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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA CARRERA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) DE LA PLATA COLOIDAL SOBRE EL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS EN CARNE FRESCA VACUNA TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO DE ALIMENTOS DARWIN ALEXANDER VACA BÁEZ DIRECTORA: BIOQ. MARÍA JOSÉ ANDRADE CUVI Quito, Febrero 2015
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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA
CARRERA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA
INHIBITORIA (CMI) DE LA PLATA COLOIDAL SOBRE EL
CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS PATÓGENOS EN
CARNE FRESCA VACUNA
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
DE INGENIERO DE ALIMENTOS
DARWIN ALEXANDER VACA BÁEZ
DIRECTORA: BIOQ. MARÍA JOSÉ ANDRADE CUVI
Quito, Febrero 2015
© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2015
Reservados todos los derechos de reproducción
DECLARACIÓN
Yo Darwin Alexander Vaca Báez, declaro que el trabajo aquí descrito es de
mi autoría; que no ha sido previamente presentado para ningún grado o
calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas
que se incluyen en este documento.
La Universidad Tecnológica Equinoccial puede hacer uso de los derechos
correspondientes a este trabajo, según lo establecido por la Ley de
Propiedad Intelectual, por su Reglamento y por la normativa institucional
vigente.
_________________________
Darwin Alexander Vaca Báez
C.I. 1003702386
CERTIFICACIÓN
Certifico que el presente trabajo que lleva por título “Determinación de la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la Plata Coloidal sobre el
crecimiento de microorganismos patógenos en carne fresca vacuna”,
que, para aspirar al título de Ingeniero en Alimentos, fue desarrollado por
Darwin Alexander Vaca Báez, bajo mi dirección y supervisión, en la
Facultad de Ciencias de la Ingeniería; y cumple con las condiciones
requeridas por el reglamento de Trabajos de Titulación artículos 18 y 25.
___________________
Bioq. María José Andrade Cuvi
DIRECTORA DEL TRABAJO
C.I. 1712338373
DEDICATORIA
Todo el esfuerzo realizado en este trabajo se lo dedico a mis padres Cecilia
Báez y Fabián Vaca que son la base para haber podido culminar mi estudio
universitario, a mis hermanos Fabián y Tamara, a mi familia y amigos que de
una u otra manera han sido el estímulo para no decaer.
Una dedicatoria especial a mi padre Fabián Vaca, que gracias a su interés
por la investigación e innovación científica, supo compartirme sus
conocimientos gracias a los cuales surgió mi interés por realizar esta
investigación.
AGRADECIMIENTO
A mis padres, gracias por la preocupación y la paciencia, por sus consejos
por ser un ejemplo de dedicación y esfuerzo gracias por sembrar en mi los
valores y virtudes, porque a pesar de los tropiezos o errores han estado ahí
para apoyarme y no dejarme solo, gracias por siempre haberme dado una
esperanza y una palabra de apoyo en los momentos difíciles.
Gracias a mi hermano por sus palabras de apoyo y a mi hermana por su
ayuda cuando más la necesité, no dudó en apoyarme.
Gracias a mi profesora y tutora María José Andrade que fue el aporte
fundamental e indispensable en la realización del trabajo ya que gracias a
sus conocimientos supo guiarme de la mejor manera, gracias a la Ing. Nubia
Grijalva por su apoyo valioso en momentos claves de mi trabajo.
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN ....................................................................................................... viii
ABSTRACT ........................................................................................................ x
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 1
1.1 OBJETIVOS ........................................................................................... 4
2. MARCO TEÓRICO ...................................................................................... 5
2.1 LA CARNE ............................................................................................. 5
2.1.1 MICROORGANISMOS PRESENTES EN LA CARNE VACUNA ..... 7
2.2 MÉTODOS DE CONTROL DE MICROORGANISMOS EN LA
INDUSTRIA CÁRNICA ........................................................................ 10
2.2.1 MÉTODOS FÍSICOS ..................................................................... 10
2.2.2 MÉTODOS QUÍMICOS ................................................................. 11
2.3 PLATA: EL METAL .............................................................................. 13
2.4 COLOIDES .......................................................................................... 14
2.4.1 EFECTO TYNDALL ....................................................................... 15
2.5 PLATA COLOIDAL .............................................................................. 16
2.5.1 ORÍGENES DE USO DE LA PLATA COLOIDAL .......................... 16
2.5.2 FORMAS DE USO ......................................................................... 18
ii
PÁGINA
2.5.3 USOS EN LA ACTUALIDAD ......................................................... 18
2.5.4 MECANISMOS DE ACCIÓN ......................................................... 19
2.5.5 TOXICIDAD ................................................................................... 20
3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................... 22
3.1 PLATA COLOIDAL .............................................................................. 22
3.2 CEPAS DE ENTEROBACTERIAS ...................................................... 22
3.3 PREPARACIÓN DE INÓCULOS ......................................................... 23
3.3.1 PREPARACIÓN DEL INÓCULO ESTÁNDAR ............................... 23
3.3.2 PREPARACIÓN DEL INÓCULO CON ENTEROBACTERIAS ...... 24
3.3.3 DETERMINACIÓN DE LA CMI DE PLATA COLOIDAL
(ENSAYO IN VITRO) ..................................................................... 25
3.4 APLICACIÓN DE PLATA COLOIDAL EN CARNE VACUNA
(BIOENSAYO) ..................................................................................... 27
3.4.1 RECUENTO DE BACTERIAS PATÓGENAS EN CARNE
VACUNA ........................................................................................ 28
3.4.2 EFECTO DE LA PLATA COLOIDAL SOBRE LA MICROFLORA
NATIVA DE LA CARNE VACUNA. ................................................ 29
3.4.3 EFECTO DE LA PLATA COLOIDAL SOBRE EL COLOR
SUPERFICIAL Y pH DE LA CARNE VACUNA. ............................ 29
3.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO .................................................................... 31
iii
PÁGINA
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................. 32
4.1 DETERMINACION DE LA CMI DE PLATA COLOIDAL (ENSAYO IN
VITRO) ................................................................................................ 32
4.2 APLICACIÓN DE PLATA COLOIDAL EN CARNE VACUNA
(BIOENSAYO) ..................................................................................... 36
4.3 EFECTO DE LA PLATA COLOIDAL SOBRE LA MICROFLORA
NATIVA DE LA CARNE VACUNA. ...................................................... 39
4.4 EFECTO DE LA PLATA COLOIDAL SOBRE EL COLOR
SUPERFICIAL Y pH DE LA CARNE VACUNA ................................... 40
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................. 43
5.1 CONCLUSIONES ................................................................................ 43
5.2 RECOMENDACIONES ........................................................................ 45
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 46
ANEXOS ........................................................................................................... 52
iv
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Composición Nutricional de la carne de res ......................................... 6
Tabla 2. Propiedades de las Soluciones .......................................................... 14
Tabla 3. Halo de inhibición (mm) producido por la plata coloidal sobre el
crecimiento de E. coli, Salmonella y S. aureus. .................................. 34
Tabla 4. Recuento de aerobios mesófilos totales en muestras de carne
vacuna control (0 ppm) y tratadas (29 ppm plata coloidal) al inicio
y final del almacenamiento refrigerado. .............................................. 40
Tabla 5. Recuento de aerobios mesófilos totales en muestras de carne
vacuna control (0 ppm) y tratadas (29 ppm plata coloidal) al inicio
y final del almacenamiento refrigerado ............................................... 41
v
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1 (a) Haz de luz atravesando disolución coloidal y 1 (b) Haz de luz
atravesando una dispersión. ............................................................. 15
Figura 2. Plata coloidal 14, 21 y 29 ppm .......................................................... 22
Figura 3. Cepas E. coli, S. aureus, S. typhi ...................................................... 23
Figura 4. Comparación de un tubo con agua destilada (a) y el patrón Mac
Farland (b) ........................................................................................ 24
Figura 5. Agitación de la suspensión bacteriana en un vortex. ........................ 25
Figura 6. Inóculos de E. coli (a), S. aureus (b), Salmonella (c) y Turbidez
estándar Mac Farland #4 (A y B) ...................................................... 25
Figura 7. Técnica de sembrado por extensión con perlas de vidrio (a) y (b) .... 26
Figura 8. Colocación de antibiogramas en el medio de cultivo ........................ 27
Figura 9. Muestras incubadas a 37°C (a) y Halo inhibitorio medido con
calibrador (b) ..................................................................................... 27
Figura 10. Colorímetro (Konica Minolta CR-400) ............................................. 30
Figura 11. Determinación del pH según la norma NTE INEN 0783:85 ............ 30
Figura 12. Halos inhibición producidos por plata coloidal (21 ppm) sobre
cultivos de (a) E. coli, (b) Salmonella y (c) S. aureus luego 24
horas de incubación a 37°C. .......................................................... 32
vi
PÁGINA
Figura 13. Cultivo de (A) E. coli disco control sin halo de inhibición, Cultivo
de (B) Salmonella disco control sin halo de inhibición y Cultivo de
(C) S. aureus disco control sin halo inhibitorio. .............................. 33
Figura 14. Colonias típicas de (a) E. coli en agar Chromocult, (b) Salmonella
en agar bismuto sulfito y (c) S. aureus en agar Baird Parker
luego de 24h de incubación a 37°C. ............................................... 36
Figura 15. Crecimiento de (a) E. coli, (b) Salmonella y (c) S. aureus en carne
vacuna tratada con 29 ppm plata coloidal (línea roja) y predicción
de su crecimiento en ausencia de plata coloidal usando el
software Combase Predictor (línea azul) durante 12 días de
almacenamiento refrigerado ........................................................... 38
vii
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA
ANEXO I
PREPARACIÓN DE LAS CEPAS ..................................................................... 52
ANEXO II
AJUSTE DE LA TURBIDEZ .............................................................................. 53
ANEXO III
PRODUCCIÓN MUNDIAL (T) DE PLATA POR REGIÓN ................................. 54
viii
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo de investigación fue evaluar el uso de la plata
coloidal como un agente antimicrobiano sobre el crecimiento de
microorganismos patógenos habitualmente presentes en carne vacuna
fresca. La solución de plata coloidal fue elaborada en un consultorio médico
particular en la ciudad de Cotacachi (Imbabura) e inmediatamente se
trasladó al laboratorio de Microbiología de la Universidad Tecnológica
Equinoccial (Quito-Pichincha). Para la determinación de la concentración
mínima inhibitoria (CMI) se utilizaron cultivos de cepas certificadas de
enterobacterias (Escherichia coli, Salmonella) y Staphylococcus aureus
enriquecidas con agar Muller-Hinton a las que se aplicaron dos grupos de
concentraciones de plata coloidal en dos ensayos diferentes, el primero con
3, 5, 7 y 10 ppm, y el segundo con 14, 21 y 29 ppm de plata coloidal
mediante discos impregnados por la técnica de antibiograma de disco-placa.
