This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Zellwand wird als Folge der Mutation nur soweit ab-geändert, daß ein verändertes Oberflächenladungs-muster entsteht. Die umgebaute Membran vermag hingegen die irreversible Bindung des spontan nicht mehr adsorbierbaren Phagenteilchens doch noch zu vollziehen, wenn für engen Kontakt gesorgt ist.

In einer uns erst bei der Niederschrift dieser Arbeit zugänglich gewordenen Veröffentlichung beschreiben G a r e n und P u c k den umgekehrten F a l l 6 : Eine bestimmte, gegen T 1 resistente Mutante B / l vermag T 1 wohl noch reversibel zu binden, aber nicht mehr irreversibel. Hier müßte also zwar das äußere, für die Adsorption von T 1 nötige Ladungsmuster un-verändert erhalten geblieben sein, nicht aber das für die enzymatische Folgereaktion notwendige und viel-leicht in einer tieferen Schicht der Zellwand liegende „Substrat". Ein entsprechender Schichtenaufbau der intakten Zellwand von Colibakterien erschien uns be-reits auf Grund früherer Versuche nicht unwahr-scheinlich 2.

Auf jeden Fall kann man auf Grund von Unter-

e A. G a r e n and Th. T. P u c k , J. exp. Med. 94, 177—189 [1951].

suchungen an geeigneten, phagenresistenten Bakte-rienmutanten nunmehr sehr genau zwischen den bei-den postulierten Schritten der Adsorption unterschei-den. Jeder Schritt scheint für sich und unabhängig vom anderen durch eine Mutation blockiert werden zu können. Der bündige Beweis für diese letztere An-nahme ist aber freilich erst erbracht, wenn entweder eine B/2-Mutante gefunden wird, die T 2 nur rever-sibel, jedoch nicht irreversibel bindet, oder aber, wenn z. B. die Mutante B/1 ,5 , die T 1 gar nicht spon-tan adsorbiert, nach der in dieser Arbeit beschriebe-nen Methode mit T 1 infiziert werden kann.

Unsere Methode dürfte sich übrigens auch dazu eignen, eindeutig festzustellen, ob Tryptophan als Adsorptionscofaktor bei bestimmten Phagen nur fin-den ersten oder auch für den zweiten Adsorptions-schritt benötigt wird. Wir werden dies gelegentlich untersuchen. Bisher konnte nur gezeigt werden, daß es bestimmt für den ersten Schritt notwendig ist ( i.

Frau Ursula M e t h f e s s e l bin ich wiederum für ge-schickte Hilfe bei den Experimenten zu großem Dank verpflichtet.

Über die Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser V o n O T T O W E S T P H A L , O T T O LÜDERITZ u n d FRITZ B I S T E R

Aus dem Forschungsinstitut der Dr. A. W a n d e r G.m.b.H., Säckingen (Baden), und der Biochemischen Abteilung des Chemischen Instituts der Universität Göttingen

(Z. Naturforschg. 7 b. 148—155 [1952]; eingegangen am 14. