UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS

Caracterización bromatológica de la semilla de aguacate (Persea americana) y extracción e identificación de la fracción con mayor actividad antimicrobiana y

antioxidante

Trabajo de investigación, presentado como requisito previo para la obtención del título de Química de Alimentos

Autora: Shirley Karen Triguero Ruiz

Tutora: MSc. Dayana Paulina Borja Espín

Co-tutora: MSc. María Lorena Goetschel Gómez

Quito, noviembre del 2018

DEDICATORIA

Dedicado a Dios por ser la piedra angular en mi vida, y a mi madre por su lucha y entrega día tras día en busca de mi felicidad y bienestar, mientras los tenga a

ustedes lo tendré todo.

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AGRADECIMIENTOS A Dios por todas las bendiciones recibidas, por tomar mi vida en sus manos, por

sostenerme cuando ni siquiera yo podía caminar, por permitirme cumplir un sueño más. A mí amada madre Jacqueline por su amor incondicional, su entrega y

dedicación, por creer en mí cuando ni si quiera yo creía, a mi querido padre Rommel, quien me apoyo incondicionalmente en todo momento, quien con su sabiduría e inteligencia me ayudo a tomar buenas decisiones en mi vida.

A mi querido amigo y compañero de momentos felices y tristes, mi enamorado, mi prometido, mi novio y esposo, mi amado Luis, por acompañarme durante casi toda la carrera y ser un apoyo incondicional, gracias por todo tu amor, paciencia y espera.

A mi tutora la MSc. Dayana Borja, por todos sus conocimientos y apoyo durante toda la investigación no lo hubiese logrado sin usted, a mi Co-tutora la MSc. Lorena Goetschel, gracias por todos sus conocimientos impartidos durante la carrera, es un gran ejemplo a seguir.

A mi tribunal el Dr. Fernando Novillo y la MSc. Rommy Terán, por sus conocimientos como profesionales del área, vitales para el desarrollo de la investigación.

Al Ing. Daniel Arboleda, la Ing. Milene Díaz, la MSc. Ana María Hidalgo, al MSc. Mario Bermeo, Dr. Iván Tapia, por todos sus conocimientos compartidos durante la carrera.

Al Ing. William Viera por proporcionarnos las muestras de aguacate. A la Universidad Central del Ecuador, de manera especial a mi querida Facultad

de Ciencias Químicas quien se convirtió en mi segundo hogar y gracias a la cual he llevado acabo mis objetivos como profesional.

Y por último pero no menos importante a mis queridos compañeros y amigos Miller Espinoza, Mishel Yánez y especialmente a Alexandra Aymacaña quien me acompaño durante todo el proceso de esta investigación, quienes con sus bromas y ocurrencias hicieron mi vida estudiantil más amena.

De todo corazón y de la manera más sincera, muchas gracias.

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ÍNDICE DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1

CAPÍTULO I ................................................................................................................ 2

EL PROBLEMA .......................................................................................................... 2

1.1 Planteamiento del problema ................................................................................. 2

1.2 Formulación del problema .................................................................................... 5

1.2.1 Preguntas directrices. ..................................................................................... 5

1.3 Objetivos .............................................................................................................. 5

1.3.1 General. .......................................................................................................... 5

1.3.2 Específicos. .................................................................................................... 5

1.4 Justificación e importancia ................................................................................... 6

CAPÍTULO II .............................................................................................................. 8

MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 8

2.1 ANTECEDENTES ............................................................................................... 8

2.2 Fundamento Teórico ............................................................................................. 9

2.2.1 Aguacate. ....................................................................................................... 9

2.2.1.1 Taxonomía del Aguacate. ....................................................................... 9

2.2.1.2 Aguacate en el Ecuador. ........................................................................ 11

2.2.1.3 Composición del Aguacate ................................................................... 11

2.2.2 Análisis de los alimentos. ............................................................................ 11

2.2.2.1 Determinación de humedad y sólidos totales ........................................ 11

2.2.2.2 Determinación de cenizas. .................................................................... 12

2.2.2.3 Determinación de grasa bruta. .............................................................. 13

2.2.2.4 Determinación de proteína .................................................................... 13

2.2.2.5 Determinación de carbohidratos ........................................................... 14

2.2.2.5 Determinación de fibra bruta ................................................................ 14

2.2.3 Componente químico vegetal. ..................................................................... 15

2.2.3.1 Metabolitos secundarios. ....................................................................... 15

2.2.4 Antioxidantes. .............................................................................................. 19

2.2.4.1 Tipos de antioxidantes. ......................................................................... 19

2.2.4.3 Evaluación de la actividad antioxidante. ............................................... 21

2.2.5 Actividad antimicrobiana. ............................................................................ 22

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2.2.5.1 Resistencia bacteriana en animales y humanos. .................................... 23

2.2.5.1 Evaluación antimicrobiana. ................................................................... 24

2.2.5.3 Microorganismos de prueba .................................................................. 25

2.2.5.4 Control positivo. .................................................................................... 25

2.2.6 Técnicas Cromatográficas............................................................................ 26

2.2.6.1 Clasificación de las técnicas cromatográficas. ...................................... 27

2.2.6.2 Cromatografía líquida. .......................................................................... 27

2.2.6.3 Cromatografía de gases. ........................................................................ 27

2.2.6.4 Cromatografía en Capa Fina ................................................................. 27

2.3 Marco Legal ...................................................................................................... 28

2.4 Hipótesis ............................................................................................................. 28

2.5 Conceptualización de variables .......................................................................... 29

2.5.1 Variables independientes. ............................................................................ 29

2.5.2 Variable dependiente. .................................................................................. 29

2.5.3 Variable de interés. ...................................................................................... 29

CAPÍTULO III ........................................................................................................... 30

MARCO METODOLÓGICO .................................................................................. 30

3.1 Diseño de la investigación .................................................................................. 30

3.2 Población y muestra ........................................................................................... 30

3.3 Materiales y métodos .......................................................................................... 30

3.3.1 Métodos ....................................................................................................... 33

3.3.1.1 Muestreo ................................................................................................ 33

3.3.1.2 Análisis bromatológico. ........................................................................ 33

3.3.1.3 Extracción. ............................................................................................ 34

3.3.1.4 Fraccionamiento. ................................................................................... 34

3.3.1.5 Tamizaje Fitoquímico. .......................................................................... 36

3.3.1.5 Identificación por cromatografía de capa fina. ..................................... 39

3.3.1.6 Cuantificación de fenoles ...................................................................... 40

3.3.1.7 Cuantificación de flavonoides ............................................................. 40

3.3.1.8 Evaluación de la actividad antimicrobiana. .......................................... 41

3.3.1.9 EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ........................ 43

Curva de Calibración ..................................................................................... 43

3.4 Diseño Experimental ................................................................................... 44

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3.6 Técnicas e Instrumentos de recolección de datos ............................................... 45

3.7 Técnicas de procesamiento de información y análisis de datos ......................... 45

CAPÍTULO IV ........................................................................................................... 49

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ..................................................... 49

4.1 Muestreo ............................................................................................................. 49

4.2 Análisis Bromatológico ...................................................................................... 49

4.3 Proceso de Extracción ........................................................................................ 54

4.3.1 Tamizaje fitoquímico ................................................................................... 55

4.3.2 Cromatografía en capa fina. ......................................................................... 59

4.4 Cuantificación de Flavonoides ........................................................................... 61

4.5 Cuantificación de Fenoles .................................................................................. 62

4.7 Evaluación de la actividad antimicrobiana ......................................................... 71

CAPÍTULO V ............................................................................................................. 77

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ....................................................... 77

5.1 Conclusiones ...................................................................................................... 77

5.2 RECOMENDACIONES .................................................................................... 79

ANEXOS ..................................................................................................................... 83

ANEXO 1. Certificado del INIAP ......................................................................... 83

ANEXO 2. Diagrama causa y efecto ....................................................................... 84

ANEXO 3. Fragmento de la norma INEN 518 (Determinación de humedad).85

ANEXO 4. Fragmento de la norma INEN 520 (Determinación de Cenizas).88

ANEXO 5. Fragmento de la norma INEN 519 (Determinación de Proteína).91

ANEXO 6. Fragmento de la norma INEN 523 (Determinación de Grasa total).94

ANEXO 7. Fragmento de la norma INEN 522 (Determinación de fibra cruda).97

ANEXO 8. Diagrama de flujo del proceso de fraccionamiento ............................ 101

ANEXO 9. Valores críticos de F para un contraste de una cola (P=0,05) ............. 103

ANEXO 10. Valores de t de Student ..................................................................... 104

ANEXO 11. Proceso del tratamiento de la muestra .............................................. 105

ANEXO 12. Maceración y tamizaje fitoquímico.................................................. 105

ANEXO 13. Ensayos Fitoquímicos ....................................................................... 106

ANEXO 14. Preparación de la Cromatografía en capa fina .................................. 106

ANEXO 15. Cuantificación de Fenoles y Flavonoides ......................................... 107

ANEXO 16. Actividad Antimicrobiana ................................................................. 107

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ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1.Clasificación en Razas del Aguacate ................................................................... 10 Tabla 2. Composición proximal del aguacate en base húmeda, en 100g ......................... 11 Tabla 3. Ventajas y Desventajas de los antioxidantes naturales y sintéticos ................... 21 Tabla 4. Susceptibilidad antimicrobiana del control positivo, Ceftriaxona ..................... 26 Tabla 5. Susceptibilidad antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a las diferentes cepas bacterianas ........................................................................................................................ 26 Tabla 6.Lista de Materiales, Equipos y Reactivos............................................................ 31 Tabla 7. Ensayos específicos para la detección de grupos fitoquímicos en las fracciones obtenidas ........................................................................................................................... 36 Tabla 8. Criterios de interpretación de pruebas cualitativas ............................................. 39 Tabla 9. Fases móviles y reveladores a utilizar en la cromatografía de capa fina ............ 39 Tabla 10. Volúmenes para la curva de calibración con Ácido ascórbico ......................... 43 Tabla 11. Factores de estudio y niveles ............................................................................ 44 Tabla 12. Matriz de operacionalización de variables ....................................................... 44 Tabla 13. Diseño factorial AxBxC ................................................................................... 47 Tabla 14. Anova para un diseño factorial AxBxC............................................................ 47 Tabla 15. Resultados obtenidos de la determinación de humedad y sólidos totales ........ 49 Tabla 16. Resultados obtenidos de la determinación de grasa cruda ............................... 50 Tabla 17. Resultados obtenidos de la determinación de proteína..................................... 50 Tabla 18. Resultados obtenidos de la determinación de cenizas ...................................... 51 Tabla 19. Resultados obtenidos de la determinación de fibra cruda ................................ 51 Tabla 20.Resultados generales obtenidos del análisis bromatológico .............................. 52 Tabla 21. Resultados generales del análisis estadístico en base seca ............................... 52 Tabla 22. Comparación de los resultados de Bressani (2009) .......................................... 53 Tabla 23. Cuadro comparativo del estudio de Cevallos y Montoya (2013) ..................... 53 Tabla 24. Resultados del Tamizaje fitoquímico de la semilla Hass y Fuerte ................... 55 Tabla 25. Resultados de la cromatografía en capa fina .................................................... 59 Tabla 26. Rf obtenidos de la cromatografía de capa fina ................................................. 60 Tabla 27. Resultados de la absorbancia del Estándar de Quercetina ................................ 61 Tabla 28. Concentración de Flavonoides en extracto y fracciones de las variedades Hass y Fuerte ............................................................................................................................. 62 Tabla 29. Resultados de la curva de Estándar de Ácido Gálico ....................................... 62 Tabla 30. Concentración de fenoles en extracto y fracciones de las variedades Hass y Fuerte ................................................................................................................................ 63 Tabla 31. Datos de la curva de calibración del ácido ascórbico ....................................... 64 Tabla 32. Resultados de la curva del Estándar Ácido ascórbico ...................................... 64 Tabla 33.Resultado en % de inhibición del extracto de semilla Hass .............................. 65 Tabla 34. Resultado en % de inhibición de la fracción acuosa de la semilla Hass .......... 66 Tabla 35. Resultados en % de inhibición de la fracción éter dietílico de la semilla Hass 67 Tabla 36. Resultados en % de inhibición del extracto de la semilla Fuerte ..................... 67

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Tabla 37. Resultado del % de inhibición de la fracción acuosa de la semilla Fuerte ....... 68 Tabla 38. Resultados del % de inhibición de la fracción éter dietílico de la semilla Fuerte .......................................................................................................................................... 69 Tabla 39. Resultado de la absorbancia de la fracción activa de las variedades Hass y Fuerte en presencia de Escherichia coli. ........................................................................... 71 Tabla 40. Resultados del % de inhibición del extracto y las fracciones de las variedades Hass y Fuerte frente a Escherichia coli ............................................................................ 72 Tabla 41. Resultados del análisis estadístico .................................................................... 72 Tabla 42. Resultado de las absorbancias medidas de las variedades Hass y Fuerte en presencia de Staphylococcus aureus. ................................................................................ 73 Tabla 43. Resultados del % de inhibición del extracto y las fracciones de las variedades Fuerte y Hass en presencia de Staphylococcus aureus. .................................................... 74 Tabla 44. Resultados del análisis estadístico .................................................................... 75

ÍNDICE DE GRÁFICAS

Gráfica 1. Unidades estructurales de los metabolitos secundarios ................................... 16 Gráfica 2. Origen de metabolitos secundarios a partir del metabolismo primario ........... 16 Gráfica 3. Esquema de distribución para la placa de microdilución ................................ 42 Gráfica 4. Curva de calibración de estándar de quercetina .............................................. 61 Gráfica 5. Curva de estándar de ácido gálico ................................................................... 63 Gráfica 6. Curva del estándar del ácido ascórbico ........................................................... 65 Gráfica 7. Curva del % de inhibición de la semilla Hass ................................................. 66 Gráfica 8. Curva del % de inhibición de la fracción acuosa de la semilla Hass ............... 66 Gráfica 9. Curva del % de inhibición de la fracción éter dietílico de la semilla Hass ..... 67 Gráfica 10. Curva del % de inhibición del extracto de la semilla Fuerte ......................... 68 Gráfica 11. Curva del % de inhibición de la fracción acuosa de la semilla Fuerte .......... 69 Gráfica 12. Curva del % de inhibición de la fracción éter dietílico de la semilla Fuerte . 70 Gráfica 13. Curvas de los % de inhibición y las fracciones ............................................. 70

ÍNDICE DE ECUACIONES

Ecuación 1. Cálculo del porcentaje de humedad .................................................. 12 Ecuación 2. Cálculo del porcentaje de sólidos totales .......................................... 12 Ecuación 3. Cálculo del porcentaje de Cenizas .................................................... 12 Ecuación 4. Cálculo del porcentaje de Grasa ....................................................... 13 Ecuación 5. Cálculo del porcentaje de proteína .................................................... 13 Ecuación 6. Cálculo del porcentaje de Carbohidratos .......................................... 14 Ecuación 7. Cálculo del porcentaje de fibra cruda ............................................... 15 Ecuación 8. Cálculo del porcentaje de inhibición del DPPH ............................... 22 Ecuación 9. Cálculo del porcentaje de inhibición................................................. 42 Ecuación 10. Porcentaje de inhibición, frente al DPPH ....................................... 43 Ecuación 11. Fórmula para el cálculo de Varianza .............................................. 45 Ecuación 12. Fórmula para el cálculo de la Desviación Estándar ........................ 46

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Ecuación 13. Texp. Para varianzas iguales ........................................................... 46 Ecuación 14. Texp. Para varianzas diferentes ...................................................... 46 Ecuación 15. Cálculo del rendimiento .................................................................. 54

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Tema: “Caracterización bromatológica de la semilla de aguacate (Persea americana) y extracción e identificación de la fracción con mayor actividad antimicrobiana y antioxidante”

Autora: Shirley Triguero Ruiz Tutora: Msc. Dayana Borja Espín Co-tutora: Msc. Lorena Goetschel

RESUMEN

En el presente trabajo de investigación se determinó la composición proximal (porcentaje de humedad, sólidos totales, cenizas, grasa, proteína, fibra cruda y carbohidratos) de la semilla de aguacate (Persea americana) de la variedad Hass y Fuerte, los resultados para la variedad de semilla Hass son: humedad 12,24%; sólidos totales (ceniza 3,65%; proteína 4,43%; fibra 8,50%; grasa 2,21%; y carbohidratos 68,99%), para la semilla de la variedad Fuerte se obtuvo los siguientes resultados, para humedad el 11,97%; sólidos totales (ceniza 3,25%; proteína 3,34%; fibra 9,08%; grasa 1,85%; carbohidratos 70,54%), además se comparó entre si los resultandos, obteniendo que ambas variedades son diferentes. Posterior a esto se realizó una extracción mediante maceración con etanol al 96%, dicho extracto se fraccionó y se realizó un tamizaje fitoquímico y cromatografía de capa fina para identificar los grupos de compuestos, obteniéndose en mayor abundancia los siguientes metabolitos secundarios: taninos, fenoles, quinonas, flavonoides y Saponinas; se cuantifico los fenoles y flavonoides presentes las fracciones. Se determinó la actividad antioxidante mediante el método de DPPH con las fracciones que presentan mayor concentración de flavonoides, obteniendo el porcentaje de inhibición de cada fracción activa, siendo el extracto total de semilla de la variedad Hass la que mayor actividad antioxidante presenta. Finalmente se realizó la evaluación de la actividad antimicrobiana con la fracciones que presentan mayor concentración de flavonoides, mediante el método de placa de microdilución en dos cepas bacterianas (Escherichia coli y Staphylococcus aureus), siendo la fracción de éter dietilico de la variedad Hass la que mejores porcentajes de inhibición dio incluso mejor que el antibiótico Ceftriaxona.

Palabras claves: aguacate, antimicrobiano, tamizaje fitoquímico, DPPH, antioxidante

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Title: "Bromatological characterization of the avocado seed (Persea americana) and

extraction and identification of the fraction with greater antimicrobial and antioxidant activity

Abstract

In the present work of investigation the proximal composition (percentage of humidity, total solids, ashes, fat, protein, crude fiber and carbohydrates) of the seed of avocado (Persea americana) of the Hass and Fuerte variety was determined, the results for the Hass seed variety are: moisture 12.24%; total solids (ash 3.65%, protein 4.43%, fiber 8.50%, fat 2.21%, and carbohydrates 68.99%), for the seed of the Fuerte variety the following results were obtained, for humidity 11.97%; total solids (ash 3.25%, protein 3.34%, fiber 9.08%, fat 1.85%, carbohydrates 70.54%), in addition the results were compared, obtaining that both varieties are different. After this, an extraction was made by maceration with 96% ethanol, this extract was fractioned and a phytochemical screening and thin layer chromatography were performed to identify the groups of compounds, obtaining in greater abundance the following secondary metabolites: tannins, phenols, quinones, flavonoids and saponins; the phenols and flavonoids present the fractions were quantified. The antioxidant activity was determined by means of the DPPH method with the fractions that have the highest concentration of flavonoids, obtaining the percentage of inhibition of each active fraction, being the total seed extract of the Hass variety the one with the highest antioxidant activity. Finally, the evaluation of the antimicrobial activity was carried out with the fractions that have the highest concentration of flavonoids, by means of the microdilution plate method in two bacterial strains (Escherichia coli and Staphylococcus aureus), being the fraction of diethyl ether of the Hass variety the one that Better percentages of inhibition gave even better than the antibiotic Ceftriaxone.

Keywords: avocado, antimicrobial, phytochemical screening, DPPH, antioxidant

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INTRODUCCIÓN En el presente trabajo se realizó la caracterización bromatológica de la semilla

de aguacate (Persea americana) y fraccionamiento e identificación de la fracción con mayor actividad antimicrobiana y antioxidante.

En el capítulo 1 “El Problema”, se explica el planteamiento del problema con

detalle aclara la problemática que con lleva a la realización de la investigación; la formulación del problema y la justificación e importancia del porqué la realización de esta investigación.

En el capítulo 2 “Marco teórico”, se exponen como antecedentes algunas

investigaciones ya realizadas en otros países sobre la semilla de aguacate, mediante fuentes bibliográficas se indica su composición, principios activos y propiedades, metabolitos secundarios, métodos de extracción, fraccionamiento e identificación de principios activos, antioxidante y antimicrobiano. También se definen las variables y se exponen las políticas y reglamentos que rigen el desarrollo del proyecto.

En el capítulo 3 “Marco Metodológico”, se define el tipo, nivel y paradigma de

investigación al que pertenece el presente proyecto, se describe: población muestra, métodos y materiales que se utilizaron en la experimentación. En este capítulo también se mencionan las variables con sus dimensiones e indicadores mediante la matriz de operacionalización de variables.

En el capítulo 4 se presenta el análisis y discusiones de los resultados, se detallan

los resultados obtenidos, mediante análisis estadístico En el capítulo 5, se realizó las conclusiones en base a los objetivos planteados en

la investigación y se realizan las respectivas recomendaciones para investigaciones a futuro.