Las muestras se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Se midió el halo de
inhibición. Una vez definida la CMI para cada microorganismo, se evaluó el
efecto de la plata coloidal sobre el color superficial de la carne y por otro
lado, se determinó el crecimiento de cada microorganismo inoculado
artificialmente en pulpa de carne fresca vacuna adquirida en el
supermercado local. En los ensayos se utilizó carne sin aplicación de plata
coloidal (muestra no tratada denominada control). Se realizaron recuentos
de Escherichia coli, Salmonella y Staphylococcus aureus y recuento total
(microflora nativa) inmediatamente después del tratamiento (día 0) y a los 4,
8 y 12 días de almacenamiento a 6°C. El diámetro promedio del halo
inhibitorio con la dosis de 21 ppm de plata coloidal para E. coli fue de
12.6mm, para Salmonella 10.7mm y para S. aureus 14.4mm por lo que se
seleccionó esta dosis para los ensayos realizados en la carne fresca. La
aplicación de la plata coloidal retrasó el oscurecimiento de la carne, no
produjo cambios en el pH y disminuyó el crecimiento de los microorganismos
experimentados. Inmediatamente después de la aplicación de la plata
coloidal se encontró menor crecimiento de E. coli, Salmonella y S. aureus en
ix
comparación con la carne control. En cuanto al efecto sobre la microflora
nativa de carne, se comprobó mediante el recuento total que al aplicar plata
coloidal existe una reducción del crecimiento en un 35% en relación a la
carne sin aplicación de plata coloidal en el día cero, y una reducción del 70%
en la carne con aplicación de plata coloidal para el día 9. El análisis global
de los resultados propone el uso de la plata coloidal como una alternativa
para el control de microorganismos patógenos y microflora nativa de carne
vacuna fresca permitiendo obtener un producto inocuo, sin producir cambios
en sus características organolépticas y con mayor vida útil.
x
ABSTRACT
The purpose of the present research was to evaluate the use of colloidal
silver as an antimicrobial agent on the growth of pathogenic microorganisms
usually present in fresh beef. Colloidal silver solution was developed in a
particular doctor’s office Cotacachi city (Imbabura) and immediately was
taken to the Microbiology laboratory at Universidad Tecnológica Equinoccial
(Quito-Ecuador). Certified culture strains were used for determination of
minimum inhibitory concentration (MIC) of Enterobacteriaceae (Escherichia
coli, Salmonella typhi) and Staphylococcus aureus enriched with agar Muller-
Hinton which were subject two groups of concentrations of colloidal silver in
two different trials, the first with 3, 5, 7 and 10 ppm, and the second with 14,
21 and 29 ppm, using disks impregnated by disco-placa antibiogram technic.
The samples were incubated at 37ºC for 24 hours. The zone of inhibition was
measured. Once the CMI was defined for each microorganism, the effect of
colloidal silver on the surface color of the beef, was evaluated, and the other
hand, it was determined the growth of each microorganism artificially
inoculated in pulp of fresh beef purchased in the local supermarket. Meat
without application of colloidal silver was used in trials (untreated sample
called control) was used in trials. Counts were made of Escherichia coli,
Salmonella and Staphylococcus aureus and a total count (native microflora)
immediately after the treatment (day 0) and 4, 8 and 12 days of storage at
6ºC. The average diameter of the inhibitory halo with a dose of 21 ppm of
colloidal silver for E. coli was 12.6mm, for Salmonella 10.7mm and for S.
aureus 14.4mm which is why this dose selected for the trials dose carried out
in fresh meat. The application of colloidal silver delayed the darkening of
meat, no changes in pH and decreased the growth of micro-organisms
subject to test. Immediately after the application of colloidal silver, was found
lower growth of E. coli, Salmonella and S. aureus was found compared to
control meat as far as. In terms of the effect on the native microflora of meat,
it was found through the total count, that by applying colloidal silver, there is
a reduction of growth by 35% in relation to the meat without colloidal silver in
xi
the zero-day, and a 70% reduction in the beef whith colloidal silver on day
9th. Overall analysis of the results, suggests the use of colloidal silver as an
alternative for the control of pathogenic micro-organisms and native
microflora on fresh beef allowing a harmless product, without producing
changes in organoleptic and longer life.
1. INTRODUCCIÓN
1
1. INTRODUCCIÓN
La utilización de sustancias con efectos antimicrobianos es conocida desde
tiempos antiguos, donde un conocimiento empírico-tradicional no científico
ha sido usado y transmitido por generaciones; este es el caso del uso de la
plata coloidal que por más de cien años atrás era un elemento infaltable en
los botiquines de la mayoría de las consultas médicas, utilizado como un
germicida eficaz (Ramírez, Morón de Salim, Catinella , & Castillo, 2012).
Actualmente mediante la nanotecnología, ciencia encargada de la
investigación científica y la producción de materia en escala nanométrica
(átomos y moléculas), es posible elaborar sustancias coloidales que realicen
nuevas funciones y tengan nuevas propiedades (Serena, 2010).
El término coloidal se refiere a una sustancia con partículas en suspensión
que se encuentran cargadas eléctricamente y que no pueden ser vistas por
el ojo humano; la plata coloidal incapacita el metabolismo del oxígeno de
cualquier microorganismo unicelular de tal manera que lo sofoca en unos
pocos minutos, si esto ocurre en el interior del organismo humano, estos
productos son desechados mediante el sistema inmunológico y linfático
(Antón, 2013). Además la plata coloidal no elimina enzimas benéficas para el
organismo como generalmente lo hacen los antibióticos farmacéuticos, ya
que las enzimas tienen una forma de vida muy diferente a la de cualquier
organismo unicelular (Solórzano, 2012). Durante décadas los antibióticos
han sido utilizados muchas de las veces de forma inapropiada mediante
tratamientos interrumpidos o innecesarios, por ejemplo se ha usado
antibióticos para curar simples resfriados; en los años 50 el uso de
antibióticos y su producción masiva resultaba tan rentable que más del 50%
de los antibióticos producidos no se los utilizaba en la rama de la medicina,
sino en áreas como la agricultura y ganadería (Morones, 2009) de tal
manera que los microorganismos han desarrollado nuevos y originales
mecanismos de resistencia a los antibióticos tradicionales.
2
En la antigüedad se conocía que la plata evitaba enfermedades, se sabe que
el ejército de Alejandro Magno colocaba monedas de plata para mantener el
agua pura, la clase noble utilizaba y comía en utensilios elaborados a base
de plata. En el siglo XIX el nitrato de plata se utilizaba para cicatrizar y
prevenir infecciones en heridas y quemaduras, y su uso sigue vigente hasta
la actualidad donde numerosos compuestos de plata se comercializan en el
mercado en forma de suplementos naturales para combatir enfermedades
infecciosas. Por ejemplo en hospitales el uso de nitrato de plata en forma de
soluciones diluidas se aplica en los ojos de recién nacidos para evitar
posibles infecciones (Morones, 2009).
Es así que la investigación de la plata coloidal queda abierta para diversas
áreas de la ciencia en las que pueda ser experimentada su acción y uso
como una alternativa frente a la utilización de antibióticos tradicionales o
agentes antimicrobianos aplicados para el control de microorganismos
patógenos transmitidos por alimentos de consumo masivo.
En el Ecuador el segundo alimento de mayor consumo es la carne de res,
situada detrás del arroz especialmente en el sector urbano donde existe una
mayor demanda (Carillo, 2009).
Con todos estos antecedentes realizar ensayos con plata coloidal en carne
fresca vacuna resulta una alternativa tecnológica innovadora para reducir y/o
eliminar la carga microbiana presente en la misma y por consiguiente
prevenir enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s).
Según Ruiz et al., (2001) la determinación de las Concentraciones
Inhibitorias Mínimas (CIM), para patógenos específicos provee datos que
permiten predecir la eficacia “in vivo” del compuesto en el tratamiento de una
enfermedad específica. La plata coloidal tiene probado uso médico (Warren,
2005), y según la investigación realizada en México (López et al., 2008) la
aplicación de plata coloidal retarda el tiempo de propagación de hongos en
el exterior de las papayas y los jitomates, permitiendo así la completa
maduración sin provocar efectos no deseables en la apariencia de los frutos,
y preservándolos por más tiempo. Es necesario entonces establecer la CMI
de la plata coloidal con el fin de controlar el crecimiento de bacterias
3
patógenas y reducir la población microbiana de la superficie de la carne,
siendo una alternativa al uso de sustancias como el ácido láctico cuyo uso
está permitido en una concentración máxima de 190 mg/kg según el
Reglamento UE No. 101 (2013).
Las ETA’s son enfermedades de origen alimentario (intoxicaciones e
infecciones) causadas por la ingestión incidental o intencional de alimentos o
agua contaminados por microorganismos o parásitos o bien por sustancias
tóxicas que ellos las producen, lo cual constituye un grave problema para la
salud a nivel mundial según la Secretaría Distrital de Salud de Bogotá (2011)
& Bernal et al., (2011).
En la actualidad, con el desarrollo de las industrias químicas y alimentarias,
se ha incrementado el uso de sustancias artificiales que se añaden a los
alimentos con la finalidad de extender la conservación de la carne, sin
embargo, muchos de los aditivos pueden resultar tóxicos o nocivos a la
salud del hombre (FAO/OMS, 1995).
La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y Agricultura
(FAO), en la “Cumbre Mundial sobre la alimentación”, efectuada en Roma-
Italia (1996) estableció que la inocuidad de los alimentos y la búsqueda de
nuevas tecnologías que ayuden a la conservación de los mismos, es
responsabilidad de todos los gobiernos para promover la seguridad
alimentaria de las personas.
Actualmente se buscan alternativas de tecnologías y sustancias químicas
que permitan el control de crecimiento de microorganismos patógenos, en
este sentido, se han iniciado investigaciones con el uso de plata coloidal
como un germicida rentable y con efectividad para eliminar patógenos como
E. coli, S. aureus, Streptococcus pneumoniae, Salmonella, Arizona y el B.
anthracis (Warren, 2005). La plata coloidal es un probado germicida que no
produce contaminación al ambiente, no deja residuos nocivos en el alimento
y no es tóxica para el organismo humano (Warren, 2005).
4
1.1 OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la Plata Coloidal
sobre el crecimiento de microorganismos patógenos en carne fresca vacuna.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de plata coloidal
para Salmonella, S. aureus y E. coli.
Determinar el efecto de la adición de plata coloidal sobre el pH y el
color de la carne.
Aplicar la CMI de plata coloidal en carne vacuna y evaluar su efecto
sobre el crecimiento de Salmonella, S. aureus, E. coli y aerobios
mesófilos totales.
2. MARCO TEÓRICO
5
2. MARCO TEÓRICO
2.1 LA CARNE
La carne vacuna es un alimento rico en proteínas y aminoácidos, minerales,
grasa y ácidos grasos, vitaminas y también pequeñas cantidades de
carbohidratos. Nutricionalmente la importancia de la carne vacuna radica en
que posee proteínas de alta calidad las cuales contienen todos los
aminoácidos esenciales, así también sus minerales y vitaminas son de
elevada biodisponibilidad (FAO, 2013). Como se indica en la Tabla 1, en
general las proteínas constituyen un 22.3% de la composición total de la
carne, diferenciándose las miofibrilares (miosina, actina y troponina), las del
sarcoplasma (enzimas de la glicólisis, mioglobina) y las del estroma
(colágeno, elastina, reticulina y tropomiosina) siendo todas éstas las
proteínas que contienen todos los aminoácidos esenciales para el
organismo. Las grasas constituyen alrededor del 1.8% de la composición
total y éstas aportan un papel fundamental para la formación de membrana
celular, para el sistema nervioso, para la formación de hormonas y la bilis.
Las cenizas aportan un 1.2% en las cuales existen fosfatos de calcio, potasio
y magnesio así como también cloruro sódico y férrico (Pardo et al., 1998).
Las vitaminas que aporta son del complejo B (B6 y B12), importante para el
metabolismo de los alimentos, el funcionamiento celular del aparato
digestivo, médula ósea y tejido nervioso (Corporación Ganadera CORFOGA,
2008).
6
Tabla 1. Composición Nutricional de la carne de res
Composición nutricional de la carne por 100 g**
Producto Agua Prot.* Grasas Cenizas KJ*
Carne de vacuno
(magra) 75.0 22.3 1.8 1.2 116
(FAO, 2007)
La FAO recomienda una ingesta de proteína animal de al menos 20g per
cápita al día, (esto se puede lograr consumiendo 33Kg de carne magra al
año) para combatir la subnutrición y malnutrición (FAO, 2007).
La población bovina en el Ecuador, según el III Censo Nacional
Agropecuario (1999-2000) es de 4 486 020 cabezas de ganado de diferentes
razas, las cuales son utilizadas para tres propósitos: ganadería dedicada a la
producción de leche, ganadería dedicada a la producción de carne y
ganadería doble propósito.
Para el año 2012 se faenaron 1.2 millones de cabezas de ganado, esto
quiere decir que en el Ecuador se faenan cada año aproximadamente 1.2
millones de reses, de las que se obtiene un promedio de 420 millones de
libras de carne, con un consumo de 28 libras por cada ecuatoriano (Diario
Hoy, 2012). Esto demuestra que la carne vacuna forma parte de la dieta
alimenticia de la población ecuatoriana, siendo necesario que su
procesamiento y conservación hasta su llegada al consumidor final, cumpla
con estrictas medidas de inocuidad para evitar afectación a la salud humana.
La carne de res es un alimento rico nutricionalmente y debido a su
naturaleza proteica, su elevada actividad de agua y pH, está considerada
como un alimento de alto valor biológico y dentro del grupo de los alimentos
altamente perecederos. Las características propias así como la diversidad
de flora bacteriana variarán de acuerdo al tipo de contaminación que haya
sufrido el animal, esta contaminación se puede dar por infección del animal
vivo, por contaminación endógena, por invasión post-morten, o
contaminación exógena. Siendo la contaminación exógena la de más
7
cuidado ya que el ser humano puede consumir carne procedente de
animales sanos pero con contaminación exógena generando intoxicaciones
e infecciones (Restrepo et al., 2001), por lo cual es necesario un control en
toda la cadena de comercialización hasta el consumo.
Los microorganismos siempre van a estar presentes en la carne fresca,
aunque al inicio pueden estar presentes en pequeñas cantidades ya que el
músculo esquelético está libre de ellos gracias al recubrimiento de la piel y
vainas musculares. La contaminación de la carne puede ser propia de ésta
ya que en el tracto gastrointestinal existen numerosos microorganismos
patógenos que si no se toman las medidas adecuadas pueden causar
contaminación, la cual generalmente empieza durante el sacrificio del animal
durante el degüello, evisceración y despiece ya que luego de estos procesos
hay mayores superficies de contacto en las que la canal puede entrar en
contacto con diferentes factores como el suelo, el aire, el agua, insectos,
roedores, equipos, utensilios, operarios, piel del animal, entre otros. Se
debe tener un especial cuidado con el proceso de insensibilización cuando
este se realiza con el puntillazo ya que este entra en contacto con el sistema
circulatorio del animal y los microorganismos pueden ser distribuidos a los
músculos (Restrepo et al., 2001).
2.1.1 MICROORGANISMOS PRESENTES EN LA CARNE VACUNA
Los principales contaminantes de la carne bovina provienen de la piel de
animal (Micrococcus, Pseudomonas y otros Gram negativos, además
Staphylococcus y Lactobacillus), del interior del aparato gastrointestinal
(coliformes, E. coli, Clostridium, Streptococcus y en ocasiones Salmonella) y
de contaminantes exógenos presentes en el suelo, aire, agua
(Pseudomonas, B. cereus, C. perfingens, C. botulinum, E. coli, Salmonella,
Staphylococcus, Mucor, Penicilium, Alternaria, Monilia, levaduras, entre
otros) (Restrepo et al. 2001). Además que en las manipulaciones y
almacenamiento posterior puede existir contaminación (García, 2014).
8
Entre las bacterias más comunes presentes en la carne vacuna están
Salmonella typhi, E. coli y Staphylococcus aureus, causantes de
enfermedades tales como fiebre tifoidea y diarreas, respectivamente
(Coutiño et al., 2008). La bacteria Staphylococcus es causante de
intoxicaciones alimentarias. Entre los alimentos asociados a este
microorganismo se incluyen la carne, productos cárnicos, lácteos y
derivados (Ingraham, 1998).
Escherichia coli: es un organismo mesófilo, ya que puede crecer desde
temperaturas de 7°C hasta 50°C con una temperatura óptima es 37°C,
aunque existen excepciones de cepas de E. coli enterotoxigénico que se
desarrollaron a temperaturas de 4°C. El pH neutro es el óptimo para su
crecimiento, aunque puede crecer a valores inferiores de 4.4. Su Aw mínima
para su crecimiento es de 0.95 (Lange, 2010). Normalmente su hábitat es el
tracto intestinal del hombre y animales, por lo que es un indicador fecal de
alimentos y aguas (Molina & Esclava, 2014). Los principales alimentos
implicados con enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s) por E. coli
están las carnes frescas, las carnes picadas mal cocidas y accidentalmente
la leche fresca, pasteurizada o ultrapasteurizada mal procesada (Lange,
2010).
Salmonella typhi: mesófilo, aerobio y termosensible, su temperatura de
crecimiento oscila entre 5°C y 47°C con una temperatura óptima de 37°C. El
pH óptimo para su crecimiento es alrededor de 7 y su Aw mínima para su
crecimiento es de 0.93 aunque las células sobreviven en alimentos
desecados (Lange, 2010). Se encuentra en humanos, aves de corral, gatos y
cerdos de forma asintomática, pero los principales portadores son las aves,
los huevos y los roedores. Entre los alimentos relacionados a ETA’s por
Salmonella se encuentran las carnes, la leche, las aves de corral y los
huevos como su principal fuente de transmisión (Flores, 1981).
Staphylococcus aureus: es un mesófilo que puede crecer a temperaturas
de 7°C y 48°C con una temperatura óptima entre 36-40°C. Su pH óptimo
oscila entre 6-7 aunque puede crecer en valores entre 4 y 10. Su Aw mínima
9
para su crecimiento es de 0.86 (Lange, 2010). Su reservorio favorito son las
fosas nasales de donde pasa a la piel, pero también puede estar en los ojos,
garganta y tracto gastrointestinal y desde cualquiera de estas zonas puede
contaminar los alimentos (Fratamico et al., 2005).
Entre los alimentos relacionados a ETA’s por S. aureus se encuentran
carnes, leche, huevos y sus derivados, verduras y en general todo alimento
preparado y consumido en crudo que permanezca por largos periodos a
temperatura de refrigeración (Elikagaien & Fundazioa, 2013).
Por otro lado, los microorganismos que causan alteración de la carne
generan cambios organolépticos en el producto. Existen condiciones como la
aerobiosis o anaerobiosis, en las que se pueden presentar ciertas
alteraciones como:
Mucosidad superficial: causada por la temperatura y disponibilidad
de agua.
