UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA DE ... ·...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS “AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL GRANO DE QUINUA (Chenopodium quinoa Willd) ECUATORIANA, VARIEDAD INIAP- TUNKAHUÁN” Autor: Darwin Ramiro Taco Chisaguano [email protected] Trabajo de investigación para optar por el título profesional de QUÍMICO DE ALIMENTOS Tutora: Dra. Verónica Taco MSc. [email protected] Quito, Junio 2016
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
“AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL GRANO DE
QUINUA (Chenopodium quinoa Willd) ECUATORIANA, VARIEDAD INIAP-
TUNKAHUÁN”
Autor: Darwin Ramiro Taco Chisaguano
Trabajo de investigación para optar por el título profesional de
QUÍMICO DE ALIMENTOS
Tutora: Dra. Verónica Taco MSc.
Quito, Junio 2016
i
Darwin Ramiro Taco Chisaguano (2016). ‘‘Aislamiento y
caracterización de las proteínas del grano de Quinua
(Chenopodium quinoa Willd) ecuatoriana, variedad INIAP
Tunkahuán”. Trabajo de investigación para optar el grado de
Químico de Alimentos. Carrera de Química de Alimentos.
Quito: UCE. 102p.
ii
DEDICATORIA
A mis queridos padres, Jorge y Yolanda, quienes me han apoyado con consejos a lo largo de
mis estudios.
A mis hermanos, Maritza, David y Alexandra, que han estado a mi lado en los momentos de
felicidad y tristeza.
A Stephanie Mora, quien ha sido una persona importante en mi vida, como apoyo y
compañía en todo momento.
iii
AGRADECIMIENTO
Gracias a Dios por darme la oportunidad de culminar una etapa más en mis estudios y de
regalarme una familia maravillosa ya que gracias a ellos lo pude lograr.
A mis padres que han sido un ejemplo de vida y me han sabido guiar a lo largo de mi vida
como estudiante estando presentes en los éxitos y en los fracasos.
A mis maestros que me brindaron sus conocimientos de esta manera ser un profesional día a
día.
A la Universidad Central del Ecuador y a la Facultad de Ciencias Químicas que me acogieron
durante mi vida universitaria.
A Stephanie Mora quien me apoyo en los momentos que más necesite y a quien debo en parte
la culminación de mi carrera.
A mi tutora la Doctora Verónica Taco quien me supo guiar para la realización de este trabajo.
A mis compañeros de clase que hicieron más amenos los años en la universidad.
iv
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA QUÍMICA DE ALIMENTOS
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Por la presente, dejo constancia que he leído el Trabajo de investigación presentado por el señor
DARWIN RAMIRO TACO CHISAGUANO para optar por el título profesional Química de
Alimentos cuyo tema es ‘‘Aislamiento y caracterización de las proteínas del grano de Quinua
(Chenopodium quinoa Willd) ecuatoriana, variedad INIAP Tunkahuán”, la misma que reúne
los requerimientos, y los méritos suficientes para ser sometido a evaluación por el Tribunal
Calificador.
En la ciudad de Quito, a los 5 días del mes de Abril de 2016
----------------------------------------------
Dra. Verónica Taco Taco
CI 1719308056
v
vi
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA QUÍMICA DE ALIMENTOS
CESIÓN DE DERECHOS
Yo DARWIN RAMIRO TACO CHISAGUANO declaro conocer y aceptar la disposición del
Artículo 215, numerales 3 y 8 del Estatuto de la Universidad Central del Ecuador que señala:
"El patrimonio de la Universidad Central está constituido por:
Las publicaciones, memorias, obras de arte, tesis, investigaciones científicas y tecnológicas, y
lo que a futuro produjere.
Los beneficios provenientes de inversiones, investigación, prestación y venta de servicios,
portadas, marcas y otros conceptos".
Autorizo a la Universidad Central del Ecuador la difusión de mi tesis para fines académicos,
respetando mis derechos de autor de conformidad con la Ley de Propiedad Intelectual.
DARWIN RAMIRO TACO CHISAGUANO
CI 172009191-5
vii
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
El tema de investigación “Aislamiento y caracterización de las proteínas del grano de Quinua
(Chenopodium quinoa Willd) ecuatoriana, variedad INIAP Tunkahuán” se llevó a cabo en las
instalaciones de los laboratorios de Análisis de Alimentos, en el de Oferta de Servicios y
Productos de la Facultad de Ciencias Químicas, en el Centro Internacional de Zoonosis y en el
laboratorio de Productos Naturales de Posgrado de la Universidad Central del Ecuador.
viii
CONTENIDO
DEDICATORIA ........................................................................................................................ ii
AGRADECIMIENTO ............................................................................................................. iii
CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR ................................................................ iv
CESIÓN DE DERECHOS ........................................................................................................ vi
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN....................................................... vii
CONTENIDO ........................................................................................................................ viii
ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................................. xii
ÍNDICE DE FIGURAS.......................................................................................................... xiii
ÍNDICE DE GRÁFICOS ........................................................................................................ xiv
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................ xv
RESUMEN ............................................................................................................................. xvi
ABSTRACT ........................................................................................................................... xvii
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 1
CAPÍTULO I ............................................................................................................................. 3
EL PROBLEMA ........................................................................................................................ 3
1.1. Planteamiento del problema ........................................................................................ 3
1.2. Formulación del problema .......................................................................................... 3
1.3. Preguntas directrices ................................................................................................... 3
1.4. Objetivos ..................................................................................................................... 4
1.4.1. Objetivo general: .................................................................................................. 4
1.4.2. Objetivos específicos: .......................................................................................... 4
1.5. Justificación e importancia .......................................................................................... 4
CAPÍTULO II ............................................................................................................................ 7
MARCO TEÓRICO................................................................................................................... 7
2.1. Antecedentes ............................................................................................................... 7
2.2. Fundamentación teórica .............................................................................................. 8
ix
2.2.1. Pseudocereales ..................................................................................................... 8
2.2.2. Quinua (Chenopodium quinoa)............................................................................ 8
2.2.3. Proteínas ............................................................................................................. 14
2.2.4. Análisis bromatológico del grano de quinua ..................................................... 20
2.2.5. Análisis en los aislados proteicos ...................................................................... 24
2.3. Fundamento Legal ..................................................................................................... 28
2.4. Hipótesis: ................................................................................................................... 29
2.4.1. Hipótesis de trabajo (Hi): ...................................................................................... 29
2.4.2. Hipótesis nula (Ho):............................................................................................... 29
2.5. Sistema de Variables ................................................................................................. 29
CAPÍTULO III ......................................................................................................................... 30
METODOLOGÍA .................................................................................................................... 30
3.1. Diseño de la investigación......................................................................................... 30
3.2. Población y muestra .................................................................................................. 30
3.2.1. Población............................................................................................................ 30
3.2.2. Muestra .............................................................................................................. 30
3.3. Diseño experimental .................................................................................................. 30
3.4. Matriz de operacionalización de las variables........................................................... 34
3.5. Técnicas e instrumentos de recolección de datos validez y confiabilidad ................ 34
3.5.1. Primera etapa: Acondicionamiento de la muestra ............................................. 34
3.5.2. Segunda etapa: Obtención de la harina desengrasada y aislado proteico .......... 39
3.5.3. Tercera etapa: Caracterización de los aislados proteicos ................................... 39
3.6. Técnicas de procesamiento y análisis de datos ......................................................... 43
CAPÍTULO IV......................................................................................................................... 44
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS .................................................................... 44
4.1. Resultados ................................................................................................................. 44
4.1.1. Primera etapa: Acondicionamiento de la muestra ............................................. 44
x
4.1.2. Segunda etapa: Obtención de la harina desengrasada y aislado proteico .......... 44
4.1.3. Tercera etapa: Caracterización de los aislados proteicos ................................... 46
CAPÍTULO V .......................................................................................................................... 53
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...................................................................... 53
5.1. Conclusiones ................................................................................................................. 53
5.2. Recomendaciones ......................................................................................................... 54
REFERENCIAS ....................................................................................................................... 55
ANEXOS ................................................................................................................................... 1
Anexo 1 .................................................................................................................................. 2
Alimentos que más contribuyen al consumo de energía y proteína................................... 2
Anexo 2 .................................................................................................................................. 3
Anexo 3 .................................................................................................................................. 4
Apertura de la malla de los Tamices .................................................................................. 4
Anexo 4 .................................................................................................................................. 5
Tamaño de partícula para la harina de quinua ................................................................... 5
Anexo 5 .................................................................................................................................. 6
Resultados del análisis bromatológico ............................................................................... 6
Anexo 6 .................................................................................................................................. 7
Norma Técnica Ecuatoriana: Quinua-Requisitos............................................................... 7
Anexo 7 .................................................................................................................................... 15
Norma Harina de origen vegetal. Determinación del tamaño de partículas .................... 15
Anexo 8 ................................................................................................................................ 21
Galería de fotos: ............................................................................................................... 21
Primera etapa: Acondicionamiento de la muestra ........................................................... 21
Anexo 9 ................................................................................................................................ 23
Segunda etapa: Obtención del aislado proteico de la harina de quinua ........................... 23
Anexo 10 .............................................................................................................................. 25
xi
Tercera etapa: Caracterización de los aislados proteicos ................................................. 25
xii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Comparación de los perfiles de aminoácidos esenciales de la quinua ........................ 10
Tabla 2 Características ambientales de la quinua variedad INIAP-Tunkahuán ...................... 12
Tabla 3 Características nutricionales y de calidad del grano de quinua .................................. 13
Tabla 4 Contenido de aminoácidos en la harina de Quinua ..................................................... 14
Tabla 5 Operacionalización de las variables ............................................................................ 34
Tabla 6 Soluciones para electroforesis .................................................................................... 41
Tabla 7 Preparación de los geles concentrador y separador para electroforesis ...................... 42
Tabla 8 Comparación de resultados del análisis bromatológico .............................................. 47
Tabla 9 Contenido de proteína total en los aislados proteicos AP1 y AP2 .............................. 47
Tabla 10 Contenido de proteína soluble en los aislados proteicos AP1 y AP2 ....................... 49
Tabla 11 Determinación de compuestos fenólicos totales en los aislados proteicos ............... 50
Tabla 12 Resultados tamaño de partícula para la harina de quinua ........................................... 5
Tabla 13 Análisis bromatológico de la harina de quinua ........................................................... 6
xiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Fenotipo de la variedad Tunkahuán. Estado fisiológico, madurez ............................ 11
Figura 2 Enlace peptídico ........................................................................................................ 16
Figura 3 Esquema del equipo de extracción Söxhlet ............................................................... 22
Figura 4 Acción de los antioxidantes fenólicos ....................................................................... 24
Figura 5 Reacción de Biuret .................................................................................................... 25
Figura 6 Electroforesis en gel de poliacrilamida ..................................................................... 27
Figura 7 Método aislamiento proteico sin tratamiento ácido previo P1 .................................. 32
Figura 8 Método aislamiento proteico con tratamiento ácido previo P2 ................................. 33
Figura 9 Equipo de extracción de grasa ................................................................................... 37
Figura 10 Solubilidad de las proteínas pH 11 .......................................................................... 45
Figura 11 Proteínas solubilizadas ............................................................................................ 45
Figura 12 Aislados proteicos ................................................................................................... 46
Figura 13 Perfil electroforético SDS-PAGE (aislados proteicos)............................................ 52
Figura 14 Distribución geográfica de la producción mundial de quinua ................................... 3
Figura 15 Apertura de malla de los tamices............................................................................... 4
Figura 16 Recepción de la materia prima ................................................................................ 21
Figura 17 Homogenización de la muestra ............................................................................... 21
Figura 18 Molida de los granos ............................................................................................... 21
Figura 19 Tamizado de la harina de quinua ............................................................................. 21
Figura 20 Extracción de grasa.................................................................................................. 22
Figura 21 Determinación de la humedad ................................................................................ 22
Figura 22 Determinación de cenizas ........................................................................................ 22
Figura 23 Determinación de proteína total .............................................................................. 22
Figura 24 Solubilización de las proteínas ................................................................................ 23
Figura 25 Solubilización de las proteínas por dos métodos diferentes .................................... 23
Figura 26 Separación de las proteínas solubles ....................................................................... 23
Figura 27 Precipitación isoeléctrica ......................................................................................... 23
Figura 28 Separación del precipitado ...................................................................................... 24
Figura 29 Determinación de grasa en los aislados proteicos ................................................... 25
Figura 30 Determinación de proteína ...................................................................................... 25
Figura 31 Determinación de compuestos fenólicos ................................................................. 25
Figura 32 Preparación de las muestras para la electroforesis .................................................. 25
xiv
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Solubilidad proteica en función del pH del medio .................................................. 18
Gráfico 2 Alimentos que más contribuyen al consumo de proteínas ......................................... 2
Gráfico 3 Alimentos que más contribuyen al consumo total diario de energía ......................... 2
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
AP1 Aislado proteico procedimiento uno
AP1I Aislado proteico procedimiento dos
BSA Albúmina Sérica Bovina
FAO Organización de Agricultura y Alimentos
INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización
INIAP Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias
P1 Procedimiento uno
P2 Procedimiento dos
PAGE Por sus siglas en ingles polyacrylamide gel electrophoresis (Electroforesis en gel
de poliacrilamida)
PI Punto isoeléctrico
PRONALEG Programa Nacional de Leguminosas y Granos Andinos
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
St Estándar
xvi
RESUMEN
El presente trabajo de investigación se centró en la obtención del aislado proteico del grano de
quinua (Chenopodium quinoa Willd) ecuatoriana variedad INIAP-Tunkahuán.
El aislamiento de las proteínas se realizó a partir de la harina de quinua desengrasada (método
Söxhlet). Se solubilizaron las proteínas a pH alcalino (11), seguido por su precipitación a pH
ácido (4,5).
Se utilizaron dos procedimientos para obtener el aislado proteico, con el fin de verificar la
remoción de compuestos fenólicos, cuya presencia en el aislado podría conferirle
características organolépticas indeseables. El primer procedimiento consistió en realizar la
solubilización alcalina seguida por la precipitación ácida de las proteínas y en el segundo se
incrementó un pretratamiento ácido, seguidos de la solubilización y precipitación con el fin de
remover los compuestos fenólicos.
Los resultados mostraron que el contenido de proteína total en los granos de quinua fue del
14%, mientras que, en el aislado proteico fue del 70%, independientemente del procedimiento
de aislamiento usado con un nivel de confianza del 95%.
De forma similar se observó que el contenido de proteínas solubles (método de Biuret) de los
aislados proteicos obtenidos por ambos procedimientos fue del 66% con un α = 0,05, esos
resultados evidenciaron que el pretratamiento ácido no afecta el contenido de proteína total y
proteínas solubles extraídas.
Por otro lado el contenido de compuestos fenólicos (método de Folin-Ciocalteu) del aislado
proteico obtenido sin el pretratamiento ácido fue 2,7 veces mayor en comparación con el
procedimiento con pretratamiento ácido, lo que significa que un tratamiento ácido previo
remueve a los compuestos fenólicos, cuya presencia modificó el color de los aislados proteicos
obtenidos.
Finalmente, la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE
por sus siglas en inglés), con el sistema Tris-Tricina, mostró que la mayor proporción de las
proteínas de los aislados tienen pesos moleculares por debajo de los 171 kDa, que corresponden
a proteínas globulares, básicamente se extraen las mismas proteínas en los dos procedimientos
estudiados.
PALABRAS CLAVE: quinua, aislado proteico, proteína soluble, compuestos fenólicos
xvii
ABSTRACT
This research work focused on obtaining a protein isolate from Ecuadorian quinoa
(Chenopodium quinoa Willd) of the INIAP-Tunkahuán variety.
The protein was extracted from degreased quinoa flour (Söxhlet method), after which they were
solubilized in alkaline pH (11) and precipitated in acidic pH (4,5).
Two procedures were used in this study in order to obtain the protein isolate, removing phenolic
compounds that could have unwanted effects on the isolate. The first procedure consisted on
conducting an alkaline solubilization of the proteins, followed by an acidic precipitation; the
second consisted on adding an acidic pretreatment, followed by protein solubilization and
precipitation, in order to remove phenolic compounds.
The results show that the total protein content in quinoa grains was 14%, whereas the isolate
had a 70% concentration, independent of the isolation procedure employed; confidence level
was 95%.
Similarly, the soluble protein content (Biuret method) in the isolates, in both procedures, was
66%, with α = 0,05. These results suggest that acidic pretreatment does not affect overall and
soluble protein concentrations.
On the other hand, the amount of phenolic compounds (Folin-Ciocalteu method) in the protein
isolate was 2,7 times higher when there was no acidic pretreatment, compared to the procedure
that does include acidic pretreatment. This means that previous acidic treatment removes
phenolic compounds, which affected the color of the protein isolates.
Finally, this study ran a Tris-Tricine SDS-PAGE, which indicated that the highest portion of
isolated proteins have molecular weights below 171kDa, making them globular proteins.
Basically, the same proteins were extracted in both procedures.
KEYWORDS: QUINOA/ PROTEIN ISOLATE/ SOLUBLE PROTEIN/ PHENOLIC
COMPOUNDS.
I CERTIFY that the above and foregoing is a true and correct translation of the original document in Spanish. Silvia Donoso Acosta Certified Translator ID.: 0601890544
1
INTRODUCCIÓN
Se ha visto en la actualidad el desarrollo de productos proteicos a partir de fuentes vegetales
para el consumo humano, ya sea por un menor costo con relación a las proteínas de origen
animal (Salgado, 2009), o dado por casos de personas que tienen intolerancia a la leche y alergia
a proteínas de origen animal (Castel, 2010).
Una fuente proteica alternativa de alto valor nutricional es la quinua debido a que reúne 16 de
los 20 aminoácidos que forman las proteínas (Villacrés, Peralta, Egas, & Mazon, 2011), por lo
que se ha comprobado que el valor proteico de la quinua es muy cercano al de la leche (Wahli,
2002).
En Ecuador, específicamente, en el Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias
(INIAP), se han realizado estudios de mejoramiento que han llevado al desarrollo de variedades
con buenas características nutricionales y agronómicas, dado que la quinua como producto
industrial ha ido ganando espacio a nivel mundial (Villacrés, Peralta, Egas, & Mazon, 2011),
en 1986 el INIAP entregó las primeras variedades mejoradas INIAP-Imbaya e INIAP-
Cochasquílas, los cuales eran altas en contenido de saponinas, posteriormente se desarrollaron
variedades dulces, (con bajo contenido de saponinas), INIAP-Ingapirca e INIAP-Tunkahuán
(Villacrés, Peralta, Egas, & Mazon, 2011).
La quinua ecuatoriana variedad INIAP-Tunkahuán, es una de las variedades más cultivadas y
comercializadas, (Egas, E, Salazar, Peralta, & Ruilova, 2010), ya que, ha sido modificada para
soportar plagas y cuyo contenido de saponinas es bajo (Nieto, Vimos, Monteros, Caicedo, &
Rivera, 1992). Las saponinas son las responsables del sabor amargo y la generación de espuma
en la quinua (Peralta, 2009).
El grano de quinua contiene de 12 a 16% de proteína (Peralta, 2010; Rivera, 2006; Silva, 2006),
las albúminas y las globulinas constituyen la mayor fracción proteica (del 44 al 77% de proteína
total) y las prolaminas están en menor porcentaje (0,5 a 7,0%) (Koziol, 1992). Un subproducto
en el aislamiento de las proteínas de la quinua son los compuestos fenólicos, los cuales
interactúan con las proteínas de bajo peso molecular, este tipo de uniones pueden alterar la
calidad de dichas proteínas (Salgado, 2009).
Estudios realizados en granos de amaranto y girasol muestran que el aislamiento de proteínas
mediante precipitación isoeléctrica con un tratamiento ácido previo lograron disminuir la
2
cantidad de fenoles, favoreciendo a la conservación de características organolépticas de calidad
de los aislados proteicos obtenidos (Castel, 2010; Salgado, 2009).
El objetivo de esta investigación fue obtener un aislado proteico de los granos de quinua usando
el método de precipitación isoeléctrica, contrastando dos procedimientos para remover los
compuestos fenólicos del aislado proteico sin alterar a las proteínas de la quinua.
3
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
1.1.Planteamiento del problema
Dada la gran demanda que existe en la actualidad de tener una gama extensa de productos
alimenticios que posean una alta calidad proteica, nace la necesidad de ofertar nuevos
ingredientes para la elaboración de productos para grupos específicos, tales como vegetarianos,
deportistas de alto rendimiento o las personas en general que deseen optar por una fuente de
proteína diferente a las de origen animal. Estudios demuestran que los deportistas de fuerza y
potencia presentan unos requerimientos diarios mayores de proteínas (Bean, 2005), así mismo
otra tendencia observada es que cada vez, más personas tienden a consumir alimentos más
saludables, o que les puedan ayudar a prevenir enfermedades reemplazando ingredientes
tradicionales como las proteínas cárnicas por nuevas opciones como son las proteínas vegetales
(Castel, 2010).
Una etapa crítica, en la obtención del aislado proteico de origen vegetal usando el método de
precipitación isoeléctrica es que, se observó que junto con las proteínas también se extraen
compuestos fenólicos que dieron características organolépticas objetables en los productos
alimenticios (Castel, 2010).
Por lo que surge la necesidad de contrastar dos procedimientos para la obtención de aislados
basados en la modificación del pH del medio, para afectar la solubilidad y lograr la remoción
de compuestos fenólicos del aislado proteico de la quinua sin alterar a las proteínas aisladas.
1.2.Formulación del problema
¿La utilización de dos procedimientos de extracción por precipitación isoeléctrica con y sin
pretratamiento ácido, afectará al contenido de proteínas, compuestos fenólicos y perfil
electroforético de los aislados obtenidos?
1.3.Preguntas directrices
¿Es posible obtener la harina desengrasada del grano de quinua ecuatoriana
(Chenopodium quinoa Willd), variedad INIAP-Tunkahuán, usando el método
Söxhlet, para acondicionar la muestra previo al aislamiento de las proteínas?
4
¿Es posible aislar las proteínas de la harina de quinua desengrasada mediante el
método de precipitación isoeléctrica con y sin pretratamiento ácido para remover
los compuestos fenólicos?
¿Se podrá cuantificar el porcentaje de proteínas totales, solubles y compuestos
fenólicos en los aislados proteicos, usando los métodos de Kjeldahl, Biuret y Folin-
Ciocalteu, para determinar el efecto del pretratamiento ácido sobre la cantidad de
proteína y el grado de remoción de compuestos fenólicos de los aislados?
¿Se podrá determinar el perfil electroforético de los aislados proteicos de la quinua
para conocer el efecto del pretratamiento ácido sobre las proteínas aisladas?
1.4.Objetivos
1.4.1. Objetivo general:
Aislar y caracterizar las proteínas del grano de quinua (Chenopodium quinoa Willd)
ecuatoriana, variedad INIAP-Tunkahuán”
1.4.2. Objetivos específicos:
Obtener la harina desengrasada del grano de quinua ecuatoriana (Chenopodium
quinoa Willd), variedad INIAP-Tunkahuán, usando el método Söxhlet, para
acondicionar la muestra previo al aislamiento de las proteínas.
Aislar las proteínas de la harina de quinua desengrasada mediante el método de
precipitación isoeléctrica con y sin pretratamiento ácido para remover los
compuestos fenólicos.
Cuantificar el contenido de proteínas totales, solubles y compuestos fenólicos en los
aislados proteicos, usando los métodos de Kjeldahl, Biuret y Folin- Ciocalteu, para
determinar el efecto del pretratamiento ácido sobre la cantidad de las proteínas y el
grado de remoción de compuestos fenólicos de los aislados.
Determinar el perfil electroforético de los aislados proteicos de la quinua para
conocer el efecto del pretratamiento ácido sobre las proteínas aisladas.
1.5.Justificación e importancia
La quinua es un pseudocereal cultivado desde tiempos remotos por los Incas y es considerado
por la FAO como un alimento perfecto, la quinua se la ha seleccionado como uno de los
5
cereales destinados para contribuir con la seguridad alimentaria en el siglo XXI, la proteína de
los granos de quinua va de 10 a 16% dependiendo de la variedad empleada (Elsohaimy, Refaay,
& Zaytoun, 2015).
En la actualidad la quinua está en un rápido proceso de expansión y representa un gran
potencial para mejorar las condiciones de vida de la población rural, donde se cultiva, y del
mundo moderno (Rojas, Alanda, Irigoyen, & Blajos, 2011).
La FAO conjuntamente con el Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca
(MAGAP), desde el 2005 viene impulsando proyectos de fomento de la producción de quinua
en las provincias de Carchi, Cotopaxi, Bolívar, Pichincha e Imbabura, sobretodo de la variedad
INIAP-Tunkahuán; la cual es la variedad que más se cultiva en el país (Peralta, 2009).
En el Ecuador, la quinua es consumida en forma de productos como son: fideos de pasta corta,
quinua fermentada, galletas, sopas instantáneas, bebidas a base de quinua malteada, expandidos
de quinua y barras energéticas (Mazón, Peralta, Villacrés, Rivera, & Subía, 2009). Sin embrago
existen otros productos de alto valor agregado como los suplementos alimenticios, en el cual,
uno de los componentes son las proteínas aisladas.
El método más utilizado para aislar proteínas, de matrices como la quinua, es el de precipitación
isoeléctrica. Se conoce que empleando este método junto con el aislado proteico también se
extraen compuestos fenólicos que podrían conferir a los aislados características objetables. Una
forma de remover los compuestos fenólicos, es utilizando un pretratamiento ácido previo a la
precipitación isoeléctrica de las proteínas sin alterarlas.
La caracterización y cuantificación de proteínas en los aislados proteicos es de relevante
importancia puesto que al variar el procedimiento de extracción de proteínas, puede efectuarse
una disminución en la cantidad de compuestos fenólicos (evitando la formación de complejos
indeseados como los de proteínas-fenoles que provocan cambios en color, sabor, etc.), una
disminución en el rendimiento de extracción y/o una desnaturalización proteica.
El aislado proteico del grano de quinua podría ser usado como un nuevo ingrediente para la
elaboración de productos alimenticios con alto valor agregado, como se han desarrollado
productos a base de proteína de soya, de esta manera se puede aumentar el consumo y promover
el cambio de la matriz productiva debido al aumento en la comercialización de la quinua y de
6
esta manera aumentando las exportaciones a Estados Unidos, Colombia, Unión Europea y
Japón (Peralta, Mazón, Murillo, Rivera, & Monar, 2008).
Las proteínas poseen propiedades nutricionales, además de sus componentes se obtienen
moléculas nitrogenadas, las cuales permiten conservar la estructura y el crecimiento de sus
consumidores, lo cual es de mucha importancia desde el punto de vista nutricional; además
como ingredientes de productos alimenticios ayudan a establecer la estructura y las propiedades
finales del alimento (Badui, 2006).
7
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1.Antecedentes
En el Ecuador se encuentran escasos estudios sobre la obtención de aislados proteicos del grano
de quinua y su aprovechamiento para el desarrollo de productos funcionales a base de las
proteínas de quinua.