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CAPÍTULO I

EL PROBLEMA 1.1 Planteamiento del problema La agricultura es una de las principales actividades desarrolladas en el país, se

considera como la actividad de extraer, producir, distribuir y comercializar productos cultivados. Es la columna vertebral de muchos países en vía de desarrollo, ya que proporciona alimento y empleo generando ingresos económicos para el país, es así que alrededor de 1.6 de millones de personas en el Ecuador trabajan en esta actividad. (Facultad de Ingeniería Agropecuaria, 2017)

La agricultura y la protección social en las zonas rurales se encuentran ligadas

entre sí, ya que es el sustento económico de muchas familias, sacar de la pobreza a estas personas resulta difícil, por ello programas de capacitación, y ayuda tecnológica permitirá que los productos obtenidos de la agricultura mejoren incrementando sus ingresos económicos lo cual disminuirá el hambre y la pobreza en dichas personas. (FAO, 2015)

Actualmente en el Ecuador se producen diferentes variedades de aguacate,

siendo la variedad Hass la que tiene una demanda internacional. Por este motivo, el INIAP capacita a los agricultores con técnicas avanzadas para mejorar la calidad del producto, ya que representa un ingreso económico al país, es así que Wilson Vásquez, jefe de la Granja Tumbaco del INIAP, señala que existen 500 hectáreas de la variedad Hass en las provincias de Carchi, Imbabura y Pichincha.

La mayor parte de la producción es destinada al mercado nacional, y la parte que

se exporta va destinada al mercado europeo, lo mejor de todo esto es que gracias al clima favorecido que presenta el Ecuador se produce aguacate todo el año, cual hace posible la exportación del producto y la generación de ingresos económicos para familias que viven de esta actividad. (Ministerio de Agricultura y Ganadería, 2017)

El Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), realiza un programa de Fruticultura, en la cual se evalúa el cultivo del aguacate, dando como resultado que a mayor siembra del cultivo de aguacate hay mayor producción por superficie, mejorando la calidad de la fruta, y generando oportunidades de trabajo. (Ministerio de Agricultura y Ganadería, 2012)

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Actualmente el mundo se encuentra en una situación crítica, ya que la agricultura debe satisfacer las necesidades alimenticias de una población que está en constante crecimiento, generando un aumento del uso de los recursos naturales como el suelo y el agua, bajo graves cambios climáticos. En consecuencia, los esfuerzos están enfocados en generar una transición de la forma de producción de los alimentos, para que estos sean más sostenibles, más beneficiosos para la salud humana y con menos consecuencias ambientales. En muchos países se considera a la agricultura como una actividad que contamina el medio ambiente, lo cual lleva a que se de otro enfoque para que genere beneficios, productos e incluso mayores fuentes de empleo y por tanto ingresos económicos; de ahí nace la agroecología la cual es descrita por la FAO como la base para aplicar conceptos y principios ecológicos con el fin de optimizar las interacciones entre las plantas, los animales, los seres vivos y el medio ambiente. La agroecología al mismo tiempo que apoya a una alimentación saludable, justa y sostenida permite restaurar los servicios ecosistémicos, que muchas veces son destruidos no solo por dicha actividad sino también por las actividades industriales, las cuales buscan aprovechar los recursos naturales al máximo. Para generar beneficios se necesita un entorno favorable, que incluya políticas, inversión pública, instituciones e investigaciones adecuadas. (Centro de conocimientos sobre agroecología, 2017)

La agricultura y la industria van de la mano, ya que los productos obtenidos de la tierra son procesados y convertidos en productos secundarios; sin embargo, mucha de la materia prima utilizadas a nivel industrial generan algún tipo de contaminación sea por el uso de maquinaria pesada, por la liberación de polvos, o simplemente por desecho parcial de sus componentes como es el caso de las frutas, o las semillas utilizadas para la extracción de aceites. En el mundo muchas industrias carecen de un manejo adecuado de desechos, por lo que estos terminan en la basura generando a largo plazo una contaminación mayor. El manejo de los desechos depende de las normas anticontaminación que posee cada país, lo que puede contribuir de forma importante a reducir la emisión de residuos contaminantes, y también a utilizarlos de forma rentable; aunque muchos países aún siguen careciendo de esta política. (Departamento Económico y Social (FAO), 1997)

De forma empírica se conoce que ciertos desechos naturales considerados así por las industrias tienen beneficios y aplicaciones útiles para la humanidad y el medio ambiente; sin embargo, no existen investigaciones científicas que lo sustenta especialmente en el caso de la semilla de aguacate.

Dichos desechos naturales pueden contar con principios activos, los cuales pueden ser utilizados con diferentes fines y para diferentes áreas, como por ejemplo antioxidantes, lo cual representa alternativas para una alimentación más saludable.

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Además, pueden contener sustancias con capacidad antimicrobiana, constituyendo una opción para prevenir la aparición de infecciones.

Los antioxidantes existen de dos tipos los sintéticos y los naturales, en los alimentos estos están enfocados a evitar el enranciamiento de las grasas, el cambio de color y pérdida del valor nutricional, es decir prolongan la vida útil del alimento, existen varias estructuras moleculares con diferencias sustanciales en cuanto a su efectividad cuando se usan sobre diferentes alimentos o en diferentes condiciones de proceso y manejo. Por lo que la selección de un antioxidante adecuado optimiza la dificultad de predecir cómo funcionará en presencia de prooxidantes y antioxidantes que se encuentran presentes de forma natural en el alimento o se producen durante el procesado de este. (Pokorni, 2001).

Las tendencias futuras señalan que los inhibidores de la oxidación son

importantes no solo como protectores de los alimentos, sino también contra ciertos estados patológicos, al aumentar el conocimiento sobre los peligros potenciales para la salud que conlleva el consumo de antioxidantes sintéticos, se ha generado interés por el uso de antioxidantes naturales asumiendo que los antioxidantes naturales son más seguros, pero algo debemos tener claro el ser humano debe obtener los antioxidantes a partir de la dieta, surgiendo el interés actual hacia el papel de los antioxidantes contenidos en la dieta como componentes bioactivos de los alimentos, alguno de ellos son conocidos como la vitamina E y C. Además, el interés por los flavonoides ha aumentado, estos son compuestos de difenilpropanos que frecuentemente se encuentran en plantas, se consumen en la alimentación diaria, siendo la principal fuente las verduras y frutas. Los flavonoides y otros polifenoles poseen acciones antitumorales, antialérgicas, antiagregantes, antiisquémicas y antiinflamatorias. Según el estudio de Zutphen Elderly señala que el consumo de flavonoides reduce la mortalidad asociada a las enfermedades coronarias, por otro lado, algunos estudios epidemiológicos señalan el papel de los antioxidantes fenólicos de la dieta in vivo como protectores contra el cáncer. Los flavonoides pueden ejercer esta actividad por inhibición de algunas enzimas como la xantina oxidas, lipooxigenasa, por interacción con otros antioxidantes como el ascorbato, y lo que es más importante captando radicales libres. (Pokorni, 2001)

Debido a la creciente demanda de población y su necesidad de producir

alimentos sanos, los fabricantes optan por añadir antioxidantes naturales obtenidos de tejidos animales y/o vegetales, pero antes de ser agregados estos deben cumplir con requerimientos tales como ser solubles en agua, no deben contribuir con colores, olores, y sabores, deben ser estables al menos un año a temperaturas de 25ºC y 30ºC, ser fáciles de incorporar y deben ser efectivos a concentraciones bajas. (Pokorni, 2001)

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En conclusión, la agricultura es y seguirá siendo quien mueva la economía de las zonas rurales, la fuente primaria de alimentación del ser humano, los productos obtenidos de dicha actividad son la materia prima para las industrias, aunque sus desechos provocan gran contaminación. El aumento creciente de la población obliga a aprovechar las cualidades beneficiosas de los desechos con la finalidad de reducir el impacto ambiental.

1.2 Formulación del problema ¿Qué características bromatológicas presenta la semilla de aguacate Persea

americana y cuáles son los grupos de compuestos responsables de su efecto antimicrobiano y antioxidante?

1.2.1 Preguntas directrices.

• ¿Qué porcentaje de humedad, sólidos totales, ceniza, grasa, fibra cruda, proteína y carbohidratos presenta la semilla de aguacate de la variedad Hass y Fuerte?

• ¿Cómo se debe preparar la muestra para el proceso de extracción? • ¿Cómo fraccionar el extracto crudo obtenido? • ¿Cómo extraer los principios activos presentes en la semilla de aguacate

de la variedad Hass y Fuerte? • ¿Cómo identificar los grupos de compuestos extraídos de la semilla de

aguacate? • ¿Cómo evaluar la actividad antimicrobiana de las fracciones obtenidas? • ¿Cómo evaluar la propiedad antioxidante de las fracciones obtenidas?

1.3 Objetivos 1.3.1 General. Realizar la caracterización bromatológica de la semilla de aguacate de las

variedades Hass y Fuerte, y fraccionar e identificar los grupos de compuestos responsables de la actividad antimicrobiana y antioxidante presente en el extracto.

1.3.2 Específicos.

• Determinar la composición proximal de las semillas de aguacates de las variedades Hass y Fuerte, mediante el cálculo del porcentaje de: humedad, sólidos totales, ceniza, grasa, fibra cruda, proteína y carbohidratos.

• Realizar una comparación cuantitativa de los resultados bromatológicos obtenidos entre la variedad Hass y la variedad Fuerte.

• Realizar una extracción mediante maceración con etanol al 96% • Identificar los grupos de compuestos fitoquímicos presentes en las

fracciones obtenidas mediante pruebas y/o ensayos de tamizaje Fitoquímico y cromatografía en capa fina.

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• Evaluar la actividad antioxidante de las fracciones con mayor concentración de flavonoides o fenoles obtenidas, mediante el método DPPH

• Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos sobre Staphylococcus aureus y Escherichia coli, mediante el ensayo de placa de microdilución.

• Determinar estadísticamente la fracción que tiene una mayor actividad antimicrobiana sobre los 2 microorganismos ensayados.

1.4 Justificación e importancia La agricultura contribuye de forma considerable al cambio climático y la vez es

una víctima de sus efectos, el cambio climático reduce la resistencia de los sistemas de producción y contribuye a la degradación de los recursos naturales. (FAO, 2015)

Actualmente los elevados niveles de hambre y malnutrición en el mundo y la

carga insostenible de las actividades humanas sobre la capacidad de la tierra representan un enorme desafío para la agricultura, el cual se va agravando por el crecimiento continuo de la población, provocando el aumento en la producción de alimentos a escala mundial en 60 por ciento, y al mismo tiempo un tercio de los alimentos producidos (1300 millones de toneladas al año) se pierden o se desperdician en todo el mundo, mientras que cerca de 815 millones de personas padecen hambre en el mundo; Dichos desperdicios provocan enormes costos económicos y medioambientales. (Organización de la Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, 2015)

Por lo tanto, para alimentar al mundo de manera sostenible es necesario cultivar

más alimentos y a la vez reducir los impactos ambientales negativos como la pérdida del suelo, agua y nutrientes, las emisiones de gases de efecto invernadero y la degradación de los ecosistemas.

En Ecuador según el censo Agropecuario del 2002 sostiene que existen 2300 ha

de aguacate en huertos como monocultivo, y 5500 has en asociación con especies perennes y/o anuales. La Dirección de Información Geográfica y Agropecuaria del MAGAP (2008), señala que en el país existen 1216 ha de aguacate guatemaltecos y 1491 ha de aguacates nacionales y antillanos. (Reinoso Chiriboga, 2015)

Una de las proyecciones de los agricultores en Ecuador es aumentar los cultivos

para exportar. El INIAP señala que si se mejora la calidad de siembra obtendrán mejores beneficios, se desea llegar a 10000 has de siembra para poder exportar mayor cantidad de este producto.

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En el mercado ecuatoriano una variedad que se consume mucho es la conocida como “Fuerte”, cuyo consumo per cápita calculado es de 1,4 kg por habitante (Ministerio de Agricultura y Ganadería, 2012). Mientras que la variedad Hass presenta precios más bajos, siendo el preferido para mercados externos, ya que Corpoaguacate recibe constantemente pedidos por varios exportadores locales, un contenedor semanal a $1,15 el kg, el problema radica en que no existe suficiente área cultivada, para poder cumplir con el requerimiento de exportación. (Frias, 2016)

En el Ecuador la primera utilidad que recibe el aguacate es para consumo local,

consumiendo únicamente su pulpa de diferentes formas en ensaladas, batidos, purés, etc., su segunda aplicación a nivel industrial es la elaboración de aceites siendo la variedad Hass la más utilizada, en ambas aplicaciones se desecha la cáscara y la semilla generando contaminación ambiental. Estos subproductos pueden ser utilizados disminuyendo de esa forma el impacto ambiental que esta fruta genera, si bien es cierto la demanda de consumo no es tan grande como sucede con otras frutas, pero su utilización y producción va en aumento.

El término nutracéutico es utilizado para referirse a productos de origen natural

con propiedades biológicas activas, beneficiosas para la salud y con capacidad preventiva y/o terapéutica definida. (Sociedad Española de Nutraceútica Médica, s.f.).

La semilla de aguacate presenta propiedades que pueden ser definidas como

nutracéuticas, mismas que pueden ser aprovechadas por la industria alimenticia y farmacéutica.

Según lo expuesto, esta investigación es importante ya que el Ecuador se está

proyectando a ser un exportador de aguacate, lo que incrementará las zonas de producción. El consumo local, también es considerable y podría aumentar. El aguacate es una fruta que se produce casi todo el año, por ende, la generación de los subproductos es constante y a su vez la contaminación ambiental también. La generación de una nueva utilidad para los desechos generará nuevas alternativas de utilización de los subproductos y a su vez nuevas fuentes de trabajo, promoviendo de esa forma una producción sostenible generando impactos positivos en el ambiente y en la economía del país.

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CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO 2.1 ANTECEDENTES De forma creciente alrededor del mundo, pero sobre todo los países de América

Central y del Sur se han enfocado en explotar las cualidades de los desechos del aguacate como la semilla y la cscara, es por ello que Pedro Luis Chávez Álvarez (2012) realizó la evaluación antimicrobiana y antioxidante en extracto de residuos de aguacate.

Henríquez L., Patiño J., García M., (2013) realizaron la estimación de la

actividad antimicrobiana del polvo de semillas de aguacate, se estimó por el método de la concentración mínima inhibitoria para cepas microbianas seleccionadas por su relación con el deterioro de productos cárnicos. El polvo de las semillas de aguacate inhibió el crecimiento de las cepas microbianas ensayadas, observándose resultados positivos a la menor concentración del aditivo (48,8 mg/L), lo que demuestra su potencial antimicrobiano para su aplicación en la formulación de alimentos para garantizar su inocuidad e incrementar su vida útil.

Wilson Polania Barreto (2014) en la Universidad Nacional de Colombia

investigó la actividad antioxidante de los residuos del aguacate Hass (Persea americana Mill. variedad Hass) sometidos a extracciones clásicas y a fluidos presurizados, se empleó extracción soxhlet a presión reducida usando tanto de forma directa como sucesivo hexano, acetato de etilo y etanol, éste se empleó en evaluaciones posteriores de actividad antioxidante sobre oleína de palma. Posteriormente se evaluó la actividad antioxidante del mejor extracto contra el correspondiente obtenido mediante Extracción soxhlet a presión atmosférica. Tanto para oleína de palma como para carne de res cruda se encontró que la semilla fue más promisoria que el epicarpio sometido a extracción soxhlet a presión reducida.

Urra C., Soto C., Zuñiga M., (2015) analizaron las propiedades antioxidantes de

residuos (semilla y cáscara) de la agroindustria de palta (Persea americana mill, avocado) en Chile, utilizando las variedades Hass (semillas y cáscara). Las muestras fueron liofilizadas, molidas y almacenadas al vacío a temperatura ambiente. Las extracciones se realizaron con una razón residuo/solvente 1/20 (Metanol 100%, Metanol/Agua (75/25) y Agua 100%), 1 hora a 45°C. Los extractos recuperados fueron analizados para compuestos fenólicos totales (CFT, 3), usando ácido gálico como patrón. Para la medición de antioxidantes se utilizaron 2 métodos: Captación del radical libre DPPH y el método de la capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC), usando Trolox como patrón.

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No existen mayor cantidad de estudios e investigaciones que sustenten la

actividad antimicrobiana y antioxidante de la semilla de aguacate, sin embargo, los pocos estudios realizados y publicados demuestran que la semilla de aguacate si tiene dichas propiedades, pero no se analiza la composición proximal de esta semilla.

2.2 Fundamento Teórico 2.2.1 Aguacate. En la época precolombina el aguacate se cultivaba en México y América

Central, donde recibía el nombre de “Ahuacatl” que los españoles convirtieron en aguacate, su cultivo se extendió por las faldas de la Cordillera Andina hasta Perú donde sería llamado “Palta”.

De esta forma los españoles introdujeron el aguacate en los Antillas y los

portugueses en Brasil, donde ya se cultivaba en el siglo XVII, después fue llevado a Florida, en California no se cultivó sino hasta 1871.

En el siglo XVIII lo introducen en las Islas Canarias y luego a España. En

Centro América se encuentra en zonas como México, Guatemala, Colombia, Venezuela, Ecuador, Perú, Argentina, Brasil y Chile.

El aguacate es un fruto ovalado o esférico que proviene de un árbol de hoja

perenne procedente de las zonas tropicales y subtropicales de Centroamérica, puede alcanzar hasta 20 metros de altura y tardar 4 años en producir fruto. Presenta una piel gruesa y verde brillante, aunque varía el tono y la textura de esta en función de la variedad, la pulpa es cremosa de color verde pálido a blanco amarillento muy similar a la mantequilla. En su interior se encuentra una única semilla, de tamaño considerable y de color amarillo, recubierta por una capa leñosa de color marrón que la aísla de la carne. (Sánchez Pineda de las Infantes, 2004).

2.2.1.1 Taxonomía del Aguacate. Un concepto general aceptado acerca del aguacate es que puede clasificarse en

tres razas: Mexicana, Guatemalteca y Antillana. Las características de dichas razas pueden resumirse en el siguiente cuadro:

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Tabla 1.Clasificación en Razas del Aguacate Característica Antillana Guatemalteca Mexicana

Hojas Sin olor especial Sin olor especial Olor a anís Época de floración

Febrero-marzo Marzo – abril Enero – Febrero

Época de recolección

Mayo-septiembre Enero – septiembre Junio – Octubre

Periodo Floración-recolección

5-8 meses 10 a 15 meses 6 -8 meses

Peso de la fruta 250 g. a 2,5 kg 125 g a 2,5 kg Menos de 250 g. Corteza del fruto Coriácea y lisa Gruesa y dura Delgada y lisa

Contenido en aceite del fruto

Bajo Mediano - alto Mediano –alto

Resistencia al frio Plantas jóvenes -2º a – 1ºC -4º a -2º C -4º a -3ºC Plantas adultas -4º a -1º C -5º a – 3ºC -7 a -4ºC

Fuente: (Álvarez de la Peña, 1981) Además, en el libro “El Aguacate” de Álvarez de la Peña se menciona las

variedades más corrientes existentes en el mundo como: Anaheim, Bacon, Benik, Booth 7 y 8, Choquette, Duke, Fuerte, Hall, Hass, Hickson, Lula, Mac Arthur, Mexicola, Nabal, Pollock, Redd, Rincón, Simmonds, Taylor, Tonnage, Topa – Topa, Waldin, Zutano.

De las cuales las principales variedades son: - Bacon: Es la variedad más temprana de aguacate y tiene forma ovalada. Es muy cultivada en España. Se puede obtener en los mercadas a partir del mes de octubre - Cocktail: también llamado dátil, es alargado, procede de frutos abortados, por lo que no posee hueso central, su sabor es fino y delicado, son muy comercializados en Francia. Se produce en Israel y en España. - Fuerte: Tiene forma de pera y pesa unos 250 gramos, su piel es áspera pero relativamente fina y destaca por su exquisito sabor, esta variedad es cultivada en Israel, Kenia, Sudáfrica y España. Se puede conseguir durante todo el año. - Hass: Posiblemente la variedad más conocida y comercializada en España, México y América del Sur, es pequeño, rugoso y de piel oscura, la pulpa es de color amarilla. - Pinkerton: variedad alargada, con forma de pera, la piel es rugosa y su sabor agradable, solo está disponible durante los meses de febrero y marzo. (Sánchez Pineda de las Infantes, 2004)

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2.2.1.2 Aguacate en el Ecuador. En el Ecuador, gracias a las condiciones climáticas, el aguacate tiene un futuro

prometedor, ya que en el país existen las 3 razas de aguacate: Antillanos, Mexicanos y Guatemaltecos, distribuidos en diferentes regiones o zonas del país; los Antillanos se encuentran en la Zona del Litoral, los Mexicanos y Guatemaltecos en los Valles de la serranía. Dentro de los Guatemaltecos se encuentra la variedad Hass la cual es considerada para la exportación, siendo así que la Dirección de información Geográfica y Agropecuaria del MAGAP (2008) señala que en el país existen 1216 hectáreas de aguacate Guatemalteco y 1.491 hectáreas de aguacates Nacionales y Antillanos. (Revista El Agro, 2010)

2.2.1.3 Composición del Aguacate Tabla 2. Composición proximal del aguacate en base húmeda, en 100g

Nutrientes Valor por 100 g Agua 72.33 g

Energía 167 Kcal Proteína 1.96 g

Lípidos totales 15.41 g Carbohidratos por diferencia 8.64 g

Fibra dietética total 6.8 g Azúcar total 0.30 g

Tomado de: United States Department of Agriculture (2017) Modificado por: Triguero, S.