Modificaciones en el color de los pigmentos de la carne: puede
tomar tonalidades de color como verde, pardo o gris causado por
bacterias, compuestos oxidantes como peróxidos o sulfuro de
hidrógeno.
Modificaciones sufridas por las grasas: las carnes expuestas al
aire libre están expuestas a la oxidación de grasas no saturadas,
ocasionando su enranciamiento.
Fluorescencia: es ocasional pero la producen bacterias del género
Flavobacterium que crecen en la superficie de la carne.
Olores y sabores extraños: las levaduras que se desarrollan en la
superficie crean una película superficial viscosa, la lipólisis ocasiona
olores, sabores y colores (blanco, crema, rosado, pardo) extraños.
Agriado: debido a las enzimas propias de la carne, a la producción
bacteriana de ácidos grasos o lácticos, o a la proteólisis sin
putrefacción (bacterias anaerobias o facultativas).
10
Putrefacción: debido a la degradación anaerobia de proteínas lo que
produce sustancias muchas de ellas tóxicas que son las que otorgan
sabores u olores desagradables.
Husmo: cuando se produce putrefacción próxima a los huesos
realizado por bacterias anaerobias y facultativas entre las cuales
están las bacterias Coliformes (Castillo, 2010).
2.2 MÉTODOS DE CONTROL DE MICROORGANISMOS EN
LA INDUSTRIA CÁRNICA
La conservación de alimentos como la carne supone el bloqueo de la acción
de microorganismos o enzimas que puedan alterar las características del
producto como el aspecto, olor y sabor; los agentes alterantes pueden estar
presentes en los propios alimentos (como las enzimas) o exógenos como
microorganismos del entorno (como las bacterias). Con el fin de incrementar
la vida útil de la carne se aplican métodos físicos y químicos para controlar el
crecimiento de microorganismos y la actividad enzimática (Veall, 1993).
2.2.1 MÉTODOS FÍSICOS
Se han probado exitosamente métodos como: el aumento de energía por
tratamientos térmicos o radiación, la reducción de temperatura (refrigeración
y congelación), reducción del contenido de agua (como liofilización,
concentración o deshidratación) y aplicación de barreras (como el envasado
en atmósferas modificadas y controladas).
La carne de res requiere de bajas temperaturas para mantener y conservar
sus propiedades, es decir que la aplicación del frío es esencial para frenar el
crecimiento de microorganismos, la refrigeración y congelación pueden
aplicarse solas o en combinación con otras técnicas, tales como la
irradiación, o el envasado en atmósferas modificadas (Veall, 1993). En
11
carnes frescas el método más utilizado es la refrigeración ya que para su
maduración requiere un tiempo entre 14 días a 0°C y de 3 días a 18°C, todo
esto con el fin de obtener un producto más blando y jugoso. Una canal
generalmente puede almacenarse entre 3 y 6 semanas a 0 °C tomando en
cuenta que la humedad relativa no afecte la pérdida de peso y que no se
produzca pardeamiento de la mioglobina (Orrego, 2004). Para la producción
de frío se puede utilizar la refrigeración mecánica que se logra haciendo
circular un refrigerante entre dos puntos, de tal forma que se absorbe el calor
de un punto (evaporizador) y se libera en otro punto (condensador). Este
método se utiliza en cuartos fríos donde las canales son almacenadas para
su posterior comercialización. Con la refrigeración se consigue la reducción
de la tasa de crecimiento microbiano y una reducción de la tasa de
respiración de los mismos (Manual de Agricultura No. 669, 1995) siendo una
tecnología utilizada desde hace muchos años.
2.2.2 MÉTODOS QUÍMICOS
En la revista Mundo Alimentario publicada en 2009 se menciona que en los
últimos años se ha incrementado las técnicas de control de microorganismos
especialmente en Estados Unidos donde se han presentado brotes de
intoxicación con carne cruda y productos agrícolas. A continuación se
enlistan algunos de los métodos más utilizados en la industria cárnica:
Agua: el agua potable se utiliza para reducir moderadamente la
contaminación de la superficie de canales aplicándola por aspersión
normal o aspersión a alta presión.
Ozono: se utiliza durante el almacenamiento en frío ya que este se
disuelve con el agua contenida en el alimento, reduciendo así la
contaminación de las superficies expuestas. También se utiliza para
tratar agua usada para descontaminar la carne. Actualmente está
siendo usado para descontaminar carne y pollo listos para consumir
(Mundo Alimentario, 2009).
12
Cloro (hipoclorito): su uso para la descontaminación de canales se
encuentra en debate ya que no se considera una práctica aceptable
porque existe la posibilidad de la formación de compuestos orgánicos
clorados potencialmente dañinos. Generalmente se usa a
concentraciones de 50-200ppm y con un tiempo de contacto de entre
uno y dos minutos (Morales, 2009).
Peróxido de Hidrógeno: es un compuesto activo para soluciones
descontaminantes de la industria alimenticia. En algunos países la
concentración máxima para canales de carne y pollo es de 100ppm,
pero concentraciones efectivas de peróxido de hidrógeno pueden
alterar el color y apariencia de las canales tratadas.
Ácidos orgánicos: el ácido láctico y ácido acético son utilizados para
reducir la contaminación bacteriana de la carne de res, cerdo, cordero
y pollo en canal. Se los utiliza antes del enfriamiento ya que a una
temperatura de 50-55°C actúan de mejor manera. Su aplicación tiene
como desventaja los cambios de color y sabor de la superficie de la
carne.
Ácido Peroxiacético: utilizado para descontaminar canales de carne
y pollo con una concentración máxima a 220ppm. Generalmente se lo
utiliza por aspersión para carnes rojas, aunque su uso es mucho más
costoso que los hipocloritos (Mundo Alimentario, 2009).
Además se estudian las denominadas “Tecnologías Emergentes” que son
alternativas para el uso de sustancias químicas y la aplicación de
tecnologías convencionales que permiten reducir recursos económicos y
también obtener un producto con valor agregado (Morales, 2009; Goetsch,
2011). Una de esas tecnologías es la aplicación de la plata coloidal como
una alternativa al uso de anhídrido sulfuroso en la elaboración de vino tintos
(López et al., 2012)
13
2.3 PLATA: EL METAL
La plata es un metal precioso que se encuentra en la naturaleza
generalmente en la corteza terrestre, su símbolo químico es Ag y su peso
atómico 107.8682g/mol; es el sexagésimo séptimo elemento natural más
abundante, entre sus propiedades están: poseer la más alta conductividad
térmica y eléctrica de todos los metales con la menor resistencia de contacto
por lo que se convierte en un metal fácil de aplicar electrólisis. Es blanda,
maleable y dúctil (se puede deformar sin romperse), no es soluble en agua,
posee sensibilidad a la luz, es inalterable al aire libre, no se combina
fácilmente con otros elementos para formar compuestos por lo que también
se la considera un metal noble (Warren, 2005; Molera, 1990).
En la naturaleza existen escasas sustancias que se encuentran puras, ya
que la mayoría de ellas se encuentran mezcladas y algunas de forma
homogénea, es decir, que sus componentes están mezclados de forma
semejante a nivel molecular; éstas son las llamadas soluciones.
Una solución se define como una mezcla química y físicamente homogénea
de dos o más sustancias, las cuales pueden ser líquidas, sólidas o
gaseosas. De esta manera se puede obtener soluciones de líquidos en
líquidos, sólidos en líquidos, gases en gases, gases en líquidos y sólidos en
sólidos. Según el tamaño de la partícula que está dispersa las soluciones
pueden ser: verdaderas, coloidales y suspensiones (Gutiérrez, 1985).
Las diferencias entre éstas se encuentran en el tamaño de las partículas que
las conforman, según se indica en la Tabla 2.
14
Tabla 2. Propiedades de las Soluciones
Propiedad Disolución Coloide Suspensión
Tamaño de partícula 0.1-1.0 nm 1-100 nm >100 nm
Sedimenta No No Si
Filtra a través de papel No No Si
Se separa mediante diálisis No Si Si
Homogénea Si Intermedia No
(Reboiras, 2008)
2.4 COLOIDES
El término coloide lo empleó por primera vez el padre de la química coloidal,
Thomas Graham (1805-1869) para referirse a pequeñas partículas
suspendidas en un líquido o gel que no atravesarían una membrana de
pergamino, las partículas que lograrán atravesarla como las de sal, azúcar y
otras, fueron denominadas cristaloides. La palabra coloide se deriva del
griego kolla, que significa cola, pegamento; pero esta definición es muy
limitada ya que las características de un coloide están dadas por su tamaño
(Warren, 2005).
Los coloides son sistemas binarios formados por dos fases, una dispersa
(dispersoide) que generalmente es sólida y la otra dispersante (medio de
dispersión) que generalmente es líquida y está en mayor cantidad. En estos
sistemas coloidales las partículas de uno de sus componentes están en el
rango de 1 a 100nm y las partículas del otro componente están en el rango
inferior a 1nm. Los sistemas coloidales son denominados también “coloide”
“dispersión coloidal” “estado coloidal” y “sol”. Cuando el medio de dispersión
es el agua los coloides se clasifican en liófobos y liófilos. Esta clasificación
se da de acuerdo a la afinidad que posea la fase dispersa para con la fase
dispersante:
15
- Coloides liófobos.- la fase dispersa posee poca o baja afinidad
(aversión) por la fase dispersante.
- Coloides liófilos.- la fase dispersa tiene bastante afinidad por la fase
dispersante.
Las propiedades específicas de los coloides están dadas por el tamaño de
las partículas y no por las propiedades químicas que puedan tener los
mismos (Velásquez & Merchan, 2005).
2.4.1 EFECTO TYNDALL
Esta propiedad coloidal tiene como sustento la difracción de la luz, es decir
que cuando un haz de luz atraviesa una solución con partículas coloidales
en forma perpendicular al ángulo de observación, estas son visibles
claramente, caso contrario con las dispersiones sin partículas en suspensión
no pueden dispersar la luz (Valenzuela, 1995). En la Figura 1a se observa el
haz de luz atravesando un coloide verdadero y la Figura 1b muestra el haz
de luz atravesando una disolución sin partículas coloidales.