La composición química del grano de quinua es: proteínas 15,73%, cenizas 2,57%, grasa
6,11%, fibra bruta 6,22% y carbohidratos 69,37%, además calcio 0,07%, fósforo 0,35,
magnesio 0,19%, sodio 0,01%, potasio 0,66%, hierro 95 ppm, manganeso 22 ppm, zinc 75 ppm
y cobre 8 ppm (Peralta, 2010).
Estudios realizados en quinua en el 2006 por Silva y Rivera obtuvieron aislados proteicos a
partir del grano de quinua mediante extracción a pH 11 y pH 9 respectivamente. El contenido
de proteínas totales en dichos aislados fueron 83,5 y 77,2% respectivamente, mediante
electroforesis determinaron que las albúminas y las globulinas fueron las proteínas mayoritarias
en el aislado proteico, ambas estabilizadas por puentes disulfuro, las cuales tienen una
abundancia de albúminas (31%) y globulinas (37%), la solubilidad de la proteína tuvo un
máximo en ambos estudios a un pH 11 con 41,4% y 94,6% respectivamente (Silva, 2006;
Rivera, 2006).
Elsohaimy, Refaay, & Zaytoun en el 2015 determinaron las condiciones óptimas para la
obtención del aislado de proteína de granos de quinua, se investigó las propiedades físico-
químicas y funcionales de las proteínas aisladas. El aislado de proteína de quinua se obtuvo
mediante la solubilidad de la proteína a valores de pH entre 5 y 10. En la electroforesis en gel
de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico SDS se mostró bandas de proteína con pesos
moleculares de 85 kDa las cuales no se encontraron en todos los valores de pH (5, 6, 7, 8, 9 y
10), mientras que las proteínas de pesos moleculares de 55 kDa correspondiente a la globulina
y las proteínas de 33 kDa correspondiente a la proteína de quinua se encontró en todos los
valores de pH. (Elsohaimy, Refaay, & Zaytoun, 2015).
Castel en el 2010 obtuvo un aislado de proteínas del grano de amaranto (Amaranthus
mantegazzianus) por el método de precipitación isoeléctrica, la concentración proteica fue del
8
73,1%, en la electroforesis SDS-PAGE la mayoría de las bandas fueron de 56,4; 37,2; 35,3;
28,6; 27,2 y 26,2 kDa, bandas menores de 87,9; 51,8; 40,5; 33,1; 23,1 y 21,5 kDa y un grupo
de bandas infinitas de 20 a 14 kDa, se usó un tratamiento ácido para separar los compuestos
fenólicos, para muestra aislada por precipitación isoeléctrica sin tratamiento ácido se obtuvo
2,51 mg ácido gálico/mg de muestra mientras que para la muestra aislada por precipitación
isoeléctrica con tratamiento ácido se obtuvo 1,16 mg de ácido gálico/mg de muestra, con lo
que se demostró que con una extracción ácida inicial, en el método alternativo, logra separar y
concentrar una gran cantidad de compuestos fenólicos en la fracción soluble (Castel, 2010).
2.2.Fundamentación teórica
2.2.1. Pseudocereales
Los pseudocereales, no pertenecen a las gramíneas, y poseen hojas muy anchas. Sin embargo,
producen granos y semillas similares a las de las gramíneas, por eso, desde la antigüedad, han
sido usados de igual forma que las primeras: molidas, como harina y en una variedad de
productos, como por ejemplo, el pan. (Espores, 2014).
2.2.2. Quinua (Chenopodium quinoa)
“Su nombre científico es Chenopodium quinoa Willd, cuya familia es Chenopodiaceae también
se la conoce como: kiuna, parca, supha, jopa, jupha, quinhua, quínua, quinua, kinoa, sweet
quinua, white quinua, peruvian rice, inca rice” (Silva, 2006), tiene una antigüedad, por lo
menos, de 5000 años desde que se la ha cultivado (Repo & Encina, 2008), es un nutritivo
pseudocereal que se cultivó y cuyo origen tiene en la región andina, se utilizó ampliamente en
la alimentación de los pueblos incas (Peralta, 1985), en algunos casos inclusive remplazaba por
completo las proteínas de origen animal en la dieta (Koziol, 1992), el cultivo de este
pseudocereal disminuyó después de la conquista española, a medida que fueron ingresando
cereales como son el arroz, trigo y la cebada (Wahli, 2002), su grano está libre de gluten por lo
que se considera fácil de digerir (Hemalatha, Pedenla, V., & Sreerama, 2015).
Desde un punto de vista botánico, podemos decir que los cereales son plantas que producen
sus granos en espigas, con hojas largas y angostas, entre estas tenemos la cebada y el trigo,
pero la quinua produce hojas anchas con formas de triángulos o corazón y panojas en lugar de
espigas pero se forman granos, la quinua pertenece a la familia Quenopodiaceas, mientras que
los cereales a la familia de las Gramíneas (Nieto & Fisher, 1990).
9
La quinua es una planta herbácea, su raíz es pivotante con ramificaciones sencillas y alcanza
una profundidad hasta aproximadamente los 60 cm, la altura de la planta varía entre los 90 y
180 cm, el tallo es redondo con aristas con un color del tallo juvenil de verde claro, el tipo de
panoja es glomerular con un tamaño de 20 a 60 cm, el tamaño del grano es aproximadamente
de 2,1 mm de diámetro y 1 mm de espesor, el color de la semilla es blanco (Peralta, 2010).
El cultivo de quinua puede crecer en grandes altitudes, soportar heladas adaptándose mejor que
otras plantas, los periodos vegetativos que presenta la planta supera los 150 días (Egas, E,
Salazar, Peralta, & Ruilova, 2010), una ventaja que tiene la planta de quinua es que de sus
partes se aprovecha el tallo y las hojas, por su alto contenido en fibra, son buenos para hacer
que los animales ganen peso y produzcan más leche (Rivera, 2006).
En Ecuador, en las provincias de Carchi, Imbabura, Pichincha, Cotopaxi y Chimborazo son las
de mayor producción, los granos de quinua son de tamaño mediano, de sabor dulce y con un
contenido de saponinas menor al 0,1% (Egas, E, Salazar, Peralta, & Ruilova, 2010).
La quinua se caracteriza no por su cantidad de proteína (14% y 18%), si no por su calidad en
las proteínas (Terán, 2008), este se debe a que contiene 16 de los 20 aminoácidos existentes
(Villacrés, Peralta, Egas, & Mazon, 2011), entre estos la cistina, tirosina y el triptófano. La
quinua es considerada como el alimento más completo dentro de los vegetales, su valor
nutricional es comparable con los alimentos de origen animal como la carne, leche o huevos
(Nieto & Fisher, 1990).
La calidad más alta de una proteína se determina por su alto valor biológico, alta digestibilidad
y un alto score de aminoácidos; el score de una proteína, refleja su contenido en aminoácidos
(AA) en comparación con la proteína ideal. La relación de aminoácidos (mg de un aminoácido
esencial en 1.0 g de proteína de referencia/mg del mismo aminoácido en 1.0 g del patrón de
referencia) de cada uno de los 9 aminoácidos esenciales, más tirosina y cistina, es calculada de
acuerdo al informe FAO/OMS/UNU (1985); como se puede ver en la tabla 1, el grano de
quinua comparándola con otros alimentos como el maíz, arroz y el trigo, no tiene aminoácido
limitante lo cual demuestra que la quinua tiene una alta calidad proteica (Suárez, Kizlansky, &
López, 2006) (Koziol, 1992).
10
Tabla 1 Comparación de los perfiles de aminoácidos esenciales de la quinua
FAOa Quinuab Maízb Arrozb Trigob
Isoleucina 3,0 4,9 4,0 4,1 4,2
Leucina 6,1 6,6 12,5 8,2 6,8
Lisina 4,8 6,0 2,9 3,8 2,6
Metioninac 2,3 5,3 4,0 3,6 3,7
Fenilalaninad 4,1 6,9 8,6 10,5 8,2
Treonina 2,5 3,7 3,8 3,8 2,8
Triptófano 0,66 0,9 0,7 1,1 1,2
Valina 4,0 4,5 5,0 6,1 4,4
a Patrones de puntuación de los aminoácidos para niños de edades comprendidas entre los 3 y 10 años, adoptados por
la FAO (2013), Dietary protein quality evaluation in human nutrition, Reporta f and FAO Expert Consultation. Roma.
b Koziol (1992)
c Metionina + cisteína
d Fenilalanina + tirosina
Fuente: (Koziol, 1992)
El INIAP, a partir de 1967 con el Programa de Introducción de Nuevos Cultivos Económicos
de la Sierra, comenzó a buscar nuevas fuentes de proteína para la alimentación humana y
animal (Peralta, 2009-2011), en el Ecuador se comenzó por el rescate de este grano andino
junto con el chocho y el amaranto desde el año 1983 (Peralta, 2010), en 1986 por medio del
Programa de Cultivos Andinos se presentan dos variedades mejoradas de quinua INIAP-
Cochasqui e INIAP-Imbaya (Nieto & Fisher, 1990).
En 1992 el INIAP presenta dos nuevas variedades de quinua INIAP-Tunkahuán e INIAP-
Ingapirca, las cuales son de bajo contenido en saponinas (Peralta, 2009-2011), la variedad
INIAP-Ingapirca, fue originada de una población de germoplasma introducida de la
Universidad Nacional del Altiplano de Puno, Perú en 1980; en Ecuador fue seleccionada en
1983 como material promisorio e introducida en el Banco de Germoplasma del INIAP, como
ECU.0507 (Nieto, Vimos, Monteros, Caicedo, & Rivera, 1992), en la figura 1 se observa el
fenotipo de la variedad INIAP-Tunkahuán en estado de floración. Desde 1992 hasta 1996, esta
variedad fue evaluada en diferentes ambientes de la sierra para ver su adaptabilidad mediante
11
el Programa de Cultivos Andinos, con una adaptabilidad en áreas comprendidas entre 2400 y
3200 metros de altura (Peralta, 2010)
El Programa Nacional de Leguminosas y Granos Andinos (PRONALEG) en el 2007 libera la
variedad INIAP-Pata de venado (Peralta, 2009-2011), esta variedad fue obtenida por
intercambio de germoplasma con Bolivia y el material genético fue registrado en el
Departamento Nacional de Recursos Fotogénicos del INIAP con el código ECU-572, (Mazón,
Peralta, Monar, & Subía, 2008)
De todas las variedades de quinua que se mencionaron, la más abundante y la que más se
comercializa en el Ecuador, es la variedad INIAP-Tunkahuán, en el 2010 se estimó que de
2000 ha de siembra de quinua, el 70% corresponde a la variedad INIAP-Tunkahuán, esta
variedad fue liberada oficialmente como variedad mejorada en 1992 (Peralta, 2010).
Esta variedad se la ha clasificado como variedad de valle, está recomendada que su cultivo se
de en localidades con altitudes menores a los 3400 metros sobre el nivel del mar, así mencionan
(Nieto, Vimos, Monteros, Caicedo, & Rivera, 1992), actualmente se cultiva la variedad desde
Carchi hasta Cañar y se está fomentando el cultivo hacia Azuay y Loja ya que tiene suelo y
clima aptos (Peralta, 2010). En la tabla 2 se muestran las características de adaptación y los
requerimientos ambientales para esta variedad.
Figura 1 Fenotipo de la variedad Tunkahuán. Estado fisiológico,
madurez
Fuente: (Nieto, Vimos, Monteros, Caicedo, & Rivera, 1992)
12
Tabla 2 Características ambientales de la quinua variedad INIAP-Tunkahuán
Fuente: (Nieto, Vimos, Monteros, Caicedo, & Rivera, 1992)
Esta variedad de quinua está clasificada entre las variedades dulces, su color y tamaño son
aceptables ubicándose dentro de las características industriales y de los consumidores, como
establece la Norma Técnica Ecuatoriana INEN 1673:2013, las características nutricionales y
de calidad del grano de quinua INIAP-Tunkahuán se muestran en la tabla 3 (Nieto, Vimos,
Monteros, Caicedo, & Rivera, 1992).
El alto valor nutritivo que tiene el grano de quinua es debido no solo por su composición
química, sino también por la cantidad y calidad de sus proteínas, las cuales fluctúan entre un
12 y 16% (Peralta, 2010). “Es así como, la calidad de las proteínas de quinua es considerada
tan buena o mejor que la caseína, esto, debido al buen balance de los aminoácidos esenciales,
sobresaliendo el triptófano, la cisteína y la metionina. Sin embargo, la mayor importancia
radica en su alto contenido de lisina, un aminoácido deficitario en la mayoría de los vegetales,
especialmente en el trigo” (Silva, 2006).
Esta calidad proteica, en combinación con un contenido de carbohidratos del orden del 60% y
aceites vegetales del orden del 8%, la hacen altamente nutritiva (Nieto & Fisher, 1990).
Característica Variedad INIAP-Tunkahuán
Altitud (m sobre el nivel del mar 3000-3600
Temperatura °C 6-12
Precipitación (mm/año) 400-800
Tolerante a la sequia si
Granizadas* si
Heladas* si
pH del suelo 5,3-7
Vientos ** Tolerante
* Siempre que el fenómeno aparezca después de los 60 días del ciclo
** Pueden producir volcamientos sobre todo cuando está cerca de la cosecha
13
Tabla 3 Características nutricionales y de calidad del grano de quinua
Fuente: (Nieto, Vimos, Monteros, Caicedo, & Rivera, 1992)
En la tabla 3 podemos observar que la harina de quinua tiene un alto contenido en proteínas las
cuales poseen un buen balance de aminoácidos, contiene 16 aminoácidos de los cuales diez son
esenciales, de acuerdo con la tabla 4 los aminoácidos más abundantes son: el ácido glutámico,
la leucina, la arginina, la glicina y el ácido aspártico, estos aminoácidos ayudan a las actividades
de las glándulas endócrinas y formación de esteroles (Araneda, 2004).
Característica Variedad Tunkahuán
Color de grano Blanco
Grano de primera,% 80 a 90
Peso hectolítrico, kg/hl 65
Tamaño de grano, mm 1,7 a 2,1
Contenido de saponina,% 0,06
Deterioro de grano Muy bajo
Forma del grano Redondo aplanado
Proteína total,% 15,73
Grasa,% 6,11
Cenizas,% 2,57
Fibra,% 6,22
Calcio,% 0,10
Fósforo,% 0,35
Potasio,% 0,66
Energía total 4744
14
Tabla 4 Contenido de aminoácidos en la harina de Quinua
Fuente: (Silva, 2006)
El costo de producción de una hectárea de quinua variedad INIAP-Tunkahuán, estimado en
junio del 2010 fue de US$ 1.330,00, con un rendimiento promedio de 2000 kg/ha (44 qq/ha)
(Peralta, 2010).
2.2.3. Proteínas
Entre las diferentes muestras de proteínas podemos encontrar a los aislados y los concentrados
proteicos, cuanto más filtrada o purificada sea la proteína será más aislada o pura, los aislados
Aminoácidos %
Ac. Aspártico 1,3
Ac. Glutámico 3
Serina 0,7
Histidina* 0,4
Glicina 1,2
Treonina* 0,8
Arginina* 1,6
Alanina 0,7
Tirosina 0,6
Valina* 0,9
Metionina* 0,4
Cistina 0,1
Isoleucina* 0,8
Leucina* 1,2
Fenilalanina* 0,8
Lisina* 1
*Aminoácidos esenciales
15
proteicos tienen una concentración de proteínas mayor a 70% y con niveles bajos de grasa y
otras macromoléculas, mientras que los concentrados proteicos tienen una concentración de
proteína menor al 65% y posee niveles altos de otras macromoléculas (Silva, 2006).
Las proteínas son las macromoléculas más versátiles de los seres vivos, constituidos por hasta
21 aminoácidos distintos, un aminoácido es un compuesto que contiene un grupo amino y uno
carboxilo (Colby, 1987) . Los aminoácidos se unen vía enlaces amida sustituidos. A diferencia
de los enlaces glicosídicos y fosfodiéster de los polisacáridos y ácidos nucleicos, los enlaces
amida de las proteínas tienen parcialmente carácter de doble enlace, lo que incrementa la
complejidad estructural de las proteínas, poseen amplios y surtidos grupos funcionales entre
los que se incluyen, tioles, alcoholes, ácidos carboxílicos, tioéteres, carboxiamidas y una serie
de grupos básicos (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003). A nivel elemental las proteínas contienen
50-55% de carbono, 6-7% de hidrógeno, 20-23% de oxígeno, 12-19% de nitrógeno y 0,2-3,0%
de azufre. (Damodaran, Parkin, & Fennema, 2008), en algunas se han encontrado fósforo,
hierro, zinc y cobre (Robinson, 1991).
Las proteínas son las moléculas que más abundan en nuestro organismo, se encuentran en el
interior de las células, siendo importantes para su estructura y función; funcionan como
catalizadores, transportan y almacenan otras moléculas como el oxígeno, por otro lado
proporcionan apoyo mecánico y protección inmunológica (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003),
también son los instrumentos moleculares mediante los cuales se expresa la información
genética (Rivera, 2006), además de esto las proteínas desempeñan una función esencial en la
apetencia del alimento por lo que influye en sus características organolépticas (Salgado, 2009).
De acuerdo a su organización, a las proteínas se las divide en 4 niveles: una estructura primaria
no es más que la secuencia de aminoácidos en una proteína (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003),
o también se la conoce como estructura covalente, la cual va a estar determinada por su
secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica y de la posición de los puentes disulfuro,
la cadena polipeptídica es la unión de varios aminoácidos por medio de enlaces peptídicos,
como se puede ver en la figura 2a la formación de un enlace peptídico, (Laguna & Garza,
2002). La estructura secundaria de una proteína se da por una única cadena polipeptídica como
son la hélice α o por cadenas adyacentes como son las láminas plegadas β, consiste en patrones
regulares de plegamiento, estas uniones se dan por medio de puentes de hidrógeno entre los
grupos NH y CO (Colby, 1987; Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003; Mckee, 2003), estos patrones
se producen cuando todos los ángulos ϕ (fi) (ángulo de rotación alrededor de Cα – C) en un
16
segmento polipeptídico son iguales y todos los ángulos ψ (psi) (ángulo de rotación alrededor
de Cα – N) son iguales, como se muestra en la figura 2b (Mckee, 2003). La hélice α es una
estructura rígida en forma de varilla y se forma cuando la estructura gira a la derecha en la que
el grupo NH de cada enlace peptídico se enlaza al grupo CO del residuo localizado cuatro
posiciones delante de la cadena, en las láminas plegadas β la cadena polipeptídica se encuentra
casi totalmente extendida, estas se forman cuando a los lados de cadenas polipeptídicas se
alinean dos o más segmentos polipeptídicos, cada segmento individual se denomina cadena β
que en lugar de estar enrolladas se encuentran extendidas, las láminas plegadas β están
estabilizadas por enlaces de hidrógeno que se forman entre los grupos N – H y carbonilo del
esqueleto polipeptídico de cadenas adyacentes (Colby, 1987; Mckee, 2003).
A medida que se avanza a lo largo de la molécula, la cadena polipeptídica esta plegada
localmente, formando alguna de las estructuras secundarias que se explicaron (hélice α y
lámina β). Pero para que la estructura sea globular y compacta, estas regiones también deben
plegarse unas sobre otras, con este plegado se da a la molécula una forma tridimensional total
a este plegado se lo denomina estructura terciaria de la proteína (Mathews, Holde, & Ahern,
2004). La estructura terciaria se estabiliza por interacciones hidrófobas, interacciones
Figura 2 Enlace peptídico
a) Formación de un péptido b) Dimensiones de un dipéptido
Fuente: (Mckee, 2003)
17
electrostáticas, enlaces de hidrógeno y enlaces covalentes (Mckee, 2003). La estructura
cuaternaria se refiere al ordenamiento espacial de las subunidades y la naturaleza de sus
interacciones, las proteínas con varias subunidades en las que alguna o todas las subunidades
son idénticas se denominan oligómeros, estos están formados por protómeros que pueden estar
formados por una o varias subunidades. Un gran número de proteínas oligoméricas contienen
dos o cuatro subunidades protoméricas denominadas dímeros y tetrámeros. Las subunidades
polipeptídicas se ensamblan y se mantienen unidas por interacciones no covalentes, como el
efecto hidrófobo, las interacciones electrostáticas, los enlaces de hidrógeno y los
entrecruzamientos covalentes (Mckee, 2003; Colby, 1987; Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003).
Se distinguen, así, entre proteínas globulares y proteína fibrosas. Las proteínas globulares
tienen formas esféricas o elipsoidales resultantes del plegamiento de las cadenas polipeptídicas
sobre sí mismas. En cambio las proteínas fibrosas son moléculas con forma de varilla, formadas
por cadenas polipeptídicas lineales enrolladas (por ejemplo, tropomiosina, colágeno, queratina
y elastina). Las proteínas fibrosas pueden formarse también vía la agregación lineal de
pequeñas proteínas globulares, como sucede en la actina y la fibrina (Damodaran, Parkin, &
Fennema, 2008).
Las albúminas y las globulinas se las clasificaron primero como proteínas globulares en base a
su solubilidad, especialmente en soluciones salinas a distinta concentración (McGilvery R. ,
1977), globulina es un término para un tipo general de proteínas dicho nombre es debido a sus
propiedades como son la solubilidad (McGilvery R. , 1972)
2.2.3.1. Solubilidad de las proteínas
La solubilidad de las proteínas depende de la concentración de sales, pH, temperatura y la
polaridad del solvente, a concentraciones bajas de sal, la solubilidad de las proteínas aumenta,
a concentraciones mayores la solubilidad disminuye provocando la precipitación de las
proteínas (Laguna & Garza, 2002).
De acuerdo a su solubilidad las proteínas vegetales se agrupan de la siguiente manera:
albuminas, solubles en agua; globulinas, solubles en soluciones salinas diluidas; prolaminas,
solubles en alcohol y glutelinas, solubles en soluciones alcalinas o ácidas (Ventureira, 2010).
De acuerdo a esto tenemos:
18
Albúminas solubles a pH 6.6 en agua entre las cuales tenemos la albúmina sérica,
ovoalbúmina y α-lactoalbúmina, cuyos pesos moleculares son 66,399 kDa, 44,55 kDa
kDa y 14,178 kDa respectivamente.
Globulinas solubles a pH 7.0 en soluciones salinas como son la glicinina, faseolina y
β-lactoglobulina (19,363 kDa).
Glutelinas solubles a pH 2.0 en soluciones ácidas y alcalinas a pH 12 como son las
glutelinas de trigo.
Prolaminas son solubles en etanol al 70% como son la zeína, gluten de maíz y gliadinas
del trigo (Badui, 2006).
La solubilidad de las proteínas depende del pH del medio en que se encuentra, en el gráfico 1
se observa que la solubilidad máxima es a pH muy ácido o muy básico, cuando las proteínas
se encuentras en el pH indicado van a presentar carga neta positiva o negativa, la fuerzas de
repulsión que se producen por las cargas que adquieren van a ser las causas en el incremento
de la solubilidad (Salgado, 2009).
Aprovechando la solubilidad de las proteínas una metodología tradicional para la obtención de
concentrados proteicos es la precipitación isoeléctrica (Castel, 2010). Para lo cual primero
tenemos que saber que es el punto isoeléctrico (pI), el punto isoeléctrico de una proteína es el
pH en el que la carga neta es cero (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003), en dicho valor de pH que
Gráfico 1 Solubilidad proteica en función del pH del medio
Fuente: (Salgado, 2009)
19
ocurre esta carga neta se denomina punto isoeléctrico por ejemplo consideremos a la alanina
que es un aminoácido sencillo, que tiene dos grupos titulables, durante la titulación con una
base fuerte como el NaOH, la alanina pierde dos protones de forma escalonada, en una solución
ácida la alanina se encuentra presente fundamentalmente en la forma sin carga en el grupo
carboxilo, en estas circunstancias la carga neta de la molécula es +1 debido a que el grupo
amonio esta protonado, el descenso de la concentración de H+ hace que el grupo carboxilo
pierda su protón y se transforme en un grupo carboxilato con carga negativa, en este punto (pI)
la alanina va a tener carga neta y es eléctricamente neutra (Mckee, 2003). La precipitación
isoeléctrica en las proteínas se va dar cuando la solución alcance el punto isoeléctrico dado que
la solubilidad de la proteína es mayor a pH básico al disminuir el pH la proteína va a tender a
precipitar (Mathews, Holde, & Ahern, 2004).
Como la proteína ya no tiene movimiento en el punto isoeléctrico debido a la neutralidad de su
carga, se utiliza este efecto para poder separar las proteínas en un campo eléctrico según sus
puntos de neutralidad,
Debido al alto valor nutricional, funcionalidad y alto contenido proteico las proteínas vegetales
han aumentado su uso industrialmente (Castel, 2010), por lo que los concentrados proteicos y
como se los obtenga van a influir en el valor nutricional de los productos alimenticos
Estudios epidemiológicos han demostrado que el consumo de alimentos vegetales ha generado
reducción de la aparición de enfermedades crónico-degenerativas, dado que estos alimentos
son fuentes de carotenoides y polifenoles, los cuales actúan como agentes antioxidantes
(Castel, 2010).
Entre los principales compuestos antioxidantes que están en la naturaleza encontramos a los
compuestos fenólicos los cuales provienen de las plantas, los cuales son generados por las
plantas como defensas hacia los agentes agresores como son la radiación ultravioleta, la
temperatura, los patógenos etc. (Castel, 2010), en química son sustancias que poseen en su
estructura anillos bencénicos asociados a grupos hidroxilos en posiciones diferentes (Taiz &
Zeiger, 2006).
La mayor parte de los compuestos fenólicos se encuentran en las capas externas de los granos,
los cuales van actuar como protectores contra patógenos y pestes, siendo los principales fenoles
presentes en los cereales son los ácidos fenólicos, los taninos y flavonoides este último en
menor cantidad (Castel, 2010), los granos de quinua contienen varios compuestos fenólicos
20
tales como la quercentina, kaempferol y rutina y sus derivados, ácido vanílico, ácido ferúlico
y el ácido 4-glucosido (Hemalatha, Pedenla, V., & Sreerama, 2015).
Con el tratamiento ácido empleado previo a la precipitación isoeléctrica se disuelven
compuestos polares entre ellos los fenoles estos se extraen al separar la parte soluble de la
insoluble por centrifugación con lo que se obtiene un concentrado proteico con menor cantidad
de compuestos fenólicos (Castel, 2010).