2.2.2 Análisis de los alimentos. El análisis de los alimentos con respecto a su composición química y sus

propiedades físicas permite identificar su valor nutricional, además el análisis químico es una herramienta muy útil en proceso de producción ya que permite garantizar la calidad de dichos procesos, desde el control de materias primas hasta el producto terminado.

Las pruebas y ensayos que se realizan buscan la identificación de componentes

afines como grasas, proteínas, fibra, cenizas, sólidos totales entre otros, desde luego dichos componentes y ensayos varían en función de la naturaleza de la muestra.

2.2.2.1 Determinación de humedad y sólidos totales En alimentos naturales el agua se encuentra presente alrededor de un 60 a 90%,

el agua se presenta en dos formas, como agua libre y agua ligada, el agua libre es la que predomina en los alimentos y es la que se estima por los métodos usados para el cálculo

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del contenido de agua y el agua ligada se encuentra en los alimentos de forma cristalizada.

El método más común utilizado para la determinación del contenido de agua es

por desecación en estufa hasta peso constante en éste la muestra es deshidratada previamente a 90 – 100° C y luego se deseca en estufa de 2 a 3 horas a 98-100°C y se utiliza la pérdida de peso para determinar el contenido de humedad, mientras que la materia remanente es considerada como sólidos totales. Las ecuaciones 1, 2 y 3 resumen este proceso. (Hart & Fisher, 1984)

%𝐻𝐻𝑢𝑚𝑒𝑒𝑑𝑎𝑑 =𝑝𝑒𝑒𝑠𝑜𝑜 𝑑𝑒𝑒 𝐻𝐻2𝑂 𝑒𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑒𝑠𝑡𝑡𝑟𝑎𝑝𝑒𝑒𝑠𝑜𝑜 𝑑𝑒𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑒𝑠𝑡𝑡𝑟𝑎 ℎú𝑚𝑒𝑒𝑑𝑎

𝑥100

%𝐻𝐻𝑢𝑚𝑒𝑒𝑑𝑎𝑑 = (𝐴+𝑀)−𝐵𝑀

𝑥100 Ecuación 1. Cálculo del porcentaje de humedad

%𝑇𝑜𝑜𝑡𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑒 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑜𝑠 = 100 − %𝐻𝐻𝑢𝑚𝑒𝑒𝑑𝑎𝑑 Ecuación 2.

Cálculo del porcentaje de sólidos totales

Dónde: A= peso en gramos de cápsula vacía M= peso en gramos de muestra B= peso en gramos de la cápsula más la muestra seca 2.2.2.2 Determinación de cenizas. Todos los alimentos contienen minerales que forman parte de los compuestos

orgánicos, resulta muy difícil determinar cada uno de estos compuestos, y la incineración para destruir toda la materia orgánica cambia su naturaleza y las sales metálicas de los ácidos orgánicos se convierten en óxidos o carbonatos o a su vez pueden reaccionar durante la incineración para formar fosfatos, sulfatos o haluros; algunos elementos como el azufre y los halógenos pueden no ser retenidos en las cenizas perdiéndose por volatilización.

El método consiste en pesar cierta cantidad de extracto seco, para ser incinerada

a temperaturas de 525-550°C en una mufla, hasta que adquiera un color blanco o grisáceo, se seca en desecador y se pesa para luego determinar el porcentaje de ceniza (Hart & Fisher, 1984)

La ecuación 3 expresa la forma de calcular el contenido de ceniza. %𝐶𝑒𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 = 𝐵−𝐴

𝑀𝑥100 Ecuación 3.

Cálculo del porcentaje de Cenizas

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Dónde: A= peso en gramos del crisol vacía M= peso en gramos de muestra B= peso en gramos del crisol con la muestra calcinada 2.2.2.3 Determinación de grasa bruta. La grasa bruta se encuentra constituida por diferentes sustancias extraídas con

éter etílico, incluyendo a los ésteres de los ácidos grasos con el glicerol a los fosfolípidos, las lecitinas, los esteroles, las ceras, los ácidos grasos libres, los carotenoides, la clorofila entre otros pigmentos.

La determinación se lleva a cabo en una muestra previamente deshidratada en

estufa para eliminar su contenido en agua, se pueden utilizar dos tipos de extractores los continuos como Underwriters, Knorr, Goldfish o Bailey-Walker y los intermitentes como el Soxhlet, pero este proceso dependerá de la muestra a analizar.

El método más utilizado es el Soxhlet por su eficacia a pesar de tener la

desventaja de utilizar grandes cantidades de disolvente, el contenido de grasas del alimento se calcula mediante la pérdida de peso de la muestra o mediante el peso de las grasas extraídas. (Hart & Fisher, 1984)

%𝐺𝑟𝑎𝑠𝑎 = 𝐵−𝐴

𝑀𝑥100 Ecuación 4.

Cálculo del porcentaje de Grasa

Dónde: A= peso en gramos del vaso vacío. M= peso en gramos de muestra. B= peso en gramos del vaso con el residuo de grasa. 2.2.2.4 Determinación de proteína Para la determinación de proteína se analiza el nitrógeno total, y el método

oficial para el análisis es el J. Kjeldahl, el cual se fundamenta en convertir el nitrógeno en sulfato amónico y luego en amoníaco. Posteriormente el digerido es neutralizado con álcali y destilado sobre una solución de ácido bórico. Los iones borato resultantes son titulados usando ácido valorado y cada miliequivalente (mEq) de titulante equivale a 14 mg de nitrógeno presentes, como se observa en la ecuación 5. (Hart & Fisher, 1984)

%𝑃𝑟𝑜𝑜𝑡𝑡𝑒𝑒í𝑛𝑎 = 𝑁𝐻𝐶𝑙∗(𝑉𝑚−𝑉𝑏)∗0,014∗ƒ𝑀

𝑥100 Ecuación 5. Cálculo del porcentaje de proteína

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Dónde: 𝑁𝐻𝐶𝑙= normalidad del ácido clorhídrico valorado (aprox. 0,1N) 𝑉𝑚= volumen de HCl valorado consumido por la muestra 𝑉𝑏= volumen de HCl valorado consumido por el blanco M= peso en gramos de muestra ƒ= factor de conversión de porcentaje de nitrógeno a porcentaje de proteína,

dependiente del tipo de alimento. 2.2.2.5 Determinación de carbohidratos Los carbohidratos se encuentran en plantas y animales, son la principal fuente de

energía. Estos se clasifican en monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos, siendo los monosacáridos los únicos que pueden ser absorbidos por el organismo y todos los demás deben ser hidrolizados para su absorción.

En la actualidad existen diferentes métodos para la determinación de

carbohidratos, entre ellos están los ensayos cualitativos y cuantitativos de color para la identificación de azúcares reductores, métodos enzimáticos, cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía de gases de los azúcares derivados, entre otros.

Sin embargo, la United States Food and Drug Administration establece que el

contenido total de carbohidratos debe ser calculado por diferencia, es decir que constituye el resultado de la sustracción de las sumas de los pesos de la humedad, ceniza, proteína y grasa del peso total del alimento. Mediante la ecuación 6 se puede determinar el contenido de carbohidratos en forma de porcentaje.

%𝐶𝑎𝑟𝑏𝑜𝑜ℎ𝑖𝑑𝑟𝑎𝑡𝑡𝑜𝑜𝑠 = 100 − (𝐴𝐴 + 𝐵𝐵 + 𝐶 + 𝐷) Ecuación 6. Cálculo del porcentaje de Carbohidratos

Dónde: A= porcentaje de humedad B= porcentaje de cenizas C= porcentaje de proteína D= porcentaje de grasa 2.2.2.5 Determinación de fibra bruta La fibra bruta se encuentra presente en los alimentos de origen vegetal y se

encuentra constituida por celulosa, lignina y pentosanas.

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La determinación de la fibra bruta se basa en la digestión ácido-alcalina, que utiliza ácido sulfúrico para la disolución, una disolución con hidróxido de sodio, luego se calienta a 600°C durante 16 horas en una mufla. Este método busca la eliminación progresiva de los carbohidratos. (Hart & Fisher, 1984) Y se calcula mediante la ecuación 7.

%𝐹𝑖𝑏𝑟𝑎 = (𝐷−𝐶)−(𝐹−𝐸)𝑀

𝑥100 Ecuación 7. Cálculo del porcentaje de fibra cruda

Dónde: C= peso en gramos del filtro D= peso en gramos del filtro más fibra E= peso en gramos del crisol F= peso en gramos del crisol más ceniza

M= peso en gramos de muestra

2.2.3 Componente químico vegetal. Las plantas llevan a cabo procesos bioquímicos que le permiten mantener su

homeostasis, procesos que implican la producción de metabolitos primarios y secundarios.

Metabolitos primarios son todos aquellos que son esenciales para las actividades

y funciones de la planta. Metabolito secundario se consideran a aquellas sustancias que son producidas

por otras especies y no son necesarias o esenciales para el crecimiento, desarrollo y funcionamiento de la planta.

2.2.3.1 Metabolitos secundarios. Existen 4 compuestos fundamentales de partida, precursores o “Building

blocks”, que al intervenir en diferentes rutas metabólicas secundarias que se originan del metabolismo primario del carbono, generan los denominados productos naturales, que se diferencian entre sí principalmente por su estructura y propiedades.

Acetilcoenzima A constituye el precursor de los ácidos grasos, eicosanoides,

poliacetilenos, policétidos macrocíclicos y aromáticos. A partir del mevalonato se forman los terpenos (carotenoides, esteroides, etc.), mientras que a partir del anión shikamato se forman los compuestos aromáticos (polifenoles, ácidos cinámicos, aminoácidos aromáticos, etc.). En cambio, los alcaloides son generados a partir de los aminoácidos. (Claramunt, Farrán, López, Pérez, & Santa María, 2013).

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Gráfica 1. Unidades estructurales de los metabolitos secundarios Fuente: Claramunt, Farrán, López, Pérez, & Santa María (2013)

Gráfica 2. Origen de metabolitos secundarios a partir del metabolismo primario

Fuente: Claramunt, Farrán, López, Pérez, & Santa María (2013) Algunos metabolitos que se encuentran presentes en la semilla de aguacate

según fuentes bibliográficas son: compuestos alifaticos de cadena larga; 1,2,4-trihidroxi-n-heptadecano-16-eno;1-acetoxi-2-hidroxi-4-oxo-heneicosa-12; 15-dieno (persina); protocianidina, la carnitina, carotenoides, el aceite de la semilla es abundante en tocoferol, glucósidos del ácido abscísico, fitosteroles, triterpenos, ácidos grasos con enlaces oleofínicos y acetilénicos, ácidos furanoicos, dímeros de flavanoles, proantocianidina oligoméricas, polifenoles y antocianinas.

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2.2.3.1.1 Principales usos de los metabolitos secundarios Taninos: se encuentran generalmente en las plantas y en mayor cantidad en

células muertas o moribundas, los taninos ejercen un efecto inhibidor sobre muchas enzimas debido a la precipitación de proteínas, lo que les da la función protectora en corteza y duramen de las especies vegetales, se los usa a nivel industrial en la fabricación del cuero el cual se obtiene de árboles como el Quebracho, Acacia, Castaño y Myrobalans, en la industria farmacéutica se lo obtiene de las agallas del Roble, muchas plantas como la canela, el clavo de olor entre otras contiene taninos entre sus principales componentes terapéuticos. (Evans, 2009)

Entre sus propiedades terapéuticas o medicinales, actúan como protección para

superficies inflamadas de la boca la garganta, actúan como antidiarreicos, como antídotos en envenenamiento por metales pesados, alcaloides y glucósidos. Estudios recientes se han centrado en la actividad antitumoral de los taninos. (Evans, 2009)

La actividad antitumoral del té verde y negro ha sido ampliamente investigada

en los últimos años con resultados positivos, demostrando que la epigalocatequina-3-galato previene la angiogénesis en ratones, el jugo de arándano reduce las infecciones bacterianas de la vejiga, siendo las proantocianidinas que se encuentran presente en los arándanos rojos, son los responsables de inhibir la adherencia de E. coli P-fimbriado a la superficie de las células uroepiteliales. (Evans, 2009)

Algunos medicamentos (por ejemplo, té, hojas de hamamelis y corteza de

hamamelis) contienen taninos hidrolizables y condensados. Las siguientes especies son ricos en taninos condensados:

• Cortezas: canela, cereza silvestre, cinchona, sauce, acacia (acacia, mimosa), roble y hamamelis

• Raíces y rizomas: krameria (rhatany) y helecho macho • Flores: lima y espino • Semillas: cacao, guaraná, kola y areca • Frutas: arándanos, uvas (vinos tintos), espino • Hojas: hamamelis, espino blanco y té, especialmente té verde • Extractos y jugos secos: catechu, acacia y mangle cortes, East Indian

Kino, goma butea y eucalipto Kino (Evans, 2009) Fenoles: al constituir posiblemente el grupo más grande de metabolitos

secundarios este se encuentra presente en la gran mayoría de plantas, siendo compuestos importantes en algunas de las plantas medicinales y en la industria alimentaria se utilizan como agentes colorantes, aromatizantes y antioxidantes. (Evans, 2009)

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Quinonas: la antraquinona tiene una acción laxante restringida al intestino

grueso, retrasando su efecto hasta 6 horas más, además los derivados de antraquinona y antranol influyen en el trasporte de iones a través de las células del colon mediante la inhibición de los canales de Cl. (Evans, 2009)

Flavonoides: las investigaciones recientes han demostrado su acción medicinal

en plantas como la raíz de regaliz, la manzanilla romana y el gingko, lo que deja como posibilidad que cierta cantidad de remedios herbales, cuyos componentes aún se desconocen, contienen flavonoides activos, existe otro grupo de plantas que contiene flavonoides como la flor de abedul, flor de caléndula, flor más vieja, flor de lima de cola de caballo y la pasiflora, las cuales tienen un efecto antiinflamatorio y efecto antialérgenicos.

Tiene propiedades antitrombóticas y vasoprotectoras, para la inhibición de

tumores y actúa como protector para la mucosa gástrica. Alguna de estas propiedades farmacológicas puede explicarse sobre la base de la actividad antioxidante.

Además, muchas de las plantas que contiene flavonoides son diuréticas como por ejemplo la buchu y escoba; otras antiespasmódicas como el regaliz y el perejil, o por último antimicóticas.

Algunas investigaciones señalan la actividad anti-Helicobacter pylori in vitro de

varios flavonoides como la hesperidina, hesperetina, naringina, naringenina, diosmina, diosmetina, e incluso sugieren que si no son potentes inhibidores de dicha actividad pueden contribuir a la prevención de la gastritis.

Por otra parte, el fustic (de la madera de Morus tinctoria) y zumaque (hojas de

Rhus spp.) sirve como colorantes y contienen taninos. La flavona pura, que es incolora, se produce en la superficie de algunas especies de Prímula, muchas flavonas son derivados fenólicos o metoxilados y forman glucósidos solubles en savia. (Evans, 2009)

Saponinas: Las saponinas esteroides son de gran importancia farmacéutica

debido a su relación con compuestos tales como las hormonas sexuales, la cortisona, los diuréticos esteroides, la vitamina D y los glucósidos cardíacos. Algunos esteroides naturales son utilizados como punto de partida para la síntesis parcial de materiales con fines medicinales como es el caso de esteroides, la cortisona, las hecogenina con sustitución proporciona el material de partida para la síntesis de los corticosteroides, la diosgenina por su parte es adecuada para la fabricación de anticonceptivos orales y las

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hormonas sexuales, también puede usarse para la síntesis de corticosteroides. (Evans, 2009)

Aceites y grasas: las semillas utilizadas para la extracción de aceites fijos tienen

una importancia superior a la de los cereales, estos también pueden ser extraídos del pericarpio de la fruta, de esa forma podemos encontrar una gran variedad de aceites los cuales van a diferir en la cantidad de carbonos que la cadena de ácido graso posea, se pueden presentar sólidos o líquidos, y el aguacate es una de las frutas que posee un aceite de gran calidad. (Evans, 2009)

2.2.4 Antioxidantes. Los antioxidantes retardan el desarrollo de flavores que produce la rancidez, los

antioxidantes pueden inhibir o retardar la oxidación de dos formas: la primera es captando radicales libres, en cuyo caso se denominan antioxidantes primarios o por mecanismo y segundo son los que no están relacionados con la captación de radicales libres estos se conocen como antioxidantes secundarios. (Pokorni, 2001)

Los primarios incluyen compuestos fenólicos, como la vitamina E (alfa

tocoferol), los secundarios operan a través de un cierto número de mecanismos, incluyendo su unión a metales pesados, captación del oxígeno, conversión de hidroperóxidos a especies no radicales, absorción de la radiación UV o desactivación del oxígeno singulete, lo que nos indica que los antioxidantes secundarios solo poseen dicha actividad en presencia de un segundo componente minoritario. (Pokorni, 2001)

Antioxidantes en alimentos: Los antioxidantes en los alimentos pueden ser

definidos como cualquier sustancia que es capaz de aplazar, retardar o prevenir el desarrollo de ranciedad en el alimento u otro deterioro del flavor que produzca la oxidación.

2.2.4.1 Tipos de antioxidantes. Los antioxidantes son ampliamente utilizados como aditivos en grasas, aceites y

durante el procesado de los alimentos para prevenir o retardar el deterioro oxidativo de los alimentos. (Pokorni, 2001)

2.2.4.1.1 Antioxidantes sintéticos. Los antioxidantes sintéticos más usados son los compuestos fenólicos como el

hidroxianisol butilado (BHA), el hidroxitolueno butilado (BHT), la butilhidroquinona terciaria (TBHQ), y los ésteres del ácido gálico, como el galato de propilo (PG), el uso

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de estos antioxidantes está limitado al 0.02% del contenido de grasa o aceite del alimento. (Pokorni, 2001)

Los antioxidantes fenólicos contienen grupos alquílicas lo cual mejora la

solubilidad en grasas y aceites. El antioxidante más adecuado para aceites vegetales el TBHQ, el BHA y el BHT son estables al calor por ello se usan a menudo para productos de cocina y fritos. Por otra parte, están los galatos que por su tendencia a formar productos oscuros con los iones de hierro y su sensibilidad al calentamiento no se usan en productos de fritura.

Los antioxidantes sintéticos han sido cuestionados por varios años según

estudios realizados de toxicología, por ello se aconseja que el uso sea con precaución, dando como alternativas el uso de productos naturales. (Pokorni, 2001)

2.2.4.1.2 Antioxidantes naturales.

El uso de antioxidantes de origen natural es muy antiguo, ya que la popularidad del ahumado y el especiado como métodos caseros para la preservación de carnes y otros alimentos ricos en grasa puede deberse a que dichos tratamiento poseen un efecto retardante sobre el enranciamiento, es así que se consideran antioxidantes naturales a las sustancias que se presentan o pueden ser extraídas de los tejidos de las plantas y los animales y a aquellos que se forman durante el proceso de cocción o el proceso de compuestos alimenticios de origen vegetal o animal.

Estos se pueden encontrar en plantas, microorganismo, hongos e incluso tejido

animal. La mayoría son compuestos fenólicos entre los cuales están los tocoferoles, flavonoides y los ácidos fenólicos.

Los tocoferoles (Toc) y los tocotrienoles (Toc -3) son los más conocidos por

ende los más usados, el representante principal de este grupo es el α-tocoferol que tiene la capacidad antioxidante más baja en aceites comestibles, estos actúan donando un hidrógeno del grupo hidroxilo al radical peroxilo, el radical formado se estabiliza por deslocalización del electrón sobre la estructura del anillo aromático. A concentraciones bajas (≤ 50 𝜇𝑔 𝑔-1) el α-tocoferol es más efectivo que el 𝛾𝛾-tocoferol, pero a concentraciones altas (≤ 100 𝜇𝑔 𝑔-1) es al revés.

Los flavonoides son un grupo de origen vegetal, su estructura básica consiste en

dos anillos aromáticos unidos por una cadena alifática, se encuentran en todos los tejidos vegetales e incluyen a las flavonas, flavonoles, isoflavonas, flavononas y las

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chalconas, ejemplo de los flavonoides es la apigenina, crisina, luteolina, datiscetina, quercetina, miricetina, morina y kemferol; las agliconas son más activas sobre la oxidación en productos en masa y en bicapas de fosfolípidos.

Los flavonoides pueden actuar como antioxidantes por captación de radicales

libres incluyendo aniones superóxido, radicales peróxido lipídicos y radicales hidroxilo, también pueden actuar como moderadores de oxígenos singulete, por quelación de metales y por inhibición de la lipooxígensa.