Figura 1 (a) Haz de luz atravesando una solución de plata coloidal y 1 (b) Haz de luz atravesando agua destilada.
(Vaca, 2014)
a b
16
2.5 PLATA COLOIDAL
2.5.1 ORÍGENES DE USO DE LA PLATA COLOIDAL
La plata coloidal junto con sus propiedades antimicrobianas ha sido utilizada
desde mucho tiempo antes que se inicie la historia escrita. Desde tiempos de
la antigua Grecia y Roma, ya que se había apreciado que las familias que
utilizaban utensilios de plata para comer se enfermaban de infecciones
bacterianas muy raramente. En ese entonces se bebía en copas de plata, se
comía y servía la comida en cubiertos de plata, se transportaban los
alimentos en contenedores de plata y se utilizaban platos de plata. Este
conocimiento tradicional fue transmitido entre reyes, emperadores, sultanes,
zares y sus familiares y los efectos se pudieron constatar luego de una o dos
generaciones en los que las consecuencias de utilizar estos utensilios de
plata los hacían prácticamente inmunes a cualquier infección bacteriana; de
aquí el dicho de los linajes de “sangre azul” ya que la nobleza de ese
entonces poseía un tinte ligeramente azulado en la sangre debido a los
residuos de plata pura (Warren, 2005).
De manera contraria las personas comunes de “sangre roja” se alimentaban
en utensilios de hierro y se utilizaban planos de terracota (arcilla) y se
enfermaban frecuentemente (Solórzano, 2012).
Se conoce que los fenicios, una civilización del antiguo Egipto, utilizaban
bloques de plata para mantener el vinagre, el vino y el agua durante sus
largos viajes; de la misma forma los norteamericanos utilizaban monedas de
plata para conservar la leche. El dicho “Nació con una cuchara de plata en la
boca” comúnmente utilizado en el siglo XVIII era indicativo de salud mas no
de riqueza, ya que se comprobó que los niños alimentados con utensilios de
plata eran más sanos que los niños alimentados con utensilios de otros
metales (Goetsch, 2013).
17
La plata coloidal es una suspensión de partículas de plata en agua pura (sin
iones interferentes, excepto el H+) las cuales no se acumulan ni en el fondo
ni en la superficie gracias a que la fuerza de carga eléctrica de estas
partículas es mucho más fuerte que la fuerza de la gravedad lo que hace
que las partículas no se precipiten y sedimenten. El tamaño de estas
partículas es bastante grande como para que no se disuelvan en el agua y
apropiadamente pequeño como para viajar a través del organismo humano y
penetrar cualquier tejido (Goetsch, 2013).
La obtención de plata coloidal se realiza mediante electrólisis de plata pura
en agua destilada haciendo pasar corriente eléctrica a través de un circuito
en serie, compuesto por un electrodo de plata y agua desionizada. En este
proceso la corriente hace que la Ag0 (metal) y la Ag+ (iones) emigren desde
el electrodo hacia el agua desionizada (Warren, 2005). La concentración de
la plata se mide en partes por millón (ppm), una ppm equivale a la misma
proporción de miligramo de plata en un litro de agua.
Según la Agencia de Sustancias Tóxicas y Registro de Enfermedades
(ATSDR) de Estados Unidos el elemento plata existe en niveles de menos
de 0.000001 mg por metro cúbico de aire (mg/m³), 2.0 partes por mil
millones de partes de plata (ppb) en la superficie de las aguas, como lagos y
ríos y 0.20-0.30 partes por millón en el suelo (ppm). Compuestos de plata
también se encuentran en las aguas subterráneas y en sitios de desechos
peligrosos a lo largo de los Estados Unidos. Suministros de agua potable en
los Estados Unidos han encontrado que contienen plata en niveles de hasta
80 ppb. Las encuestas muestran que una décima parte de un tercio de las
muestras tomadas del agua potable suministros (agua subterráneas y
superficiales) contienen plata en niveles superiores a 30 ppb. (Goetsch,
2013).
La demanda mundial de plata alcanzó 32. 604 toneladas para el año 2012
(Comisión Chilena del Cobre, 2013) ver Anexo III.
18
2.5.2 FORMAS DE USO
Se reconocen dos formas de administración de la plata coloidal: indirecta y
directa, según se detalla a continuación:
Indirecta: Cuando la plata coloidal es administrada oralmente en el
organismo humano, esta se mantiene durante poco tiempo en la
corriente sanguínea, ya que las células del sistema retículo endotelial
la absorben, estas células son parte del sistema inmunológico y
atacan a la plata coloidal como a cualquier sustancia extraña. En este
proceso las células consumen e ingieren tanto las partículas de plata
coloidal como cualquier microorganismo extraño, lo que hace que se
pongan en contacto íntimo el microorganismo y la plata coloidal. En
este contacto la plata coloidal inactiva las enzimas involucradas en el
metabolismo del oxígeno y sus especies derivadas, estas reacciones
se dan dentro del microorganismo patógeno, produciendo su muerte
en el lapso de alrededor de 5-6 minutos (Goetsch, 2013; Warren,
2005), por esta razón el microorganismo no puede desarrollar
mecanismos de resistencia como ocurre generalmente con los
antibióticos sintéticos tradicionales.
Directa: Se coloca directamente en contacto a la plata coloidal con el
microorganismo de forma que al atravesar la membrana celular por
difusión simple pueda inactivar enzimas provocando la muerte celular
(Goetsch, 2013).
2.5.3 USOS EN LA ACTUALIDAD
Los usos actuales de la plata coloidal son principalmente en la rama de la
medicina, como agente para contrarrestar gérmenes, enfermedades como
salmonelosis, tifoidea, herpes labial, candidiasis, conjuntivitis, entre otros
casos que se han podido comprobar experimentalmente (Vaca, 2013).
19
También se ha probado su efectividad en el tratamiento de quemaduras
graves, ya que funciona como antiséptico y regenerador de tejidos (Warren,
2005), conjuntivitis, acné, hongos, úlceras, entre otros (Goetsch, 2013). Los
usos en la rama alimenticia son enfocados principalmente en la desinfección
de alimentos, agua o cualquier sustancia (Cavallini, 2012).
Con estos antecedentes, la importancia de realizar ensayos in vitro radica en
que a través de éstos se puede comprobar la eficacia de la plata coloidal
para eliminar microorganismos patógenos, en este caso el interés se centra
en aplicar plata coloidal mediante ensayos in vitro realizados con carne
vacuna fresca para comprobar el efecto germicida de la misma, para cepas
de enterobacterias como son: E. coli, Salmonella y S. aureus que
constituyen la flora más representativa de este tipo de carne y que son las
responsables de infecciones intestinales en los seres humanos y las
causantes de la alteración de las características sensitivas y organolépticas
de la carne (López, 2003).
2.5.4 MECANISMOS DE ACCIÓN
Según la revista Discovery Salud publicada el 26 de Noviembre del 2010 las
partículas coloidales pueden actuar de distintas formas para destruir un
microorganismo patógeno, de tal forma que está en la capacidad de:
o Romper y dañar paredes y membranas celulares de microorganismos
unicelulares y virus.
o Inhibir la replicación del microorganismo patógeno, ya que se une a
las células del DNA.
o Impedir la producción de energía del patógeno, ya que obstaculiza el
metabolismo de los fosfatos.
o Producir la muerte de microorganismos, ya que forma complejos con
grupos de electrones los cuales son indispensables para el mismo.
o Fortalece el sistema inmunológico, ya que incrementa el número de
glóbulos blancos.
20
Las técnicas de descontaminación y reducción microbiana no eliminan la
totalidad de microorganismos presentes tanto en alimentos crudos como en
procesados pero pueden ayudar a la seguridad alimentaria, evitando la
contaminación inicial y la recontaminación en el proceso de la materia prima;
esto quiere decir que ayudan a alargar la vida de anaquel de los alimentos.
Entre las técnicas de principales de descontaminación existen los
tratamientos químicos, físicos y térmicos o la combinación de alguno de ellos
(Mundo Alimentario, 2009).
2.5.5 TOXICIDAD
No se conocen efectos tóxicos secundarios relacionados con el uso
exclusivo de plata coloidal, tampoco se han documentado casos de
interacción con otros medicamentos y no existen casos publicados sobre la
generación de adicción o intolerancia (Goetsch, 2013).
Estudios realizados en la Escuela de Medicina (UCLA) pusieron de
manifiesto la capacidad de la plata coloidal para matar hongos, virus y
bacterias (Ford, 2012). Los resultados de las pruebas de laboratorio
mostraron que la plata coloidal tiene propiedades antibacterianas frente a
105 organismos por ml de Streptococcus pyogenes, Neisseria, Gardnerella
vaginalis, gonorrea y otros patógenos entéricos. Al mismo tiempo las
pruebas verificaron que la plata coloidal no tiene efectos secundarios
conocidos en la literatura médica. Ford (2012) explica que la razón por la
que la plata coloidal no reacciona con el cuerpo de una manera negativa es
porque el cuerpo en realidad requiere una cierta cantidad de plata para la
regeneración de los tejidos y la sustitución de células especiales.
Varios autores indican que la única reacción tóxica es la producida por la
plata metálica (diferente a la plata coloidal) que se puede encontrar en la
literatura médica es una afección llamada Argiria (condición cosmética) que
se caracteriza por una coloración gris-azulada permanente de la piel y que
es provocada por la ingesta masiva de sales de plata como el nitrato de
21
plata, sulfato de plata y cloruro de plata (Ford, 2012; Goetsch, 2013, Warren,
2005; Antón, 2013).
La FDA considera a la plata coloidal como un suplemente alimenticio y un
fármaco pre-1938 y señala que la comercialización de la plata coloidal ha
generado reclamaciones sobre su etiquetado y sus aplicaciones. A partir de
1997 a 1998, después de un proceso de revisión, la FDA emitió
varias sentencias contra la plata coloidal permitiendo que la Plata coloidal
sea comercializada como un suplemento mineral dietético (Goetsch, 2013).
