico utilizando o MTT. Macrófagos murinos em placas de cultivo foram incubados com os extratos em diferentes concentrações (31,25 µg/mL a 500 µg/mL). Após incubação por 72 h, o MTT

0

31,2

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*

D

E

55

foi adicionado. Após nova incubação (por 3 h, a 37 °C), o DMSO foi adicionado, as placas foram agitadas e a absorbância foi medida a 540 nm. O experimento foi realizado uma vez em triplicata. Análise estatística: os dados foram analisados por ANOVA seguida do pós-teste de Tukey (p

56

inglês, Effective concentration) de 42,58 µg/mL sobre macrófagos em

comparação com EC50 de 18,96 µg/mL sobre promastigotas de L. infantum

(Danish et al., 2011; Sartorelli et al., 2009), e um esterol, com EC50 de 15,39

µg/mL sobre macrófagos e de 19,33 µg/mL sobre células LLC-MK2 (Sartorelli

et al., 2007). Essa discrepância do extrato salino pode se dar pelo fato de que

moléculas bioativas, quando isoladas, podem apresentar melhor atividade

biológica do que quando presentes em extratos brutos.

O extrato salino de D. ambrosioides não representou risco à viabilidade

em células de mamíferos (macrófagos) (Figura 4E), resultado que estimula a

continuação dos estudos para verificar se esse extrato tem algum potencial

para ser utilizado no tratamento de leishmaniose. Também já foi descrito que o

extrato hidroalcoólico de D. ambrosioides não foi tóxico para macrófagos

peritoneais de camundongos BALB/c (García et al., 2012). Entretanto, outras

amostras obtidas a partir de D. ambrosioides, com atividade leishmanicida já

relatada na literatura, apontaram para certo grau de citotoxicidade em células

de mamíferos. Um exemplo desta citotoxicidade é a do seu óleo essencial

sobre macrófagos peritoneais, com IC50 de 58,2 µg/mL (Monzote et al., 2014)

e com efeito tóxico dose dependente para a linhagem de células MCF-7 (Jia-

liang et al., 2014). Estudos acerca do mecanismo de toxicidade do óleo

essencial de D. ambrosioides e de seus principais ingredientes purificados

(carvacrol, óxido de cariofileno e ascaridol) constataram que eles inibem a

cadeia de transporte de elétrons mitocondrial em macrófagos de camundongos

BALB/c (Monzote et al., 2009). Gadano e colaboradores (2002) avaliaram a

genotoxicidade de extratos aquosos de D. ambrosioides, obtidos a partir da

decocção e da infusão, em cultura celular de linfócitos, e observaram que

57

ambos os extratos resultaram no aumento da porcentagem de aberrações

cromossômicas, bem como na diminuição do índice mitótico, um fator que

mede a proporção de células em processo de divisão celular.

5.3. Detecção de ROS em macrófagos tratados com extratos

salinos de plantas medicinais.

Considerando que não houve efeito leishmanicida dos extratos salinos em

promastigotas de L. infantum, a possibilidade de que esses extratos tenham

efeitos indiretos, atuando no mecanismo de ação dos macrófagos contra as

amastigotas intracelulares ainda era factível. Por isso, foi avaliado se os

extratos, em concentração inferior àquela em que os extratos salinos de P.

niruri e C. leprosum apresentaram toxicidade (500 µg/mL), induzem a produção

de ROS em macrófagos.

Áre

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C. f istu

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P. nirur i

T. aure

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5 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0*

Controle

Figura 5. Produção de ROS por macrófagos tratados com extratos salinos de plantas medicinais. Macrófagos inflamatórios foram retirados da cavidade peritoneal de camundongos C57BL/6. Macrófagos foram incubados com 0,5 mM de luminol em

58

meio de cultura e tratado com extratos salinos de plantas medicinais (300 µg/mL). A quimiluminescência foi medida continuamente, imediatamente após a adição dos extratos. As barras representam a área sob a curva obtida em cada condição. O experimento foi realizado uma vez em triplicata e os dados representam a média ± desvio padrão dos experimentos. Análise estatística: as médias foram comparadas por ANOVA seguida do pós-teste de Tukey. * representa diferença estatística entre as barras (p

59

Parte II – Avaliação da ação in vitro do extrato salino de Dysphania

ambrosioides na infecção murina por leishmaniose.

