UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · Condiciones ambientales ... Los anfibios en el mundo son...
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA FERTILIZACIÓN ASISTIDA EN RANA MARSUPIAL ANDINA “Gastrotheca riobambae” EN EL CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y CONSERVACIÓN DE ANFIBIOS, PROYECTO BALSA DE LOS SAPOS DE LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL ECUADOR Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar por el título de Médico Veterinario Zootecnista AUTORES DIEGO MAURCIO CADENA QUEVEDO MICHELL DOMINIQUE GARCÍA ROMO TUTOR DR. FRANCISCO LEÓN Quito, Julio, 2012
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
FERTILIZACIÓN ASISTIDA EN RANA MARSUPIAL ANDINA
“Gastrotheca riobambae” EN EL CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y
CONSERVACIÓN DE ANFIBIOS, PROYECTO BALSA DE LOS
SAPOS DE LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL
ECUADOR
Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar
por el título de Médico Veterinario Zootecnista
AUTORES
DIEGO MAURCIO CADENA QUEVEDO
MICHELL DOMINIQUE GARCÍA ROMO
TUTOR
DR. FRANCISCO LEÓN
Quito, Julio, 2012
ii
ii
DEDICATORIA
Dedicamos el presente trabajo a Dios por permitirnos la vida y brindarnos los
medios necesarios para culminar nuestra formación profesional.
Así como también de todo corazón a nuestras familias, por su
permanentemente apoyo, su espíritu alentador, contribuyendo
incondicionalmente al logro de nuestras metas y objetivos propuestos.
iii
iii
AGRADECIMIENTO
Nuestra gratitud, principalmente está dirigida al Dios por iluminar nuestra
mente y por haber puesto en el camino a aquellas personas que han sido
soporte y compañía durante todo el periodo de estudio.
Agradecer hoy y siempre a nuestras familias por el esfuerzo realizado por
ellos, por la alegría y la fortaleza dadas para seguir adelante en cada paso
de nuestra vida profesional.
Un agradecimiento especial al Dr. Leonardo Arias Cárdenas por la
colaboración, paciencia, apoyo y sobre todo por esa gran amistad que nos
brinda siempre.
Igualmente agradecemos al Centro de Investigación y Conservación de los
Anfibios “Proyecto Balsa de los Sapos” de la Pontificia Universidad Católica
del Ecuador por permitirnos realizar este trabajo de investigación y colaborar
siempre en el mejoramiento del proceso de enseñanza y aprendizaje.
Gracias
iv
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AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Nosotros, Diego Mauricio Cadena Quevedo y Michell Dominique
García Romo en calidad de autores del trabajo de tesis realizada
sobre “Fertilización asistida en rana marsupial andina “Gastrotheca
riobambae” en el Centro de Investigación y Conservación de Anfibios,
Proyecto Balsa de los sapos de la Pontificia Universidad Católica del
Ecuador”, por la presente autorizamos a la UNIVERSIDAD CENTRAL
DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que nos
pertenecen o parte de los que contienen esta obra, con fines
estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autores, nos corresponden, con excepción de
la presente autorización, seguirán vigentes a nuestro favor, de
conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8; 19 y demás
pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Quito, a los 18 días de Julio del 2012
FIRMA FIRMA
DIEGO CADENA MICHELL GARCÍA
C.C. 0401584396 C.C. 1721944914
e-mail: [email protected] e-mail: [email protected]
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INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por el señor
Diego Mauricio Cadena Quevedo y la señorita Michell Dominique
García Romo, para optar por el Título de Médico Veterinario
Zootecnista.
Considero que dicho Trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes
para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del
jurado examinador que se designe.
En la ciudad de Quito, a los 17 días del mes de Abril del 2012
---------------------
Firma
Dr. Francisco León
Cd. N° 1703272730
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APROBACIÓN DEL TRIBUNAL
FERTILIZACIÓN ASISTIDA EN RANA MARSUPIAL ANDINA
“Gastrotheca riobambae” EN EL CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y
CONSERVACIÓN DE ANFIBIOS, PROYECTO BALSA DE LOS
SAPOS DE LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL
ECUADOR
El Tribunal constituido por:
Presidente.- Dr. Edison Encalada; Vocal Principal.- Dr. Javier Vargas;
Vocal Principal.- Dra. Martha Naranjo; Vocal Suplente.- Dr. Julio Soria;
Biometrista.- Dr. Eduardo Aragón
Luego de receptar la presentación del trabajo de grado previo a la
obtención del título de Médico Veterinario Zootecnista presentado por
el señor Diego Mauricio Cadena Quevedo y la señorita Michell
Dominique García Romo.
Con el Título: Fertilización asistida en rana marsupial andina
“Gastrotheca riobambae” en el Centro de Investigación y
Conservación de Anfibios, Proyecto Balsa de los sapos de la Pontificia
Universidad Católica del Ecuador
Ha emitido el siguiente veredicto de Aprobación del Trabajo de Tesis.
Quito, 10 de Julio del 2012
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vii
Para constancia de lo actuado
FIRMAN:
DR. EDISON ENCALDA
Presidente
DR. JAVIER VARGAS
Vocal Principal
DRA. MARTHA NARANJO
Vocal Principal
DR. JULIO SORIA
Vocal Suplente
DR. EDUARDO ARAGÓN
Biometrista
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INDICE DE CONTENIDOS
pp.
DEDICATORIA ................................................................................................ ii
AGRADECIMIENTO ...................................................................................... iii
AUTORÍA INTELECTUAL ............................................................................. iv
INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR .................................................. v
APROBACIÓN DEL TRIBUNAL ................................................................... vi
LISTA DE CUADROS ................................................................................... xii
RESUMEN .................................................................................................... xiii
ABSTRCT ..................................................................................................... xiv
INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1
CAPÍTULO I
REVISIÓN DE LITERATURA ......................................................................... 3
DESCRIPCIÓN DE LA ESPECIE .............................................................. 3
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA ESPECIE ............................. 3
Origen.................................................................................................... 3
Hábitat ................................................................................................... 3
Descripción geográfica ......................................................................... 4
Ritmos Endógenos o Biológicos .......................................................... 5
Hábitos Alimenticios ............................................................................. 5
Taxonomía ............................................................................................ 6
FISIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN .................................................... 7
Aparato Reproductor ............................................................................ 7
Hembra ............................................................................................ 7
Anatomía .................................................................................... 7
Ovogénesis ................................................................................ 7
Macho .............................................................................................. 8
Anatomía .................................................................................... 8
ix
ix
Espermatogénesis ..................................................................... 8
Madurez Sexual .................................................................................... 9
Ciclo Reproductivo................................................................................ 9
INFERENCIA DEL MEDIO AMBIENTE EN LA REPRODUCCIÓN ..... 11
Condiciones ambientales ................................................................... 11
Agua .................................................................................................... 13
Humedad............................................................................................. 13
Temperatura ....................................................................................... 14
Luz ....................................................................................................... 15
NUTRICIÓN Y BALANCE ENERGÉTICO .............................................. 16
Dietas .................................................................................................. 17
HORMONA GONADOTRÓPICA CORIÓNICA HUMANA EN ANFIBIOS19
Estructura ............................................................................................ 19
Producción .......................................................................................... 19
Dosis en anfibios ................................................................................ 20
Vías de Administración ....................................................................... 20
Presentación comercial ...................................................................... 20
Mecanismo de acción hormonal ........................................................ 21
CAPÍTULO II
MATERIALES Y PROCEDIMIENTO ............................................................ 23
MATERIALES ........................................................................................... 23
PROCEDIMIENTO ................................................................................... 24
Cuarentena y Adecuación de Acuaterrarios ...................................... 24
Procedimiento de limpieza ............................................................ 24
Obtención de los especímenes .......................................................... 25
Selección de individuos en estado adulto.......................................... 25
Sexaje ................................................................................................. 25
Morfología ....................................................................................... 25
Periodo de adaptación y ciclos de estimulación ambiental .............. 28
Lluvia .............................................................................................. 28
x
x
Luz................................................................................................... 28
Temperatura ................................................................................... 28
Esquema de Alimentación.............................................................. 28
Protocolo Hormonal ............................................................................ 29
Preparación de laboratorio ............................................................. 29
Registro de peso............................................................................. 29
Aplicación de la hormona ............................................................... 31
Características del área de experimento ........................................... 31
Análisis estadístico de los resultados ................................................ 33
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIONES ................................................................ 34
RESULTADOS ......................................................................................... 34
DISCUSIONES ................................................. 35
Conducta Sexual y Amplexus ............................................................ 35
Ovulación y Espermiación .................................................................. 37
Incubación ........................................................................................... 38
Crías .................................................................................................... 39
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................... 40
CONCLUSIONES..................................................................................... 40
RECOMENDACIONES ............................................................................ 41
CAPÍTULO V
BIBLOGRAFÍA .............................................................................................. 42
REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS ......................................................... 42
ENTREVISTAS ........................................................................................ 51
NETGRAFÍA ............................................................................................. 51
CAPÍTULO VI
ANEXOS ........................................................................................................ 54
A Esquema Hormonal .............................................................................. 54
xi
xi
B Protocolo Hormonal .............................................................................. 55
C Administración de la hormona (HCG) en la cavidad celómica............ 56
D Rana Marsupial Andina Hembra (Gastrotheca riobambae) ................ 57
E Rana Marsupial Andina Macho (Gastrotheca riobambae) .................. 58
F Tipos de Callos Nupciales .................................................................... 59
G Esquema de Vocalización en Anuros .................................................. 60
H Amplexus de Rana Marsupial Andina (Gastrotheca riobambae)........ 61
I Ovulación de Rana Marsupial Andina (Gastrotheca riobambae) ......... 62
J Espermiación Rana Marsupial Andina (Gastrotheca riobambae) ....... 63
K Huevos fertilizados en el marsupio de Rana Marsupial Andina .......... 64
L Rana Marsupial Andina Hembra en incubación ................................... 65
M Verificación de preñez en Rana Marsupial Andina ............................ 66
N Regulación Hormonal en la Reproducción de la Rana Marsupial
Andina Hembra ..................................................................................... 67
O Rana Marsupial Andina alimentándose ............................................... 68
P Distribución Neuroanatómica de los Anfibios ...................................... 69
Q Ciclo ovárico de los Anuros .................................................................. 70
R Marsupio de la Rana Marsupial Andina ............................................... 71
S Distribución geográfica de la Rana Marsupial Andina ......................... 72
T Certificación del Centro de Investigación y Conservación de Anfibios73
U Autorización de Investigación Científica .............................................. 74
V Certificación del Tiempo de Investigación ........................................... 75
W Registro de Tutoría ............................................................................... 74
X Costos del Tratamiento ......................................................................... 75
xii
xii
LISTA DE CUADROS
CUADRO pp
Cuadro N° 1 Características Nutricionales (Tenebrio molitor)................ 18
Cuadro N° 2 Características Nutricionales (Gryllus sp.) ......................... 18
Cuadro N° 3 Características Morfológicas para el sexaje ...................... 26
Cuadro N° 4 Registro Morfológico ........................................................... 27
Cuadro N° 5 Actividades Diarias ............................................................. 29
Cuadro N° 6 Registro de Peso y Dosificación ......................................... 30
Cuadro N° 7 Registro de Resultados Grupo Testigo .............................. 34
Cuadro N° 8 Registro de Resultados Grupo Experimental..................... 35
Cuadro N° 9 Resultados Porcentuales de los grupos en estudio .......... 35
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
FERTILIZACIÓN ASISTIDA EN RANA MARSUPIAL ANDINA
“Gastrotheca riobambae” EN EL CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y
CONSERVACIÓN DE ANFIBIOS, PROYECTO BALSA DE LOS
SAPOS DE LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL
ECUADOR
ASSISTED FERTILIZATION OF THE ANDEAN MARSUPIAL FROG
“Gastrotheca riobambae” IN THE CENTER OF REASERCH AND
CONSERVATION OF AMPHIBIANS PROJECT: BALSA DE LOS
SAPOS OF THE PONTIFICIA CATHOLIC UNIVERSITY OF
ECUADOR
RESUMEN
Las diversas especies de anfibios en el Ecuador se encuentran en una inminente amenazada. Este estudio se realizó en el Centro de Investigación y Conservación de Anfibios, de la Pontificia Universidad
Católica del Ecuador, ubicado en Quito (Itchimbía), Provincia de Pichincha, y tuvo como objetivo desarrollar crías de Gastrotheca riobambae, mediante la aplicación de un protocolo hormonal a través
del uso de la Hormona Gonatrópica Coriónica Humana (HCG) en dosis de 20UI/gr a día consecutivo. En total se incluyeron 20 individuos en el estudio, 5 parejas en grupo experimental (5 machos y
5 hembras), más 5 parejas en grupo testigo, los dos grupos en cautiverio recibieron condiciones ambientales y de manejo idénticas. Los resultados demostraron que la HCG es 100% efectiva para la
producción de gametos masculinos y femeninos mediante el análisis de cálculo porcentual; expresando un 20% de efectividad con respecto a la conducta sexual. En conclusión, esta investigación prueba que la
dosis de 20 UI/gr de HCG no fue efectiva para la obtención de crías de Gastrotheca riobambae en cautiverio, por lo que se recomienda
realizar más investigaciones en anuros marsupiales, así como también
mejorar las condiciones ambientales en cautiverio.
xiv
xiv
Palabras Claves: FERTILIZACIÓN / RANA MARSUPIAL/
GONADOTROPINAS / CAUTIVERIO / AMPLEXUS.
ABSTRACT
The diverse species of amphibians in Ecuador are experiencing an
imminent threat. This study was performed in the Center of Reaserch
and Conservation of Amphibians project: Balsa de los Sapos of the
Pontificia Catholic University of Ecuador located in Quito (Itchimbía),
Pichincha province. The aim of this study was to develop offspring of
Gastrotheca riobambae, through the application of a hormonal protocol
through the use of human chorionic gonadotropic hormone (HCG) with
in doses of 20UI/gr each day. In total the study included 20 animals, 5
couples for the experimental group (5 males and 5 females), plus 5 in
couples of witness group; the 2 groups were held in identical
conditions and by the same management. The results showed that the
HCG is 100% effective for the production of masculine and feminine
gametes through the analysis of percent calculation; expressing 20%
effectively with respect to sexual conduct. In conclusion, this survery
showed that a dose of 20 UI/gr de HCG is not effective in creating
offspring of Gastrotheca riobambae in captivity, it is recommended for
further investigations in marsupial frogs to better the conditions of
captivity.
Keys Words: FERTILIZATION / MARSUPIAL FROG/
GONADOTROPINS / CAPTIVITY / AMPLEXUS.
1
INTRODUCCIÓN
Los anfibios en el mundo son especies muy importantes ya que cumplen
funciones primordiales en los ecosistemas, como ser controladores de
plagas, alimento para otras especies y la más transcendental, es actuar
como bioindicadores ecológicos1. En la actualidad las estadísticas sobre la
extinción progresiva de los anfibios es una cruda realidad; nuestro país
cuenta con cerca de 455 especies de anfibios, de los cuales alrededor de
140 están en riesgo de extinción y de ellos aproximadamente 25
presumiblemente extintos; siendo estas especies las más amenazadas del
planeta debido a que en la Región Andina, el incremento de la temperatura
ha sido 4 veces mayor que el promedio mundial (0.5Cº en el último siglo).
(Coloma, 2008)
Conociendo este problema, es imprescindible realizar esfuerzos en la
conservación de los anfibios, y para ello existen tecnologías reproductivas
aplicadas en los programas de cautiverio, que son valiosas herramientas
frente a las dificultades en la obtención de crías de las especies
amenazadas. Estas técnicas incluyen: fertilización asistida, sincronización
hormonal y almacenamiento de gametos.
La fertilización asistida ha sido comúnmente empleada por más de 60 años
en varias especies clave de laboratorio para estudios básicos del desarrollo
de la biología, la embriología y la investigación biomédica (Holt et al. 2004;
Roth & Obringer 2003).
1 Consiste en una especie vegetal, hongo o animal, cuya presencia (o estado) nos da
información sobre las características ecológicas (físico-químicas, micro-climáticas,
biológicas y funcionales), del medio ambiente.
2
2
En el país no existen antecedentes de resultados en la aplicación de estas
técnicas en anfibios, sin embargo, hay casos de estudios aplicados para la
conservación de especies amenazadas en otros países; de allí se resalta a
la rana cubana (Osteopilus septentrionalis), al Sapo Wyoming (Bufo baxteri),
a la rana mexicana (Rana de Moctezuma), en los cuales se utilizaron la
Hormona Gonadotropina Coriónica Humana (HCG) para la inducción de la
reproducción. (Browne R., 2006)(Trujillo et al. 2003)
El género Gastrotheca en Ecuador está representado por 16 especies, de las
cuales 10 (62,5%) están bajo amenaza, (UICN, 2004-2010, Ron et al., 2008).
Para este trabajo se ha escogido como modelo de experimentación a la
Gastrotheca riobambae, que se encuentra en la Lista Roja de la UICN2 como
una especie amenazada (www.iucnredlist.org), de clasificación EN (en
peligro de extinción).
El objetivo que persigue este trabajo es aplicar un protocolo hormonal de
fertilización asistida empleando la Hormona Gonadotrópica Coriónica
Humana para obtener crías de rana marsupial andina en cautiverio.
Además comprobar si la hormona produce gametogénesis y una conducta
sexual positiva (amplexus).
En algunas especies, ya es posible utilizar estas técnicas de mejora de
eficacia
para producir una gran cantidad de diversidad genética animal, para los
proyectos de repoblación al medio ambiente. (Whitaker, 2001)
Este trabajo puede ser la base para desarrollar posteriores estudios en la
aplicación de nuevas técnicas y protocolos reproductivos.
2 Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza
3
3
CAPÍTULO I
REVISIÓN DE LITERATURA
DESCRIPCIÓN DE LA ESPECIE
La rana marsupial andina (Gastrotheca riobambae) es endémica de Ecuador,
este espécimen tiene comportamientos similares a otras ranas arborícolas;
sin embargo su modo de reproducción difiere del característico de las demás
ranas. Sus huevos no se desarrollan en el agua sino en el dorso de la madre,
dentro de un marsupio y eclosionan en forma de renacuajos. (Del Pino, 1980)
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA ESPECIE
Origen
La pluviselva tropical donde las ranas incubadoras adquieren mayor
diversidad, constituye posiblemente el lugar donde evolucionaron; debido a
las presiones de selección que favorecieron el perfeccionamiento de este
mecanismo de incubación interna. Así también la intensa competencia por
los sitios de reproducción (las charcas) y los numerosos predadores que
amenazan los huevos que están desprotegidos. (Del Pino, 1989).