3. MATERIALES Y MÉTODOS
22
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 PLATA COLOIDAL
La plata coloidal fue elaborada bajo el protocolo establecido por el Dr.
Fabián Vaca Echeverría ubicado en el cantón Cotacachi (provincia de
Imbabura). La solución fue trasladada en frascos ámbar y protegida de la luz
como indica la Figura 2, hasta los laboratorios de Microbiología de la
Facultad de Ciencias de la Ingeniería, de la Universidad Tecnológica
Equinoccial (Quito) para su experimentación.
Figura 2. Plata coloidal 14, 21 y 29 ppm
3.2 CEPAS DE ENTEROBACTERIAS
Se trabajó con tres diferentes cepas certificadas de enterobacterias:
Escherichia coli (ATCC 15224), Salmonella typhi (ATCC 14028) y
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), como se puede observar en la Figura
3, las cuales fueron adquiridas en el laboratorio de Microbiología de la
Universidad Central del Ecuador y se las trasladó al Laboratorio de
Microbiología de la Universidad Tecnológica Equinoccial e inmediatamente
23
se las almacenó a una temperatura menor a 7°C según las especificaciones
del proveedor.
Figura 3. Cepas E. coli, S. aureus, S. typhi
Para la activación de las cepas se realizó un cultivo en caldo TSB en el cual
se inoculó cada una de las bacterias, las que posteriormente se incubaron a
37ºC durante 24 horas. El procedimiento de activación de las cepas se
detalla en el Anexo I.
3.3 PREPARACIÓN DE INÓCULOS
3.3.1 PREPARACIÓN DEL INÓCULO ESTÁNDAR
Para la preparación del inóculo se utilizó la turbidez del estándar Mac
Farland, el cual según National Committee for Clinical Laboratory Standars
(2003), se prepara mezclando una solución acuosa de cloruro de bario (1%)
y ácido sulfúrico (1%) para formar una suspensión de sulfato de bario
precipitado con una turbidez reproducible como detalla la Figura 4b.
b a c
24
Figura 4. Comparación de un tubo con agua destilada (a) y el patrón Mac Farland (b)
3.3.2 PREPARACIÓN DEL INÓCULO CON ENTEROBACTERIAS
Para la preparación del inóculo se utilizaron las cepas de enterobacterias y
de S. aureus, previamente incubadas en caldo de enriquecimiento (TSB)
durante 24 horas a 37°C.
Se tomó una pequeña alícuota de la bacteria enriquecida y se la colocó en
un tubo de tapa rosca con 4ml de agua destilada (previamente esterilizados)
y se procedió a agitar en un vortex como indica la Figura 5, este
procedimiento se repitió hasta que la suspensión de la bacteria presentó la
misma absorbancia que la suspensión de turbidez estándar Mac Farland #4
correspondiente a una densidad de bacterias aproximada de 12 x 108
UFC/ml, como indica el Anexo II. Para medir la absorbancia se utilizó el
espectrofotómetro (GENESYS 20 – ThermoSpectronic).
a b
A
25
Figura 5. Agitación de la suspensión bacteriana en un vortex.
3.3.3 DETERMINACIÓN DE LA CMI DE PLATA COLOIDAL (ENSAYO IN
VITRO)
A partir de los inóculos bacterianos (12 x 108 UFC/ml) como detalla la Figura
6A y 6B se tomó 1ml de alícuota y se homogenizó en un tubo de ensayo que
contenía 9ml de agua destilada estéril a partir de ésta (107) se procedió a
realizar diluciones sucesivas (106, 105 y 104).
Figura 6. Inóculos de E. coli (a), S. aureus (b), Salmonella (c) y Turbidez estándar Mac Farland #4 (A y B)
b
A B
a c d
a b d c
26
Para la inoculación se tomaron las diluciones pares (108, 106 y 104) y se
sembró 0.1 ml en Agar Muller-Hinton por la técnica de extensión con perlas
de vidrio estériles como indica la Figura 7a y 7b.
Figura 7. Técnica de sembrado por extensión con perlas de vidrio (a) y (b)
Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) usando el método
de las diluciones seriadas (Sánchez et al., 2013). Se probaron
concentraciones de 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 29 ppm de plata coloidal. Se aplicó
el método del disco ensayo (Faria et al., 1998) utilizando discos estériles, se
empleó el método Kirby-Bauer indicado para determinar antibiosensibilidad
según el National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS), los
discos fueron impregnados de plata coloidal con las diferentes
concentraciones tal como indica la Figura 8, y se usó como muestra control
un disco impregnado de agua destilada estéril. Los ensayos se realizaron
por triplicado.
Para la preparación de los discos se utilizó papel secante perforado con un
sacabocados (de la Cruz et al., 1984) obteniéndose discos de 7 mm de
diámetro que se colocaron en recipientes de vidrio y fueron esterilizados.
a b
27
Figura 8. Colocación de antibiogramas en el medio de cultivo
Las muestras se incubaron a 37°C durante 24 horas como indica la Figura
9a. Transcurrido este tiempo se realizó la medición del halo de inhibición
dado por las diferentes dosis de plata coloidal y las distintas concentraciones
bacterianas. Para medir los halos inhibitorios se utilizó un calibrador como
muestra la Figura 9b.
Figura 9. Muestras incubadas a 37°C (a) y Halo inhibitorio medido con calibrador (b)
3.4 APLICACIÓN DE PLATA COLOIDAL EN CARNE VACUNA
(BIOENSAYO)
Se realizaron cortes de pulpa redonda/blanca fresca de carne de res en
cubos de 2.5 cm3 y se procedió a sumergirla en una solución bacteriana (E.
a b
28
coli, Salmonella, S. aureus) correspondientes al patrón Mac Farland #4 (12
x 108 UFC/ml) durante 15 minutos. Posteriormente se procedió a colocar la
CMI (determinada según el procedimiento de la sección 3.3.3) de plata
coloidal por aspersión. Las muestras se colocaron en bolsas plásticas
estériles y se almacenaron en refrigeración. Cada 4 días durante 12 días se
realizaron recuentos de las bacterias ensayadas y se midió el color
superficial de la carne. Todos los ensayos fueron comparados con
muestras control (cubos de carne de res sin aplicación de plata coloidal).
3.4.1 RECUENTO DE BACTERIAS PATÓGENAS EN CARNE VACUNA
Se tomaron muestras de carne los días 0, 4, 8 y 12 de almacenamiento
refrigerado. Se pesaron 10g de carne vacuna (dilución 10-1) inoculada con
las diferentes bacterias y tratada con plata coloidal, y se colocaron en 90ml
de agua destilada estéril y se homogenizó. A partir de esta dilución se
realizaron diluciones sucesivas (10-2, 10-3, 10-4 y 10-5) en tubos de ensayo
que contenían 9ml de agua destilada estéril. Los tubos se homogenizaron
utilizando un vortex y se tomó 0.1 ml y se inoculó por extensión con perlas
de vidrio estériles en agar Chromocult para E. coli; BSA para Salmonella y
Agar Baird Parker para S. aureus. Las muestras se incubaron a 37°C
durante 24 horas. Se realizó el recuento de las colonias características en
cada medio de cultivo. El crecimiento de las bacterias patógenas inoculadas
artificialmente en la carne se comparó con una población control cuyos
valores se obtuvieron utilizando microbiología predictiva a través del
software Combase Predictor según la metodología utilizada por Auz, (2013).
29
3.4.2 EFECTO DE LA PLATA COLOIDAL SOBRE LA MICROFLORA
NATIVA DE LA CARNE VACUNA.
Se utilizó pulpa blanca de carne de res adquirida en el mercado local. Se
cortó en cubos y se almacenó durante 9 días en refrigeración. Las muestras
se dividieron en tres partes: carne sin ningún tratamiento, carne con
aplicación de agua destilada y carne con aplicación de plata coloidal (29
ppm).
Se aplicó un método estándar para el recuento de aerobios mesófilos totales
utilizando agar plate count (PCA), se incubó durante 24 horas a 37°C.
3.4.3 EFECTO DE LA PLATA COLOIDAL SOBRE EL COLOR
SUPERFICIAL Y pH DE LA CARNE VACUNA.
Para la medición del color se utilizó el colorímetro (Konica Minolta CR-400)
como muestra la Figura 10. Se evaluó el efecto de la aplicación de plata
coloidal en muestras control (carne sin aplicación de plata coloidal) y
tratadas (carne con plata coloidal) luego de 12 días de almacenamiento
refrigerado. Se midieron los parámetros del color: luminosidad (L), matiz
(ángulo Hue) y cromaticidad (Cr*).
30
Figura 10. Colorímetro (Konica Minolta CR-400)
La determinación del pH se realizó según la norma NTE INEN 783 1985. Se
utilizó un medidor del pH (Thermoscientific) que fue introducido en una
solución que contenía 25g de carne vacuna homogenizada con 100 ml de
agua destilada como detalla la Figura 11.
Figura 11. Determinación del pH según norma (NTE INEN 783, 1985)
31
3.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados de las diferentes dosis de plata coloidal en el ensayo in vitro y
la aplicación de la CIM en carne vacuna (bioensayo) se compararon a través
de un análisis de varianza, empleando la prueba de rangos múltiples de
Tukey, con una significancia de 0.05% usando el paquete estadístico
INFOSTAT versión estudiantil.
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
32
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 DETERMINACION DE LA CMI DE PLATA COLOIDAL
(ENSAYO IN VITRO)
Las cepas de bacterias utilizadas en el presente trabajo de investigación
(Escherichia coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus) son
representativas de la flora bacteriana patógena que pueden estar presentes
en la carne fresca vacuna. Estos microorganismos son los responsables de
los cambios físico-químicos de la carne y con ello causantes de
enfermedades de transmisión alimentaria sean intoxicaciones o infecciones.