2.2.3.2. Desnaturalización de las proteínas
Considerando las pequeñas diferencias de energía libre de las proteínas plegadas y desplegadas,
no es de sorprenderse que la estructura proteica sea especialmente sensible a los factores del
entorno (Mckee, 2003), estos pueden ser la temperatura alta, el pH extremo o la presencia de
solventes orgánicos que debilitan las interacciones no covalentes (Colby, 1987). El proceso de
destrucción de la estructura se denomina desnaturalización un ejemplo de la desnaturalización
tenemos la albúmina del huevo (clara de huevo) soluble y transparente se hace insoluble y
opaca tras calentarla, la mayoría de las desnaturalizaciones son irreversibles. Las principales
condiciones desnaturalizantes son: ácidos y bases fuertes, disolventes orgánicos, detergentes,
agentes reductores, concentración salina, iones metálicos pesados, cambios de temperatura y
la agresión mecánica (Mckee, 2003; Mathews, Holde, & Ahern, 2004; Berg, Tymoczko, &
Stryer, 2003).
En la desnaturalización de las proteínas la estructura se aleja de su forma nativa dado por el
cambio en su formación tridimensional o una pérdida de la estructura ordenada, el cambio de
pH en el ambiente puede ocasionar cambios en la ionización de las cadenas laterales ya que se
afecta el número de puentes salinos que son los encargados de estabilizar la estructura primaria
(Badui, 2006)
2.2.4. Análisis bromatológico del grano de quinua
2.2.4.1. Determinación del contenido de humedad
La determinación de secado en estufa se basa en la pérdida de peso de la muestra por
evaporación del agua. Para esto se requiere que la muestra sea térmicamente estable y que no
contenga una cantidad significativa de compuestos volátiles (Nollet, 1996).
21
El principio operacional del método de determinación de humedad utilizando estufa y una
balanza analítica, incluye la preparación de la muestra, pesado, secado, enfriado y pesado
nuevamente de la muestra (Nollet, 1996).
2.2.4.2. Determinación del contenido de cenizas
Se determinan por incineración de la muestra, en un crisol de platino, a una temperatura ente
600-700 °C, esto hace que la materia orgánica se carbonice y luego se oxida dando CO2, H2O,
N2O, NO, SO2, etc., y los elementos minerales quedan como ceniza blanca que se pesa. Las
sales que se descomponen al calcinar, como los carbohidratos, se transforman en óxidos de
caracteres básicos y valorables por alcalimetría. Las sales de ácidos orgánicos también dan,
finalmente, óxidos básicos. En cambio los cloruros, sulfatos, fosfatos, etc., de Na, K, Ca, etc.,
quedan en las cenizas inalterados. La basicidad de las cenizas da una idea de la proporción
entre sales orgánicas más carbohidratos y las otras sales inorgánicas, es típica para cada
alimento y puede utilizarse, en muchos casos, para detectar fraudes.
El análisis de las cenizas sirve también para conocer el contenido en elementos esenciales de
un alimento (Yúfera, 1998).
2.2.4.3. Determinación del contenido de grasa (método de Söxhlet)
Es una extracción semicontinua con un disolvente orgánico. En este método el disolvente se
calienta, se volatiliza y condensa goteando sobre la muestra la cual queda sumergida en el
disolvente. Posteriormente éste es sifoneado al matraz de calentamiento para empezar de nuevo
el proceso. El contenido de grasa se cuantifica por diferencia de peso, el diagrama del equipo
empleado para este método se presenta en la figura 3 (Nielsen, 2003).
22
2.2.4.4. Determinación de fibra bruta
Se determina atacando la muestra, sucesivamente, con HCl y NaOH, en caliente, hasta dejar
solo la parte no digerible, que es, principalmente, celulosa y parte de lignina como
lignocelulosa, lo cual representa la parte fibrosa e indigerible de los alimentos.
Para una mayor exactitud la muestra se incinera para descontar las cenizas que van a
corresponder la parte de minerales presentes, se debe tomar en cuenta que se debe confundir la
fibra cruda con la fibra dietética, fisiológicamente importante, ya que está formado por
hemicelulosas y pectinas que no se digieren en el intestino humano y sin embargo se hacen
solubles en el proceso del análisis de fibra cruda (Yúfera, 1998).
2.2.4.5. Determinación del contenido de proteína total por el método Kjeldahl
Se determina valorando el nitrógeno total por el método Kjeldahl y multiplicando por un factor
que va a depender del producto analizado, así por ejemplo para el trigo se usa el factor 5,83, ya
que la proteína de trigo contiene un promedio del 17,15% de nitrógeno (100/17,5=5,83). Todos
los compuestos nitrogenados existentes en la muestra (aminoácidos, sales amónicas, aminas,
etc.) se dan en este método empírico y convencional, como proteínas (Yúfera, 1998).
Figura 3 Esquema del equipo de
extracción Söxhlet
Fuente: (Nielsen, 2003)
23
El método Kjeldahl se basa en la destrucción de la materia orgánica, en medio fuertemente
ácido y oxidante, de modo que todo el N que contiene se transforma en sulfato amónico, y el
C, H y S, son oxidados a CO2, H2O y SO2 (Yúfera, 1998).
Durante el proceso de descomposición ocurre la deshidratación y carbonización de la materia
orgánica combinada con la oxidación de carbono a dióxido de carbono. El nitrógeno orgánico
es transformado a amoniaco que se retiene en la disolución como sulfato de amonio. La
recuperación del nitrógeno y velocidad del proceso pueden ser incrementados adicionando
sales que abaten la temperatura de descomposición (sulfato de potasio) o por la adición de
oxidantes (peróxido de hidrógeno, tetracloruro, persulfatos o ácido crómico) y por la adición
de un catalizador (Nollet, 1996).
El método de Kjeldahl consta de las siguientes etapas:
a) Digestión Proteína(ac) + H2SO4(ac) → CO2(g) + (NH4)2SO4(ac) + SO2(g)
b) Destilación (NH4)2SO4(ac) + 2NaOH(ac) → Na2SO4(ac) + NH3(g)+ H2O(l)
(Recibiendo en HCl)
(Recibiendo en H3BO3) NH3(g) + H3BO3(l) → NH4H2BO3(ac)
c) Titulación
(si se recibió en HCl) NH4Cl(ac) + HCl(ac) + NaOH(l) → NH4Cl(ac) + NaCl(ac) + H2O(l)
(si se recibió en H3BO3) NH4H2BO3(ac) + HCl(ac) → H3BO3(ac) + NH4Cl(ac)
En la mezcla de digestión se incluye sulfato sódico para aumentar el punto de ebullición y un
catalizador para acelerar la reacción, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en el destilado se
retiene o bien por un ácido normalizado y se valora por retroceso, o en ácido bórico y valora
directamente. El método Kjeldahl no determina, sin embargo, todas las formas de nitrógeno a
menos que se modifiquen adecuadamente; esto incluye nitratos y nitritos (Pearson, 1993).
24
2.2.5. Análisis en los aislados proteicos
2.2.5.1. Determinación de compuestos fenólicos
Los fenoles son compuestos químicos que se encuentran ampliamente distribuidos en las
plantas. Los tres grupos más importantes son los flavonoides, los ácidos fenólicos y los
polifenoles, siendo el primero uno de los más estudiados, los fenoles son también antioxidantes
y atrapan radicales libres, previniendo que éstos se unan y dañen las moléculas de ácido
desoxirribonucleico (Repo & Encina, 2008).
La capacidad antioxidante de los compuestos fenólicos se debe principalmente a sus
propiedades reductoras y estructura química, los antioxidantes fenólicos interfieren en la
oxidación lipídica por la rápida donación de átomos de hidrogeno a los radicales libres como
se puede ver en las siguientes reacciones (Castel, 2010).
ROO• + ArOH → ROOH + ArO•
RO• + ArOH→ ROH + ArO•
Los radicales intermedios formados por la acción antioxidante de los fenólicos son
relativamente estables, debido a la resonancia del anillo aromático (figura 4) presente en la
estructura de estas sustancias (Castel, 2010).
Para el análisis de compuestos fenólicos se usa el método de Folin-Ciocalteu. El método de
Folin-Ciocalteu se basa en la capacidad de los fenoles para reaccionar con agentes oxidantes.
Figura 4 Acción de los antioxidantes fenólicos
Fuente: (Castel, 2010)
25
El reactivo de Folin-Ciocalteu contiene molibdato y tungstato sódico, que reaccionan con
cualquier tipo de fenol, formando complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico. La transferencia
de electrones a pH básico reduce los complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico en óxidos,
cromógenos de color azul intenso, de tungsteno (W8O23) y molibdeno (Mo8O23), siendo
proporcional este color al número de grupos hidroxilo de la molécula (Gutierrez, Ortiz, &
Cisneros, 2008). Este método cuantifica el contenido de compuestos fenólicos totales como
ácido gálico. (Nieto & Fisher, 1990)
2.2.5.2. Cuantificación del contenido de proteínas (Biuret)
El método Biuret es la técnica más simple para la determinación de proteínas solubles. Las
sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos (aspargina, glutamina) forman un
complejo purpura-violeta con sales de cobre (II) alcalinas como se muestra en el figura 5, es
posible que el color se desarrolle por la formación de ion coordinado, tetracúprico, con dos
grupos amida adyacentes (Herrera, Bolaños, & Giselle, 2003).
El desarrollo del color es diferente para cada proteína y su intensidad se la puede determinar
espectroscópicamente a una longitud de onda de 540 nm. La cuantificación de las proteínas se
lleva a cabo con una curva patrón, utilizando el principio establecido por la ley de Beer. Existen
pocas interferencias en esta determinación, entre ellas la presencia de ion amonio altera el
desarrollo del color; algunos pigmentos absorben a la misma longitud de onda, algunos lípidos
Figura 5 Reacción de Biuret
Formación del compuesto coordinado en la determinación de
proteínas por el método Biuret
Fuente: (Herrera, Bolaños, & Giselle, 2003)
26
y carbohidratos son capaces de formar complejos con el ion coordinado (Herrera, Bolaños, &
Giselle, 2003).
2.2.5.3. Determinación del perfil electroforético
La electroforesis es el proceso mediante el cual las proteínas migran de acuerdo a su carga en
un campo eléctrico. Esta técnica es de interés especial como método analítico, ya que permite
determinar el número de proteínas diferentes en una preparación, así como estimar el peso
molecular o el punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se lleva a cabo en un gel formado
por un polímero entrecruzado (poliacrilamida), que actúa como un tamiz, disminuyendo la
migración de las proteínas en función de su carga y peso molecular (Laguna & Garza, 2002;
Murray, y otros, 2013).
Una molécula con una carga eléctrica neta se desplazará en un campo eléctrico. Este fenómeno,
llamado electroforesis, ofrece un procedimiento poderoso para separar proteínas y otras
macromoléculas, como el ADN y el ARN. La velocidad de migración, v, de una proteína en un
campo eléctrico depende de la fuerza de ese campo eléctrico, E, la carga neta de la proteína, z,
y el coeficiente de fricción, f (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003).
La fuerza eléctrica, Ez, que arrastra a la molécula cargada hacia el electrodo de carga opuesta,
sufre la resistencia, fv, debida a la fricción viscosa entre la molécula que se desplaza y el medio
en el que lo hace. El coeficiente de fricción f depende tanto de la masa y de la forma de la
molécula que emigra como de la viscosidad del medio η. Para una esfera de radio r,
Las separaciones electroforéticas se realizan casi siempre sobre geles, porque el gel sirve como
un tamiz molecular que potencia la separación como se puede apreciar en la figura 6 donde
vemos un aparato para electroforesis en gel normalmente se separan varias muestras por
electroforesis en un gel plano de poliacrilamida. Se usa una micropipeta para colocar las
disoluciones de las proteínas en los pocillos del gel. Se coloca una tapa sobre la cámara del gel
y se aplica un voltaje. Los complejos SDS dodecilsulfato sódico)-proteína cargados
negativamente migran en dirección del ánodo, en la parte inferior del gel. Las moléculas más
pequeñas que los poros del gel se desplazan a su través, mientras que las moléculas mucho
mayores que los poros del gel permanecen casi inmóviles. Las moléculas de tamaño intermedio
se desplazan a través del gel con diversos grados de dificultad (Mathews, Holde, & Ahern,
2004; Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003).
27
La electroforesis se lleva a cabo en un bloque delgado, vertical, de policrilamida. La dirección
del flujo es vertical descendente. Los geles de poliacrilamida, formados por la polimerización
de la acrilamida entrecruzada por metilenbisacrilamida, son el soporte preferido para la
electroforesis ya que son inertes químicamente y se forman con facilidad (Berg, Tymoczko, &
Stryer, 2003).
Las proteínas se pueden separar de acuerdo con sus masas moleculares, utilizando
electroforesis en gel de poliacrilamida, en condiciones desnaturalizantes. La mezcla de
proteínas se disuelve primero en un medio con dodecilsulfato de sodio que se representa por
las siglas en ingles SDS “sodium dodecyl sulfete”. El SDS un detergente aniónico que rompe
casi todas las interacciones no covalentes en las proteínas nativas. También se añade
mercaptoetanol o ditiotreitol para reducir los puentes disulfuro. Los aniones de SDS se unen
con la cadena principal a razón de un SDS por cada dos residuos de aminoácido. Este complejo
SDS con una proteína desnaturalizada tiene una gran carga negativa conseguida por unión de
SDS es normalmente mucho mayor que la carga de la proteína nativa, por lo que esta se
considera no significativa. Los complejos SDS-proteína se someten entonces a electroforesis.
Cuando la electroforesis se acaba, las proteínas en gel se pueden visualizar tiñéndolas con plata
o con un colorante como el azul de Coomassie, que manifiesta una serie de bandas. Los
marcajes radiactivos se pueden detectar colocando una hoja de película de rayos X sobre el gel,
Figura 6 Electroforesis en gel de poliacrilamida
(A) Aparato de electroforesis en gel. (B) Separación de las proteínas de acuerdo a su
tamaño
Fuente: (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003)
28
un procedimiento conocido como autorradiografía (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003; Hicks,
2000).