Hábitat
Esta rana se encuentra en áreas de bastante pluviosidad. Los adultos
habitan bajo piedras o aglomeraciones de plantas, donde se esconden
4
4
durante el día y en la noche se desplazan hacia las corrientes de agua.
(Frolich et al., 2003). Esta rana da vida a renacuajos que se desarrollan tanto
en charcas temporales y en riberas de lagos (Elinson et al., 1989, citado por
Cuesta, 1990).
Esta especie se distribuye en el callejón interandino ecuatoriano, el mismo
que ha soportado gran deforestación (Valencia et al., 1999), y pérdida del
hábitat, ocasionado por el crecimiento de la frontera agrícola y ganadera, la
explotación de madera, la minería, el desarrollo de infraestructura, viviendas,
industria, caminos y represas, así como los incendios (Young et al., 2004).
Estos factores, inciden en la formación de fragmentos poblacionales
dispersos y aislados dentro de su área de distribución original (Saunders et
al., 1991; Young et al., 2004). A esto se suma la micosis ocasionada por
Batrachochytrium dendrobatidis, el cual ha sido relacionado con la
declinación de varias ranas y sapos en Ecuador y el mundo (Berger et al.,
1998; Longcore et al., 1999; Ron & Merino, 2000; Merino-Viteri, 2001;
Weldon et al., 2004; Young et al., 2004; Merino-Viteri et al., 2005; Angulo et
al., 2006; Pounds et al., 2006).
Distribución geográfica
Las ranas del género Gastrotheca, se distribuyen en los Andes de
Sudamérica desde Venezuela hasta el norte de Argentina y al este de Brasil
y Panamá. (Duellman & Hillis, 1987, citado por Cuesta, 1990).
La rana marsupial andina, es una de las pocas ranas incubadoras que ha
conquistado las altitudes de la ciudad de Quito y sus alrededores a 3000
m.s.n.m; pues la mayoría de ranas con estas características habitan en
estratos de bosques tropicales en las zona bajas del Ecuador (Del Pino,
1989a & Duellman, 1977, citado por Cuesta, 1990).
5
5
Se encuentra distribuida: valles interandinos del norte y centro; desde las
zonas aledañas a la población de Riobamba, en el sur hasta la zona cercana
a la población de Ibarra y Otavalo en el norte, hasta altitudes entre los 2500 y
3000 m.s.n.m. (Duellman & Hillis, 1987, citado por Cuesta, 1990)
También se la encuentra cerca de la población de Ambato y en sus
alrededores, descendiendo al río Pastaza por debajo de Baños a una
elevación de 1590 m.s.n.m. Al sur de Riobamba se la encuentra a una altura
de 3200 m.s.n.m y en Machachi se la encuentra a 3120 m.s.n.m. En la zona
norte en la Laguna de Cuicocha a los 3070 m.s.n.m. (Duellman & Hillis, 1987,
citado por Cuesta, 1990). (ver Anexo S)
Ritmos Endógenos o Biológicos
Los anfibios presentan ritmos endógenos “circa”, que persisten aunque se
hayan separado de su ambiente natural y sean colocados en un laboratorio,
bajo condiciones ambientales controladas. Estos ritmos pueden verse
alterados por temperaturas ambientales, regímenes de luz, niveles de
oxígeno y volverse arrítmicos. Entre estos hay que remarcar los ciclos
circatidales que se correlacionan con ciclos de lluvia, marea y afectan la
reproducción. (Ecker, 2002)
Las ranas se esfuerzan por mantener algún tipo de constancia de su medio
interno; casi todos los animales muestran una variación rítmica innata de
acuerdo con los cambios cíclicos de su medio ambiente. (Ecker, 2002)
Hábitos alimenticios
Las ranas son sensibles al movimiento y al color de sus presas, atrapándolas
con su boca, masticando en ocasiones o simplemente tragándolas enteras.
(Hernández, 1988).
6
6
Las ranas no perciben los objetos que no tienen movimiento, y aunque su
aparato digestivo admite cualquier tipo de sustancia orgánica, solo es capaz
de ingerir animales que se mueven.
Los reproductores requieren de proteína viva como fuente de energía para
un mejor desarrollo. Su dieta varía según la abundancia, la obtención local y
estacionaria de las especies de las que se alimenta, debido a su voracidad
cumplen con una función reguladora de los animales que son su presa. (ver
Anexo O)
Taxomonía
Reino: Animal
Phylum: Cordados
Subphylum: Vertebrado
Superclase: Tetrápoda
Clase: Anfibios
Orden: Anuros
Suborden: Neobatrachia
Familia: Hemiphractidae
Género: Gastrotheca
Especie: riobambae
Nombre científico: - Gastrotheca riobambae (Fowler, 1913).
7
7
FISIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN
Aparato Reproductor
Hembra
Anatomía
Consta de un par de ovarios redondeados, a los que les siguen los oviductos
(conducto de Müller), los cuales cumplen funciones de almacenamiento de
los óvulos. A lo largo del oviducto desembocan glándulas accesorias, que
segregan sustancias albuminoideas (mucina) para recubrir a los óvulos y
brindarles protección, principalmente mecánica y contra la desecación. Los
óvulos caen en la cavidad celómica y son dirigidos por medio de los cilios
peritoneales hacia el extremo anterior de los oviductos o infundibulum,
abierto en forma de embudo, con sus paredes muy elásticas y ciliadas
interiormente. Una vez que ocurre la ovulación, el huevo penetra en los
oviductos y es impulsado por corrientes ciliares a lo largo del mismo, en un
movimiento espiral, recubriéndose de capas de albumen gelatinoso, hasta
alcanzar el útero u ovisaco donde se agrupan para ser expulsados por la
cloaca.
Los huevos son células redondeadas de aproximadamente 3.3mm,
compuestos por un núcleo, una importante cantidad de citoplasma y una
cantidad importante de vitellus o vitelo alimenticio; a pesar de su aparente
simplicidad en su organización, contiene en sí todas las potencialidades
necesarias para el desarrollo de un nuevo ser cuando sea fertilizado. (Del
Pino, 1986)
Ovogénesis
Los gametos femeninos inician su desarrollo, cuando las ovogonias pasan
una división mitótica para producir los ovocitos primarios los cuales se
someten a dos divisiones meióticas; la primera división produce un ovocito
8
8
secundario y un corpúsculo polar primario (célula no funcional) y en la
segunda división produce un óvulo y un corpúsculo polar secundario. Por lo
cual se concluye que cada ovogonia va a producir un solo óvulo. (Rugh,
1935)
Macho
Anatomía
Consta de un par de testículos lobulados, a los que le siguen los conductos
deferentes o de Wolf (conducto arquinéfrico o mesonéfrico) y se encuentran
estrechamente vinculados al aparato urinario en la porción craneal del riñon,
que conjuntamente van a desembocar en la cloaca. Las gónadas masculinas
están compuestas por células de Leydig y células de Sertoli las cuales
producen hormonas esteroideas (andrógenos).
Espermatogénesis
Los espermatozoides son producidos a partir de las espermatogonias en los
túbulos seminíferos de los testículos durante la espermatogénesis. Las
Espermatogonias sufren de divisiones mitóticas para producir
espermatogonias adicionales, que se diferencian en espermatocitos
primarios. A su vez, estas células sufren dos divisiones meióticas para
producir las espermátides. La diferenciación de las espermátides produce
espermatozoides que reciben la nutrición de las células de Sertoli. Cada
espermatozoide es una célula altamente organizada con tres secciones: una
cabeza compuesta por un núcleo, un acrosoma y un cuello; una parte media,
provista de mitocondrias que suministran energía y una cola filamentosa
utilizada para locomoción. El acrosoma produce enzimas proteolíticas que
digieren la cápsula del huevo y permiten que el espermatozoide penetre en el
óvulo.
9
9
Madurez Sexual
La madurez sexual se alcanza a los 7 u 8 meses. (Frolich et al., 2003). Con
todas las condiciones ambientales y nutricionales favorables, está
dependientemente influenciado por los estímulos primarios de la lluvia,
temperatura y luminosidad (Wright, 2001).
Ciclo reproductivo
En la mayoría de las especies de Anuros la fecundación es externa. Esto
significa que el óvulo y el espermatozoide se unen fuera del cuerpo de la
hembra formando un cigoto diploide. La hembra es ovulípara, es decir, que
deposita una gran cantidad de óvulos que el macho fertiliza con esperma,
durante el “amplexus” o abrazo nupcial.
En la rana marsupial andina, el amplexus axilar (apareamiento durante el
cual el macho se aferra a la hembra con sus miembros anteriores para
realizar la cópula) ocurre en tierra y dura aproximadamente de 24 a 48 horas
antes de la puesta de los huevos (Cuesta, 1990). (ver Anexo H)
Durante el encuentro sexual, el macho trepa en el dorso de la hembra y abre
el marsupio con sus patas traseras; a medida que los huevos emergen de la
cloaca de la hembra al ritmo de uno o dos por minuto, el macho toma uno a
uno los huevos (óvulos) con sus patas traseras y procede a fecundarlos con
su esperma y posteriormente los deposita en el marsupio de la hembra
ubicado en su dorso; el transporte de los huevos hacia la bolsa marsupial
toma de 6 a 8 horas en total (Auber-Thomay & Leterllier, 1986, citado por
Cuesta, 1990).