Los cultivos de Escherichia coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus
en agar Muller Hinton presentaron claros halos de inhibición producidos por
el efecto antibacteriano de la plata coloidal como indica la Figura 12.
Figura 12. Halos inhibición producidos por plata coloidal (21 ppm) sobre cultivos de (a) E. coli, (b) Salmonella y (c) S. aureus luego 24 horas de
incubación a 37°C.
Se probaron siete dosis diferentes de plata coloidal: 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 29
ppm para establecer su efecto microbicida. Como se puede observar en la
Tabla 3, la inhibición de la plata coloidal varió según el tipo de bacteria y la
A C B
33
población bacteriana. Los discos control (impregnados con agua destilada
estéril) no presentaron en ningún caso halos de inhibición como muestra la
Figura 13. En todos los casos, la dosis de 3 ppm de plata coloidal solamente
inhibió en el área del disco impregnado.
A B C
Figura 13. Cultivo de (A) E. coli disco control sin halo de inhibición, Cultivo de (B) Salmonella disco control sin halo de inhibición y Cultivo de (C) S.
aureus disco control sin halo inhibitorio.
34
Tabla 3. Halo de inhibición (mm) producido por la plata coloidal sobre el crecimiento de E. coli, Salmonella y S. aureus.
Microorganismo Concentración de plata coloidal (ppm)
3 5 7 10 14 21 29
UFC/ml Halo de inhibición (mm)
E. coli
108 7.,00c
7.,00c
9.,00b
9.,66b
11.,50a
10.,83a
11.,00a
106 7.,00
d 7.,00
d 7.,33
d 9.,67
c 10.,00
c 12.,83
a 11.,33
b
104 7.,00
c 7.,00
c 7.,00
c 7.,00
c 11.,83
b 14.,00
a 13.,83
a
Salmonella
108 7.,00c
7.,00c
7.,00c
7.,00c
9.,75b 9.,83b 12.,67a
106 7.,00
c 7.,00
c 7.,00
c 7.,00
c 9.,67
b 11.,17
a 11.,17
a
104 7.,00
d 7.,00
d 7.,00
d 7.,00
d 9.,17
c 11.,00
b 12.,67
a
S. aureus
108 7.,00e
9.,66d
9.,00d
9.,53d
10.,83c
12.,75b
13.,67a
106 7.,00
d 7.,00
d 7.,00
d 9.,66
c 11.,33
b 14.,17
a 14.,83
a
104 7.,00
d 7.,00
c 7.,00
c 7.,00
c 7.,00
c 17.,17
a 15.,57
b
A partir de la concentración de 7 hasta 29 ppm se encontró un incremento
del halo de inhibición en función del incremento de la concentración de plata
coloidal. Mientras que a medida que se disminuyó la población bacteriana se
observó un mayor halo de inhibición con todas las concentraciones de plata
coloidal ensayadas. La destrucción de microorganismos y la inhibición de su
crecimiento dependen de varios factores como el tamaño de la población, es
así que una población mayor requerirá mayor tiempo para morir que una
población más pequeña (Kenneth et al., 2005). Además, la concentración o
intensidad de un agente antimicrobiano guarda una relación directa con el
efecto de control del crecimiento microbiano, es decir que a mayor
concentración del agente mayor inhibición (Kenneth et al., 2005).
No se encontró diferencia significativa entre los halos de inhibición de las
concentraciones de 14, 21 y 29 ppm de plata coloidal aplicadas en el cultivo
de E. coli de concentración 10^8 ufc/ml. Los mayores halos de inhibición en
cultivos de Salmonella se encontraron con el uso de 29ppm de plata coloidal
en las tres concentraciones de células (10^8, 10^6 y 10^4 ufc/ml). Para una
35
población de S. aures de 10^6 y 10^4 ufc/ml, una concentración de plata
coloidal de 21 ppm produjo mayor efecto inhibitorio, mientras que para la
población de 10^8 se encontró mayor inhibición con la aplicación de 29 ppm
de plata coloidal.
Soluciones de nanopartículas de plata menores a 10nm probaron tener un
efecto bactericida en cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y
Pseudomonas aeruginosa (Khaydarov, 2009) el efecto causado estaría
relacionado con el daño de la membrana celular y penetración de las
partículas de plata en el interior de la célula. El uso de microscopia óptica de
barrido electrónico confocal permite observar estos cambios en las
estructuras celulares. La estabilidad y actividad antimicrobiana de la plata
coloidal se probó durante dos años, debiéndose mencionar que para la
obtención de nanopartículas se utilizó reducción química del nitrato de plata
en presencia de un estabilizador (Nazar, 2007), a diferencia de este estudio
donde las partículas de Ag se liberan cargadas eléctricamente por
electrólisis en un medio acuoso estéril.
La diferencia de la respuesta de un microorganismo frente a un agente
antimicrobiano estaría relacionada con la activación de genes que
potencialmente expresen mecanismos como respuesta evolutiva a la
intervención humana (Cabrera et al., 2007); la concentración del agente
antimicrobiano es un factor que influye sobre la eficacia del mismo (Kenneth
et al., 2005). Estudios realizados con iones de plata y nanopartículas
muestran que 15 ppm de iones de plata son más efectivas que
concentraciones superiores a 190 ppm de nanopartículas (The Silver
Institute, 2013).
El uso de sustancias en dosis subterapeúticas para el tratamiento de una
infección produce el desarrollo de resistencia a estas sustancias por parte de
los microorganismos, por ello es muy importante determinar la dosis efectiva
para el control del crecimiento de microorganismos (Faria et al., 1998). Al
analizar el efecto de la plata coloidal sobre la población 10^8 de cada
bacteria, y al no encontrarse diferencia significativa entre los halos de
36
inhibición de E coli producido por las dosis de 14, 21 y 29 ppm de plata
coloidal, al igual que las dosis de 21 y 29 ppm sobre Salmonella y siendo la
dosis de 29 ppm la que produjo mayor inhibición de S. aureus, se seleccionó
esta concentración (29 ppm) para realizar los bioensayos.
4.2 APLICACIÓN DE PLATA COLOIDAL EN CARNE VACUNA
(BIOENSAYO)
Durante 12 días de almacenamiento se realizaron recuentos de E. coli,
Salmonella y S. aureus inoculadas artificialmente y tratadas con plata
coloidal. En la Figura 14a, se observan las colonias características de E. coli
en agar Chromocult que corresponden a colonias con un color púrpura en el
borde y en el centro un color oscuro brillante; en la Figura 14b se observan
colonias de Salmonella en agar bismuto sulfito, de color verde oscuro
metálico y alrededor un halo con un tono más bajo; y en la Figura 14c las
colonias de S. aureus en agar Baird Parker presentan colonias con centro
negro y un halo transparente alrededor.
Estas características de las colonias se tomaron en cuenta para realizar el
recuento de las diferentes bacterias durante 12 días de almacenamiento
refrigerado.
Figura 14. Colonias típicas de (a) E. coli en agar Chromocult, (b) Salmonella en agar bismuto sulfito y (c) S. aureus en agar Baird Parker luego de 24h de
incubación a 37°C.
a c b
37
La bacteria E. coli inoculada artificialmente en la carne presentó una
población inicial de 5.8 log UFC/ml, luego de la aplicación de la plata coloidal
(29 ppm) y posterior incubación y almacenamiento en refrigeración la
población se mantuvo prácticamente constante como muestra la Figura 15a,
presentando en el día 12 (288 horas) una población de 5.76 log UFC/ml. Con
la misma población inicial y utilizando el software de predicción de
crecimiento microbiano se puede observar que en 12 días la población de E.
coli alcanza un valor de 8.70 log/ml.
La carne inoculada artificialmente con Salmonella y tratada con plata coloidal
(29 ppm) presentó una reducción de 0.53 unidades logarítmicas luego del
almacenamiento refrigerado (288 horas), a diferencia de que la carne sin
tratamiento presentaría luego al final del almacenamiento un incremento de
2.1 unidades logarítmicas como lo indica la Figura 15b.
La aplicación de 29ppm de plata coloidal sobre una población de 4.6 log
UFC/ml de S. aureus como indica la Figura 15c, permitió un incremento de
0.15 unidades logarítmicas, presentando al final del almacenamiento (12
días) una población de 4.76 log ufc/ml mientras que la carne sin aplicación
de plata coloidal habría presentado un incremento de 2 unidades
logarítmicas en 10 días.
Según Kenneth et al (2005), los agentes químicos de control de crecimiento
de bacterias pueden clasificarse como bactericidas (producen la muerte de
la bacteria) o bacteriostáticos (no produce la muerte de la bacteria sin
embargo impide su reproducción). La plata coloidal (29 ppm) estaría
ejerciendo un efecto bacteriostático frente a E. coli, Salmonella y S. aureus
ya que las poblaciones bacterianas se mantienen prácticamente constantes
a lo largo del tiempo de almacenamiento. Esto se puede deber a la carga
bacteriana sumamente concentrada de las bacterias aplicadas en la carne
(12x108UFC/ml).
38
Figura 15. Crecimiento de (a) E. coli, (b) Salmonella y (c) S. aureus en carne vacuna tratada con 29 ppm plata coloidal (línea roja) y predicción de su crecimiento en ausencia de plata coloidal usando el software Combase Predictor (línea azul) durante 12 días de almacenamiento refrigerado
39
La adición de preservantes con actividad antimicrobiana es una práctica
común en la industria de alimentos. Las sustancias más utilizadas son: sales
de los ácidos benzoico y sórbico, los compuestos de amonio cuaternario, los
ésteres del ácido parahidroxibenzoico (parabenos), fenoles (Lemus &
Hernández, 2007). Se ha probado el uso de ácido láctico, ácido
peroxiacético e hipoclorito de sodio en la desinfección de canales bovinas,
de éstos se encontró mayor efecto del ácido láctico sobre E. coli, y bacterias
como Salmonella no se vieron afectadas por ninguno de los tres ácidos
ensayados (Montero, 2009). Es así que la comprobación del efecto
bacteriostático de la plata coloidal sería una alternativa al uso de estas
sustancias en la industria de productos cárnicos.