Las proteínas pequeñas se desplazan rápidamente a través del gel, mientras que las grandes se
quedan arriba, junto al lugar de aplicación de la mezcla. El desplazamiento en estas condiciones
de la mayor parte de los polipéptidos es linealmente proporcional al logaritmo de su masa. Sin
embargo, algunas proteínas ricas en carbohidratos y las proteínas de membrana no cumplen
esta relación empírica. La electroforesis sobre gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE,
“polyacrylamide gel electrophoresis”) es rápida, sensible y capaz de un alto grado de
resolución. Cuando se tiñe con azul de Coomassie, basta 0,1 µg (~ 2 pmol) de una proteína
para dar una banda diferenciada y, con la tinción de plata se puede detectar incluso cantidades
menores (~0,02 µg). Se puede distinguir, normalmente, entre proteínas que difieren entre sí
aproximadamente en un 2% de sus masas por ejemplo entre 40 y 41 kDa, lo que corresponde
a una diferencia de unos 10 residuos de aminoácidos (Berg, Tymoczko, & Stryer, 2003).
2.3. Fundamento Legal
En el Plan Nacional Buen Vivir en el objetivo 3 “Mejorar la calidad de vida de la población”,
en la misma se explica que:
La Constitución, en el artículo 66, establece “el derecho a una vida digna, que asegure la salud,
alimentación y nutrición, agua potable, vivienda, saneamiento ambiental, educación, trabajo,
empleo, descanso y ocio, cultura física, vestido, seguridad social y otros servicios sociales
necesarios”. Por ello, mejorar la calidad de vida de la población es un proceso multidimensional
y complejo.
Entre los derechos para mejorar la calidad de vida se incluyen el acceso al agua y a la
alimentación (art. 12), a vivir en un ambiente sano (art. 14), a un hábitat seguro y saludable, a
una vivienda digna con independencia de la situación social y económica (art. 30), al ejercicio
del derecho a la ciudad (art. 31) y a la salud (art.32). La calidad de vida se enmarca en el
régimen del Buen Vivir, establecido en la Constitución, dentro del Sistema Nacional de
Inclusión y Equidad Social (art. 340), para la garantía de servicios sociales de calidad en los
ámbitos de salud, cultura física y tiempo libre, hábitat y vivienda, transporte y gestión de
riesgos (Senplades, 2013-2017).
29
En el Plan Nacional Buen Vivir en el objetivo 10 “Impulsar la transformación de la matriz
productiva”
La Constitución establece la construcción de un “sistema económico justo, democrático,
productivo, solidario y sostenible, basado en la distribución igualitaria de los beneficios del
desarrollo (art. 276), en el que los elementos de transformación productiva se orienten a
incentivar la producción nacional, la productividad y competitividad sistémicas, la
acumulación del conocimiento, la inserción estratégica en la economía mundial y la producción
complementaria en la integración regional; a asegurar la soberanía alimentaria; a incorporar
valor agregado con eficiencia y dentro de los limites biofísicos de la naturaleza; a lograr un
desarrollo equilibrado e integrado de los territorios; a propiciar el intercambio justo en
mercados y el acceso a recursos productivos; y a evitar la dependencia de importaciones de
alimentos (art. 284) (Senplades, 2013-2017)
2.4. Hipótesis:
2.4.1. Hipótesis de trabajo (Hi):
Es posible aislar las proteínas del grano de Quinua (Chenopodium quinoa Willd) ecuatoriana,
variedad INIAP Tunkahuán y caracterizarla.
2.4.2. Hipótesis nula (Ho):
No es posible aislar las proteínas del grano de Quinua (Chenopodium quinoa Willd)
ecuatoriana, variedad INIAP Tunkahuán y caracterizarla.
2.5. Sistema de Variables
Variable independiente: Procedimiento para el aislamiento de proteínas del grano de quinua
Variables dependientes:
1) Contenido de proteína total de los aislados proteicos
2) Contenido de proteína soluble de los aislados proteicos
3) Contenido de compuestos fenólicos de los aislados proteicos
4) Perfil electroforético en los aislados proteicos
30
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
3.1. Diseño de la investigación
La investigación fue de tipo descriptiva experimental, se llevó a cabo en las instalaciones de
los laboratorios de Análisis de Alimentos, en el de Oferta de Servicios y Productos de la
Facultad de Ciencias Químicas y en el laboratorio de Productos Naturales de Posgrado de la
Universidad Central del Ecuador, se realizó una manipulación de variables en condiciones
controladas, y así se desarrolló una interpretación correcta del fenómeno estudiado.
3.2. Población y muestra
3.2.1. Población
No aplica
3.2.2. Muestra
La muestra está constituida por 1 kg de granos de quinua ecuatoriana de la especie
Chenopodium quinoa Willd, variedad INIAP -Tunkahuán, marca comercial INAGROFA, que
fue adquirido en supermercados Supermaxi, Quito-Ecuador.
3.3. Diseño experimental
Variable independiente: Procedimiento para el aislamiento de proteínas del grano de quinua
Niveles 2: Procedimiento sin pretratamiento ácido (P1)
Procedimiento con tratamiento ácido (P2)
Tratamientos: 2
Replicas: 5
Variables dependientes:
1) Contenido de proteína total de los aislados proteicos
2) Contenido de proteína soluble de los aislados proteicos
3) Contenido de compuestos fenólicos de los aislados proteicos
31
4) Perfil electroforético en los aislados proteicos
Para lo obtención del aislado proteico del grano de quinua se contrastaron dos procedimientos,
ambos basados en la precipitación isoeléctrica de proteínas a pH de 5. La diferencia entre uno
y otro, es que el un método tiene un pretratamiento ácido para disminuir el contenido de
compuestos fenólicos como se explica en el figura 8, una vez obtenidos los datos se realizara
una prueba de contraste, la prueba t-student pareada, con un nivel de significancia del 95%.
En las figuras 7 y 8 se muestran los métodos usados para la obtención del aislado proteico del
grano de quinua.
32
Concentrado proteico
SOLUBILIZACIÓN ALCALINA
CENTRIFUGAR
Separación de fases?
NO
Sobrenadante
PRECIPITACIÓN ÁCIDA
CENTRIFUGAR
Separación de fases?
Aislado proteico (Sedimento)
SI
NO
FIN
AP1
Figura 7 Método aislamiento proteico sin tratamiento ácido previo P1
33
Solubilización ácida
Concentrado proteico
CENTRIFUGAR
Separación de fases?
NO
SOLUBILIZACIÓN ALCALINA
CENTRIFUGAR
Sedimento
Separación de fases?
NO
Sobrenadante
PRECIPITACIÓN ÁCIDA
CENTRIFUGAR
Separación de fases?
Aislado proteico (Sedimento)
NO
FIN
SI
SI
AP2
SI
Figura 8 Método aislamiento proteico con tratamiento
ácido previo P2
34
3.4.Matriz de operacionalización de las variables
En el trabajo presente las variables se operacionalizaron de la siguiente manera:
Tabla 5 Operacionalización de las variables
VARIABLES DIMENSIONES INDICADORES
Compuestos fenólicos
Compuestos fenólicos
mg ácido gálico
100 g de muestra seca
Proteína soluble Proteína soluble % proteína
Proteína Proteína % proteína
Pesos moleculares Peso molecular kDa
3.5. Técnicas e instrumentos de recolección de datos validez y confiabilidad
3.5.1. Primera etapa: Acondicionamiento de la muestra
La cantidad de 1 kg de quinua se sometió a un proceso de disminución de tamaño de partícula
usando un molino Hamilton Beach Modelo: 80365 Serie:C4431AX, con lo que se obtuvo
harina de quinua, se pesaron exactamente 100,0000 g de harina de quinua en una balanza
analítica Mettler Toledo Modelo: Al204, Serie 1227121174, luego se transfirió a un tamizador
Sieve shanker Model:SS-15 Serie: SS15-7303. El tamaño de poro del juego de tamices usado
fue de 2; 1,7; 0,85; 0,25; 0,18; 0,15 y 0,06 mm, la muestra se tamizo por 5 minutos. Luego se
procedió a pesar la harina retenida en los tamices trasvasando la harina del tamiz en un papel,
comenzando la operación por el tamiz superior hasta llegar al tamiz del fondo (INEN, 2013).
Los porcentajes de partículas retenidas y no se retenidas se calcularon con las ecuaciones 1 y
2.
% 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑡í𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎𝑠 = 𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑡𝑎𝑚𝑖𝑧 (𝑔)
𝑚𝑎𝑠𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑔)𝑥 100 (1)
% 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑡í𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑛𝑜 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎𝑠 = 100 − % 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑡í𝑐𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑎𝑠 𝑎𝑐𝑢𝑚𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎𝑠 (2)
35
Una vez determinado el porcentaje de masa que pasa por la abertura de malla se determinó el
tamaño de partícula haciendo uso del Anexo 3, comparando el número de malla con el tamaño
de poro.
Análisis bromatológico del grano de quinua
A la harina de quinua se procedió a realizar un análisis bromatológico, previo al aislamiento y
caracterización proteica. Dichos análisis consta de los siguientes parámetros:
Determinación del contenido de sólidos (totales) y humedad (33.1.03 método oficial
AOAC 925.10)
Se pesaron 3,0000 g de harina de quinua previamente homogenizada en una cápsula
previamente tarada a 130 ° C en una estufa Blue M Modelo: SW-17TA Serie: S4-3196 y
enfriada en un desecador hasta alcanzar temperatura ambiente, luego se colocó la cápsula con
la muestra en la estufa por 1 hora a 130 ° C y, se la enfrió en un desecador y finalmente se pesó
la capsula una vez alcanzado la temperatura ambiente en una balanza analítica.
El contenido de humedad en la harina de quinua se calculó en base a la ecuación 3
%𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =𝑚2−𝑚3
𝑚2−𝑚1∗ 100 (3)
Donde:
m1: masa de la cápsula vacía, en gramos
m2: masa de la cápsula con la muestra antes del secado, en gramos
m3: masa de la cápsula con la muestra seca, en gramos
Determinación del contenido de cenizas método directo (32.1.05 Método oficial AOAC
923.03)
Se pesó 1,5000 g de harina de quinua en un crisol para cenizas que fue calcinado a 550 ° C en
una mufla Thermo Scientific Modelo:FB1310M Serie; 1256080901301 por 30 minutos y se
enfrió en un desecador hasta que alcanzar la temperatura ambiente, la harina de quinua se
36
calcino en la mufla a 550 °C hasta obtener una ceniza clara, se enfrió en un desecador y se pesó
cuando se alcanzó la temperatura ambiente.
Las cenizas de la harina de quinua se expresaron en porcentaje mediante la ecuación 4
%𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 =𝑚2−𝑚1
𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎∗ 100 (4)
Donde:
m1: masa del crisol vacío, en gramos
m2: masa del crisol más ceniza, en gramos
Determinación del contenido de grasa (cruda) método de extracción con solventes
(39.1.08 Método oficial AOAC 991.36)
Primero se procedió a extraer la humedad como ya se explicó anteriormente, luego se pesó
10,0000 g de harina de quinua en un dedal de celulosa, se pesó un vaso de extracción,
previamente lavado y tarado a 130 °C durante una hora, se procedió a encender el extractor de
grasa Velp Scientifica (figura 9) y abrir el flujo del agua del condensador, se adhirieron a las
columnas de extracción los dedales de celulosa que contenían la harina de quinua, luego se
añadió 50 mL de éter di etílico dentro de cada vaso para cubrir los capuchones cuando estén en
posición de inmersión, una vez realizado el proceso de extracción se removió los vasos de
extracción del extractor de grasa y se colocó en la sorbona para finalizar la evaporación del
solvente, posteriormente se llevaron los vasos con la grasa al desecador para que se enfrié hasta
temperatura ambiente y se tomó el peso del vaso más la grasa.
37
La grasa de la harina de quinua se expresa en porcentaje, mediante la ecuación 5
%𝐺𝑟𝑎𝑠𝑎 =𝑚2−𝑚1
𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎∗ 100 (5)
Donde:
m1: vaso vacío, en gramos
m2: vaso más grasa, en gramos
Determinación del contenido de proteína cruda método de digestión en bloque (39.1.19
Método oficial AOAC 981.10)
Se pesó 0,5000 gramos de harina de quinua en un papel libre de nitrógeno, se colocó la muestra
en los tubos de digestión, luego se añadió una tableta catalizadora, 12 mL H2SO4 concentrado,
2,5 mL H2O2 al 35%, posteriormente se digesto la muestra en un digestor Velp Modelo:
F307C0199 Serie 328985 por 30 min, una vez fríos los tubos de digestión se añadió 50 mL de
agua destilada, seguido de una destilación en un destilador Velp Modelo: F30630198 Serie
329750 donde el destilado se recogió en un matraz colector con 25 mL de solución de H3BO3
y con la mezcla de indicadores, finalmente se tituló con HCl 0,1 N hasta el cambio a color
gris.