Com a triagem realizada na fase inicial da pesquisa, foi selecionado o

extrato salino da espécie D. ambrosioides que, apesar de não ter efeito

citotóxico sobre promastigotas de L. infantum, em contrapartida, não

apresentou toxicidade em macrófagos e estimulou a produção de ROS,

mecanismo de defesa dos macrófagos contra alguns protozoários do gênero

Leishmania. Os resultados seguintes explanam a ação do extrato salino de D.

ambrosioides em L. major e na infecção in vitro por Leishmania.

5.4. Viabilidade celular das promastigotas de Leishmania

major tratados com extrato salino de Dysphania

ambrosioides

Dois métodos de investigação da citotoxicidade de fontes potenciais para

o desenvolvimento de possíveis drogas são a contagem no microscópio óptico

dos parasitos viáveis e o teste de viabilidade celular utilizando o MTT. Apesar

do extrato salino de D. ambrosioides não ter apresentado toxicidade sobre

promastigotas de L. infantum, foi avaliado se o mesmo possuía efeito citotóxico

em outro agente causador da leishmaniose, através da contagem das

promastigotas viáveis de L. major submetidas ao tratamento com o extrato

(Figura 6).

60

D . a m b ro s o id e s ( g /m L )

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*

Figura 6. Viabilidade das promastigotas de Leishmania major tratados com extrato salino de Dysphania ambrosioides. O efeito citotóxico do extrato de D. ambrosioides sobre promastigotas de L. major foi avaliado através da contagem de células viáveis no microscópio óptico. Promastigotas de L. major em placas de cultivo foram incubadas com o extrato em diferentes concentrações (31,5-500 µg/mL). Após incubação por 48 h, uma alíquota foi retirada de cada poço e a contagem foi realizada na câmera de Neubauer. Os dados são representativos de um experimento realizado em triplicata. Análise estatística: os dados foram analisados por ANOVA seguida do pós-teste de Tukey (p

61

Outras pesquisas entnofarmacológicas com D. ambrosioides apresentam

resultados opostos do que foi observado no presente trabalho. O óleo essencial

obtido a partir de D. ambrosioides, por exemplo, tem apresentado

citotoxicidade sobre diferentes espécies de Leishmania (Bezerra et al., 2006;

Monzote et al., 2007; Monzote et al., 2014a). Sua atividade antimicrobiana se

estende as formas promastigotas de L. infantum (IC50 = 6,4 µg/mL), L.

amazonensis (IC50 = 4,5 µg/mL) e L. donovani (EC50 = 4,45µg/mL) (Monzote

et al., 2007; Monzote et al., 2014a). A ação tóxica do óleo essencial abrange

também tripomastigotas de T. cruzi (IC50 = 1,9 µg/mL) e T. brucei (0,2 µg/mL),

estendendo sua ação contra outros protozoários da família Trypanosomatidae

(Borges et al., 2012; Monzote et al., 2014a). O extrato hidroalcoólico dessa

espécie também apresentou citotoxicidade em promastigotas de L.

amazonensis, apresentando um IC50 de 151,9 μg/mL (Bezerra et al., 2006).

5.5. Efeito leishmanicida in vitro do extrato salino de Dysphania

ambrosioides em formas amastigotas de Leishmania spp.

Diferentes modelos de estudo têm sido utilizados para avaliar a ação

leishmanicida de plantas medicinais, cujas metodologias abrangem estudos

com promastigotas (Jiménez-González, Veloza e Sepúlveda-Arias, 2013; Liu et

al., 2014; Monzote et al., 2014a; Sartorelli et al., 2007; Teles et al., 2011).

Nessa pesquisa, o extrato salino de D. ambrosioides foi tóxico para

promastigotas de L. major, não apresentando efeitos contra a forma

promastigota de L. infantum. Contudo, outro método de averiguar a atividade

leishmanicida, como a contagem de amastigotas intracelul