10
10
Este procedimiento continúa hasta que se han ubicados 130 huevos en el
marsupio (Del Pino & Escobar, 1981, citado por Cuesta, 1990), luego la
hembra busca una piedra y se aprieta contra esta para lograr una mejor
distribución en el interior de la bolsa (Del Pino 1980, citado por Cuesta,
1990). Estos eventos ocurren en la noche o en las primeras horas de la
madrugada (Hoogmoed, 1967, citado por Del Pino).La incubación de los
huevos de la rana marsupial andina (Gastrotheca riobambae) dura
aproximadamente entre 100 y 120 días (Del Pino & Escobar, 1981; citado por
Cuesta, 1990), en esta etapa las hembras se agrandan paulatinamente por el
crecimiento de los embriones y sus movimientos se restringen
considerablemente (Del Pino, 1981). (ver Anexo L)
Durante la incubación las paredes del marsupio desarrollan una capa
abundantemente irrigada por capilares sanguíneos; esta capa se adapta a la
forma de los huevos originando una cámara especial para cada uno de ellos;
dentro de cada cámara el embrión está rodeado por una membrana vascular,
que consiste en un paquete especializado de branquias acampanadas en
forma discoidal que se crean varias semanas después de la incubación y
envuelven al embrión. Al principio, son películas de tejido que se extienden
desde cada lado de la cabeza del embrión, en algunas especies se fusionan
y los envuelven completamente, formando un saco repleto de fluido donde el
embrión flota. Las branquias acampanadas se originan de los arcos
branquiales. Al nacimiento de los renacuajos, estas branquias son
reabsorbidas o se desprenden.
Mediante las branquias, la madre y los embriones en su bolsa están en
íntimo contacto fisiológico. El revestimiento de la cámara embrionaria está
separado de las branquias acampanadas del embrión tan sólo por la cápsula
ovular de gelatina; en las ranas marsupiales esta capa de gelatina es finísima
a comparación de otras especies de ranas.
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Lo importante, es el contacto íntimo entre los aportes sanguíneos de la
madre y el embrión, a través de las membranas yuxtapuestas en su primer
tercio de incubación y después los nutrientes que sustentan el desarrollo
proceden en su mayoría de las reservas propias del vitelo, que contiene
grasas y carbohidratos de reserva, que incrementan el volumen del huevo y
mantienen al embrión durante su larga estancia en el marsupio. (Del Pino &
Escobar, 1981, citado por Cuesta, 1990).
En la Gastrotheca riobambae, la abertura del marsupio permanece dilatada
durante la estación reproductora, a medida que la hembra se prepara para la
reproducción, la abertura se contrae. La bolsa marsupial se mantiene cerrada
durante la incubación, lo que permite guardar los embriones hasta que nacen
los renacuajos. Llegado el momento del nacimiento la madre sumerge la
parte posterior de su cuerpo en el agua e introduce los largos dedos de sus
patas traseras dentro del marsupio para inducir la salida de los renacuajos,
tardando dos o más días en desovar completamente (Del Pino, 1980, citado
por, Cuesta 1980).
INFERENCIA DEL MEDIO AMBIENTE EN LA REPRODUCCIÓN
Condiciones ambientales (estímulos externos)
La reproducción suele ser una actividad sincrónica, entre factores externos,
sistema nervioso (cerebro) y factores internos (hormonas), pero al final es
provocada directamente o indirectamente por las señales ambientales como:
temperatura, lluvia, fotoperiodo, presión atmosférica y humedad.
Los vertebrados como los anfibios, poseen una gran variedad de receptores
sensoriales que captan la información y estímulos del medio externo o
interior, esta información es enviada al sistema nervioso central, donde se
procesa y se elaboran las respuestas, sean motores, autónomas o
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12
endócrinas. El sistema efector para la respuesta endócrina está constituido
por el eje hipotálamo hipófisis (Aguilar,1990), además las señales del medio
ambiente (temperatura, intensidad luminosa, campo magnético) son
responsables de la sincronización circadiana para la producción de
sustancias biológicamente activas que comprende serotonina, melatonina,
péptidos como la hormona liberadora de gonadotropina (LHRH), la hormona
liberadora de tirotropina (TRH), vasotocina y hormonas primarias que
estimulan el hipotálamo (Reichlin S. 1989), específicamente el área pre-
óptica que es donde la mayoría de las neuronas productoras de GnRH
residen en el cerebro de los anfibios. Estos axones GnRH terminan en la
eminencia media, desde donde la GnRH es liberada en el sistema portal
hipofisario y viaja por la sangre a la glándula pituitaria anterior (Daniels &
Licht,1980; McCreery et al., 1982; McCreery & Licht, 1983; Licht et al., 1984;
Porter & Licht, 1985), que a su vez produce las hormonas
gonadotróficas: hormona estimulante del folículo (FSH) y la hormona
luteinizante (LH), que a continuación, inician cambios estructurales y
funcionales en las gónadas (Obringer, 2000). (ver Anexo P)
La segunda fase de la ovogénesis depende en gran medida de la
temperatura, la nutrición y la edad de la hembra. Las altas temperaturas
pueden inhibirla y un período de bajas temperaturas (hibernación) podrían
ser necesarias para la ovulación. El número de factores que influyen en el
ciclo y la complejidad en sus interacciones intervienen a que el éxito en
forma natural o la inducción artificial sea impredecible.
La crianza y reproducción de anfibios en cautiverio requerirá especial
atención en lo referente a la temperatura del aire y del agua, luz y humedad
que pueden variar significativamente entre hábitats naturales especializados
y micro hábitats (Wright, 2001).
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Agua
El agua es uno de los factores más importantes dentro del ciclo reproductivo
y vital de los anfibios, ya que estos no beben agua por su boca, sino que la
absorben a través de su piel permeable junto con una parte significativa de
oxígeno. Si su piel se seca, perderá la habilidad de intercambiar gases a
través de la misma y se sofocarán.
En nuestro país donde hay una estación cálida seca, con temperaturas
extremas, el agua y la comida escasean durante el verano, en respuesta a
una posible deshidratación los sapos entran en un estado muy parecido a la
hibernación, llamado estivación o sueño estival; se refiere a un
aletargamiento en el que caen algunas especies de vertebrados e
invertebrados para sobrevivir a la sequía y ahorrar energías; las funciones
corporales se enlentecen, disminuye el metabolismo, temperatura , gasto
cardiaco ,aunque la cabeza y tejido graso reciben un flujo mayor de sangre
que otros tejidos. Como resultado del intercambio respiratorio reducido, la
sangre se acidifica; lo cual puede a su vez disminuir la actividad enzimática
debido a un desplazamiento con respecto al pH óptimo de las enzimas
metabólicas. (Eckert, 2002).
Se ocultan en madrigueras subterráneas, frescas y húmedas; desarrollando
una gruesa capa de piel, como protección para entrampar la humedad y
ayudar en la respiración.
Humedad
Se denomina humedad ambiental a la cantidad de vapor de agua presente
en el aire. Se puede expresar de forma absoluta y relativa. La humedad
relativa es la relación porcentual entre la cantidad de vapor de agua real que
contiene el aire y la que necesitaría contener para saturarse a idéntica
temperatura.
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Este factor es muy importante porque determina que tan rápido un animal
pierde agua de su cuerpo, cuando es expuesto al aire circundante. Se puede
estimular los comportamientos reproductivos de algunas especies
aumentando la humedad, en lugar de imitar fuertes lluvias. (Poole & Grow,
2008).
Temperatura
Todos los ectotermos, por definición dependen de fuentes externas de calor
para elevar su temperatura corporal. Sin embargo, los ajustes
comportamentales y fisiológicos desarrollados para regular la temperatura
corporal están modificados por ritmos circadianos endógenos que pueden
ser afectados por ritmos externos o ambientales.
Los anfibios, dado que sus temperaturas corporales son normalmente más
próximas a las del ambiente, viven con tasas metabólicas inferiores. En
consecuencia, pueden invertir una proporción mayor de su balance
energético en el crecimiento y la reproducción. (Eckert, 2002).
Al implementar la temperatura debe considerarse el hábitat nativo y la
historia natural de cada especie, usualmente está bien a temperaturas de
18°C a 24°C para las especies de clima templado como la rana marsupial,
evitando fluctuaciones de temperaturas en rangos mayores de 8°C, sin
embargo se requerirá temperaturas más frescas en periodos de sopor o de
estaciones de invierno. La temperatura debe ser más caliente durante el día
con un pequeño decremento nocturno para simular las fluctuaciones
ambientales. (Whitaker, 2001).
La hipertermia en estas especies puede causar agitación, cambios en el
color en la piel, inmunosupresión, inapetencia, pérdida de peso a pesar del
buen apetito y a menudo es mortal.
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La hipotermia puede provocar letargo, inapetencia, distensión abdominal (por
descomposición de la ingesta), inmunosupresión y se asocia más
frecuentemente con el desarrollo de una enfermedad crónica.