La actividad antioxidante de los flavonoides está condicionada por el sustrato

usado y las condiciones de catálisis de la oxidación. Tabla 3. Ventajas y Desventajas de los antioxidantes naturales y sintéticos

Antioxidante sintético Antioxidante natural Barato Costoso

Amplio uso Uso restringido a algunos productos Actividad antioxidante media o alta Amplio rango de actividad antioxidante Aumento de la preocupación por la

seguridad Percibidas como sustancias inocuas

Uso prohibido de alguno de ellos Incremento en su uso y ampliación de sus

aplicaciones Baja solubilidad en agua Gran margen de solubilidad

Fuente: (Pokorni, 2001) 2.2.4.3 Evaluación de la actividad antioxidante. La actividad antioxidante de un compuesto o de un extracto es evaluada por la

resistencia a la oxidación de los lípidos contenidos en la estructura, por lo tanto, la mayoría de los métodos hacen seguimiento a los pasos de oxidación de los lípidos, los cuales pueden categorizarse en tres grupos:

• Decaimiento del substrato, compuesto de prueba o consumo de oxígeno

• Formación de productos de oxidación a partir del substrato oxidable

• Formación o decaimiento por el sondeo de radicales libres

La actividad antioxidante es función del tiempo (velocidad de reacción), tipo de

sustrato, temperatura, concentración del antioxidante, concentración de otras sustancias (oxígeno, peróxidos, presencia de otros antioxidantes o prooxidantes) y el coeficiente de partición del antioxidante en el sustrato. (Polania Barreto, 2014)

21

En la parte inicial, la oxidación ocurre lentamente, el momento en que se incrementa repentinamente se conoce como periodo de inducción. Los hidroperóxidos lipídicos se han identificado como productos primarios de autoxidación; su descomposición produce aldehídos, cetonas, alcoholes, hidrocarburos, ácidos orgánicos volátiles y epoxi compuestos, conocidos como productos secundarios de oxidación. (Polania Barreto, 2014)

Existen diferentes pruebas física y químicas desarrolladas para el seguimiento

de la oxidación lipídica entre estos tenemos: la ganancia en peso, consumo de oxígeno (headspace), análisis cromatográfico por cambios en reactantes, titulación yodométrica, colorimetría por formación de complejos de hierro, transformada FTIR, espectrometría para dienos y trienos conjugados, TBARS, medidas del índice de estabilidad oxidativa (Rancimat), resonancia electrónica de espín (EPR), Calorimetría Diferencial de Escaneo (DSC) y resonancia magnética nuclear (NMR),absorbancia del radical oxígeno (ORAC),inactivación del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo(DPPH).

2.2.4.3.1 Método del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH). La capacidad antioxidante se determinó por primera vez por Brand Willams

(1995), consiste en una decoloración del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH), dicho radical se reduce en presencia de antioxidantes manifestando un cambio de color en la solución. (Revista Reciteia, 2011)

La actividad antioxidante se expresa como porcentaje de inhibición, lo cual

corresponde a la cantidad de radical DPPH neutralizado por el extracto a una determinada concentración, de acuerdo a la siguiente ecuación:

% 𝐼𝑁𝐻𝐻𝐼𝐵𝐵𝐼𝐶𝐼Ó𝑁 = %𝐼 = (𝐴−𝐴1)𝐴

𝑥 100 Ecuación 8. Cálculo del porcentaje de inhibición del DPPH

A: Absorbancia del blanco A1: Absorbancia del sistema (muestra)

Fuente: (Rivas, Oranday, & Verde, 2016) 2.2.5 Actividad antimicrobiana. Los antimicrobianos forman parte de los quimioterápicos, cuyo término fue

empleado en 1906 por Ehrlich para designar a las sustancias químicas utilizadas en el tratamiento de enfermedades infecciosas, por otra parte el término antibiótico fue definido por Waksman descubridor de la estreptomicina como “el compuesto anti-infeccioso producido por microorganismos, que posee la propiedad de destruir o inhibir

22

el crecimiento de otros microorganismos a bajas concentraciones”. (Larrea & Boggio, 2007)

Los tratamientos antimicrobianos tienen como finalidad destruir los genes

infecciosos, sin lesionar las células del huésped lo cual resulta posible gracias a la diferencia biológica entre las células del organismo animal, las bacterias, hongos, y micoplasmas, etc.

Durante mucho tiempo se definió a los fármacos antiinfecciosos producidos por

microorganismo, como antibióticos y los producidos en forma sintética como quimioterápicos, lo cual cambió años después, asignándose a todos los fármacos con el nombre de antimicrobianos. (Larrea & Boggio, 2007)

Los antimicrobianos se pueden clasificar por: su espectro de actividad, su

mecanismo de acción y/o efecto y por su estructura química. 2.2.5.1 Resistencia bacteriana en animales y humanos. Existen varios factores que intervienen en la resistencia a los antibióticos entre

ellas están: • Características farmacocinéticas de las diferentes

clases de antibióticos, las concentraciones obtenidas, las rutas de eliminación de los fármacos, así como por el régimen de administración la cual puede ser por insuficiencia de dosis, corta duración del tratamiento, entre otras.

• Las dosis subterapéuticas ejercen una potente y selectiva presión para la emergencia de clones resistentes predispuestos en la población bacteriana.

• El uso de antibióticos para tratamiento, terapia, metafilaxis o profilaxis en medicina humana, veterinaria y agricultura, influye sobre la población bacteriana, la evolución y diseminación de resistencias está claramente asociada con el uso y abuso de antibióticos. (Larrea & Boggio, 2007)

La actividad bactericida podría estar relacionada a la composición de los aceites volátiles de cada planta, a la configuración estructural de los componentes constituyentes, a sus grupos funcionales y a posibles interacciones sinérgica. (Dorman & Deans, 2000)

La hidrofobicidad de los aceites esenciales permite que se incorporen en la

membrana bacteriana, ocasionando lesiones en su estructura.

23

De las hojas de aguacate, pulpa, piel y semilla se han aislado algunos metabolitos secundarios con actividad insecticida y fungicida, como es el caso de las acetogeninas como la persina e isopersina y algunos furanos monoalquilados con restos alquilo de cadena larga como los avocado-furanos (Rodriguez Saona & Maynard, 1999)

2.2.5.1 Evaluación antimicrobiana. Para realizar la prueba antimicrobiana se deben tomar en cuenta 3 condiciones;

primero, el extracto de la planta debe estar en contacto con la pared celular de los microorganismos seleccionados; segundo, las condiciones deben ajustarse para que los microorganismos puedan crecer cuando no estén presentes agentes antimicrobianos; tercero, debe existir algún medio para juzgar la cantidad de crecimiento.

2.2.5.2 Métodos de prueba para la actividad antimicrobiana

2.2.5.2.1 Métodos de difusión En esta técnica un reservorio que contiene el extracto de la planta a ser

evaluados se pone en contacto con un medio inoculado (p. ej. agar), después de la incubación, se mide el diámetro de la zona despejada es decir el halo de inhibición.

2.2.5.2.2 Método de dilución En este método las muestras son mezcladas con un medio adecuado, que

previamente ha sido inoculado con el microorganismo de prueba. Después de la incubación el crecimiento puede evaluarse por visualización directa o comparación turbidimétrica del cultivo de prueba con un cultivo de control. Usualmente se debe realizar varias diluciones del extracto a evaluar y luego se inocula el microorganismo, después de la incubación el punto final de la evaluación se tomará la dilución en la que no hubo crecimiento o creció en menor cantidad en comparación con las otras diluciones (valor MIC).

Algunos investigadores han usado un sistema de inoculación multipunto, con

este método se puede inocular hasta 25 microorganismos diferentes en una misma placa de agar; la placa de microdilución permite la prueba simultánea de tres diluciones de uno o dos extractos de plantas contra no menos de 24 o 12 microorganismos, después de la incubación se evalúa el crecimiento por turbidez.

2.2.5.2.3 Método bioautográficos Son métodos para localizar la actividad antibacteriana en un cromatograma, la

mayoría de los procedimientos se basan en la técnica de difusión en agar, mediante la cual el extracto se transfiere desde el cromatograma de papel a una placa de agar inoculada a través de un proceso de difusión. La actividad se visualiza mediante la formación de halos de crecimiento o de inhibición.

24

2.2.5.3 Microorganismos de prueba

2.2.5.3.1 Escherichia coli. Es una bacteria que normalmente vive en el intestino grueso del ser humano,

mamíferos, aves, peces, reptiles, anfibios e insectos, en ocasiones se las encuentra en el agua.

Es la causa principal de la mayoría de las infecciones en vías urinarias, de la

gastroenteritis que es producida por Escherichia coli enteropatógena, además en procesos industriales es considerado como un indicador de contaminación.

Es un bacilo Gram negativo, de 1 – 3 μm por 0.5 μm, que se presenta sólo, en

pares, en cortas cadenas o formando grupos, es anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae. Se ha clasificado cinco categorías de Escherichia coli: enteropatógena, enterotoxigénica, enteroinvasora, enteroadherente y enterohemorrágica. (Andocilla L., 2003)

2.2.5.3.2 Staphylococcus aureus. Pertenece a la familia Staphylococcaceae. Es Gram positivo, aunque las cepas

viejas o los microorganismos fagocitados se tiñen como Gram negativo. Tiene forma de coco y puede aparecer en parejas, en cadenas o en racimos. Su tamaño oscila entre 0,8 a 1,5 micras de diámetro, es inmóvil y algunas cepas producen una cápsula externa mucoide que aumenta su capacidad para producir infección. En relación con su metabolismo, es anaerobio facultativo, coagulasa positiva, catalasa positiva y oxidasa negativo. (INSHT, 2012)

Se encuentran presentes en la flora normal de las narinas (fosas nasales),

nasofaringe, región perineal (en mujer en hombre) y piel. Puede colonizar diversas superficies epiteliales y mucosas, en alimentos a base huevo como las cremas para pasteles. (INSHT, 2012)

2.2.5.4 Control positivo. Ceftriaxona es un antibiótico betalactámico que pertenece a las cefalosporinas de

tercera generación. Es un bactericida de amplio espectro y acción prolongada que muestra una actividad significativa frente a gérmenes gramnegativos y grampositivos serios. Actúa inhibiendo la síntesis y reparación de la pared celular bacteriana. (Rodríguez, 2013)

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Tabla 4. Susceptibilidad antimicrobiana del control positivo, Ceftriaxona

Agente Disco difusión (mm)

Concentración mínima inhibitoria (µg/mL)

S I R S I R Ceftazidima ≥21 18-20 ≤17 ≤4 8 ≥16 Ceftriaxona ≥23 20-22 ≤19 ≤1 2 ≥4 Cefotaxima ≥26 23-25 ≤22 ≤1 2 ≥4

Fuente: (Sarasti Moya, 2018) Tabla 5. Susceptibilidad antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a las diferentes

cepas bacterianas Ceftriaxona

Cepas bacterianas

Difusión en disco (mm)

Concentración mínima

inhibitoria (µg/mL)

S I R Escherichia

coli ≥23 20-22 ≤19 ≥0,125

Pseudomonas aeruginosa

≥21 14-20 ≤13 ≥16

Staphylococcus aureus

≥14 11-13 ≤10 ≥4

Fuente: (Sarasti Moya, 2018) 2.2.6 Técnicas Cromatográficas. La cromatografía constituye un método para la separación de componentes

estrechamente relacionados presentes en mezclas complejas, que debido a su especificidad presenta aplicaciones en todas las ramas de la ciencia.

Este método se fundamenta en el desplazamiento de una muestra con una fase

móvil (líquido, gas o fluido supercrítico) a través de una fase estacionaria inmiscible fijada a una columna o a una superficie sólida. Los componentes de la muestra se distribuyen, dependiendo de sus propiedades, entre la fase móvil y la estacionaria. Por lo tanto, aquellos compuestos que presentan una mayor afinidad con la fase estacionaria son fuertemente retenidos por lo que presentarán un desplazamiento lento con el flujo de la fase móvil. En contraste, aquellos componentes que no son fines con la fase estacionaria y por ende se unen de forma débil presentarán un movimiento mucho más rápido. Como resultado los diferentes componentes de la muestra se separan formando bandas o zonas discretas que pueden analizarse de forma cualitativa o cuantitativa. (Skoog, Holler, & Crouch, 2008)

26

2.2.6.1 Clasificación de las técnicas cromatográficas. Existen varias clasificaciones de la cromatografía, pero la más importante se

fundamenta en dos criterios el primero se basa en la forma en la cual las fases se ponen en contacto, clasificando a la técnica en cromatografía de columna y cromatografía en plano, y el segundo criterio se basa en la naturaleza de la fase móvil, clasificando a la técnica en cromatografía de líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. (Skoog, Holler, & Crouch, 2008)

2.2.6.2 Cromatografía líquida. La cromatografía de líquidos se lleva a cabo en columnas de vidrio con

diámetros de 10 a 50 mm, las longitudes rellenas de la columna eran de 50 a 500 cm de partículas sólidas cubiertas con un líquido adsorbido que formaba la fase estacionaria.

La cromatografía de líquidos es la técnica analítica de separación más utilizada,

debido a su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para automatizarla, su capacidad para separar especies no volátiles o termolábiles, pero, sobre todo, su amplia aplicabilidad a sustancias que son importantes en la industria y a muchos campos de la ciencia. (Skoog, Holler, & Crouch, 2008)

2.2.6.3 Cromatografía de gases. Existen 2 tipos de cromatografía; la cromatografía gas-líquido (CGL) y la

cromatografía gas-sólido (CGS), la primera es la que más se utiliza en los campos de la ciencia siendo abreviada como CG, la segunda se basa en la fase estacionaria sólida en que la retención de los analitos ocurre porque hay adsorción y por lo tanto su aplicación es limitada, mientras que en la cromatografía de gas-líquido el analito se divide entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un relleno sólido inerte o en las paredes de un tubo capilar. (Skoog, Holler, & Crouch, 2008)

2.2.6.4 Cromatografía en Capa Fina La técnica se realiza en placas de vidrios revestidas con una capa delgada y

adherente de partículas finamente divididas, esta capa constituye la fase estacionaria, las partículas con semejantes a las de la cromatografía por adsorción, de reparto en fase normal y en fase inversa.

Se deposita una gota de la muestra cerca de uno de los extremos de la placa y

esta es arrastrada a lo largo de la placa (fase estacionaria) por una fase móvil, es similar a la elución en la cromatografía de líquidos, una vez que el solvente se desplazó la mitad o las dos terceras partes de la longitud de la placa, se retira del recipiente y se

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seca. Una vez seca se lee a una longitud de onda visible (Skoog, Holler, & Crouch, 2008).

2.3 Marco Legal El presente trabajo de investigación se encuentra en concordancia con las

políticas y lineamientos estratégicos establecidos para el cumplimiento del Plan Nacional del Buen Vivir, específicamente con los relacionados a: el auspicio de la igualdad, inclusión y equidad social y territorial; la garantía de los derechos de la naturaleza; la promoción de la sostenibilidad ambiental territorial y global; y el impulso a la transformación de la matriz productiva.

Política 2.1. “Generar condiciones y capacidades para la inclusión económica, la

promoción social y la erradicación progresiva de la pobreza” Política 7.2. “Conocer, valorar, conservar y manejar sustentablemente el

patrimonio natural y su biodiversidad terrestre, acuática continental, marina y costera, con el acceso justo y equitativo a sus beneficios”

Política 7.4. “Impulsar la generación de bioconocimiento como alternativa a la producción primario-exportadora”

Política 7.8. “Prevenir, controlar y mitigar la contaminación ambiental en los procesos de extracción, producción, consumo y pos-consumo”

Política 10.1. “Diversificar y generar mayor valor agregado en la producción nacional”.

Política 10.2. “Promover la intensidad tecnológica en la producción primaria, de bienes intermedios y finales”

Política 10.4. “Impulsar la producción y la productividad de forma sostenible y sustentable, fomentar la inclusión y redistribuir los factores y recursos de la producción en el sector agropecuario, acuícola y pesquero”.

La Constitución de la República del Ecuador señala en el Artículo 15 que “el Estado promoverá, en el sector público y privado, el uso de tecnologías ambientalmente limpias y de energías alternativas no contaminantes y de bajo impacto”.

2.4 Hipótesis Hipótesis de trabajo (Hi): Las variedades de semilla de aguacate Hass y Fuerte presentan las mismas

características bromatológicas Las variedades de semilla de aguacate Hass y Fuerte presentan actividad

antioxidante. Las variedades de semilla de aguacate Hass y Fuerte presentan los mismos

grupos de compuestos responsables de la actividad antimicrobiana. Hipótesis nula (Ho): Las variedades de semilla de aguacate Hass y Fuerte no presentan las mismas

características bromatológicas. Las variedades de semilla de aguacate Hass y Fuerte no presentan actividad

antioxidante.

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Las variedades de semilla de aguacate Hass y Fuerte no presentan los mismos grupos de compuestos responsables de la actividad antimicrobiana.

2.5 Conceptualización de variables 2.5.1 Variables independientes. V1: Tipo de fracción: Son las fracciones obtenidas por el método de separación

(FH, FA, FC, FNaCl, FH2, FB, FED, FAC.E1, FAC.E2, FA2) V2: Tipo de microorganismo: Se usaron dos tipos de bacterias para evaluar la

actividad antimicrobiana Staphylococcus aureus ATCC y Escherichia coli ATCC. V3: Variedad de Aguacate: Se usaron dos variedades de aguacate conocidas

como “Fuerte” y “Hass”.

2.5.2 Variable dependiente.

V5: Actividad antimicrobiana de los extractos. Expresado por la turbidez que indica el crecimiento que hubo en cada micropocillo inoculado

V6: Evaluación de la actividad antioxidante. Se evaluó mediante la resistencia a la oxidación de los lípidos contenido en la semilla a través del método DPPH.

2.5.3 Variable de interés. V7: Composición proximal de la cáscara de aguacate. Se determinó mediante

el análisis bromatológico de las semillas de aguacate de cada variedad (porcentaje de: humedad, sólidos totales, ceniza, grasa, proteína, fibra, carbohidratos por diferencia).

V8: Composición cualitativa de los extractos. Mediante las pruebas de tamizaje fitoquímico se podrán identificar las familias de compuestos extraídas mediante los diferentes solventes.

29

CAPÍTULO III

MARCO METODOLÓGICO 3.1 Diseño de la investigación La presente investigación está sujeta a un modelo cuantitativo, ya que se basa en

la recolección de datos y el análisis de los mismos que permitirán responder las preguntas planteadas y comprobar hipótesis establecidas. Este enfoque se basa en medición numérica, el conteo y uso de la estadística para establecer con exactitud los patrones existentes en una población. (Gómez, 2006)

Esta investigación presenta diferentes etapas ya que es descriptivo debido al

análisis bromatológico que se realizó, describiendo la composición proximal de la semilla de aguacate, es exploratorio ya que se realizaron pruebas cualitativas obteniendo información preliminar sobre el tema, y por último es explicativa ya que permite conocer la relación que existe entre las variables.

El proyecto se fundamenta en una revisión bibliográfica y documental, ya que el

presente trabajo está sustentado en fuentes escritas como libros, artículos científicos, revistas científicas y cualquier otro tipo de documento legal, y es experimental porque la información obtenido es resultado de la actividad realizada por el investigador, de forma que recrea todos los parámetros planteados para de esa forma observar los resultados.

3.2 Población y muestra La población para esta investigación corresponde a la semilla de aguacate

(Persea Americana) de la variedad “Fuerte” y “Hass” en estado de maduración proveniente de la finca del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), ubicado en Tumbaco, se tomará como muestra 20 Kg de aguacates enteros de cada variedad, obteniéndose 750 g de semilla en polvo de cada variedad, de los cuales se tomaron 100 g de cada variedad para el análisis bromatológico, mientras que para el fraccionamiento y evaluación de los componentes bioactivos se tomaron 150 g para cada variedad.

3.3 Materiales y métodos El presente trabajo de investigación se llevó a cabo en los laboratorios de la

Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, ubicada en la Ciudadela Universitaria, cantón Quito, Ecuador.

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Tabla 6.Lista de Materiales, Equipos y Reactivos

Análisis Bromatológico

Materiales Equipos Reactivos

Pinzas para manipulación de

cápsulas Desecador con

sustancia desecante activa

Espátula Cápsulas

Tubos Kjeldahl de 300 ml

Erlenmeyer de 250 Papel celofán incoloro Núcleos de ebullición

Vasos de vidrio Crisoles de porcelana Embudos de vidrio

Balanza analítica Mettler Toledo con

resolución de 0,0001g. Estufa Precisión,

135±2°C. Equipo de

determinación de proteína (Digestor y

Scrubber marca Selecta, destilador marca Velp). Bureta de 50 ml marca

Brand. Sorbona

Mufla, 600±20°C marca Thermo scientific

Plancha de calentamiento

Ácido sulfúrico concentrado

Catalizador Kjeldahl Solución de ácido

bórico al 4% Solución de

hidróxido de sodio al 40%

Solución valorada de ácido clorhídrico

0,1N Éter de petróleo Agua destilada

Solución de ácido sulfúrico al 1,25%

Solución de hidróxido de sodio

al 1,25%

Extracción

Frascos de vidrio de 750 ml con tapa

metálica Papel filtro Watman

tipo 1 Matraz Kitasato

Embudo Butchner Manguera Papel film

Papel aluminio Molino

Balanza analítica Mettler Toledo con

resolución de 0,0001g. Bomba de vacío. Agitador marca

Thermolyne. Rotavapor marca Büchi

Heating Bath B-490. Cámara cromatográfico. Lámpara de luz UV 254

y 396 nm.

Etanol 96%

Fraccionamiento

Embudos de separación

Tubos de ensayo Vasos de

precipitación Soporte universal Aros de hierro o

de madera Probetas

Frascos ámbar Papel film

Hexano Cloroformo

Cloruro de sodio 1% Butanol

Éter dietílico Ácido tartárico Acetato de etilo

Carbonato de sodio al 10%

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Tamizaje fitoquímico

Pipetas volumétricas Pera de succión Tubos de ensayo

Gradilla Placas de sílica gel

Cámara cromatográfica Lámpara de luz UV 254

y 396 nm Espectrofotómetro

marca Fisher Scientific

Reactivo de Sudan III

Reactivo de Dragendorff

Reactivo de Mayer Reactivo de Wagner Reactivo de Baljet Reactivo de Kedde Anhídrido acético Ácido sulfúrico

concentrado Ácido clorhídrico

concentrado Cinta de magnesio

metálico Alcohol amílico

Solución de cloruro férrico al 5%

Hidróxido de potasio en etanol al 10%

Benceno Hidróxido de

amonio Solución de gelatina

salada Cloroformo

Metanol Ninhidrina

Etanol al 96% Butanol

Quercetina Cloruro de Aluminio

Ácido acético en metanol al 5% Ácido gálico

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Ensayo de actividad

antimicrobiana

Cultivo Escherichia coli ATCC 8734

Cultivo Staphylococcus

aureus ATCC 6538 Caldo nutritivo

Tubos de ensayo Pipetas automáticas

Mechero Bunsen Placa de

microdilución Asa de inoculación

Aguja de inoculación Puntas estériles

Equipo de protección personal

Incubadora Cabina de seguridad

biológica tipo II Autoclave

Hybrid Multi-Mode Microplate Reader

(programa Gem 5TM )

Ensayo de evaluación de

actividad Antioxidante

Tubos de ensayo Balón aforado de 10

mL Espectrofotómetro

Ácido ascórbico 2,2-Diphenyl -1-picrylhydrazyl

DPPH

Elaborado por: Triguero, S. 3.3.1 Métodos 3.3.1.1 Muestreo Una vez identificada la población de estudio, así como el lugar de toma de

muestra, el proceso se llevó a cabo según los parámetros establecidos en la Norma INEN 1750 correspondiente a “Hortalizas y frutas frescas. Muestreo”. El muestreo se realizó de forma aleatoria

3.3.1.2 Análisis bromatológico. a. Determinación de humedad: el ensayo se llevará a cabo mediante la NTE INEN 518 (ver anexo 3) b. Determinación de cenizas: el ensayo se llevará a cabo mediante la NTE INEN 520 (ver anexo 4) c. Determinación de proteína: el ensayo se llevará a cabo mediante la NTE INEN 519 (ver anexo 5) d. Determinación de grasa: el ensayo se llevará a cabo mediante la NTE INEN 523 (ver anexo 6) e. Determinación de fibra cruda: el ensayo se llevará a cabo mediante la NTE INEN 522 (ver anexo 7) f. Determinación de carbohidratos: mediante el cálculo de diferencia

33

3.3.1.3 Extracción. En la presente investigación se realizó una extracción con etanol al 96% para la

cual se establecieron los siguientes pasos: 1. Acondicionar la muestra mediante procesos de lavado en solución de ácido hipoclorito al 3%, secar a menos de 30 °C y reducir el tamaño de partícula 2. Pesar 150 gr de la muestra 3. Adicionar 250 ml de etanol al 96 % 4. Permitir maceración durante 48 horas a temperatura ambiente y con una ligera agitación 5. Filtrar al vacío 6. Concentrar usando rotavapor hasta un volumen aproximado de 60 ml 7. Almacenar en refrigeración el extracto obtenido 8. Secar y pesar el residuo sólido obtenido 9. Repetir el mismo procedimiento para la otra variedad de semilla de aguacate(ver anexo 11)

3.3.1.4 Fraccionamiento. La obtención de las fracciones es una adaptación de la marcha analítica presente

en libro de (Sarker, Latif, & Gray, 2006) que se llevó a cabo en función de la polaridad del solvente usado. (Ver anexo 8)

El extracto obtenido se dividió en cuatro partes iguales para ambas variedades,

de las cuales 3 de ellas fueron fraccionadas usando solventes de diferente polaridad. El siguiente procedimiento se realizó exactamente igual para ambas variedades de semilla de aguacate.

Primer fraccionamiento

1. Fraccionamiento con Hexano: el extracto de la semilla Hass y la semilla fuerte obtenido de la maceración con etanol al 96%, una vez concentrado y dividido en cuatro partes iguales cada una de 10 mL, se cogieron los 10 mL del extracto y se añadió 10 mL de hexano, se agitó en un embudo de separación, se dejó en reposo y por densidades se separó la muestra obteniéndose una fracción de Hexano y una fracción de etanol.

2. Fraccionamiento con Cloroformo: la fracción de etanol obtenida del proceso anterior se le agregó cloroformo en proporción 1:1 y 2 mL de agua, se agitó y se separó en función de sus densidades obteniéndose la fracción cloroformo y una fracción acuosa

34

3. Fraccionamiento con Cloruro de Sodio: a la fracción de cloroformo obtenida en el paso anterior se le añadió 10 mL de cloruro de sodio al 1% con el objetivo de remover taninos, obteniendo en función de sus densidades dos fracciones, la fracción de cloroformo libre de taninos y la fracción de cloruro de sodio al 1%.

Segundo fraccionamiento 1. Fraccionamiento con hexano: el extracto de la semilla Hass y la

semilla fuerte obtenido de la maceración con etanol al 96%, una vez concentrado y dividido en cuatro partes iguales cada una de 10 mL, se cogieron los 10 mL del extracto y se añadió 10 mL de hexano, se agitó en un embudo de separación, se dejó en reposo y por densidades se separó la muestra obteniéndose una fracción de Hexano y una fracción de etanol.

2. Fraccionamiento con n-Butanol: a la fracción de etanol obtenida

en el paso anterior se le añadió 2 mL de agua y 10 mL de n-butanol, no hubo una separación ya que sus densidades son muy similares, por lo tanto, solo se obtuvo la fracción n-butanol

3. Fraccionamiento con Éter dietílico: a la fracción de n- butanol

obtenida en el paso anterior se le añadió 10 mL de éter dietílico, con la finalidad que la saponina presente precipite, de esa forma separamos el precipitado en función de la densidad obteniéndose dos fracciones, la fracción de n-butanol, y la fracción de éter dietílico.

Tercer fraccionamiento

1. Fraccionamiento con Acetato de Etilo: la tercera parte del extracto de la semilla de ambas variedades se les añadió por separado ácido tartárico hasta obtener un pH igual a 5 y 10 mL de ácido acético saturado en agua, obteniendo dos fracciones, la fracción ácido-acuosa y la fracción de acetato de etilo con componentes neutrales.

2. Fraccionamiento con Acetato de Etilo parte 2: a la fracción

ácido-acuosa que obtuvimos en el paso anterior se le añadió una solución de carbonato de sodio al 10% hasta obtener un pH igual a 11 y 10 mL de acetato de etilo, obtenido por separación en función de sus densidades dos fracciones, la fracción acuosa, la cual posiblemente contiene aminas cuaternarias y alcaloides de n-óxidos y la fracción de acetato de etilo parte 2 la cual posiblemente contiene aminas de primer, segundo y tercer orden.

35

3.3.1.5 Tamizaje Fitoquímico. Los diferentes compuestos químicos que se encuentran presentes en la semilla de

aguacate de ambas variedades fueron extraídos selectivamente en función de los reactivos a utilizar, por lo tanto los ensayo cualitativos se realizan de forma específica, según la siguiente tabla.

Tabla 7. Ensayos específicos para la detección de grupos fitoquímicos en las

fracciones obtenidas

Fraccionamiento Fracción Ensayo Grupo

Fitoquímico a identificar

Primero

F. Hexano

Lieberman-Burchard

Triterpenos y /o esteroides

Baljet Lactonas y curaminas

Sudán Aceites y grasas

F. Acuosa

Espuma Saponinas Shinoda Flavonoides

Ninhidrina Aminoácidos libres

o aminas en general

Borntrager Quinonas

Kedde Glicósidos

cardiotónicos

Cloruro Férrico Fenólicos y/o

taninos

F. Cloroformo Dragendorff Alcaloides

Mayer Alcaloides Wagner Alcaloides

F. Cloruro de Sodio Gelatina Taninos

Cloruro Férrico Fenólicos y/o

taninos

Segundo

F. Hexano

Lieberman-Burchard

Triterpenos y /o esteroides

Baljet Lactonas y curaminas

Sudán Aceites y grasas F. Butanol Espuma Saponinas

F. Éter Dietílico

Cloruro Férrico Fenólicos y/o

taninos Shinoda Flavonoides

Borntrager Quinonas Kedde Glicósidos

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cardiotónicos

Tercero

F. Acetato de Etilo 1

Baljet Lactonas y curaminas

Lieberman-Burchard

Triterpenos y /o esteroides

Sudán Aceites y grasas

F. Acetato de Etilo 2

Dragendorff Alcaloides Mayer Alcaloides

Wagner Alcaloides

F. Acuosa

Dragendorff Alcaloides Mayer Alcaloides

Wagner Alcaloides

Ninhidrina Aminoácidos libres

o aminas en general

Elaborado por: Triguero, S.

a) Ensayo de Mayer: A una alícuota de la fracción acuosa añadir 1 gota de ácido clorhídrico concentrado (calentar suavemente y dejar enfriar). Adicionar una pizca de cloruro de sodio en polvo, agitar y filtrar. Colocar 2-3 gotas de la solución reactiva de Mayer. El ensayo se considera positivo si se desarrolla opalescencia, turbidez definida y/o precipitado coposo.

b) Ensayo de Wagner: A una alícuota de la fracción acuosa añadir 1

gota de ácido clorhídrico concentrado (calentar suavemente y dejar enfriar). Adicionar 2-3 gotas de reactivo de Wagner. La aparición de opalescencia, turbidez y/o precipitado indica un ensayo positivo.

c) Ensayo de Dragendorff: A una alícuota de la fracción acuosa añadir 1 gota de ácido clorhídrico concentrado (calentar suavemente y dejar enfriar), posteriormente se adicionan 3 gotas de reactivo de Dragendorff. Se considera positivo el ensayo cuando existe opalescencia, turbidez y/o formación de precipitado.

d) Ensayo de Liebermand-Burchard: Tomar una alícuota de la

fracción y colocarla en un tubo de ensayo (si ésta no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse el solvente y el residuo disolverse en 1 mL de cloroformo). Adiciona 1 mL de anhídrido acético y homogeneizar. Seguidamente añadir por las paredes del tubo 3-4 gotas de ácido sulfúrico concentrado, sin agitar. Un ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de

37

coloración: rosa-azul muy rápido, verde intenso-visible, aunque rápido, verde oscuro-negro final de la reacción.

e) Ensayo de Shinoda: Permite identificar la presencia de

flavonoides. A una alícuota del extracto disuelto en alcohol se añade 1ml de ácido clorhídrico concentrado y un pedazo de cinta de magnesio metálico. Se espera 5 minutos y se adiciona 1ml de alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que se separen. El resultado se considera positivo si la fase correspondiente al alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo intensos.

f) Ensayo de Bontrager: Tomar una alícuota de la fracción, adicionar 5mL de ácido sulfúrico 1N y llevar a ebullición por 10 minutos. Filtrar por gravedad y adicionar, sobre el líquido filtrado, un volumen igual de benceno. Colocar en un embudo de separación, agitar y dejar en reposo. Separar la fase orgánica y adicionar 1 mL de hidróxido de amonio, Observar la coloración rosa en la capa acuosa.

g) Ensayo de cloruro férrico: Permite reconocer la presencia de

compuestos fenólicos y/o taninos. A una alícuota del extracto acuoso se añade acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una solución de cloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica. El desarrollo de una coloración rojo-vino indica la presencia de compuestos fenólicos en general, una coloración verde intensa es indicativo de la presencia de taninos del tipo pirocatecólicos, mientras que una coloración azul corresponde a taninos del tipo pirogalotánicos.

h) Ensayo de gelatina salada: Adicionar el reactivo de gelatina-sal a

una alícuota de la fracción de estudio en una cantidad igual a la mitad de la misma. El ensayo se considera positivo si aparece un precipitado blanco floculento.

i) Ensayo de espuma: Permite identificar la presencia de saponinas, tanto en tipo esteroidal como triterpénica. Diluir una alícuota de la fracción, disuelta en alcohol, con 5 veces su volumen de agua y agitar fuertemente durante 5-10 minutos. El ensayo se considera positivo si aparece espuma en la superficie del líquido, de más de 2 mm de altura que persista por más de 2 minutos.

38

j) Ensayo de Baljet: Permite reconocer la presencia de compuestos

con agrupamiento lactónico como las curaminas. El desarrollo de una coloración y precipitado rojo al agregar 1mL del reactivo de Baljet sobre 1 mL de la muestra, indica la presencia de estos compuestos.

k) Reacción de Kedde: A una alícuota de la fracción en estudio

adicionar 0,5mL del reactivo de Kedde y 3-4 gotas de hidróxido de potasio al 10% en etanol. La reacción se considera positiva si existe el desarrollo de una coloración púrpura muy estable.

l) Ensayo de Sudan: Permite reconocer la presencia de compuestos

grasos, para lo cual, a una alícuota de la fracción en el solvente de extracción se añade 1 ml de una solución diluida en agua de colorante Sudan III. Se calienta en baño de agua hasta evaporación completa del solvente. La presencia de compuestos grasos se considera positiva si aparecen gotas o una película coloreada de rojo en el seno del líquido o en las paredes del tubo de ensayo.

Tabla 8. Criterios de interpretación de pruebas cualitativas

+++ Abundante ++ Moderado + Medianamente escaso

+/- Escaso - Nada

Elaborado por: Triguero, S. 3.3.1.5 Identificación por cromatografía de capa fina. Mediante cromatografía en capa fina se identificó la presencia de familias de

compuestos fitoquímicos específicos en las fracciones. Tabla 9. Fases móviles y reveladores a utilizar en la cromatografía de capa fina

Grupo fitoquímico Fase móvil Revelador

Alcaloides Acetato de etilo/

metanol/agua (100:13,5:10)

Reactivo de Folin más vapores de Amoniaco

Esteroles Éter de petróleo/acetona

(80:20) Anhídrido acético + ácido

sulfúrico + etanol Flavonoides Butanol/ácido Reactivo de Folin más

39

acético/agua (12,5:2,5:5) vapores de Amoniaco

Antraquinonas Benceno/acetato de etilo/ácido acético

(75:24:1)

Hidróxido de potasio al 10% en metanol

Naftoquinonas Benceno/ éter de petróleo

(2:1) Hidróxido de potasio al

10% en metanol

Taninos Acetona/hexano

(4:1) Reactivo de Komarowsky

Fuente: (Wagner & Bladt, 1996) Modificado por: Triguero, S.

3.3.1.6 Cuantificación de fenoles Para el estándar se realizó una solución de ácido gálico de 1,3 mg/mL, a partir de

dicha solución se prepararon 7 soluciones más de menor concentración, obteniéndose soluciones de 0,1-1,3 mg/mL.(ver anexo 15)

Preparación de las muestras para la determinación de fenoles 1. Se tomó 100 µL de cada solución patrón de ácido gálico y 100 µL

de la muestra. 2. Se colocaron en tubos de ensayo, previamente cubiertos por papel

aluminio para aislarlo de la luz. 3. Se añadió 7,9 mL de agua destilada y 500 µL de reactivo de

Folin-Ciocalteu. 4. Se homogeneizó el contenido de los tubos y se dejó en reposo

durante 2 horas a temperatura ambiente y cubierto de la luz. 5. Transcurrido ese tiempo se miden las absorbancias a 765 nm. 6. Para la preparación del blanco se añadió 500 µL de reactivo de

Folin-Ciocalteu y se añadió 7,9 mL de agua destilada.

3.3.1.7 Cuantificación de flavonoides Para el estándar se realizó una solución madre de quercetina de 150 mg/L en

acetato de etilo, de la cual se fueron tomando de 50 µL-350 µL, a cada muestra se le añadió 200 µL de cloruro de Aluminio y se aforó hasta un volumen de 5 mL con ácido acético en metanol al 5%.

Preparación de las muestras para la determinación de flavonoides

1. Se colocó 200 µL de muestra, 200 µL de cloruro de aluminio y se aforó a un volumen de 5 mL con ácido acético en metanol al 5%.

2. Para el blanco se añadió 200 µL de cloruro de aluminio y se aforó a un volumen de 5 mL con ácido acético en metanol al 5%.

40

3.3.1.8 Evaluación de la actividad antimicrobiana. Preparación de los medios de cultivo Se prepararon dos medios de cultivo, Caldo Nutritivo para el crecimiento

bacteriano y Caldo Brain Heart Infusion (BHI) para la activación de las cepas ATCC Caldo BHI

• Se preparó 100 mL de caldo BHI, se esterilizó, y se refrigeró hasta su uso posterior Caldo Nutritivo

• Se preparó 200 mL de caldo nutritivo, se disolvió en agua destilada, se esterilizó, y se refrigeró hasta su posterior utilización.

Cultivo de Cepas bacterianas ATCC Una vez preparado el caldo BHI, se sumergió el asa de inoculación en el criovial

y luego se sumergió la misma asa de inoculación al tubo de ensayo que contenía el caldo BHI el procedimiento se repitió 3 veces, para asegurarnos que haya traspaso de los microorganismos, se dejó incubar por 24 horas a 36 °C.

Preparación del inóculo A partir de las cepas activadas, se tomó 0.1 mL de la suspensión bacteriana en

BHI y se pasó a tubos que contenían agua estéril, y se ajustó la turbidez del agua estéril con los microorganismos hasta obtener un valor de 0.08-0.1 en el espectrofotómetro a 594 nm.

Método de la placa de microdilución Se utilizó una placa de microdilución de 96 pocillos, Caldo Nutritivo, y una

suspensión bacteriana de una concentración 0,5 en la escala McFarland. En los pocillos del 1-4 se agregó 100 µL del extracto de la semilla de aguacate

de la variedad Hass, 100 µL del caldo nutritivo y se realizaron diluciones hasta la columna C, en los pocillos del 5-8, en la columna A se agregó 100 µL de la Fracción Acuosa de la variedad de semilla Hass, 100 µL del caldo nutritivo y se realizó diluciones hasta la columna C, en los pocillos del 9-12 se agregó en la columna A 100 µL de la fracción éter dietílico, 100 µL del caldo nutritivo y se realizó diluciones hasta la columna C, en los pocillos 1-4, en la columna F se agregó 100 µL del Extracto de la semilla de la variedad Fuerte, 100 µL del caldo nutritivo y se realizó diluciones hasta la columna H, en los pocillos 5-8 en la columna E se agregó 100 µL, 100 µL del caldo nutritivo de la fracción acuosa de la semilla Fuerte y se realizó diluciones hasta la columna H, en los pocillos del 9-12 de la columna E se agregó 100 µL de la fracción

41

éter dietílico de la semilla Fuerte, 100 µL del caldo nutritivo y se realizó diluciones hasta la columna H, en los pocillos ya mencionados se agregó 100 µL de suspensión bacteriana.

En los pocillos 1-4 en la columna D se agregó el blanco el cual consistía en

medio de cultivo puro, en los pocillos 5-8 en la columna E se agregó el antibiótico con la bacteria, y en los pocillos 9-12 en la columna D se agregó el medio de cultivo junto con la bacteria

El mismo proceso se aplicó para la bacteria Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

Se determinó el porcentaje de inhibición de acuerdo con cada fracción obtenida, y de acuerdo a cada cepa bacteriana, mediante la siguiente ecuación.

% 𝐼𝑁𝐻𝐻𝐼𝐵𝐵𝐼𝐶𝐼Ó𝑁 = 𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜−𝐴𝑏𝑠.𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜

𝑥 100 Ecuación 9.

Cálculo del porcentaje de inhibición.

La absorción del control positivo corresponde al valor del medio de cultivo con

la bacteria inoculada.

Gráfica 3. Esquema de distribución para la placa de microdilución

Elaborado por: Triguero, S.

Extracto semilla Hass Extracto semilla Fuerte Fracción Acuosa Hass Fracción Acuosa Fuerte Fracción Éter dietílico Hass Fracción Éter dietílico Fuerte Blanco Control + Antibiótico

42

3.3.1.9 EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Método del radical DPPH Preparación del radical DPPH. Para la presente evaluación se realizó el método del radical DPPH con algunas

modificaciones, para ello se preparó una solución patrón de 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) en metanol grado analítico por lo que se pesó 3 mg del reactivo y se aforó a 50 ml, se conservó en la oscuridad durante 15 min hasta su uso. Se realizó un barrido espectral con la solución preparada para determinar la longitud de onda máximo, la cual fue de 517 nm.

Curva de Calibración

• La curva de calibración se realizó con una solución de Ácido ascórbico de 1000 ppm

• Se pesó 49 mg de DPPH y se aforó a 250 mL con etanol al 96% • Se agregó en cada tubo de ensayo los valores indicados en la tabla

10 • Se cubrió de papel aluminio a los tubos y se sometieron a

agitación constante de 200 rpm durante 30 min. • Transcurrido ese tiempo se midieron las absorbancias a 517 nm

Tabla 10. Volúmenes para la curva de calibración con Ácido ascórbico

Tratamiento Concentración (µL)

DPPH Etanol 96%

Blanco --- 5.8 mL 200 µL 1 2 5.8 mL 198 µL 2 4 5.8 mL 196 µL 3 10 5.8 mL 190 µL 4 20 5.8 mL 180 µL 5 40 5.8 mL 160 µL 6 100 5.8 mL 100 µL 7 160 5.8 mL 40 µL

Elaborado por: Triguero, S. Mediante la siguiente ecuación se calculó el % de inhibición de la

muestra frente al DPPH

% 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑐𝑖ó𝑛 = �1 − 𝐴𝑚𝐴𝐷𝑃𝑃𝐻

� 𝑥100 Ecuación 10.