4.3 EFECTO DE LA PLATA COLOIDAL SOBRE LA
MICROFLORA NATIVA DE LA CARNE VACUNA.
Existen numerosos estudios con el uso de sustancias con actividad
antimicrobiana con ensayos in vitro (Ramírez et al., 2012; Alzamora et al.,
2001;Guzmán et al., 2011; Lemus & Hernández, 2007); la realización de
bioensayos permite un aproximación más cercana al efecto real de una
sustancia frente a la flora nativa de un alimento. Son escasos los estudios
realizados como bioensayos, es decir la aplicación directa sustancias
antimicrobianas en alimentos (Vásquez, et al., 2009; Urrego et al., 2005).
En la carne se desarrolla una flora miscelánea, debido principalmente del
potencial redox del producto, favoreciendo el crecimiento de
microorganismos proteolíticos de géneros como Escherichia, Aeromonas,
Proteus, Enterobacter, Staphylococcus, Micrococcus y Bacillus, cuando el
producto se encuentra en refrigeración predomina el género Pseudomonas
(Mossel et al., 2003), también pueden encontrarse bacterias de los géneros
Alcaligenes, Acinetobacter, Moraxella y Aeromonas. El crecimiento de las
40
bacterias propias de la carne reducen la vida útil del producto (Percival,
2004).
Se realizó recuento del número total de unidades formadoras de colonias
(UFC) al inicio y al final del almacenamiento refrigerado para muestras de
carne control y muestras tratadas (29 ppm plata coloidal). Como se puede
observar en la Tabla 4 luego de 12 días de almacenamiento las muestras
control presentaron un incremento de 2.3 unidades logarítmicos a diferencia
de las muestras tratadas que presentaron 1.9 unidades logarítmicos más
que al inicio del ensayo. El retraso en el crecimiento bacteriano permite
obtener un producto con mayor vida media de la carne, sin embargo hacen
falta estudios para dilucidar el efecto de esta sustancia sobre la célula
bacteriana.
Tabla 4. Recuento de aerobios mesófilos totales en muestras de carne vacuna control (0 ppm) y tratadas (29 ppm plata coloidal) al inicio y final del
almacenamiento refrigerado
Muestra
Tiempo de almacenamiento
(días)
0 12
Log UFC/g
Control (0 ppm ) 4.8 7.1
Tratada (29 ppm) 4.6 6.5
4.4 EFECTO DE LA PLATA COLOIDAL SOBRE EL COLOR
SUPERFICIAL Y pH DE LA CARNE VACUNA
La plata coloidal tiene un amplio uso médico como se ha indicado
anteriormente, su aplicación sin control puede provocar entre otros efectos
41
secundarios argiria (color grisáceo en la piel por acumulación de plata en las
células). Por otro lado, existen presentaciones comerciales de plata coloidal
(0.36%) para uso industrial y casero para la desinfección de agua de bebida,
para el lavado de frutas y verduras, lavado de carne, pescado y mariscos
(Goetsch, 2013) sin reportarse efectos sobre las características
organolépticas de estos productos.
El color es la característica sensorial más importante en el momento de
decisión de compra de la carne cruda (Depetris, 2005). En la Tabla 5 se
presentan los resultados de los parámetros de color medidos en carne
control y tratada (29 ppm plata coloidal) luego de 12 días de almacenamiento
refrigerado. La aplicación de la plata coloidal no produjo cambios en los
valores de L y Hue, se encontró diferencia significativa en los valores de Cr
de la carne. No se encontró diferencia significativa en los valores de pH de
las muestras control y tratadas.
Tabla 5. Medición del color de muestras de carne vacuna control (0 ppm) y
tratadas (29 ppm plata coloidal) en el transcurso de 12 días de almacenamiento en refrigeración
Parámetros de
color
Plata coloidal
Control(0 ppm) Tratada (29ppm) Δ CT
C T
L*
h
c*
35.5a
35.3a
15.04b
31.8b
30.7b
19.81a
-3.7
-4.6
4.77
pH 6.52a 6.34a
Jara (2007) indica que las mediciones de color de la carne deben asociarse
con el pH. El color de la carne cruda depende de varios factores ante y post
mortem, por ejemplo la nutrición animal, velocidad de enfriamiento de la
canal, pH del músculo, tiempo y temperatura de almacenamiento, humedad,
concentración de mioglobina, entre otros (Braña et al., 2011). La plata
42
coloidal no produjo cambios en el pH de la carne pero influyó sobre los
parámetros color L*, H* y c*. Para ΔL se observó una disminución de
luminosidad en 3.7 unidades, para ΔHue una disminución de 4.6 unidades
en el tono del color y para ΔC* hubo un aumento de 4.7 unidades es decir
que el color superficial de la carne se hizo más intenso. En general, la
aplicación de la plata coloidal en la carne redujo el crecimiento de la flora
nativa, influyó sobre el color superficial y no alteró el pH de la carne de res.
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
43
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
Los cultivos de Escherichia coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus
presentaron claros halos de inhibición producidos por el efecto
antibacteriano de la plata coloidal en el ensayo in vitro. Se probaron siete
dosis diferentes de plata coloidal: 3, 5, 7, 10, 14, 21 y 29 ppm y se
seleccionó la dosis de 29 ppm como la concentración mínima inhibitoria
frente a estas bacterias patógenas frecuentemente asociadas con el
consumo de carne contaminada.
La aplicación de la CMI de plata coloidal (29 ppm) en carne inoculada
artificialmente con Escherichia coli, Salmonella typhi y Staphylococcus
aureus (bioensayo) permitió confirmar el efecto bacterióstico de la plata
coloidal al comparar el crecimiento de estas bacterias en muestras tratadas
(determinado usando técnicas de microbiología clásica) y controles
(aplicando microbiología predictiva).
La aplicación de la plata coloidal (29 ppm) en carne vacuna produjo el
retraso del crecimiento microbiano (microflora nativa). Luego de 12 días de
almacenamiento las muestras control presentaron un incremento de 2.3
unidades logarítmicas a diferencia de las muestras tratadas que presentaron
1.9 unidades logarítmicas más que al inicio del ensayo. El retraso en el
crecimiento bacteriano permite obtener un producto con mayor vida media
de la carne, sin embargo hacen falta estudios para dilucidar el efecto de esta
sustancia sobre la célula bacteriana.
La plata coloidal no produjo cambios en el pH de la carne y tampoco influyó
sobre los parámetros color L y Hue, excepto Cr* en el que se observó un
incremento, es decir que el color superficial de la carne se hizo más intenso.
44
En general, la aplicación de la plata coloidal en la carne no produjo cambios
en las características físicas del producto.
Los resultados globales indican que la plata coloidal usada en una
concentración de 29 ppm constituye una alternativa al uso de sustancias
como el ácido láctico para la desinfección superficial de canales de carne
vacuna, sin embargo hacen falta estudios para evaluar las tecnologías de
aplicación que puede ser por inmersión o aspersión.
45
5.2 RECOMENDACIONES
Aplicar tratamientos de plata coloidal a lo largo de la cadena de
procesamiento de carne vacuna no solo en el producto final, con el fin
de reducir la contaminación y obtener productos con mayor vida de
anaquel.
Realizar experimentos con otros tipos de microorganismos presentes
en alimentos, con el fin de comprobar la eficacia microbicida de la
plata coloidal como antibiótico natural.
Evaluar el tiempo de vida útil sensorial de la carne sometida a
solución coloidal de plata (14ppm).
Realizar investigaciones que permitan descartar efectos tóxicos en la
aplicación de plata en estado coloidal, como método de
conservación.
BIBLIOGRAFÍA
46
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Obelisco.
ANEXOS
52
ANEXOS
ANEXO I
PREPARACIÓN DE CEPAS
o Se procedió a esterilizar la superficie de trabajo, para lo cual se limpió
con alcohol y se encendió los mecheros de bunsen con el fin de que
otorguen un ambiente seguro de trabajo y protejan al ambiente en
caso de una contaminación con los patógenos con los que se
experimentó.
o Se esterilizó el aza de digralsky, colocándola en la llama del mechero
unos pocos segundos al rojo vivo, se esperó que se enfríe y se la
introdujo al recipiente que contenía la cepa de E.coli, se sembró
mediante picadura mediante leves movimientos de izquierda a
derecha en un tubo que contenía 10 ml de agar TSB, con la
precaución de sacar el aza de siembra por el mismo trayecto por el
cual fue introducida. Se realizó el mismo procedimiento para las
cepas de S. aureus y S. typhi.
o Al momento de abrir y al momento de cerrar los tubos que contenían
tanto el medio de cultivo TSB como los que contenían las
enterobacterias, se procedió a hacer el flameado de la boca de los
tubos.
o Todo el procedimiento se realizó bajo presencia de calor dado por los
mecheros de bunsen.
o Se incubó a 37°C durante 24 horas los tres tubos sembrados con las
cepas de enterobacterias.
53
ANEXO II
AJUSTE DE LA TURBIDEZ
Se utilizó tubos de ensayo estériles de 7.5cm de largo y con tapa rosca los
cuales contenían las cepas de enterobacterias y S. aureus previamente
activadas. A partir del tubo patrón Mc Farland #4 se realizó la medición por
triplicado de la absorbancia a 640nm para lo cual se utilizó el
espectrofotómetro, obteniendo una media de 0.755 y este valor fue utilizado
como referencia para determinar la misma absorbancia para los tubos con E.
coli, Salmonella y S. aureus. Para disminuir o aumentar el valor de la
absorbancia se utilizó agua destilada estéril y las cepas de enterobacterias y
S. aureus respectivamente. Una vez obtenida la misma absorbancia que el
tubo patrón las cepas de E. coli, Salmonella y S. aureus quedaron
estandarizadas.
54
ANEXO III
(Comisión Chilena, 2014)
África 479 2%
Oceanía y otros 1935 8%
Europa 3269 13%
Asia 5325 21%
Norteamérica 7014 27%
Sudamérica 7471 29%
Producción mundial (T) de plata por región