La proteína de la harina de quinua se expresa en porcentaje, mediante las ecuaciones 6 y 7
Figura 9 Equipo de extracción de grasa
38
%𝑁 =(𝑉𝐴−𝑉𝐵)∗0,014∗𝑁𝐻𝐶𝑙
𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎∗ 100 (6)
%𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 =(𝑉𝐴−𝑉𝐵)∗0,014∗𝐹𝑃∗𝑁𝐻𝐶𝑙
𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎∗ 100 (7)
Donde:
VA: Volumen de HCl consumido en la muestra, mL
VB: Volumen de HCl consumido en el blanco, mL
N: Normalidad del HCl, mol/L
FP: Factor de proteína 5,70
Determinación del contenido de fibra cruda (4.6.01 Método oficial AOAC 962,09)
Se pesó 1,0000 g de harina de quinua en un erlenmeyer de 250 mL a esto se añadió 100 mL de
H2SO4 al 1,25% y se hirvió por 30 minutos, luego se filtró y se lavó con agua caliente hasta
ausencia de ácido, se transfirió el contenido del papel al erlenmeyer original, se añadió 100 mL
de NaOH al 1,25% y se hirvió por 30 min, posteriormente se filtró en papel filtro cuantitativo
previamente pesado y tarado y se lavó con agua caliente hasta ausencia de hidróxido,
finalmente se secó, enfrió y peso.
La fibra de la harina de quinua se expresa en porcentaje, mediante la ecuación 8
%𝑓𝑖𝑏𝑟𝑎 =𝑚2−𝑚1
𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎∗ 100 (8)
Donde:
m1: papel filtro vacío, en gramos
m2: papel filtro más fibra, en gramos
39
3.5.2. Segunda etapa: Obtención de la harina desengrasada y aislado proteico
La harina de quinua desengrasada fue obtenida extrayendo la grasa por el método Söxhlet.
Para obtener el aislado proteico sin tratamiento ácido previo se suspendió la harina de quinua
desgrasada en agua tipo 1 al 10% p/v, luego se solubilizo las proteínas, se ajustó el pH de la
solución a 11,0, con NaOH 1N con un pH-metro Mettler Toledo Modelo: S220 Serie:
B351126640, manteniéndose a temperatura ambiente y agitación en un agitador Velp
Scientifica Serie: 68470, por 30 minutos, posteriormente se centrifugó durante 60 min a 2600
rpm a temperatura ambiente en una Centrifuga Dynac Modelo: 0101 Serie: 11442, se precipito
las proteínas llevando el sobrenadante a pH 5, con HCl 1 N, luego se centrifugo a 2600 rpm
por 60 min a 4 °C y finalmente se neutralizo el precipitado usando NaOH 0,1 N.
Para obtener el aislado proteico con tratamiento ácido previo se partió de la harina de quinua
desengrasada, se realizó una extracción a pH 4,5; a temperatura ambiente; al 10% p/v con agua
tipo 1 y con agitación por 60 minutos y luego se separó la parte soluble de la insoluble para lo
cual se centrifugo a 2600 rpm en una centrifuga Dynac, Modelo 01101, serie 11442 a
temperatura ambiente. A partir de la parte insoluble se procedió a extraer las proteínas por el
método de precipitación isoeléctrica como se mencionó anteriormente. En el figura 8 se
muestra la obtención de los aislados con el pretratamiento ácido previo, las extracciones fueron
realizados por quintuplicado.
3.5.3. Tercera etapa: Caracterización de los aislados proteicos
Una vez obtenidos los aislados proteicos de la harina de quinua, se procedió a su cuantificación
realizando un análisis bromatológico para esto de determino:
Se realizó un análisis bromatológico en los aislados obtenidos. Se empleó el método de Biuret
para la determinación de proteína soluble para lo cual primero se prepara una curva de
calibración usando como estándar albumina de suero de bovino se preparó una solución madre
con una concentración 20 mg/mL mediante la cual se prepararon soluciones con diferentes
concentraciones (0; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0mg/mL) para las cuales se añadió una solución de
tartrato de sodio y potasio hasta completar 2 mL, más 2 mL del reactivo de Biuret, para la
muestra se disolvió 1 g de proteína y se aforo a 50 mL de esta solución se tomó 1 ml y se la
llevo a un volumen total de 10 mL, las soluciones tanto del estándar como las muestras se
midieron con una longitud de onda a 540 nm en un espectrofotómetro UV-Vis para los cálculos
40
se utilizó la curva de calibración elaborada como se menciona en la ecuación 9, para las
mediciones se hicieron cinco repeticiones.
𝐴 = 𝑎𝐶 + 𝑏 (9)
A: Absorbancia (adimensional)
a: pendiente de la curva (mL/mg)
C: Concentración de las soluciones (mg/mL)
b: Punto de Corte (adimensional)
A continuación se realizó el análisis de la cantidad de compuestos fenólicos expresados como
mg de ácido gálico/100 g muestra, en los extractos obtenidos mediante el método de Folin
Ciocalteu descritos por varios autores (Castel, 2010; Repo & Encina, 2008; Salgado, 2009),
para lo cual se pesó 0,3 gramos del aislado proteico y se añadió 10 mL de metanol grado
cromatógrafo a esta solución se la agitó por 30 min luego se filtró lavando con 10 mL de
metanol, para la lectura de las muestras se realizaron 3 curvas de calibración tomando como
estándar al ácido gálico las concentraciones empleadas fueron de 0, 10, 30, 50, 70 100 ppm, se
hizo reaccionar 500 µL de los estándares y de las muestras con 2,5 mL del reactivo de Folin
Ciocalteu y se dejó por 2 minutos en reposo a temperatura ambiente; se adicionó 2 mL de
Na2CO3 75 g/L, se agitó y se incubo por 15 min a 50 °C, se enfrió los tubos en agua a 4°C y
finalmente se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro UV-VIS a una longitud de onda de
760 nm, para los cálculos respectivos se empleó la ecuación 10.
𝐴 = 𝑎𝐶 + 𝑏 (10)
A: Absorbancia (adimensional)
a: pendiente de la curva (L/mg)
C: Concentración de las soluciones (mg/L)
b: Punto de corte (adimensional)
Finalmente se determinó el perfil electroforético de los aislados proteicos, esto se lo realizó
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio
(SDS-PAGE). Se prepararon geles separadores de poliacrialmida al 12% p/v con geles
apiladores al 5% p/v.
41
La composición para cada uno de los geles se muestra en la tabla 6
Tabla 6 Soluciones para electroforesis
SOLUCIÓN REACTIVO CONCENTRACIÓN
O CANTIDAD
CONDICIONES
Amortiguadora de
cátodo
Tris-base
Tricina
SDS
Agua destilada
100 mM
100 mM
0,1% (p/v)
Aforar a 500 mL
Amortiguadora de
ánodo
Tris-base
Agua destilada
200 mM Aforar a 500 mL,
ajustar pH 8,9
Amortiguadora de
gel (tris- HCI/DS)
Tris-base
Agua destilada
SDS
200 mM
0,3% (p/v)
Aforara a 100 mL,
ajustar el pH 8,45
Amortiguadora de
muestra
Tris-HCl
Glicerol
SDS
Comassie G-250
Agua destilada
1.0 M
2,4 mL
0,8 g
2.0 mg
Ajustar el pH 6,8
Aforar a 100 mL
Acrilamida
(37,5:1)*
Acrilamida
Bis-acrilamida
Agua destilada
37,1 g
0,38 g
Aforar a 100 mL
Glicerol diluido Glicerol 80% (p/p)
42
Persulfato Persulfato de
amonio
10% (p/v)
*% T= 37,5 representa el porcentaje en peso de acrilamida (monómero lineal) y% C= 1 representa el
porcentaje de bis-acrilamina (monómero entrecruzado)
Los geles concentrador y separador se prepararon con las cantidades de reactivos mostradas en
la siguiente tabla. Una vez que los geles polimerizaron y los pocillos estuvieron formados, éstos
se montaron en una cámara MINIPROTEAN III de BioRad. En el reservorio interior se colocó
la solución amortiguadora de cátodo hasta cubrir los pocillos y en el reservorio exterior se
colocó la del ánodo hasta llegar a una tercera parte del volumen de la cámara.
Tabla 7 Preparación de los geles concentrador y separador para electroforesis
REACTIVO GEL SEPARADOR 12% GEL CONCENTRADOR
5%
Acrilamida
Amortiguadora de gel
(Tris HCI/SDS)
Agua destilada
Temed
APS*10%
3 mL
1,87 mL
2,58 mL
10 µL
38 µL
0,42 mL
1,25 mL
0,82 mL
2,5 µL
12 µL
* Persulfato amónico (N2H8S2O8)
Todas las muestras fueron disueltas en el buffer de muestra, se calentaron a 100°C durante 5
minutos en un equipo de calentamiento Wise Thermmodelo HB-96D. Todas las muestras se
centrifugaron a temperatura ambiente 15 minutos a 4000 rpm en una centrífuga Hettich modelo
D-78532. En cada pocillo se sembró los volúmenes correspondientes a 2-12,5µL, 3-11µL, 4-
11µL correspondiente a 30µg/mL de proteínas. La muestra se corrió 2 horas a voltaje constante
(100V) hasta que el frente azul de Comassie llego casi al borde inferior del gel.
Los geles obtenidos se fijaron y colorearon simultáneamente (1/2 hora) con una solución de
etanol 46%, ácido acético glacial 8% y agua conteniendo 0,1% p/v de Azul Comassie.
Posteriormente fueron decolorados con una solución acuosa de etanol 30% p/v y ácido acético
5% p/v (12 horas). Para estimar la masa molecular de las proteínas, se separaron también en
los geles patrones peso molecular protein novex, en el posillo 1-7µL cuyos pesos moleculares
fueron de 460, 268, 238, 171, 117, 71, 55, 41 y 31 kDa
43
Mediante el uso de un peso molecular patrón y comparando con los valores de la bibliografía
podemos identificar los pesos moleculares a qué tipo de proteínas corresponden.
3.6. Técnicas de procesamiento y análisis de datos
Los datos obtenidos se compararon mediante una prueba de contraste la cual es la prueba t-
student pareada, luego los datos obtenidos fueron procesados con la herramienta estadística
Statgraphics centurión XVI y SigmaPlot 12.0 para realizar las gráficas correspondientes.
44
CAPÍTULO IV
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Resultados
4.1.1. Primera etapa: Acondicionamiento de la muestra
Las propiedades organolépticas se establecieron experimentalmente una vez que se obtuvo la
harina de quinua, las características presentadas fueron un color café claro, un olor
característico y el sabor ligeramente dulce, para el tamaño de partícula se empleó la
metodología explicada anteriormente (INEN, 2013), los resultados obtenidos para el porcentaje
de masa retenida en los tamices mostrada en el anexo 4 y con el uso de la tabla que se presenta
en la figura 18 en los anexos se determinó el tamaño de partícula el cual fue de 0,25 mm.
Como parte del acondicionamiento de la muestra se realizó un análisis bromatológico cuyos
resultados se presentan en el anexo 5, con los resultados detallados en la tabla 13, podemos ver
que los valores de grasa obtenidos en la quinua son similares a los encontrados por Koziol
(1992), el resto de valores obtenidos en el análisis bromatológico como la proteína total es
comparable con los encontrados en otras investigaciones (Koziol, 1992; Peralta, 2010; Rivera,
2006; Silva, 2006).
4.1.2. Segunda etapa: Obtención de la harina desengrasada y aislado proteico
4.1.2.1 Desengrasado de la harina de quinua
Se obtuvo la harina de quinua desengrasada mediante la extracción de la grasa a partir del grano
de quinua molido para esto se empleó la muestra obtenida en el análisis bromatológico
(extracción de grasa).
4.1.2.2. Aislamiento de las proteínas con y sin tratamiento ácido previo
El método de extracción con tratamiento ácido previo hizo que la muestra de harina de quinua-
agua 1:10 se vea blanca a comparación con el tratamiento normal el cual se veía la harina de
quinua más el agua de un color amarillo claro como se muestra en la figura 10, luego de la
primera centrifugación se separó la parte soluble a pH 11, se pudo ver una coloración café para
el tratamiento ácido y una amarilla para el tratamiento normal (figura 11) y finalmente se
obtuvo los aislados proteicos, una coloración gris clara para el tratamiento ácido y una
45
coloración blanca para el tratamiento normal, estos concentrados proteicos iban oscureciéndose
con el paso del tiempo hasta llegar a un color gris (figura 12). Estos colores debido
posiblemente a que los compuestos fenólicos sufren una rápida oxidación formando quinonas
que luego reaccionan con las proteínas lo que resulta en una solución de color marrón oscuro
(Castel, 2010).
Figura 10 Solubilidad de las proteínas pH 11
Figura 11 Proteínas solubilizadas
46
4.1.3. Tercera etapa: Caracterización de los aislados proteicos
Una vez obtenidos los aislados proteicos se procedió a realizar un análisis bromatológico para
poder comparar con los valores en la harina de quinua como se muestra en la tabla 8, donde se
puede ver que en los aislados proteicos de quinua no se encontró ceniza, grasa ni fibra al
contrario de proteína total que fue un valor de 70% lo que corresponde a un porcentaje alto en
proteína.
Figura 12 Aislados proteicos
47
Tabla 8 Comparación de resultados del análisis bromatológico
PARÁMETRO
n
QUINUA
n
AISLADOS PROTEICOS
AP1 n AP2
Humedad 5 11,09 ± 0,31 - NA - NA
Ceniza 5 2,58 ± 0,02 2 0,00 ± 0,01 2 0,00 ± 0,00
Grasa 5 6,73 ± 0,15 2 0,00 ± 0,00 2 0,00 ± 0,00
Fibra cruda 5 3,90 ± 0,22 2 0,00 ± 0,00 2 0,00 ± 0,00
Proteína 5 14,15 ± 0,28 5 70,10 ± 0,85 5 70,24 ± 0,58
Extracto libre
de nitrógeno
NA 61,55 -
NA - NA
n: número de determinaciones
NA: No aplica
Determinación de proteína por método Kjeldahl
Con los resultados obtenidos y mostrados en la tabla 9 para las proteínas aisladas mediante los
dos métodos diferentes, se puede ver que por medio de ambos método obtenemos aislados
proteicos con un 70% de proteína total, valores que son comparables a los reportados por Castel
(2010) quien por medio de la precipitación isoeléctrica obtuvo un aislado proteico con un
73,1% en concentración de proteínas para el amaranto, el cual se asemeja a la quinua en cuanto
a sus propiedades químicas como nutricionales.