Porcentaje de inhibición, frente al DPPH

43

Preparación de la muestra de semilla de aguacate de las variedades Hass y Fuerte Se agregó de 2 a 160 µL de muestra, 5,8 mL de DPPH y de 200 a 40 µL como se

indica en la tabla 10, se cubrieron los tubos con papel aluminio y se agitó a 200 rpm durante 30 minutos, se repitió el procedimiento para cada fracción que se requería ser analizada para determinar si presenta actividad antioxidante

3.4 Diseño Experimental El análisis de la actividad antimicrobiana del extracto crudo y de sus fracciones

se fundamentó en un diseño factorial de 3X7. En la tabla 11 se detallan los factores y niveles de estudio propuestos en este trabajo de investigación.

Tabla 11. Factores de estudio y niveles Factores Niveles Codificación Tipo de

microorganismo Staphylococcus aureus SA

Escherichia coli EC

Extracto crudo Variedad Hass SH

Variedad Fuerte SF

Tipo de fracción

Fracción Acuosa Hass FAH Fracción Éter dietílico

Hass FEDH

Fracción Acuosa Fuerte FAF Fracción Éter dietílico

Fuerte FEDF

Elaborado por: Triguero, S. 3.5 Matriz de operacionalización de variables La tabla 12 resume las variables de estudio propuestas para este trabajo, sus

dimensiones, indicadores e ítems. Tabla 12. Matriz de operacionalización de variables

Variable Dimensiones Indicadores Ítems

Tipos de fracción Fracciones

obtenidas a partir del extracto crudo

Fracción Acuosa, variedad Hass

Fracción Éter dietílico, Variedad

Hass Fracción Acuosa, Variedad Fuerte

Fracción Éter dietílico, Variedad

Fuerte 44

Composición cualitativa de las

fracciones

Técnicas de tamizaje

fitoquímico

Familia de compuestos

químicos

Presencia /ausencia de grupos o familias de compuestos fitoquímicos

Actividad Antioxidante

Técnica del DPPH Porcentaje de

inhibición

Actividad antimicrobiana

Porcentaje de inhibición de crecimiento

Turbidez, en pocillos de placa de

microdilución

Composición química proximal

Cantidad de agua Porcentaje de

humedad

Cantidad de grasa Porcentaje de grasa

Cantidad de ceniza Porcentaje de

ceniza Cantidad de

proteína Porcentaje de

proteína Cantidad de fibra Porcentaje de fibra

Cantidad de carbohidratos

Porcentaje de carbohidratos

Elaborado por: Triguero, S.

3.6 Técnicas e Instrumentos de recolección de datos Ya que el presente trabajo de investigación se fundamenta en la

experimentación, la observación constituirá la técnica principal para abstraer la información del fenómeno en estudio correspondiente a la determinación de la actividad antimicrobiana de los extractos, la actividad antioxidante y la composición proximal de la semilla de aguacate, se usó un cuaderno de laboratorio en el cual se registró los resultados obtenidos del tamizaje fitoquímico, del análisis bromatológico, de la actividad antimicrobiana y antioxidante.

3.7 Técnicas de procesamiento de información y análisis de datos Las mediciones correspondientes a la determinación de la composición química

proximal de la semilla de aguacate de las variedades Hass y Fuerte se realizaron por cuadruplicado, por lo que se utilizó la media aritmética de los datos obtenidos para expresar el resultado final, para evaluar si las variedades presentan o no las mismas características bromatológicas se realizó un análisis de varianza de comparación de dos medias experimentales, y luego se concluyó según la t de Student

𝑠2 = ∑ (𝑥1−�̅�)2𝑁𝑖=1

𝑛−1 Ecuación 11. Fórmula para el cálculo de Varianza

45

Dónde: n= número de datos presentes en un conjunto 𝑥𝑖= datos presentes en un conjunto �̅�= media aritmética de los datos analizados

𝑠 = �∑ (𝑥1−�̅�)2𝑛𝑖=1

𝑛−1 Ecuación 12. Fórmula para el cálculo de la

Desviación Estándar

Dónde: n= número de datos presentes en un conjunto 𝑥𝑖= datos presentes en un conjunto �̅�= media aritmética de los datos analizados Si las varianzas son iguales se aplica la siguiente ecuación

𝑡𝑡𝑒𝑥𝑝 = 𝑥1− 𝑥2

𝑆𝑥�1𝑛1+ 1𝑛2

Ecuación 13. T.experimental para varianzas iguales

Si las varianzas son diferentes se aplica la siguiente ecuación

𝑡𝑡𝑒𝑥𝑝 = 𝑥1− 𝑥2

�𝑆12

𝑛1+ 𝑆2

2

𝑛2

Ecuación 14.T.experimental para varianzas diferentes

La hipótesis alternativa establece que las variedades Fuerte y Hass presentan las

mismas características bromatológicas, en otras palabras, nos dice que tienen la misma cantidad de humedad, sólidos totales, proteína, grasa, cenizas, fibra y carbohidratos

Hipótesis alternativa: Hi: U1 = U2 = Hipótesis nula: Ho: U1 ≠ U2 ≠ La actividad antimicrobiana se midió mediante la turbidez, para el resultado se

utilizó la media aritmética, los mismos que fueron utilizados para expresar el porcentaje de inhibición de cada fracción y del extracto de cada variedad, para evaluar si las variedades Hass y Fuerte presentan los mismos grupos de familias responsables de la actividad antimicrobiana se realizó un análisis de varianza ANOVA mediante un diseño factorial de 3x3

46

Tabla 13. Diseño factorial AxBxC

Factor A Diluciones

Factor C Tipo de

fracciones

Factor B Variedad de semilla

B1 B2 C1 C2 C3 C1 C2 C3

A1 A1B1C1 A1B1C2 A1B1C3 A1B2C1 A1B2C2 A1B2C3 A2 A2B1C1 A2B1C2 A2B1C3 A2B2C1 A2B2C2 A2B3C3 A3 A3B1C1 A3B1C2 A3B1C3 A3B2C1 A3B2C2 A3B2C3

Elaborado por: Triguero, S.

Tabla 14. Anova para un diseño factorial AxBxC Fuente de variación

Suma de cuadrados

Grados de libertad Cuadrados medios Estadísticas F

Factor A SCA a-1 SCA/(a-1) CMA/CME Factor B SCB b-1 SCB/(b-1) CMB/CME Factor C SCC c-1 SCC/(c-1) CMC/CME Factor

AB SCAB (a-1)(b-1) SCAB/(a-1)(b-1) CMAB/CME

Factor AC

SCAC (a-1)(c-1) SCAC/(a-1)(c-1) CMAC/CME

Factor BC

SCBC (b-1)(c-1) SCBC/(b-1)(c-1) CMBC/CME

Factor ABC

SCABC (a-1)(b-1)(c-1) SCABC/(a-1)(b-1)(c-1) CMABC/CME

Error SCE abc(n-1) SCE / abc(n-1) Total SCT N-1

Elaborado por: Triguero, S. Hipótesis: La hipótesis alternativa establece que todas las medias de la población (medias

de los niveles de los factores) son iguales, mientras que la hipótesis nula establece que al menos una es diferente.

Hipótesis alternativa: Hi: U1 = U2 = U3 = U4 = Hipótesis nula: HO: U1 ≠ U2 ≠ U3 ≠ U4 ≠ Hipótesis de estudio en cada factor - Para el factor A (Concentración): 𝐻𝐻i: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 𝐴𝐴 = 0 𝐻𝐻o: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 𝐴𝐴 ≠ 0 𝐻𝐻i: El nivel de concentración no ejerce ningún tipo de actividad antibacteriana

(% de inhibición) 𝐻𝐻o: El nivel de concentración ejerce actividad antibacteriana (% de inhibición).

47

- Para el factor B (Variedad de la semilla) 𝐻𝐻i: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 𝐵𝐵 = 0 𝐻𝐻o: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 𝐵𝐵 ≠ 0 𝐻𝐻i: La variedad de la semilla no influye en la actividad antibacteriana (% de

inhibición). 𝐻𝐻o: La variedad de la semilla si influye en la actividad antibacteriana (% de

inhibición). - Para el factor C (fracciones) 𝐻𝐻i: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 C = 0 𝐻𝐻o: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 C ≠ 0 𝐻𝐻i: La fracción o extracto total no influye en la actividad antibacteriana (% de

inhibición). 𝐻𝐻o: La fracción o extracto total si influye en la actividad antibacteriana (% de

inhibición). - Para la interacción AB (Concentración-Variedad de semilla): 𝐻𝐻i: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 𝐴𝐴𝐵𝐵 = 0 𝐻𝐻o: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 𝐴𝐴𝐵𝐵 ≠ 0 𝐻𝐻i: No hay interacción entre los factores A y B. 𝐻𝐻o: Hay interacción entre los factores A y B. - Para la interacción AC (Concentración-Tipo de fracción): 𝐻𝐻i: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 𝐴𝐴C = 0 𝐻𝐻o: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 𝐴𝐴C ≠ 0 𝐻𝐻i: No hay interacción entre los factores A y C. 𝐻𝐻o: Hay interacción entre los factores A y C. - Para la interacción BC (Variedad de semilla-Tipo de fracción): 𝐻𝐻i: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 BC = 0 𝐻𝐻o: 𝐸𝐸𝑓𝑓𝑒𝑒𝑐𝑐𝑡𝑡𝑜𝑜 𝐵𝐵C ≠ 0 𝐻𝐻i: No hay interacción entre los factores B y C. 𝐻𝐻o: Hay interacción entre los factores B y C.

48

CAPÍTULO IV

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 4.1 Muestreo La toma de la muestra se realizó en las instalaciones del INIAP, ubicado en

Tumbaco, fue seleccionada al azar durante 5 semanas, cada semana se recolectaron 4 kg de aguacates enteros, la maduración se llevó a cabo en condiciones naturales, la cual consistía en 6 días al ambiente, la taxonomía de la especie vegetal estudiada se expone en el Anexo 1.

4.2 Análisis Bromatológico Una vez realizado el tratamiento de la muestra de ambas variedades se llevó a

cabo el análisis bromatológico en las instalaciones de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, todos los ensayos se realizaron por cuadruplicado y en función de lo establecido en la norma INEN para cada ensayo específico.

La determinación de Humedad se llevó a cabo mediante desecación en estufa

que utiliza la pérdida de peso de la muestra para calcular el contenido de agua presente en la muestra, mientras que para sólidos totales se utiliza la muestra seca. Los resultados obtenidos se expresan en la Tabla 15.

Tabla 15. Resultados obtenidos de la determinación de humedad y sólidos

totales

Repeticiones

Variedad Fuerte Hass

%Humedad % Sólidos totales %Humedad % Sólidos

totales R1 11,9684 88,0316 12,2370 87,7630 R2 11,9778 88,0222 12,2289 87,7711 R3 11,9546 88,0454 12,2447 87,7553 R4 11,9640 88,0360 12,2283 87,7717

Promedio 11,9662 88,0338 12,2347 87,7653 Elaborado por: Triguero, S.

Para la determinación de grasa cruda se realizó una hidrólisis ácida, la cual

consiste en romper las uniones de los lípidos, generando facilidad para ser extraíble, el porcentaje de grasa cruda se determinó gravimétricamente usando el peso de la grasa extraída y relacionándola con el peso de la muestra inicial, los resultados obtenidos se expresan en la Tabla 16.

49

Tabla 16. Resultados obtenidos de la determinación de grasa cruda

Repeticiones

Variedad Fuerte Hass

% Grasa cruda

% Grasa cruda

R1 1,8446 2,2024 R2 1,8440 2,2211 R3 1,8291 2,2088 R4 1,8692 2,2026

Promedio 1,8466 2,2087 Elaborado por: Triguero, S.

Para la determinación de proteína se utilizó el método Kjeldahl, el cual analiza el

nitrógeno orgánico presente en la muestra, mediante el uso de un factor de conversión. El factor utilizado corresponde al valor estándar de 6,25 ya que no existe una

relación específica entre contenido de nitrógeno-porcentaje de proteína como es el caso de los lácteos, cereales entre otros. Los resultados obtenidos se expresan en la Tabla 17.

Tabla 17. Resultados obtenidos de la determinación de proteína

Repeticiones Variedad

Fuerte Hass % Proteína % Proteína

R1 3,3301 4,4297 R2 3,3270 4,4293 R3 3,3298 4,4293 R4 3,3297 4,4298

Promedio 3,3292 4,4295 Elaborado por: Triguero, S.

La determinación de cenizas se llevó a cabo mediante calcinación por vía seca,

para eliminar el agua y los elementos volátiles mediante vaporización, los compuestos orgánicos son incinerados y la mayoría de los elementos inorgánicos se convirtieron en sulfatos, óxidos, fosfatos, etc. Usando el peso obtenido después de la calcinación se calculó gravimétricamente el porcentaje, los resultados obtenidos se expresan en la Tabla 18.

50

Tabla 18. Resultados obtenidos de la determinación de cenizas

Repeticiones Variedad

Fuerte Hass % Ceniza % Ceniza

R1 3,2429 3,6667 R2 3,2476 3,6693 R3 3,2634 3,6360 R4 3,2387 3,6249

Promedio 3,2481 3,6492 Elaborado por: Triguero, S.

La determinación de fibra cruda se calculó mediante gravimetría, para lo cual se

eliminaron todas la interferencias tales como lípidos, proteínas e hidratos de carbono, mediante el proceso de hidrólisis ácida y alcalina continuos, los residuos no solubilizados y no digeridos se recogieron por filtración, luego de secado se pesó, para eliminar el error generado por la presencia de compuestos inorgánicos, los residuos fueron calcinados, luego se pesó, y se restó del correspondiente a la fibra, los resultados obtenidos se expresan en la Tabla 19.

Tabla 19. Resultados obtenidos de la determinación de fibra cruda

Repeticiones

Variedad Fuerte Hass

% Fibra cruda

% Fibra cruda

R1 9,0727 8,4932 R2 9,0673 8,5081 R3 9,0818 8,4631 R4 9,0782 8,5183

Promedio 9,0750 8,4957 Elaborado por: Triguero, S.

Los carbohidratos totales se calcularon de forma teórica por diferencia, es decir

se restó del 100% los valores obtenidos de grasa, proteína, ceniza, humedad y fibra, los resultados obtenidos se expresan en la Tabla 20.

Los resultados generales del análisis bromatológico de la semilla de aguacate de

la variedad Hass y Fuerte se expresan en la Tabla 20. De acuerdo con ellos, los carbohidratos constituyen el principal componente.

51

Tabla 20.Resultados generales obtenidos del análisis bromatológico

Variedad %Humedad % Cenizas

% proteína

% fibra

% Grasa

% carbohidratos

Fuerte 11,9662 3,6897 3,7817 10,3090 2,0977 80,1224 Hass 12,2347 4,1580 5,0470 9,6800 2,5166 78,5983

Elaborado por: Triguero, S.

Tabla 21. Resultados generales del análisis estadístico en base seca

Variedad % Grasa Desviación Estándar Varianza Fexp Ftab Texp Ttab

Fuerte 2,0977 3,68x10-5 4,04x10-

5

2,47 9,28 35,38 1,943 Hass 2,5166 9,91x10-3 9,98x10-

5

Variedad % Proteína Desviación Estándar

Varianza Fexp Ftab Texp Ttab

Fuerte 3,7817 1x10-6 3x10-5

24,94 9,28 18x105

1,943

Hass 5,0470 3x10-3 1x10-6

Variedad % Ceniza Desviación Estándar Varianza Fexp Ftab Texp Ttab

Fuerte 3,6897 5,6x10-5 1,5x10-4 4,27 9,28 33,26 1,943

Hass 4,1580 0,0254 6,4x10-4

Variedad % Fibra Desviación Estándar Varianza Fexp Ftab Texp Ttab

Fuerte 10,3085 6x10-6 5x10-5

14,41 9,28 3133,94 1,943 Hass 9,6800 0,0274 7,5x10-4

Variedad %Carbohidratos Desviación Estándar Varianza Fexp Ftab Texp Ttab

Fuerte 80,1224 3x10-6 2,4x10-4

7,69 9,28 66,89 1,943 Hass 78,5983 0,0429 0,018

Elaborado por: Triguero, S. Se realizó el análisis de varianza para cada parámetro en cada variedad, es decir

% de humedad de la variedad Hass y de la variedad Fuerte, y así con todo lo demás, el análisis de varianza nos lleva a calcular la F de Fisher de forma experimental, la cual se comparó con la F tabulada(ver anexo 9), si la F experimental es menor a la F tabulada las varianzas son iguales y se procederá a calcular la t de Student de forma experimental con la ecuación 13, por otro lado si la F experimental es mayor a la F tabulado las varianzas son diferentes y se procederá a calcular la t de Student con la ecuación 14. Dichos valores de t experimental se comparan con la t tabulada (ver anexo 10), si la t experimental es menor que la tabulada las medias son iguales, pero si es mayor las medias son diferentes.

52

Después de esta breve explicación, los resultados obtenidos mediante análisis

estadístico que se muestra en la tabla 21, nos indica que los porcentajes de humedad, solidos totales, ceniza, grasa, proteína, fibra cruda y carbohidratos de la variedad Hass son diferentes a los porcentajes que presenta la variedad Fuerte. Siendo la variedad Hass la que presenta mayor porcentaje de humedad, grasa, proteína y cenizas; mientras que la variedad Fuerte presenta mayor porcentaje de sólidos totales, fibra cruda y carbohidratos.

Los valores obtenidos fueron comparados con el trabajo de Bressani (2009),

donde se analizó la composición proximal de la semilla de aguacate en base seca, de varias variedades entre ella la Hass, los valores que se obtuvieron fueron comparados con los valores obtenidos en esta investigación, los mismos que se muestran en la siguiente tabla. La variedad Hass analizada en la investigación actual contiene mayor porcentaje proteína, ceniza, y fibra, y presenta menor porcentaje de grasa y carbohidratos.

Tabla 22. Comparación de los resultados de Bressani (2009)

Proteína Grasa Ceniza Fibra cruda

Carbohidratos

Bressani(2009) 3,44% 5,52% 3,85% 3,98% 79,54% Investigación

actual 5,07% 2,52% 4,16% 9,69% 78,60%

Elaborado por: Triguero, S. Cevallos y Montoya (2013) realizaron un análisis bromatológico en la ciudad de

Manizales en Colombia, se analizó 3 variedades de aguacate, las mismas que fueron comparadas con las variedades de la semilla de aguacate Hass y Fuerte de la presente investigación. Como conclusión las variedades Boot-8, Trinidad y Papelillos presenta mayor % de Humedad, % de proteína que las variedad Hass y Fuerte, por otra parte las las semillas de la variedad Hass y Fuerte presentan mayor porcentaje de fibra y cenizas.

Tabla 23. Cuadro comparativo del estudio de Cevallos y Montoya (2013)

Parámetro Variedad Boot-8 Trinidad papelillo Hass Fuerte

% Humedad 79,77 66,09 70,05 12,24 11,97

% Proteína 4,50 6,18 5,68 4,43 3,33 % Grasa 3,01 1,91 3,31 2,21 1,85 % Fibra 2,67 3,96 4,99 8,50 9,08

% Cenizas 3,19 3,09 3,03 3,65 3,25 Fuente: (Cevallos & Montoya, 2013)

Modificado por: Triguero, S. 53

4.3 Proceso de Extracción El proceso de extracción se realizó por maceración durante 48 horas en agitación

constante a 200 rpm con la semilla de aguacate de la variedad Hass y la variedad Fuerte, las cuales se encontraban secas y molidas, se utilizó un único solvente (etanol al 96%). El porcentaje de rendimiento de extracción se calculó mediante la ecuación 15.

% 𝑅 = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑥 100 Ecuación 15.

Cálculo del rendimiento

% 𝑅 =17,93𝑔150 𝑔

𝑥 100

% 𝑅 = 11,95 % 𝑆𝑒𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎 𝐻𝐻𝑎𝑠𝑠

% 𝑅 =19,20 𝑔150 𝑔

𝑥 100

% 𝑅 = 12,30 % 𝑆𝑒𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎 𝐹𝑢𝑒𝑒𝑟𝑡𝑡𝑒𝑒

54

4.3.1 Tamizaje fitoquímico Tabla 24. Resultados del Tamizaje fitoquímico de la semilla Hass y Fuerte

Fraccionamiento Fracción Ensayo Grupo Fitoquímico a

identificar

Semilla Hass Semilla Fuerte Resultado Observaciones Resultado Observaciones

Primero Hexano Lieberman-Burchard

Triterpenos y /o esteroides

+ Coloración rápida de rosado a azul

+ Coloración rápida de rosado a azul

Baljet Lactonas y coumarinas

- No hay cambio de coloración o aparición de

precipitado rojo

- No hay cambio de coloración o aparición de precipitado rojo

Sudán Aceites y grasas - No hay cambio de color o aparición de precipitado

- No hubo presencia de precipitado no cambio de

color Acuosa Espuma Saponinas +++ Formación de espuma

persistente por más de 5 min.