Todos los ectotermos tienen un máximo térmico crítico, el cual se expresa
cuando hay un 50 % de mortalidad (Eckert, 2002), esta tiene total relevancia
en la reproducción ya que puede afectar la maduración ovárica y testicular.
(Jorgensen, 1982).
Luz
Desde que se formó la Tierra hace más de cinco mil millones de años, la luz
solar ha sido una fuerza de selección extremadamente potente para la
evolución de los seres vivos y muchos organismos son capaces de
responder de algún modo a la luz. (Eckert, 2002).
Siendo esta el más efectivo zeitgeber o factor ambiental sincronizador. Sin
embargo, la temperatura ambiental, la disponibilidad de alimento y la
interacción con otros animales de la misma o diferente especie pueden ser
los zeitgeber que ejerzan un efecto en el metabolismo, actividad y otras
facetas básicas de la vida del animal como la reproducción. (Eckert, 2002).
El inicio de la reproducción está condicionado por el fotoperiodo, que es la
relación entre las horas de luz y oscuridad. Cuando esta relación alcanza un
determinado valor, el hipotálamo que recibe esa información a través de la
retina estimula la producción de la hormona melatonina por la glándula
pineal. Las concentraciones de melatonina en la glándula pineal, los ojos y el
plasma de las ranas presentan ritmos diarios que fluctúan estacionalmente
con valores mínimos durante el día y máximo durante la noche. En el verano
la amplitud del ritmo de melatonina es máxima mientras que en el invierno el
ritmo se anula. Esta variación estacional del ritmo diario de melatonina
depende fundamentalmente de la temperatura.
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Esta hormona produce una cascada de secreciones hormonales que
inducirán la maduración de los folículos ováricos en las hembras y el
desarrollo de las gónadas de los machos.
En condiciones de cautiverio es necesario brindar luz ultravioleta para el
metabolismo del calcio, ya que los anfibios sintetizan la vitamina D3 de la
exposición a la radiación ultravioleta -V (UVB) a través de un proceso en que
la vitamina D2 se convierte en D3, siendo esta fundamental para la absorción
del calcio que va a participar en los procesos metabólicos en construcción de
tejidos y el desarrollo y fortalecimiento óseo. Además para tener un
comportamiento normal y poder reproducirse. (Poole & Grow, 2008).
Los autores recomiendan “12/12 horas luz solar / oscuridad; siguiendo el
ciclo de luz natural” (Reed, 2005; Schultz & Douglas, 2003).
NUTRICIÓN Y BALANCE ENERGÉTICO
Los anfibios gastan una proporción (hasta la mitad) de su balance energético
total en la producción de gametos y la reproducción. La producción de
esperma es relativamente poco costosa para los machos de todas las
especies, pero la formación de óvulos puede llegar a ser un desgaste
energético demasiado alto, si los animales se encuentran en balance
energético negativo, va a ser muy difícil que se reproduzcan. (Eckert, 2002).
Dentro de la nutrición estos animales necesitan materias primas y energía
para crecer, mantenerse y reproducirse. Estos materiales y la energía usados
en su metabolismo proceden de los alimentos, este se lo usa para la
producción de tejido nuevo, la reparación del tejido existente y para la
reproducción. El alimento también sirve como una fuente de energía para
procesos permanentes, tales como el movimiento y el metabolismo, de allí la
importancia de dar dietas balanceadas. (Eckert, 2002).
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El estado nutritivo equilibrado se da cuando el anfibio tiene suficiente entrada
de todos los nutrientes necesarios para un crecimiento a largo plazo y su
mantenimiento.
Los requerimientos nutritivos incluyen:
Suficientes fuentes de energía, proteína viva y aminoácidos
esenciales para mantener un balance positivo de nitrógeno (evitar
pérdida neta de proteínas) y por ende todos los procesos corporales.
Suficiente agua y minerales para compensar su pérdida o
incorporación en los tejidos corporales
Suplementar con vitaminas no sintetizadas por el anfibio.
Dietas
Son poco conocidas; aunque existe una marcada tendencia hacia la
carnívora en los adultos, y a la herbívora en las larvas.
El alimento que se utiliza para los individuos en la etapa de desarrollo de la
rana marsupial andina (Gastrotheca riobambae) constituye:
Tenebrios en fase de larva (Tenebrio molitor).- Se presenta como una
larva dorada de 2 a 3cm de largo y de 2 a 3 mm de grueso. El tenebrio es
un complemento alimenticio de alto valor nutritivo, y su administración
debe ser cuidadosa.
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Cuadro N° 1
CARÁCTERÍSTICAS NUTRICIONALES Tenebrio molitor (larva) HUMEDAD (%)
CENIZAS
(%)
PROTEÍNA (%)
GRASA (%)
CARBOHIDRATOS (%)
Ca (mg/100gr
)
Vit C (mg/Kg)
FIBRA DIETÉTICA
(Kcal -
grasa)
62.89 1.20 18.65 13.64 3.62 3.28 38.10 2.00
Fuente: Centro de Investigaciones Biológicas y Acuícolas de Cuemanco
(2010)
Ninfas de grillos (Gryllus sp.).- Son animales muy resistentes a cambios
climáticos. Además son ricos en calcio, fósforo y proteínas.
Cuadro N° 2
CARÁCTERÍSTICAS NUTRICIONALES Gryllus sp. (larva tipo 4 y 5) HUMEDAD
(%)
CENIZA
S (%)
PROTEÍNA
(%)
GRASA
(%)
CARBOHIDRATO
S (%)
Ca
(mg/100gr)
Vit C
(mg/Kg)
FIBRA
DIETÉTICA (Kcal -
grasa)
68.96 1.52 20.72 5.74 3.06 21.53 105.90 2.80
Fuente: Centro de Investigaciones Biológicas y Acuícolas de Cuemanco
(2010)
Cochinillas de la humedad (Porcellio scaber).- Poseen un exoesqueleto
mineralizado y contiene altos niveles de Ca, Mg, Na, Fe, y Cu. Esta
especie se puede utilizar posiblemente para corregir las deficiencias
dietéticas de calcio en las dietas insectívoras. Poseen alta
biodisponibilidad y son palatables.
Larvas de moscas de la fruta (Drosophila melanogaster).- Esta especie es
muy valiosa ya que proporciona crecimiento óptimo para alcanzar
rápidamente la madurez sexual. Se utiliza esta especie de mosca por su
ciclo de vida corto y descendencia abundante.
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En cuanto a cantidades óptimas de alimento para el desarrollo de las ranas
ningún autor ofrece una cantidad determinada.
HORMONA GONADOTRÓPICA CORIÓNICA HUMANA EN ANFIBIOS
Es una hormona glicoproteica producida durante el embarazo por el embrión
humano en desarrollo después de la concepción y posteriormente por el
sincitiotrofoblasto (parte de la placenta). (Plumb, 2006)
Estructura
Contiene aproximadamente 30% de carbohidratos; formada por dos
cadenas alfa y beta con un peso molecular de 36,700 daltons, su punto
isoeléctrico es de 4.5, la subunidad o cadena alfa (14,500 daltons y 92
aminoácidos) es igual a la de otras hormonas del mismo género de origen
glicoproteíco como son la LH, FSH y TSH, de lo contrario su subunidad o
cadena beta (22,200 daltons y 145 aminoácidos) es específica de esta
hormona ya que contiene 30 aminoácidos adicionales en la secuencia de su
carbono terminal, ricos en prolina. (Plumb, 2006)
Producción
Como otras gonadotropinas, la Hormona Gonadotrópica Coriónica Humana
puede obtenerse a través de su extracción de la orina o por modificación
genética. La hormona gonadotrópica coriónica humana es producida a partir
de la capa de células sincitiotrofoblasto. (Plumb, 2006)
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Dosis en anfibios
Existe una dosis general para anfibios de 50 - 100 a 3002UI para liberación e
esperma y de 250 a 400 UI para inducción de la ovulación. (Crawshaw,
1993).
La dosis de hormonas utilizadas para producir ovulación en anuros es de
aproximadamente 130 UI de hCG, por cada 10 g de peso corporal. (Browne,
2007).
Vías de Administración en Anfibios
Se puede aplicar en varias vías como: subcutánea en el saco linfático dorsal
de los anuros, por vía intramuscular en los miembros posteriores y por vía
intracelómica (cavidad celómica). (Browne, 2007)
Presentación Comercial
En forma comercial la Hormona Gonodotrofina Coriónica Humana (HCG) se
la puede obtener bajo el nombre de Chorulon®
Composición
Cada frasco de material liofilizado contiene 5000 UI de Gonadotrofina
coriónica (hCG).
Cada frasco de diluyente contiene 5 ml de solución tampón estéril.
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Mecanismo de acción hormonal
Siguiendo el eje hipotálamo hipófisis gónadas, se necesita de un
estímulo hormonal inicial en el hipotálamo que está dado por: hormona
luteinizante y la liberación de sus hormonas análogas (LHRHs2), dentro del
protocolo este estímulo inicial lo produce el medio ambiente controlado(
12/12 horas luz solar / oscuridad y ciclos artificiales de lluvia) , así como
temperatura, intensidad luminosa, campo magnético que sincronizan los
ritmos circadianos endógenos, además de una dieta balanceada que
proporcionará la condición física adecuada tanto al macho como a la hembra;
esto a su vez hace que la glándula pituitaria produzca las hormonas
gonadotróficas: hormona estimulante del folículo (FSH) y luteinizante
hormonal (LH). Las cuales inducen la ovulación en la hembra y en el macho
el desarrollo del tejido intersticial de los testículos y de glándulas anexas.
La hormona estimulante del folículo (FSH) promueve folículos maduros, que
producen progesterona, la cual madura los ovocitos, seguido del desove. El
desarrollo de los folículos se produce en fases: existe la fase de crecimiento
primaria (etapa 1 y 2) de los ovocitos; después con un adecuado estímulo
ambiental se produce, la segunda fase de crecimiento (etapa 3 y 4) en la cual
los ovarios secretan estradiol que inhibe el desove, hasta llegar a la
maduración final de los ovocitos (etapa 5 y 6) que produce una disminución
de estradiol y el aumento de testosterona en el macho y progesterona en la
hembra, esto se da por la administración de hormonas responsables de la
ovulación como la Gonadotropina corionica humana(HCG) , produciendo así
la espermiación y la ovulación respectivamente. (Browne & Kouba, 2006) (ver
Anexo A)
En la mayoría de las ranas, los folículos postovulatorios (después de la
cópula) permanecen en los ovarios menos de una semana y no se cree que
tengan ninguna función hormonal. Pero en G. riobambae los folículos vacíos
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permanecen en los ovarios más de un mes, durante todo el primer tercio de
la incubación. Así pues al menos en sus estadios tempranos, la incubación
de ranas marsupiales depende de una regulación hormonal.
La progesterona procedente de los folículos es la responsable directa de la
activación del cierre del marsupio; las gonadotropinas estimulan simplemente
la liberación de progesterona. (ver Anexo N)
El desarrollo de las cámaras embrionarias, que envuelven a cada embrión en
una membrana vascular, parece depender también de la progesterona.
Las branquias acampanadas y las cámaras de la bolsa en las ranas
marsupiales podrían desempeñar un papel análogo, al liberar hormonas que
regularán, por su parte, la incubación avanzada. (Del Pino, 1986).
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CAPÍTULO II
MATERIALES Y PROCEDIMIENTO
MATERIALES
Alimento: grillos, tenebrios y suplemento de minerales - vitaminas.
10 Peceras de plástico
Malla plástica (3 metros)
Luber (3 metros)
Sustratos: musgos, piedras, plantas acuáticas, troncos, hojas.
Mangueras (5 metros)
1 Termómetro
1 calefactor
10 Bandejas plásticas de diferentes dimensiones
Tarrinas desechables
Reservorios de agua
Aspersor de agua
Pinzas anatómicas
Bomba de agua
1 Filtro de agua
1 Congeladora portátil
2 Frascos de hormona Gonadotrofina coriónica humana (HCG)
1 caja de jeringuillas de 1cc.
1 caja de guantes de nitrilo
1 balanza digital
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PROCEDIMIENTO
Cuarentena y Adecuación de Acuaterrarios
Se realizó una cuarentena con los especímenes durante 30 días.
Además la Balsa de los Sapos proporcionó diez acuaterrarios, previamente
desinfectados con cloro y expuestos al sol durante una semana; los cuales
en su interior estuvieron equipados de un segmento luber, una malla plástica
a la medida de la base de las cajas y una tapa con aberturas para la
ventilación; posteriormente fueron instalados en el área de cuarentena del
proyecto. Dos semanas antes de introducir los animales en los acuaterrarios,
se colocó materia orgánica (cocos, hojarasca y plantas de la zona de
recolección), de manera que la vegetación pueda establecerse y las
bacterias estén listas para descomponer los sustratos naturales.
Las plantas usadas fueron no: tóxicas y compatibles con la historia natural de
la especie.
Procedimiento de limpieza
La limpieza de los acuaterrarios se realizó siguiendo el protocolo de la Balsa
de los Sapos, el cual consiste en:
a. Recolectar agua en recipientes que serán expuestos al sol para
eliminar el exceso de cloro, 24 horas previas al lavado individual de
cada acuaterrario, que se realizó una vez por semana.
b. El lavado consiste en aplicar detergente en todas las estructuras que
componen el acuaterrario, luego enjuagar con abundante agua y por
último exponer al sol durante 30 minutos, para evaporar residuos
tóxicos.
Los acuaterrarios siempre llevaron un nivel de agua de 2cm
aproximadamente, la cual fue cambiada durante la limpieza, mediante los
sistemas de drenaje.
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Obtención de los especímenes
Para el objeto de estudio se eligió a 20 individuos (10 parejas) que fueron
donados por el Plan de Conservación Balsa de los Sapos de la Pontificia
Universidad Católica del Ecuador (PUCE), todos estos procedimientos fueron
realizados con autorización previa del Ministerio de Ambiente y las
autoridades competentes de la PUCE.
Selección de individuos en estado adulto
De la población total de Gastrothecas riobambae que posee la Balsa de los
Sapos, se seleccionó completamente al azar 10 parejas. Se realizó un
diagnóstico clínico mediante exploración física para determinar:
Patologías
Anormalidades físicas
Gestación
Además, es importante poner atención en los registros y filiación de cada
animal para determinar edad y evaluar su participación en el proyecto.
Sexaje
Morfología:
En hembras se identifica las siguientes estructuras: saco marsupial en edad
adulta, ubicado en la parte dorso caudal del animal, el cual tiene forma de V
o U invertidas (ver Anexo D).
En machos se reconoce: almohadillas nupciales que se encuentran ubicadas
en la base del dedo pulgar; son ásperas y oscuras, las hembras carecen de
estas. (ver Anexo F)
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La membrana timpánica es más abultada, grande y pigmentada en machos,
característica que no poseen las hembras. Además los machos son de
menor tamaño corporal, por ende, las hembras al pesaje presentaron mayor
masa corporal. (ver Anexo E)
Cuadro N° 3
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS PARA EL SEXAJE
Características Macho Hembra
Tamaño <5cm >6cm
Peso 18gr. a 20gr. 12gr. a 15gr.
Saco marsupial Ausente
(Vestigio en edad juvenil)
Presente en edad adulta
Forma de U ò V
Almohadilla nupcial Presente
Negra-áspera
Ausente
Membrana timpánica Bien desarrollada
Para cantos nupciales
Ausente
(No presenta vocalización)
Fuente: Directa (2012)
Elaboración: Los Autores
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Cuadro N° 4
Registro Morfológico
*Tres vistos, corresponderá a macho, menor o igual a dos, corresponderá a
hembra
Fuente: Directa
Autores: Robert K. Browne and Kevin Zippel
Parejas Almohadillas
nupciales
Presencia
de cuerdas
vocales
Tamaño
de
tímpano
Presencia
de bolsa
marsupial
Resultado*
Macho o
Hembra
1M M
1H X X H
2M M
2H X H
3M M
3H X X H
4M M
4H X H
5M M
5H X X H
6M M
6H X X H
7M M
7H X H
8M M
8H X X H
9M M
9H X X H
10M M
10H X H
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28
Periodo de adaptación y ciclos de estimulación ambiental.
La adaptación de los especímenes en los acuaterrarios comprendió un
periodo de 17 días, inmediatamente iniciarán los ciclos:
Lluvia: 1-2 horas, con intervalos de 3 horas (en la noche), estimulando así la
conducta sexual, utilizando una bomba de agua accionada por un timer.
Luz: 12-12 horas luz / oscuridad; siguiendo el ciclo de luz natural. Para lo
cual se empleó lámparas de luz ultravioleta.
Temperatura: Se mantuvo entre 22°C a 26°C, para esto se utilizó
calefactores eléctricos.
Esquema de alimentación
Una vez realizado el protocolo de limpieza, se proveyó el alimento (grillos en
etapa número 4 y 5), y una vez por semana se administrará individualmente
a cada espécimen vitaminas formuladas y tenebrios.
Previo al protocolo hormonal se suspendió la alimentación 1 día y se reanudó
luego de aplicado el protocolo.
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Cuadro N° 5
Actividades Diarias
DÍAS ACTIVIDADES
Lunes Limpieza Baños de sol Lluvia
Martes Limpieza Baños de sol Lluvia Alimentación
grillos
Miércoles Limpieza Baños de sol Lluvia
Jueves Limpieza Baños de sol Lluvia
Alimentación
grillos
Viernes Limpieza Baños de sol Lluvia
Sábado Limpieza general Baños de sol Lluvia
Alimentación
tenebrios
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
Protocolo hormonal
Preparación de laboratorio:
Desinfección previa (24 horas) de las mesas de trabajo; todo el personal
utilizó batas estériles y guantes de nitrilo.
Los materiales a utilizarse estériles, no tóxicos y libres de pirógenos.
Mantener la hormona HCG sin romper la cadena de frío.
Registro de peso:
Se registró el peso de cada individuo en una balanza digital (BOECO,
Germany, BBI-41). Para esto se procedió a:
Encerar la balanza con un recipiente plástico previamente desinfectado.
La manipulación de los animales debe ser con sumo cuidado y con
guantes de nitrilo, para evitar estrés y contaminación respectivamente.
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Además el registro de peso es útil para:
Calcular la dosis de la hormona HCG.