Tabla 9 Contenido de proteína total en los aislados proteicos AP1 y AP2
AISLADOS PROTEICOS
AP1 AP2
70,65
69,31
70,73
69,03
70,78
71,05
70,04
70,58
69,59
69,94
IC (70,10 ±0,77)% (70,24 ± 0,51)%
Número de determinaciones 5
IC: Intervalo de confianza
48
Al evaluar las medias del porcentaje de proteína para cada uno de los tratamientos AP1 y AP2
mediante la prueba t de student pareada, no se rechaza la hipótesis nula, el cual se midió con
un nivel de confianza del 95,0%, lo que nos indica que no existe diferencia significativa entre
el contenido de proteína total en los aislados proteicos AP1 y AP2.
Determinación de proteína soluble por método de Biuret
Una vez obtenidos los aislados se procedió a realizar la cuantificación de los mismos por
espectrofotometría de absorción molecular ultravioleta visible, para esto se realizó unos pasos
previos necesarios para la cuantificación de la proteína, primero se elaboró una curva de
calibración.
Curva de calibración Biuret
Concentración (mg/mL)
(C)
0 2 4 6 8 10
Ab
so
rbancia
-0,01
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Cocentración vs Absorbancia
Regresión lineal
Curva de calibración
49
Tabla 10 Contenido de proteína soluble en los aislados proteicos AP1 y AP2
AISLADO PROTEICO
AP1 AP2
67,55
66,27
65,84
67,13
67,98
66,18
72,07
67,37
62,64
63,32
IC (66,96 ±0,79)% (66,32 ± 3,37)%
Número de determinaciones 5
IC: Intervalo de confianza
Al evaluar las medias del porcentaje de proteína soluble por el método de Biuret para cada uno
de los aislados AP1 y AP2, cuyos resultados se presentan en la tabla 10, mediante la prueba t
de student pareada, con un valor de 0,32, no se rechaza la hipótesis nula, la cual se midió con
un nivel de confianza del 95,0%, lo que me indica que no existe diferencia significativa entre
el contenido de proteína soluble en los aislados AP1 y AP2, cuyo valor obtenido es similar a
un estudio realizado en quinua, donde determinaron que la harina de quinua tiene un 82% de
proteína soluble en relación a la proteína total (Urzagasti, y otros, s.f.).
Este valor alto en proteína soluble nos indica que la mayoría de aminoácidos presentes en los
aislados proteicos son polares en los que se encuentran Glicina, Serina, Treonina, Cisteina,
Cistina, Tirosina, Asparagina, Glutamina, Hidroxi prolina, y estos van a ser los que reaccionen
con el reactivo de Biuret.
Cuantificación del porcentaje de compuestos fenólicos por método de Folin-Ciocalteu
Para la cuantificación de compuestos fenólicos en los aislados proteicos AP1 y AP2 se calculó
la ecuación de la recta usando la curva de calibración de ácido gálico. La curva de calibración
se obtuvo por triplicado obteniéndose coeficientes de correlación de 0,99. Para los cálculos de
contenido de compuestos fenólicos se usó la curva de calibración promedio de las tres
determinaciones.
50
Elaboración de la curva de calibración
Tabla 11 Determinación de compuestos fenólicos totales en los aislados proteicos
AISLADOS PROTEICOS
AP1
(mg ácido gálico/100
g de muestra)
AP2
(mg ácido gálico/100
g de muestra)
39,79
35,61
42,85
32,39
36,75
14,81
14,61
14,79
13,37
13,07
IC 37,48 ± 3,58 14,13 ± 0,75
Número de determinaciones 5
IC: Intervalo de confianza
Curva de calibración polifenoles
Concentración (mg/L)
(C)
0 20 40 60 80 100 120
Ab
so
rbancia
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
A = 0,0116 C - 0,0296
A = 0,0104 C - 0,0046
A = 0,012 C - 0,0023
51
Al comparar las medias de ambos tratamientos mediante la prueba t student pareada se encontró
que existe diferencia significativa, es decir hay un efecto del método de extracción sobre el
contenido de compuestos fenólicos en los aislados proteicos.
Se pudo observar que con el tratamiento ácido se logró remover una cantidad de compuestos
fenólicos de la harina de quinua desengrasada. Es importante mencionar que al aplicar el
tratamiento ácido no se espera un valor de 0 mg ácido gálico/ g de muestra, debido a que las
proteínas globulares de la quinua presentes en la matriz son una interferencia en esta
determinación (Fernández & Galván, 2010).
De la misma manera se midió la concentración de compuestos fenólicos en la harina de quinua
desengrasada donde se encontró un valor de 64,94 (mg ácido gálico/100 g de muestra), esto se
realizó para determinar si los tratamientos realizados influían en la formación de los
compuestos fenólicos.
Estos valores de compuestos fenólicos totales encontrados en los aislados proteicos AP1 y AP2
se pueden comparar con otro estudio realizado en Perú por Repo y Encina (2008) determinaron
en la variedad de quinua Huariponcho 37,15 mg ácido gálico/100 g y en la variedad de quinua
PIQ031119 35,29 mg ácido gálico/100 (Repo & Encina, 2008).
Mediante la remoción de compuestos fenólicos de las proteínas aisladas se pudo observar que
si existía un cambio en el color de los aislados proteicos, los cuales no fueron los esperados
debido a que el aislado proteico obtenido mediante un pretratamiento ácido previo presentó un
color más oscuro que el otro procedimiento, con lo que se pudo ver que el oscurecimiento de
la proteína no depende de los compuestos fenólicos si no del método de extracción, ya que a
pH superiores a 9 al momento de solubilizar las proteínas producen reacciones de maillard de
pardeamiento.
Perfil electroforético de los aislados proteicos
Mediante la electroforesis se pudo determinar los pesos moleculares de las proteínas presentes
en los dos aislados proteicos tanto en el aislado sin pretratamiento ácido previo como con el
aislado con pretratamiento ácido previo.
52
Los perfiles electroforéticos obtenidos como se indica en el figura 13, en los diferentes pocillos
los cuales fueron colocados, St el estándar con bandas de pesos moleculares conocidos, el
pocillo 1: patrón de peso molecular, pocillo 2: aislado proteico sin tratamiento ácido previo
(AP1I) repetición 1, pocillo 3: aislado proteico con pretratamiento ácido (AP2I) repetición 1,
pocillo 4: aislado proteico sin pretratamiento ácido (AP1II) repetición 2, pocillo 5: aislado
proteico con pretratamiento ácido (AP2II) repetición 2, se encontraron la presencia de varias
bandas para los 4 casos, con pesos moleculares por debajo de los 171 kDa que corresponden a
proteínas globulares, correspondientes a: mucina con 117 kDa, BSA con 71 kDa la albúmina
66kDa , globulina con 55 KDa al igual que (Elsohaimy, Refaay, & Zaytoun, 2015) y la
ovoalbúmina con 45 kDa, en la figura 13 se puede ver que no hay diferencia de proteínas entre
cada tipo de extracción siendo esto un indicador de que la proteína al ser extraída por el
procedimiento alternativo no presenta desnaturalización, por lo que la estructura terciaria de
las globulinas está presente en los aislados proteicos como en el estándar de pesos moleculares
conocidos.
Figura 13 Perfil electroforético SDS-PAGE (aislados proteicos)
53
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones
Se obtuvo harina desengrasada del grano de quinua (Chenopodium quinoa Willd)
ecuatoriana variedad INIAP-Tunkahuán, por el método Söxhlet, que constituyó la
muestra perfectamente acondicionada de la que se aisló las proteínas.
La quinua es considerada por la FAO como una excelente fuente de proteínas de calidad
nutricional. Se obtuvieron aislados proteicos de la harina desengrasada, por dos
procedimientos fundamentados en la precipitación isoeléctrica, estos aislados podrían
ser utilizados como ingredientes en productos de alto valor agregado, como los
suplementos alimenticos.
En la cuantificación los resultados mostraron que el contenido de proteína total en los
granos de quinua fue del 14%, mientras que, en el aislado proteico fue del 70%,
independientemente del procedimiento de aislamiento usado, este último valor se
encuentra dentro del rango de la cantidad de proteína que debe tener un aislado proteico
(≥ 70%). De forma similar se observó que el contenido de proteínas solubles de los
aislados obtenidos por ambos procedimientos fue alto del 66%, lo que significa que la
mayoría de proteínas de la quinua tendrían una elevada digestibilidad, ya que existe una
relación proporcional entre la digestibilidad y la solubilidad de las proteínas
característica importante desde el punto de vista nutricional, además los resultados
evidenciaron que el pretratamiento ácido no afecta el contenido de proteína total y
proteínas solubles extraídas.
El contenido de compuestos fenólicos del aislado proteico obtenido sin el
pretratamiento ácido fue 2,7 veces mayor en comparación con el procedimiento con
pretratamiento ácido, lo que significa que un tratamiento ácido previo remueve a los
compuestos fenólicos, cuya presencia modificó el color de los aislados proteicos
obtenidos
Los perfiles de proteínas en geles de poliacrilamida con SDS-PAGE de los aislados
proteicos, mostraron que la mayor proporción de las proteínas de los aislados tienen
pesos moleculares por debajo de los 171 kDa, que corresponden a proteínas globulares,
básicamente se extraen las mismas proteínas en los dos procedimientos estudiados.
54
Finalmente se puede concluir que el aislado proteico de la quinua ecuatoriana podría
ser un ingrediente prometedor para ser empleado en alimentos funcionales y
suplementos alimenticios.
5.2. Recomendaciones
Realizar un estudio físico-químico de los aislados proteicos, en los que conste la
capacidad de retención de agua, la capacidad de retención de líquidos y la digestibilidad
proteica.
Realizar purificaciones de los aislados para obtener una proteína con un mayor
porcentaje proteico.
55
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ANEXOS
Anexo 1
Alimentos que más contribuyen al consumo de energía y proteína
Gráfico 2 Alimentos que más contribuyen al consumo de proteínas
Fuente: (Freire, y otros, 2011-2013)
Gráfico 3 Alimentos que más contribuyen al consumo total diario de energía
Fuente: (Freire, y otros, 2011-2013)
Anexo 2
Figura 14 Distribución geográfica de la producción mundial de quinua
Fuente: (Freire, y otros, 2011-2013)
Anexo 3
Apertura de la malla de los Tamices
Figura 15 Apertura de malla de los tamices
Anexo 4
Tamaño de partícula para la harina de quinua
Tabla 12 Resultados tamaño de partícula para la harina de quinua
SERIE DE
TAMIZ
EQUIVALENCIA
EN, mm
MASA
RETENIDA
%
RETENIDO
% PASA POR
EL TAMIZ
12
2,000 0 0,00 100,00
20 1,700 0,5501 0,56 99,44
40 0,850 10,4588 10,66 88,78
60 0,250 43,6629 44,52 44,26
80 0,180 17,8143 18,16 37,32
100 0,150 5,1918 5,29 20,80
250 0,066 17,9588 18,31 2,49
BASE --------- 2,4423 2,49 0,00
Anexo 5
Resultados del análisis bromatológico
Tabla 13 Análisis bromatológico de la harina de quinua
Parámetro Valor
Humedad 11,09 ± 0,31
Ceniza 2,58 ± 0,02
Grasa 6,73 ± 0,15
Fibra cruda 3,90 ± 0,22
Proteína total 14,15 ± 0,28
Extracto libre de
nitrógeno
61,55 ± 0,33
número de repeticiones 5
Anexo 6
Norma Técnica Ecuatoriana: Quinua-Requisitos
Quito - Ecuador
NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 1673:2013
Primera revisión
QUINUA. REQUISITOS
Primera edición
QUINOA. REQUIREMENTS
First edition
DESCRIPTORES: Tecnología de los alimentos, Cereales, leguminosas y productos derivados, quinua. AG 05.04-412
CDU: 633.1
ICS: 67.060
Anexo 7
Norma Harina de origen vegetal. Determinación del tamaño de partículas
Quito - Ecuador
NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 517:2013
Primera revisión
HARINA DE ORIGEN VEGETAL. DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO
DE PARTÍCULAS
Primera edición
VEGETAL FLOUR PARTICLE SIZE DETERMINATION
First edition
DESCRIPTORES: Productos alimenticios, harinas, harina de trigo, tamaño de partículas AL 02.02-
Anexo 8
Galería de fotos:
Primera etapa: Acondicionamiento de la muestra
Figura 16 Recepción de la materia prima Figura 17 Homogenización de la muestra
Figura 18 Molida de los granos
Figura 19 Tamizado de la
harina de quinua
Figura 20 Extracción de grasa
Figura 21 Determinación de la
humedad
Figura 22 Determinación de cenizas
Figura 23 Determinación de
proteína total
Anexo 9
Segunda etapa: Obtención del aislado proteico de la harina de quinua
Figura 24 Solubilización de
las proteínas
Figura 25 Solubilización de las
proteínas por dos métodos
diferentes
Figura 26 Separación de las
proteínas solubles
Figura 27 Precipitación isoeléctrica
Figura 28 Separación del
precipitado
Anexo 10
Tercera etapa: Caracterización de los aislados proteicos
Figura 29 Determinación de grasa en
los aislados proteicos
Figura 30 Determinación de
proteína
Figura 31 Determinación de compuestos
fenólicos
Figura 32 Preparación de las
muestras para la
electroforesis