+++ Formación de espuma persistente por más de 5 min.

Shinoda Flavonoides - No formación de espuma ni cambio evidente de

color

++ Color naranja, separación de fases

Ninhidrina Aminoácidos libres o aminas en

general

+ Coloración azul violáceo - No hubo cambio de color

Borntrager Quinonas +++ Presencia de coloración roja

+++ Presencia de color rojo intenso

Kedde Glicósidos cardiotónicos

- No hay presencia del color violáceo

- No hay presencia del color violáceo

Cloruro Férrico

Fenólicos y/o taninos

+++ Color verde intenso +++ Color verde intenso

55

Cloroformo Dragendorff Alcaloides + Presencia de opalescencia

- No Hubo presencia de opalescencia, turbidez o

coloración Mayer Alcaloides + Presencia de

opalescencia - No Hubo presencia de

opalescencia, turbidez o coloración

Wagner Alcaloides - No hubo cambio de color, precipitado o

turbidez

- No Hubo presencia de opalescencia, turbidez o

coloración Cloruro de

Sodio Gelatina Fenólicos y/o

taninos - No hay cambio de color o

turbidez ++ Presencia de turbidez y

precipitado Cloruro Férrico

Fenólicos y/o taninos

- No cambio apreciable de coloración

- No hubo formación de color violeta

Segundo Hexano Lieberman-Burchard

Triterpenos y/o esteroides

+ Coloración rápida de rosado a azul

+ Coloración rápida de rosado a azul

Baljet Lactonas y coumarinas

- No hay cambio de coloración o aparición de

precipitado rojo

- No hay cambio de coloración o aparición de precipitado rojo

Sudán Aceites y grasas + Aparición de gotas de color rojo

+ Aparición de gotas de color rojo

F. Butanol Espuma Saponinas - No hubo presencia de espuma persistente.

- No hubo formación de espuma persistente

F. Éter Dietílico

Cloruro Férrico

Fenólicos y/o taninos

+ Formación de color violeta

+ Formación de color violeta

Shinoda Flavonoides +++ Formación de color naranja intenso

+ Formación de color rojo

Borntrager Quinonas + Ligera presencia de color rojo

+ Ligero color rojo

56

Kedde Glicósidos cardiotónicos

- No hay presencia del color violáceo

- No hay presencia del color violáceo

Tercero

F. Acetato de Etilo 1

Baljet Lactonas y coumarinas

-

No hay cambio de coloración o aparición de

precipitado rojo

- No hay cambio de coloración o aparición de precipitado rojo

Lieberman-Burchard

Triterpenos y /o esteroides

- No hubo cambio de color de rosado a violáceo

- No hubo cambio de color de rosado a violáceo

Sudán Aceites y grasas + Aparición de gotas de color rojo

+++ Aparición de precipitado color rojo

F. Acetato de Etilo 2

Dragendorff Alcaloides + Presencia de opalescencia

- No Hubo presencia de opalescencia, turbidez o

coloración Mayer Alcaloides + Presencia de

opalescencia + Formación de opalescencia

Wagner Alcaloides + Presencia de opalescencia

- No Hubo presencia de opalescencia, turbidez o

coloración F. Acuosa

Dragendorff Alcaloides - No Hubo presencia de opalescencia, turbidez o

coloración

- No Hubo presencia de opalescencia, turbidez o

coloración Mayer Alcaloides + Presencia de

opalescencia + Formación de opalescencia

Wagner Alcaloides - No Hubo presencia de + Formación de opalescencia

57

Elaborado por: Triguero, S.

Los criterios de interpretación, de las pruebas cualitativas se presentan en la tabla 8 (pag. 39)

opalescencia, turbidez o coloración

Ninhidrina Aminoácidos libres o aminas en

general

-

No hubo cambio de color - No hubo cambio de color

58

Mediante el tamizaje fitoquímico se identificaron los grupos de compuestos o de familias como es el caso de los taninos, fenoles, flavonoides, y en menor cantidad saponinas y alcaloides, como podemos ver no todas las fracciones contienen los mismos grupos fitoquímicos.

Los grupos fitoquímicos más abundantes en la variedad de la semilla Hass son

las saponinas, quinonas, fenoles, taninos y flavonoides, en la variedad de la semilla Fuerte lo que más encontramos es las saponinas, quinonas, fenoles y aceites o grasas.

Los grupos fitoquímicos más abundantes encontrados en la variedad Hass fueron las saponinas, quinonas, fenoles, taninos y flavonoides, la variedad Fuerte se encontró las saponinas, quinonas, fenoles, taninos, flavonoides, aceites y grasas. (Ver anexo 12 y 13)

4.3.2 Cromatografía en capa fina.

Se utilizaron diferentes fases móviles y reveladores como se indica en la Tabla 9. Para identificar la presencia de compuesto fitoquímicos presentes en las diferentes fracciones de las dos variedades de semilla de aguacate obteniéndose los resultados que se muestran en la Tabla 25. (Ver anexo 14)

Tabla 25. Resultados de la cromatografía en capa fina

Fracción Grupo Fotoquímico

Semilla Fuerte Semilla Hass Observaciones Observaciones

F2. Éter dietílico

Flavonoides Mancha Fluorescente y de

onda larga en UV

Mancha Fluorescente y de onda larga en

UV

F1. Acuosa Flavonoides Mancha Fluorescente y de

onda larga en UV No aplica

F2. Acuosa Alcaloides - - F1.

Cloroformo Alcaloides No aplica -

F2. Acetato de etilo

Alcaloides Mancha de onda larga

fluorescente en UV Mancha de onda

larga fluorescente

F1. Hexano Esteroles Manchas de diferentes

colores y fluorescente en UV

Manchas de diferentes colores y fluorescente en UV

F2. Hexano Esteroles Manchas de diferentes

colores y fluorescente en UV

Manchas de diferentes colores y fluorescente en UV

F1. Acuosa Antraquinonas - - Naftoquinonas - -

F2. Éter dietílico

Antraquinonas Manchas fluorescentes y a

largadas en UV Manchas

fluorescentes y a

59

largadas en UV

Naftoquinonas Manchas fluorescentes y a

largadas en UV

Manchas fluorescentes y a largadas en UV

F1. Acuosa Taninos Mancha Fluorescente y de

onda larga en UV

Mancha Fluorescente y de onda larga en

UV F1.

Cloruro de Sodio

Taninos Mancha Fluorescente y de

onda larga en UV No aplica

F2. Éter Dietílico

Taninos Mancha Fluorescente y de

onda larga en UV

Mancha Fluorescente y de onda larga en

UV Elaborado por: Triguero, S.

Tabla 26. Rf obtenidos de la cromatografía de capa fina

Fracción Grupo Fitoquímico

Variedad Semilla Fuerte Semilla Hass

Rf Color en

UV Color en

fluorescencia Rf Color en UV

Color en fluorescencia

F2. Éter dietílico

Flavonoides 0,26 Amarillo Si 0,54 Amarillo Si

F1. Acuosa

Flavonoides - - - 0,31 Amarillo Si

F2. Acetato de etilo

Alcaloides 0,68 Rojo Si

0,17 Rojo Si

F1. Hexano

Esteroles 0,14 Verde Si 0,13 Verde Si

F2. Hexano

Esteroles 0,20 Verde Si 0,24 Verde Si

F2. Éter dietílico

Antraquinonas 0,69 Rojo Si 0,65 Rojo Si Naftoquinonas 0,90 Verde 0,84 Verde Si

F1. Acuosa

Taninos 0,52 Rojo Si 0,42 Rojo

F1. Cloruro de sodio

Taninos 0,46 Rojo Si - Rojo -

F2. Éter dietílico

Taninos 0,17 rojo Si 0,63 Rojo Si

Elaborado por: Triguero, S.

60

4.4 Cuantificación de Flavonoides El proceso se llevó a cabo mediante el método espectrofotométrico utilizando

como estándar indicador la Quercetina, obteniendo los siguientes resultados de absorbancia de acuerdo con la concentración.

Tabla 27. Resultados de la absorbancia del Estándar de Quercetina

Estándar Absorbancia Concentración (mg/mL)

Concentración Corregida(mg/mL)

1 0,119 1,5 1,4295 2 0,229 3,0 2,8590 3 0,323 4,5 4,2885 4 0,391 6,0 5,7180 5 0,484 7,5 7,1475 6 0,571 9,0 8,5770 7 0,628 10,5 10,0065

Elaborado por: Triguero, S.

Gráfica 4. Curva de calibración de estándar de quercetina

Elaborado por: Triguero, S.

𝐴𝐴 = 𝑚𝐶 + 𝑏 0,244 = 0.0593𝐶 + 0.0533

𝐶 =0.244 − 0.0533

0.0593 𝑥 100 𝑥 𝐹𝐷

𝐶 = 3215,85 [mg Quercetina/ mL extracto]

61

Tabla 28. Concentración de Flavonoides en extracto y fracciones de las variedades Hass y Fuerte

Muestra Fracción Absorbancia Concentración(mg/mL)

Semilla Fuerte

Extracto 0,244 3215,85 F. Éter

dietílico 0,081 46,71

F. Acuosa 0,111 97,30

Semilla Hass

Extracto 0,267 3603,71 F. Éter

dietílico 0,146 156,32

F. Acuosa 0,223 286,17 Elaborado por: Triguero, S.

Según los resultados obtenido observamos que la semilla Hass en comparación con la semilla Fuerte, es la que mayor concentración de flavonoides presenta.

Por otra parte, al comparar los resultados obtenidos de las fracciones acuosas de

ambas variedades, con un estudio realizado por Valenzuela (2014) en Argentina con cuatro variedades de semilla de calabaza rayada, la cual obtuvo los siguientes valores 1,35; 0,43; 1,72; 0 48 mg de Quercetina/g extracto, mientras que la semilla Hass tiene 286,17 mg de Quercetina /mL extracto, y la semilla Fuerte tiene 97,30 mg de Quercetina/mL de extracto. Dando como resultado que la semilla de aguacate tiene mayor concentración de flavonoides en comparación con la semilla de calabaza. (Valenzuela, 2014)

4.5 Cuantificación de Fenoles La cuantificación de fenoles se realizó por el método espectrofotométrico

utilizando como Estándar marcador al Ácido Gálico, obteniendo como resultado las siguientes absorbancias de acuerdo con cada concentración.

Tabla 29. Resultados de la curva de Estándar de Ácido Gálico

Estándar Concentración Concentración Corregida(mg/mL) Absorbancia

1 0,1 0,0995 0,006 2 0,2 0,1990 0,028 3 0,3 0,2985 0,087 4 0,5 0,4975 0,201 5 0,6 0,5970 0,307 6 0,8 0,7960 0,411 7 1,2 1,1940 0,655 8 1,3 1,2935 0,740

Elaborado por: Triguero, S.

62

Gráfica 5. Curva de estándar de ácido gálico

Elaborado por: Triguero, S.

𝐴𝐴 = 𝑚𝐶 − 𝑏

𝐴𝐴 = 0.6282𝐶 − 0.0863 0,068 = 0.6282𝐶 − 0.0863

𝐶 =0,068 + 0,0863

0,6282 𝑥 100 𝑥 𝐹𝐷

𝐶 = 46,71 [mg Ácido Gálico / mL extracto]

Tabla 30. Concentración de fenoles en extracto y fracciones de las variedades Hass y Fuerte

Muestra Fracción Absorbancia Concentración

(mg/ml)

Semilla Fuerte

Extracto 0,068 46,71 F. Éter

dietílico 0,029 7,97

F. Acuosa 0,187 51,38

Semilla Hass

Extracto 0,221 978,35 F. Éter

dietílico 0,016 325,69

F. Acuosa 0,210 943,33 Elaborado por: Triguero, S.

Según los resultados podemos ver que la semilla Hass es la que mayor cantidad

de fenoles presenta en comparación de la semilla Fuerte.

63

La cantidad de fenoles presentes en las semillas de aguacates de ambas variedades es abundante en comparación con la semilla de calabaza rayada según un estudio realizado en Argentina con cuatro variedades de dicha semilla, al comparar las fracciones acuosas de las semillas de aguacate con las semillas de calabaza rayada se observa valores de 67,48; 14,15; 25,06; 53,88 µmol de ácido gálico/g extracto, mientras que para la semilla Hass se obtuvo 943,33 mg/ml de ácido gálico y para la variedad Fuerte se obtuvo 51,38 mg/ml de ácido gálico. (Valenzuela, 2014)

4.6 Evaluación de la actividad antioxidante de las semillas Hass y Fuerte La evaluación de la actividad antioxidante se realizó mediante el método DPPH,

el estándar que se utilizó es el ácido ascórbico y el solvente fue agua, la longitud de onda a la cual se trabajó fue de 517 nm, la Absorbancia del DPPH fue de 2,1679.

Mediante la Ecuación 10 se realizó el cálculo del porcentaje de inhibición del ácido ascórbico y de las muestras

Tabla 31. Datos de la curva de calibración del ácido ascórbico

Tratamiento Concentración (µL) DPPH Etanol

96% Blanco --- 5.8 mL 200

1 2 5.8 mL 198 2 4 5.8 mL 196 3 10 5.8 mL 190 4 20 5.8 mL 180 5 40 5.8 mL 160 6 100 5.8 mL 100 7 160 5.8 mL 40

Elaborado por: Triguero, S.

Tabla 32. Resultados de la curva del Estándar Ácido ascórbico Estándar Volumen

(µL) Absorbancia Concentración

(mg/ µL) %

Inhibición 1 2 1,725 1,77 20,43 2 4 1,666 4,17 23,15 3 10 1,645 6,29 24,12 4 20 1,479 23,01 31,78 5 40 1,241 46,98 42,76 6 100 0,736 97,82 66,05 7 160 0,123 159,55 94,33

Elaborado por: Triguero, S.

64

Gráfica 6. Curva del estándar del ácido ascórbico

Elaborado por: Triguero, S.

Tabla 33.Resultado en % de inhibición del extracto de semilla Hass Tratamiento Volumen

(µL) Absorbancia Concentración

(mg/mL) %

Inhibición 1 2 0,240 72,07 88,93 2 4 0,179 144,15 91,74 3 10 0,172 360,37 92,07 4 20 0,169 720,74 92,20 5 40 0,165 1441,48 92,39 6 100 0,153 3603,71 92,94 7 160 0,145 5765.94 93,31

Elaborado por: Triguero, S.

65

Gráfica 7. Curva del % de inhibición de la semilla Hass

Elaborado por: Triguero, S. Tabla 34. Resultado en % de inhibición de la fracción acuosa de la semilla Hass

Tratamiento Volumen (µL) Absorbancia Concentración

(mg/mL) %

Inhibición 1 2 0,347 0,57 83,99 2 4 µL 0,328 1,14 84,87 3 10 µL 0,310 2,86 85,70 4 20 µL 0,278 5,72 87,18 5 40 µL 0,272 11,45 87,45 6 100 µL 0,238 28,62 89,02 7 160 µL 0,209 45,79 90,36

Elaborado por: Triguero, S.

Gráfica 8. Curva del % de inhibición de la fracción acuosa de la semilla Hass

Elaborado por: Triguero, S.

66

Tabla 35. Resultados en % de inhibición de la fracción éter dietílico de la semilla Hass

Tratamiento Volumen

(µL) Absorbancia Concentración

(mg/mL)

% Inhibició

n 1 2 1,990 3,13 8,21 2 4 1,945 6,25 10,28 3 10 1,839 15,63 15,17 4 20 1,835 31,26 15,36 5 40 1,503 62,53 30,67 6 100 1,233 156,32 43,12 7 160 1,112 250,11 48,71

Elaborado por: Triguero, S.

Gráfica 9. Curva del % de inhibición de la fracción éter dietílico de la semilla

Hass Elaborado por: Triguero, S.

Tabla 36. Resultados en % de inhibición del extracto de la semilla Fuerte Tratamiento Volumen

(µL) Absorbancia Concentración

(mg/mL) %

Inhibición 1 2 1,816 64,32 16,23 2 4 1,731 128,63 20,15 3 10 1,580 321,59 27,12 4 20 1,186 643,17 45,29 5 40 0,213 1286,34 90,17 6 100 0,201 3215,85 90,73 7 160 0,185 5145,36 91,47

Elaborado por: Triguero, S.

67

Gráfica 10. Curva del % de inhibición del extracto de la semilla Fuerte

Elaborado por: Triguero, S.

Tabla 37. Resultado del % de inhibición de la fracción acuosa de la semilla Fuerte

Tratamiento Volumen (µL)

Absorbancia Concentración (mg/mL)

% Inhibición

1 2 0,210 0,19 90,31 2 4 0,181 0,39 91,65 3 10 0,160 0,97 92,62 4 20 0,156 1,95 92,80 5 40 0,155 3,89 92,85 6 100 0,152 9,73 92,99 7 160 0,143 15,57 93,40

Elaborado por: Triguero, S.

68

Gráfica 11. Curva del % de inhibición de la fracción acuosa de la semilla

Fuerte Elaborado por: Triguero, S.

Tabla 38. Resultados del % de inhibición de la fracción éter dietílico de la

semilla Fuerte

Tratamiento Volumen(µL) Absorbancia Concentración (mg/mL)

% Inhibición

1 2 1,974 0,93 8,94 2 4 1,912 1,87 11,80 3 10 1,894 4,67 12,63 4 20 1,749 9,34 19,32 5 40 1,457 18,68 32,79 6 100 0,259 46,71 88,05 7 160 0,203 74,74 90,64

Elaborado por: Triguero, S.

69

Gráfica 12. Curva del % de inhibición de la fracción éter dietílico de la semilla

Fuerte Elaborado por: Triguero, S.

Según los resultados presentes en la gráfica 10, que refleja la concentración en

mg/mL de los extractos totales y de las fracciones de cada variedad, vs. El % de inhibición de cada extracto total y de cada fracción, se analizó y comparó, siendo la fracción acuosa de la variedad Fuerte la que presenta un porcentaje de inhibición más alto, seguido por el extracto total de la variedad Hass, siendo la variedad Hass la que presentó mayor poder de inhibición frente al DPPH en comparación con el estándar que es el ácido ascórbico.

Gráfica 13. Curvas de los % de inhibición y las fracciones

Elaborado por: Triguero, S.

0102030405060708090

100

64,32 128,63 321,59 643,17 1286,34 3215,85 5145,36

% d

e In

hibi

ción

Concentración (mg/mL)

S. Fuerte Extracto total

S. Fuerte, F. Éter dietilico

S.Fuerte, F. Acuosa

S. Hass, Extracto total

S. Hass, F. Éter dietilico

S. Hass, F. Acuosa

70

De manera adicional dichos resultados se compararon con los resultados de un trabajo de investigación realizado en la ciudad de Obregón, Sonora, en el cual se evalúa la actividad antioxidante por el método DPPH, en extractos obtenidos por maceración metanólica, dando como resultados un rango de 13,914-4,921 µMET/g. En el presente trabajo se usó el mismo método pero diferente solvente para la maceración y el resultado obtenido fue mucho mayor. (Chávez, 2012).

4.7 Evaluación de la actividad antimicrobiana La evaluación de la actividad antimicrobiana se llevó a cabo mediante la técnica

de pocillos de microdilución, el cual se midió por turbidez en el equipo Hybrid Multi-Mode microplate reader, mediante el programa Gem 5TM, obteniendo los resultados que se expresan en la Tabla 39 y 42. (Ver anexo 16)

Tabla 39. Resultado de la absorbancia de la fracción activa de las variedades

Hass y Fuerte en presencia de Escherichia coli. Cepa Variedad AbsC1 AbsC2 AbsC3 AbsB AbsCpos. AbsCneg.