Llevar el control de pérdida o ganancia de peso durante el desarrollo del
proyecto; y evaluar el impacto del manejo sobre los especímenes.
Cuadro N° 6
Registro de Peso y Dosificación
PAREJAS Nº DE
TERRARIO
PESO
INICIAL
(gr.)
PESO
FINAL
(gr.)
DOSIS
HCG
(20UI/gr.)
CANTIDAD
CHORULLON
(HCG)
(ml)
Pareja 1 Macho 1TESTIGO 9,34 7,30 0
Hembra 16,90 15,63 0
Pareja 2 Macho 2 TESTIGO 8,61 9,66 0
Hembra 18,04 17,12 0
Pareja 3 Macho 3 TESTIGO 11,33 12,22 0
Hembra 18,09 17,15 0
Pareja 4 Macho 4 TESTIGO 9,64 8,15 0
Hembra 18,46 18,11 0
Pareja 5 Macho 5 TESTIGO 9,21 8,93 0
Hembra 17,80 17,15 0
Pareja 6 Macho 1
EXPERIMENTAL
15,63 15,44 308,8 0,30
Hembra 21,77 21,08 421,6 0,42
Pareja 7 Macho 2
EXPERIMENTAL
14,30 15,17 303,4 0,30
Hembra 20,30 19,06 381,2 0,38
Pareja 8 Macho 3
EXPERIMENTAL
13,00 12,46 249,2 0,24
Hembra 27,10 25,08 501,6 0,50
Pareja 9 Macho 4
EXPERIMENTAL
12,06 11,34 226,8 0,22
Hembra 20,10 19,23 384,6 0,38
Pareja 10 Macho 5
EXPERIMENTAL
12,49 12,86 257,2 0,25
Hembra 19,40 19,11 382,2 0,38
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
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Aplicación de la hormona
Día uno.- Se inoculó en la cavidad celómica, mediante una jeringa de
insulina, 20 UI/g de gonadotropina coriónica humana (HCG) a machos y
hembras respectivamente. (Dosis HCG: 20 UI/gr P.V.); esto se realizó
posteriormente a la estimulación del ambiente con los métodos ya citados
(ciclos de luz, lluvia artificial y temperatura). La dosis fue concedida (Arias L.,
entrevista personal, 22 junio del 2010).
Día dos.- Después de 24 horas se repitió una nueva dosis de HCG
(gonadotropina coriónica) a una dosis de 20UI/g para los machos y 20 UI/g a
las hembras. (ver Anexo B y C)
Día tres.- Después de 5 a 12 horas de la última dosis se observó el
amplexus, ovulación y espermiación (ver Anexo H, I y J).
Día treinta.- Se realizó la Verificación de la Preñez, mediante la exploración
del marsupio. (ver Anexo M)
Características del área de experimento
La Escuela de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica del
Ecuador (PUCE) fue creada en 1963, desde entonces se ha destacado como
una entidad en la investigación científica, hoy aplicada al estudio de los
anfibios con el proyecto La Balsa de los Sapos, el cual tiene por objetivo
catalizar y optimizar la protección y recuperación de los anfibios ecuatorianos
en riesgo de extinción mediante la implementación de un plan estratégico de
conservación.
La balsa de los Sapos consta de un Centro Piloto que está establecido en las
32
32
instalaciones de la Escuela de Biología de la PUCE y cuenta con las
siguientes áreas:
Vivarium
Bioterio
Cuarentena
Sala de preparaciones
Bodega
Ubicación
Lugar: Balsa de los Sapos
Provincia: Pichincha
Cantón: Quito
Parroquia: Itchimbía
Sector: La Floresta
Factores climáticos
Humedad relativa: 78%
Temperatura media máxima: 26°C
Temperatura media mínima: 22°C
Temperatura media: 24°C
33
33
Análisis estadístico de los resultados
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar, sin repeticiones y
con tratamientos (1 testigo y 1 experimental) y 10 unidades por tratamiento
(en parejas macho y hembra).
34
34
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Los resultados se los obtuvo bajo el método de observación directa.
El análisis se realizó mediante el cálculo porcentual de los resultados, para
medición de la eficacia del protocolo hormonal aplicado al grupo
experimental frente al grupo testigo; bajo las mismas condiciones
ambientales controladas.
COMPARACION ENTRE LOS TRATAMIENTOS EN ESTUDIO
RESULTADOS
Cuadro N° 7
REGISTRO DE RESULTADOS GRUPO TESTIGO
PAREJAS AMPLEXUS ESPERMIACIÓN OVULACIÓN INCUBACIÓN
CRÍAS
1 No No No No No
2 No No No No No
3 No No No No No
4 No No No No No
5 No No No No No
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
35
35
Cuadro N° 8
REGISTRO DE RESULTADOS GRUPO EXPERIMENTAL
PAREJAS AMPLEXUS ESPERMIACIÓN OVULACIÓN INCUBACIÓN CRÍAS
1 Si Si Si Si No
2 No Si Si No No
3 No Si Si No No
4 No Si Si No No
5 No Si Si No No
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
Cuadro N° 9
RESULTADOS PORCENTALES DE LOS GRUPOS EN ESTUDIO
GRUPO AMPLEXUS OVULACIÓN ESPERMIACIÓN INCUBACIÓN CRÍAS
EXPERIMENTAL 20% 100% 100% 20% 0%
TESTIGO 0% 0% 0% 0% 0%
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
DISCUSIONES
Conducta Sexual y Amplexus
En base a los resultados obtenidos, se demostró que el uso de hormonas en
anfibios favoreció la conducta sexual (amplexus); observándose que el
tratamiento experimental que utilizó Hormona Gonadotrópica Coriónica
(HCG) obtuvó un 20% de efectividad para este parámetro, mientras que los
animales del grupo testigo no presentaron respuesta positiva ya que el
porcentaje fue del 0%.
36
36
Los anfibios presentan pronunciada aversión y conductas de evitación
cuando se exponen a una variedad de señales externas como manipulación,
la cual ocurre en animales mantenidos en cautiverio; produciéndose la
activación del eje hipotálamo - hipófisis - glándulas adrenales (HPA)
(Roseboom, 2007), favoreciendo así la producción de hormonas que
antagonizan la reproducción, tales como: corticosterona y aldosterona que
son los esteroides suprarrenales principales que circulan en el sangre (Carr &
Norris, 2005), y la epinefrina y la norepinefrina. (Withers et al., 1998; Carr &
Zozarro, 2004).
La corticosterona y aldosterona se producen a partir del colesterol en una
serie de reacciones enzimáticas en células que no forman una definida
corteza suprarrenal, como en los mamíferos, pero que se entremezclan con
el tejido del riñón y las células productoras de catecolaminas. Un aspecto
práctico de esta disposición anatómica en los anfibios es que es difícil de
aislar las células adrenocorticales de células de riñón, por lo que se le ha
asignado con el nombre de "la glándula interrenal” (Breuner et al., 2000).
La activación prolongada del eje HPA o adrenal, puede conducir a serios
déficits en la función inmune, balance de energía, y la salud, y en última
instancia un impacto negativo sobre la condición física, bloqueando toda
conducta sexual (Mc Ewen & Wingfield, 2003).
Selye (1936), quien sugirió que el estrés en anfibios es la respuesta a una
amenaza durante la cual el flujo sanguíneo aumenta y la energía (en forma
de nutrientes) va hacia los órganos críticos para responder a la amenaza,
mientras que las funciones no críticas para la supervivencia (digestión, y
reproducción) se ponen en espera, resultados que han sido confirmados
posteriormente por otros autores (Helmunt, 1985; Ziegler et al., 1995;
Dobson & Smith, 2000). Al parecer el proceso de estrés desencadena una
serie de reacciones, que según Denari & Ceballos (2005), citaron que
37
37
durante un nivel agudo de estrés las concentraciones de glucocorticoides son
elevadas, produciendo en el tejido testicular la disminución de la enzima 11B
– Hidroxilasa (protectora contra glucocorticoides), afectando directamente a
las células de Sertolli y Leydig, inhibiendo así la producción de esteroides
sexuales, bloqueando la conducta sexual.
Adicionalmente, la exposición a un hábitat de baja calidad puede dar lugar a
aumentos
de corticoesteroides en el plasma (Ward et al., 2007). Además las
condiciones de cautiverio hacen que los animales entren en el sueño estival
(estivación), bloqueando así las funciones reproductivas (Eckert, 2002). Otro
factor que incide en la reproducción es la dieta, ya que en condiciones de
cautiverio, los animales son expuestos a dietas simples que en la mayoría de
los casos no atienden los requerimientos nutricionales, circunstancia que en
vida natural si se da gracias a que los animales disponen una fuente variada
de alimentos.
Consecuentemente, el uso de HCG no produce una alta conducta sexual en
anfibios; como en el caso de este estudio.
Ovulación y Espermiación
En esta variable los animales tratados con la Hormona Gonadotrópica
Coriónica Humana presentaron una efectividad al 100% tanto en hembras
como en machos, en comparación con el grupo testigo en el cual los
resultados fueron del 0% respectivamente.
La Hormona Gonadotrópica Coriónica Humana, actúa en la gametogénesis
(ovogénesis y espermatogénesis) (Norris & López, 2011), a pesar de que los
reportes en anfibios son escasos, encontrándose los trabajos de (Vargas et
al., 2009) en la rana Montezumae, quienes observaron que bajo un
38
38
tratamiento hormonal de HCG en machos y hembras se obtuvo una
producción de gametos masculinos y femeninos; antecedentes que
concuerdan con los resultados adquiridos en este proyecto.