Escherichia coli

Semilla Hass

Extracto

0,435 0,557 0,656 0,059 0,098 0,408 0,402 0,530 0,781 0,065 0,100 0,398 0,386 0,524 0,679 0,066 0,101 0,402 0,415 0,538 0,693 0,061 0,099 0,396

Promedio 0,410 0,538 0,703 0,063 0,100 0,401

Fracción Acuosa

0,098 0,150 0,391 0,059 0,098 0,408 0,096 0,148 0,392 0,065 0,100 0,398 0,092 0,155 0,399 0,066 0,101 0,402 0,099 0,151 0,398 0,061 0,099 0,396

Promedio 0,096 0,151 0,395 0,063 0,100 0,401

Fracción éter

dietílico

0,013 0,066 0,099 0,059 0,098 0,408 0,038 0,005 0,050 0,065 0,100 0,398 0,121 0,019 0,180 0,066 0,101 0,402 0,076 0,013 0,124 0,061 0,099 0,396

Promedio 0,055 0,007 0,114 0,063 0,100 0,401

Semilla Fuerte

Extracto

0,350 0,452 0,935 0,059 0,098 0,408 0,403 0,524 1,011 0,065 0,100 0,398 0,413 0,521 1,071 0,066 0,101 0,402 0,411 0,525 1,136 0,061 0,099 0,396

Promedio 0,395 0,506 1,039 0,063 0,100 0,401

Fracción Acuosa

0,193 0,199 0,321 0,059 0,098 0,408 0,179 0,204 0,331 0,065 0,100 0,398 0,102 0,211 0,299 0,066 0,101 0,402 0,112 0,209 0,354 0,061 0,099 0,396

Promedio 0,147 0,206 0,327 0,063 0,100 0,401

Fracción éter

0,289 0,399 0,473 0,059 0,098 0,408 0,337 0,386 0,434 0,065 0,100 0,398 0,291 0,304 0,398 0,066 0,101 0,402

71

dietílico 0,301 0,387 0,445 0,061 0,099 0,396 Promedio 0,305 0,369 0,438 0,063 0,100 0,401

Elaborado por: Triguero, S. El cálculo del porcentaje de inhibición se llevó a cabo mediante la ecuación 9,

obteniendo los siguientes resultados

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝐴𝑏𝑠.𝐶𝑜𝑜𝑛𝑡𝑡𝑟𝑜𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑜𝑠𝑖𝑡𝑡𝑖𝑣𝑜𝑜 − 𝐴𝐴𝑏𝑠. 𝑐𝑐𝑜𝑜𝑛𝑐𝑐𝑒𝑒𝑛𝑡𝑡𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖𝑜𝑜𝑛

𝐴𝐴𝑏𝑠.𝐶𝑜𝑜𝑛𝑡𝑡𝑟𝑜𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑜𝑠𝑖𝑡𝑡𝑖𝑣𝑜𝑜 𝑥 100

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑐𝑖ó𝑛 =0,401 − 0,096

0,401 𝑥 100

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑐𝑖ó𝑛 = 76 Tabla 40. Resultados del % de inhibición del extracto y las fracciones de las

variedades Hass y Fuerte frente a Escherichia coli Cepa Variedad AbsC1 AbsC2 AbsC3

Escherichia coli

Semilla Hass

Extracto No

inhibe No

inhibe No

inhibe Fracción Acuosa 76% 62,34% 1,50%

Fracción éter dietílico

96,88% 85,16% 71,76%

Semilla Fuerte

Extracto 1,68% No

inhibe No

inhibe Fracción Acuosa 63,47% 48,69% 18,64%

Fracción éter dietílico

24,05% 7,98% No

inhibe Elaborado por: Triguero, S.

Los porcentajes de inhibición que se presentan en la Tabla 39. Son el resultado

de las absorbancias medidas de las concentraciones las cuales fueron diluidas 3 veces al añadir el medio de cultivo y la suspensión bacteriana.

Tomando en cuenta tal consideración, la fracción éter dietílico de la semilla Hass

tiene mayor inhibición de crecimiento bacteriano en comparación con el antibiótico el cual presentó una inhibición del 90,89% a la mínima concentración.

Tabla 41. Resultados del análisis estadístico

Fuente de variación

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Cuadrados medios

Estadísticas F

F Tabulada

Factor A Diluciones

10126,34 2 5063,17 3,86 3,16

Factor B Variedad

11193,96 1 11193,96 8,54 4,02

Factor C 32987,77 2 16493,89 12,59 3,16

72

Fracciones Interacción

AB 420,43 2 210,22 0,16 3,16

Interacción AC

7906,86 4 1976,71 1,51 2,54

Interacción BC

20443 2 10221,5 7,80

3,16

Interacción ABC

809,62 4 202,41 0,15 2,54

Error 70770,90 54 1310,57 Total 154658,86 71

Elaborado por: Triguero, S. Los valores obtenidos de F experimental nos indican que las diluciones, las

variedades y las fracciones son diferentes por separado y entre sí, además que no existe interacción entre las variedades y las diluciones, ya que los niveles de concentración de las diluciones son diferentes, por lo tanto ejercer cierta acción en la bacteria independientemente de la variedad. De igual forma no existe interacción entre las diluciones y las fracciones de cada variedad, lo que nos indica que las fracciones ejercen su propia acción sobre la bacteria independiente de la concentración que tenga. Pero si existe interacción entre las variedades y las fracciones, esto nos dice que va a depender de la variedad y de la fracción para que haya crecimiento bacteriano, y por ultimo no existe interacción entre los factores A, B, C, es decir que la inhibición se verá afectada de forma independiente de la concentración, fracción y variedad de la semilla. Después de pruebas de comparación la concentración inicial (C1) es la mejor inhibiendo el crecimiento bacteriano en ambas variedades, y en la variedad Hass la mejor fracción es la de éter dietílico, de la variedad Fuerte la mejor fracción es la acuosa, y al comparar ambas variedades la mejor es la Hass.

Tabla 42. Resultado de las absorbancias medidas de las variedades Hass y Fuerte en presencia de Staphylococcus aureus.

Cepa Variedad AbsC1 AbsC2 AbsC3 AbsB AbsCpos. AbsCneg

Staphylococcus aureus

Semilla Hass

Extracto

0,207 0,694 1,004 0,056 0,115 0,292

0,526 0,705 0,946 0,057 0,112 0,304 0,546 0,813 0,983 0,056 0,110 0,297 0,513 0,782 0,994 0,063 0,117 0,314

Promedio 0,448 0,749 0,982 0,058 0,114 0,302

Fracción Acuosa

0,008 0,173 0,308 0,056 0,115 0,292 0,065 0,185 0,331 0,057 0,112 0,304 0,062 0,277 0,262 0,056 0,11 0,297 0,051 0,198 0,289 0,063 0,117 0,314

Promedio 0,043 0,208 0,298 0,058 0,114 0,302 Fracción 0,003 0,017 0,072 0,056 0,115 0,292

73

éter dietílico

0,001 0,019 0,087 0,057 0,112 0,304 0,003 0,014 0,133 0,056 0,11 0,297 0,000 0,030 0,148 0,063 0,117 0,314

Promedio 0,000 0,020 0,110 0,058 0,114 0,302

Semilla Fuerte

Extracto

0,231 0,541 0,577 0,056 0,115 0,292 0,252 0,51 0,564 0,057 0,112 0,304 0,21 0,526 0,556 0,056 0,110 0,297

0,199 0,503 0,583 0,063 0,117 0,314 Promedio 0,223 0,520 0,570 0,058 0,114 0,302

Fracción Acuosa

0,053 0,194 0,298 0,056 0,115 0,292 0,046 0,198 0,295 0,057 0,112 0,304 0,048 0,193 0,304 0,056 0,110 0,297 0,051 0,199 0,303 0,063 0,117 0,314

Promedio 0,050 0,196 0,300 0,058 0,114 0,302

Fracción éter

dietílico

0,249 0,295 0,397 0,056 0,115 0,292 0,221 0,311 0,409 0,057 0,112 0,304 0,254 0,301 0,403 0,056 0,11 0,297 0,267 0,294 0,405 0,063 0,117 0,314

Promedio 0,248 0,300 0,404 0,058 0,114 0,302 Elaborado por: Triguero, S.

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝐴𝑏𝑠.𝐶𝑜𝑜𝑛𝑡𝑡𝑟𝑜𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑜𝑠𝑖𝑡𝑡𝑖𝑣𝑜𝑜 − 𝐴𝐴𝑏𝑠. 𝑐𝑐𝑜𝑜𝑛𝑐𝑐𝑒𝑒𝑛𝑡𝑡𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖𝑜𝑜𝑛

𝐴𝐴𝑏𝑠.𝐶𝑜𝑜𝑛𝑡𝑡𝑟𝑜𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑜𝑠𝑖𝑡𝑡𝑖𝑣𝑜𝑜 𝑥 100

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑐𝑖ó𝑛 =0,302 − 0,248

0,302 𝑥 100

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑐𝑖ó𝑛 = 17,90 Tabla 43. Resultados del % de inhibición del extracto y las fracciones de las

variedades Fuerte y Hass en presencia de Staphylococcus aureus. Cepa Variedad AbsC1 AbsC2 AbsC3

Staphylococcus aureus

Semilla Hass

Extracto No

inhibe No

inhibe No

inhibe Fracción Acuosa 84,59% 30,99% 1,41%

Fracción éter dietílico

99,42% 93.37% 63,55%

Semilla Fuerte

Extracto 26,10% No

inhibe No

inhibe Fracción Acuosa 83,60% 35,05% 0,58%

Fracción éter dietílico

17,90% 0,50% No

inhibe Elaborado por: Triguero, S.

74

Los porcentajes de inhibición que se presentan en la Tabla 43, Son el resultado de las absorbancias medidas de las concentraciones las cuales fueron diluidas 3 veces al añadir el medio de cultivo y la suspensión bacteriana.

Tomando en cuenta tal consideración, la fracción éter dietílico de la semilla Hass

tiene mayor inhibición de crecimiento bacteriano en comparación con el antibiótico el cual presentó una inhibición del 78,80% a la mínima concentración.

Tabla 44. Resultados del análisis estadístico

Fuente de variación

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Cuadrados medios

Estadísticas F

F Tabulada

Factor A Diluciones

21416,88 2 10708,44 8,36 3,16

Factor B Variedad

10732,83 1 10732,83 8,38 4,02

Factor C Fracciones

22573,15 2 11286,58 8,81 3,16

Interacción AB

225,31 2 112,66 0,09 3,16

Interacción AC

10189,6 4 2547,40 1,99 2,54

Interacción BC

27076,9 2 13538,4 10,57 3,16

Interacción ABC

1121,66 4 280,41 0,22 2,54

Error 69190,60 54 1281,31 Total 162526,90 71

Elaborado por: Triguero, S.

Los valores obtenidos de F experimental nos indicas que las diluciones, las variedades y las fracciones son diferentes por separado y entre sí, además que no existe interacción entre las variedades y las diluciones, ya que los niveles de concentración de las diluciones son diferentes por lo tanto ejercer cierta acción en la bacteria independientemente de la variedad, de igual forma no existe interacción entre las diluciones y las fracciones, lo que nos indica que las fracciones ejercen su propia acción sobre la bacteria independiente de la concentración en la que se encuentre. Por otro lado si existe interacción entre las variedades y las fracciones, es decir que la capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano está relacionado con el tipo de variedad de semilla y el tipo de fracción que se utilice, y por ultimo no existe interacción entre los factores A, B, C, es decir que la inhibición del crecimiento se verá afectada de forma independiente de la variedad, la fracción y la concentración. Después de pruebas de comparación la concentración inicial (C1) es la mejor inhibiendo el crecimiento bacteriano, de la

75

variedad Hass la mejor fracción es la de éter dietílico, y de la variedad Fuerte la mejor fracción es la acuosa, y comparando las dos variedades la mejor es la Hass.

Además, dichos valores fueron comparados con el trabajo realizado por (Chávez, Luis; 2012) en el cual realiza la evaluación antimicrobiana por el método de discos de difusión en agar, en bacterias Escherichia coli O157:H7, Salmonella y Listeria monocytogenes, en donde los resultados fueron positivos, es decir no hubo crecimiento bacteriano, reportando halos de inhibición de 20,24 y 36 nm. Por su parte en la actual investigación los resultados no son muy favorables, lo cual se le atribuye tal vez al método y a las diluciones de las concentraciones.

76

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 5.1 Conclusiones

Se caracterizó a la semilla de aguacate (Persea americana) de las variedades Hass y Fuerte, y se extrajo y se identificó la fracción con mayor actividad antioxidante y antimicrobiana.

Se determinó la composición proximal de la semilla de aguacate seca de la variedad Fuerte y variedad Hass, obteniendo como resultados los que muestran a continuación.Tabla 21.

Variedad %Humedad % Cenizas

% proteína

% fibra

% Grasa

% carbohidratos

Fuerte 11,9662 3,6897 3,7817 10,3090 2,0977 80,1224 Hass 12,2347 4,1580 5,0470 9,6800 2,5166 78,5983

Se realizó una comparación cuantitativa entre ambas variedades y mediante pruebas estadísticas, se determinó que ambas variedades son diferentes en sus componentes, es decir sus valores de humedad, grasa, proteína, ceniza, fibra cruda y carbohidratos se encuentran en diferentes cantidades para cada variedad, siendo la semilla Fuerte la que presente los valores más altos para humedad, ceniza, proteína y grasa, y la variedad Hass presenta mayor porcentaje de fibra y carbohidratos.

Se realizó el tamizaje Fitoquímico, que se inició con una maceración para cada

variedad de semilla de aguacate con etanol al 96% durante 48 horas con agitación constante a 200 rpm, con la finalidad de realizar la extracción mediante partición en el cual se obtuvo las siguientes particiones para ambas variedades: Fracción Hexano, Fracción Acuosa, Fracción Cloroformo, Fracción Cloruro de sodio, Fracción Hexano 2, Fracción Butanol, Fracción Éter dietílico, Fracción Acetato de Etilo 1, Fracción Acetato de Etilo 2, Fracción Acuosa 2.

Se identificó los metabolitos secundarios presentes en cada fracción de cada

variedad de semilla, mediante ensayos fitoquímicos, siendo los fenoles, taninos, flavonoides, saponinas, quinonas los más abundantes en ambas variedades, además se registró la presencia de otros metabolitos secundarios en menor cantidad, como los triterpenos o esteroides, aceites y grasa, aminoácidos libres, aminas en general, alcaloides, lactonas, coumarinas.

Se identificaron mediante cromatografía de capa fina los grupos fitoquímicos

como flavonoides, alcaloides, esteroles, Quinonas (Antraquinonas, Naftoquinonas),

77

taninos; en las fracciones éter dietílico, acuosa 1, acuosa 2, acetato de etilo 2, hexano 1, hexano 2, cloruro de sodio. En la variedad Fuerte, se obtuvo resultados negativos para Alcaloides en la fracción acuosa 2, y en la fracción acuosa 1 para Quinonas, para las demás fracciones los resultados fueron positivos. En la variedad Hass, para las fracciones de éter dietílico, acuosa 2, cloroformo, acetato de etilo 2, hexano 1, hexano2, acuosa 1, los resultados fueron positivos, para alcaloides en las fracciones de cloroformo y acuosa los resultados fueron negativos, así también para quinonas en la fracción acuosa. Estos resultados negativos nos indican que dichos grupos que por pruebas de tamizaje fitoquímicas resultaron positivas posiblemente se encuentran en cantidades muy pequeñas ya que en la luz UV no se vieron reflejadas.

Se cuantificó la presencia de fenoles y flavonoides en las fracciones que

salieron positivas en las pruebas del tamizaje Fitoquímico, para posteriormente evaluar la actividad antioxidante mediante el método DPPH en los extractos totales, en las fracciones de éter dietílico y acuosa de ambas variedades, determinando que la fracción con mayor porcentaje de inhibición en la variedad Hass es el extracto total, y en la variedad Fuerte es la fracción acuosa, y entre las dos variedades la que presenta mayor actividad antioxidante es la variedad Hass, con base en la concentración de flavonoides y por ende la capacidad de inhibir la actividad del DPPH. Además, al realizar una comparación de la concentración de fenoles y flavonoides presentes en la Cucúrbita o calabaza rayada realizada en Argentina, pudimos ver que las semillas de aguacate presentan mayor concentración en fenoles y flavonoides.

Se evaluó la actividad antimicrobiana para cada variedad de semilla mediante

el método de microdilución en placa, las absorbancias se leyeron en el equipo Hybrid Multi- Mode Microplate Reader, utilizando el programa Gem 5TM, utilizando Escherichia coli ATCC y Staphylococcus aureus ATCC como cepas bacterianas, a 3 concentraciones diferentes, obteniendo los siguientes resultados (Tabla 39, Tabla 42)

Cepa Variedad Fracción AbsC1 AbsC2 AbsC3

Escherichia coli

Semilla Hass

Extracto No

inhibe No

inhibe No

inhibe Fracción Acuosa 76% 62,34% 1,50%

Fracción éter dietílico

96,88% 85,16% 71,76%

Semilla Fuerte

Extracto 1,68% No

inhibe No

inhibe Fracción Acuosa 63,47% 48,69% 18,64%

Fracción éter dietílico

24,05% 7,98% No

inhibe Staphylococcus

aureus Semilla

Hass Extracto

No inhibe

No inhibe

No inhibe

78

Fracción Acuosa 84,59% 30,99% 1,41% Fracción éter

dietílico 99,42% 93.37% 63,55%

Semilla Fuerte

Extracto 26,10% No

inhibe No

inhibe Fracción Acuosa 83,60% 35,05% 0,58%

Fracción éter dietílico

17,90% 0,50% No

inhibe Se determinó mediante un análisis factorial de 3x3 que el crecimiento bacteriano

se ve influenciado por la variedad del aguacate y por el tipo de fracción, además el análisis factorial nos indica que para la bacteria Escherichia coli, la mejor variedad para inhibir su crecimiento es la semilla Hass con la fracción Éter dietílico, para la bacteria Staphylococcus aureus es la semilla Hass con la fracción Éter dietílico.

Dichas fracciones fueron comparadas con el antibiótico Ceftriaxona, a la mínima

concentración a la cual inhibe el crecimiento de cada bacteria, previo a esto hay que tomar en cuenta que dicha concentración también fue diluida al añadir el medio de cultivo y la suspensión bacteriana. Por lo tanto, el porcentaje de inhibición del antibiótico para Escherichia coli fue de 90,98% y para Staphylococcus aureus fue de 78,80%, llevando a la conclusión que las fracciones de Éter dietílico de la variedad Hass resultó mejor que el antibiótico para ambas bacterias.

5.2 RECOMENDACIONES Realizar estudios e investigaciones en los cuales se les encuentre un uso

potencial a nivel alimenticio a la semilla debido al alto contenido de carbohidratos y fibra.

Se recomienda realizar otro tipo de cromatografía para comprobación de grupos fitoquímicos presentes.

Probar la capacidad antioxidante de la semilla en alimentos sensibles a la oxidación, como la manzana, la pera, el banano, entre otras.

Realizar una validación del método de los pocillos de microdilución para determinar si es adecuado para evaluar la actividad antimicrobiana.

Probar las fracciones positivas para la inhibición del crecimiento bacteriano a diferentes concentraciones y para otros microorganismos

79

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82

ANEXOS ANEXO 1. Certificado del INIAP

83

ANEXO 2. Diagrama causa y efecto

Desechos de la semilla de aguacate

Contaminación ambiental

Genera nuevas fuentes de

investigación

Análisis de propiedades

antioxidatoria

Se utiliza solo la pulpa de aguacate para extracción de

aceites

Solo se consume la pulpa de aguacate

Falta de utilidad de la semilla de

aguacate

A nivel industrial se desecha la cascara y

la semilla

El consumidor desecha las cascara

y la semilla del aguacate

Se desconoce algún otro uso para la

semilla de aguacate

Analisis de la capacidad

antimicrobiana

Sustitutos en antibióticos para

animales

Se buscan nuevas formas de utilidad para un producto

secundario

Sustitutos para antioxidante

sintéticos

84

ANEXO 3. Fragmento de la norma INEN 518 (Determinación de humedad)

85

86

87

ANEXO 4. Fragmento de la norma INEN 520 (Determinación de Cenizas)

88

89

90

ANEXO 5. Fragmento de la norma INEN 519 (Determinación de Proteína)

91

92

93

ANEXO 6. Fragmento de la norma INEN 523 (Determinación de Grasa total)

94

95

96

ANEXO 7. Fragmento de la norma INEN 522 (Determinación de fibra cruda)

97

98

99

100

ANEXO 8. Diagrama de flujo del proceso de fraccionamiento Primer Fraccionamiento

Segundo fraccionamiento

101

Tercer Fraccionamiento

102

ANEXO 9. Valores críticos de F para un contraste de una cola (P=0,05)

Tomado de Miller & Miller (2002)

103

ANEXO 10. Valores de t de Student

Tomado de Universidad de Valencia (s.f.)

104

ANEXO 11. Proceso del tratamiento de la muestra

ANEXO 12. Maceración y tamizaje fitoquímico

Fotografia 1. secado de la semilla Fotografia 2. Molienda de la semilla

fotografia 3. Maceración Fotografía 4.

Maceración, etanol 96% Fotografía 5.Obtención

de los extractos

Fotografía 6. Concentración de los

extractos

Fotografía 7. Obtención de las

fracciones

105

ANEXO 13. Ensayos Fitoquímicos

ANEXO 14. Preparación de la Cromatografía en capa fina

Fotografía 8. Prueba de Lieberman-Burchard

Fotografía 9. Ensayo de Baljet

Fotografía 10. Ensayo de sudan

Fotografía 11. Prueba de Espuma

Fotografía 12. Prueba de Ninhidrina

Fotografía 13. Ensayo de borntrager

Fotografía 14. Ensayo del Cloruro Ferrico

Fotografía 15. Ensayo de Sudan

Fotografía 16. Siembra de las muestras en la

placa

Fotografía 17. Placa en fase movil

Fotografía 18. Revelación de placa en

Luz UV

Fotografía 19. Revelación de placa en

Luz 360 nm

106

ANEXO 15. Cuantificación de Fenoles y Flavonoides

ANEXO 16. Actividad Antimicrobiana

Fotografía 20. Preparación de curva de Quercetina (Flavonoides)

Fotografía 21. Preparación de la curva de ácido galico (Fenoles)

Fotografía 22. Placa de microdilución con Escherichia coli.

Fotografía 23. Placa de microdilución con

Staphylococcus aureus

Fotografía 24. Resultado de las Absorbancias para Escherichia coli

Fotografía 25. Resultado de las absorbancias para Staphylococcus aureus.

107