Por consiguiente, la HCG es eficaz en anfibios para la producción de
gametos femeninos y masculinos.
Incubación
En el grupo experimental un 20% de hembras entraron en periodo de
incubación, en comparación con el grupo testigo en el cual los resultados
fueron 0%.
La hembra de la pareja experimental que manifestó conducta sexual
(amplexus), entró en periodo de incubación durante 35 días, posteriormente
se produjo un abortó, posiblemente: por factores nutricionales, falta de
desarrollo anatómico en las estructuras que alojan los embriones (marsupio)
y cosanguinidad. Además se conoce que en las ranas en cautiverio, el
desarrollo de sus órganos reproductivos disminuye (Jorgensen, 1982),
siendo así muy difícil calcular la edad real a la cual las ranas llegan una
madurez sexual.
También se observó que el marsupio no se cerró totalmente, formándose la
capa ovular de gelatina que al medio ambiente sufrió desecación y tomó una
coloración parduzca. La hormona responsable de mantener el cierre del
marsupio, durante el primer tercio de incubación y el desarrollo de las
cámaras marsupiales es la progesterona, procedente de los folículos
postovulatorios, los cuales se encuentran activos aproximadamente durante
30 días; los dos tercios posteriores de incubación son sustentados por la
39
39
estructura interna del marsupio. (Se desconoce el mecanismo de hormonal
que mantiene los dos últimos tercio de incubación, pero se presume que las
branquias acampanadas y las cámaras de la bolsa podrían desempeñar un
papel análogo a la placenta en los mamíferos, al liberar hormonas que
regularan, por su parte, la incubación avanzada) (Del Pino, 1983).
Por lo tanto, la administración de la Hormona Gonadotrópica Coriónica
Humana, producirá gonadotropinas, estas a su vez estimulan la liberación
de progesterona, pero esta mantendrá el primer tercio de incubación siempre
que haya ovarios maduros que posean folículos grandes. (Del Pino, 1983).
Crías
En los 2 tratamientos, testigo y experimental, se obtuvo resultados del 0%.
Se observó que la hembra en periodo de incubación no llegó a término,
debido a la falta del desarrollo de la estructura interna del marsupio
(branquias acampanadas y cámaras embrionarias), por ende en ausencia de
las hormonas provenientes del marsupio que mantienen los dos últimos
tercios de incubación, los embriones no pueden mantenerse dentro del
marsupio y son expulsados. (Del Pino, 1983)
Por consecuencia, para llevar a término el período de incubación, las
hembras deben haber pasado sus estadíos juveniles y encontrarse en una
etapa madura reproductiva, lo cual es difícil de determinar ya que la edad
cronológica no concuerda con la edad biológica real en animales en
cautiverio. (Jorgensen, 1982).
40
40
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
CONCLUSIONES
La administración de la Hormona Gonadotrópica Coriónica Humana, a dosis
de 20UI/gr, administrada en dos días consecutivos no fue eficaz para la
reproducción en Gastrotheca riobambae.
41
41
RECOMENDACIONES
1.- La Hormona Gonadotrópica Coriónica Humana no se recomienda para
especies de anfibios que posean el ciclo reproductivo con incubación
interna; debido a que no promueve una conducta sexual positiva, siendo esta
imprescindible para la fertilización e incubación.
2.- Realizar registros de filiación de los individuos para tener datos más
exactos sobre edad y desarrollo.
3.- Mejorar los factores ambientales que intervienen dentro de la
reproducción de animales en cautiverio.
42
42
CAPÍTULO V
BIBLIOGRAFÍA
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11. Ron, S. (2008) La diversidad de la vida: entre el debacle y el anonimato.
Revista Ecuador Terra Incógnita, 53 (32 - 38).Recuperada el 20 de abril
del 2010. http://www.puce.edu.ec/zoologia.balsasapos/contacto.
54
54
CAPÍTULO VI
ANEXOS
Anexo A
Esquema hormonal
Fuente: Reproduction and Larval Rearing of Amphibians
Autores: Robert K. Browne and Kevin Zippel
55
55
Anexo B
Protocolo Hormonal
Protocolo hormonal HCG (ciclo de 2 días)
Manipulación del ambiente con ciclos de luz, lluvia y temperatura hasta
llegar al amplexus.
Gonadotrofina coriónica humana (chorullon): HCG: 20 UI/g:cavidad
celómica en día1
Gonadotrofina coriónica humana (chorullon): HCG: 20 UI/g:cavidad
celómica en día 2
Fuente: Arias L.
Elaboración: Los Autores
56
56
ANEXO C
Administración de la hormona (HCG) en la cavidad celómica
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
57
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ANEXO D
Rana Marsupial Andina Hembra (Gastrotheca riobambae)
Fuente: Shutterstock
Autores: Dr. Morley Read
58
58
ANEXO E
Rana Marsupial Andina Macho (Gastrotheca riobambae)
Fuente: Shutterstock
Autores: Dr. Morley Read
59
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ANEXO F
Tipos de Callos Nupciales
60
60
ANEXO G
Esquema de Vocalización en Anuros
61
61
ANEXO H
Amplexus de Rana Marsupial Andina (Gastrotheca riobambae)
Fuente: Archivo de la Escuela de Biología de Pontificia Universidad Católica
del Ecuador
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62
ANEXO I
Ovulación de Rana Marsupial Andina (Gastrotheca riobambae)
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
OVULACIÓN
63
63
ANEXO J
Espermiación de Rana Marsupial Andina (Gastrotheca riobambae)
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
ESPERMIACIÓN
64
64
ANEXO K
Huevos fertilizados en el marsupio de Rana Marsupial Andina
Fuente: European Biologist
Autor: Roland Weimer, fotógrafo.
65
65
ANEXOS L
Rana Marsupial Andina – Hembra en incubación
Estudiada por Del Pino.
Fuente: Archivo de la Escuela de Biología de la Pontificia Universidad Católica del
Ecuador
66
66
ANEXO M
Verificación de preñez en Rana marsupial andina
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
67
67
ANEXO N
Regulación Hormonal en la Reproducción de la
Rana Marsupial Andina Hembra
Fuente: Archivo de la Escuela de Biología de la Pontificia Universidad
Católica del Ecuador
Autor: Del Pino, 1983
68
68
ANEXO O
Rana Marsupial Andina alimentándose
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
69
69
ANEXO P
Distribución Neuroanatómica de los Anfibios
Diagrama Representativo Ilustrando la Distribución Neuroanatómica de la acción intracraneal de las neuronas TN- GnRH-I, neuronas (círculos grises);
acción GnRH-I en las neuronas de la zona pre-óptica (círculos negros), y
acción GnRH-II en las neuronas en los cerebros de las tres clases de anfibios (círculos negros).
Fuente: Hormones and Reproduction of Vertebrates, Amphibians
Autores: Norris. D., & López. K., (2011).
70
70
ANEXO Q
Ciclo ovárico de los Anuros
Ciclo ovárico de anuros con la participación de los
componentes hormonales principales. El color negro indica el más alto nivel de actividad hormonal y el color blanco
el nivel más bajo. LH, hormona luteinizante, la FSH, la hormona folículo
estimulante, GnRH, hormona liberadora de gonadotropina.
Fuente: Hormones and Reproduction of Vertebrates, Amphibians
Autores: Norris. D., & López. K., (2011).
71
71
ANEXO R
Marsupio de la Rana Marsupial Andina
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
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ANEXO S
Distribución Geográfica de la Rana Marsupial Andina
Se encuentra distribuida desde Riobamba hasta Otavalo, en altitudes entre
los 2500 hasta 3000 m.s.n.m.
Fuente: Archivo de la Escuela de Biología de la Pontificia Universidad
Católica del Ecuador
Autores: Del Pino, 1989a & Duellman, 1977, citado por Cuesta, 1990
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73
ANEXO T
Certificación del Centro de Investigación y Conservación Anfibios
74
74
ANEXO U
Autorización de Investigación Científica
75
75
ANEXO V
Certificación del Tiempo de Investigación
76
76
ANEXO W
Registro de Tutoría
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ANEXO X
Costos del Tratamiento
MATERIALES PRECIOS $ CANTIDAD TOTAL
Acuaterrarios de plástico 15 10 150
Gonadotropina coriónica humana (HCG) 15 2 30
Ampollas de agua destilada 1 20 20
Caja de agujas de insulina 12 1 12
Caja de guantes de nitrilo 12 1 12
Mangueras (m) 6 5 30
Termómetros 28 2 56
Luber (m) 25 2 50
Congeladora portátil 50 1 50
Balanza digital 100 1 100
Malla plástica (m) 6 2 18
Calentadores 150 2 300
Bandejas plásticas 5 10 50
Gastrotheca riobambae* - 20 -
Alimentación anfibios (mensual) 25 3 75
Servicios básicos: Luz, agua (mensual) 50 3 150
Papelería, Internet 300 300
TOTAL 1403
* Gastrotheca riobambae se encuentra en peligro de extinción por lo tanto su
precio es invaluable.
Fuente: Directa
Elaboración: Los Autores
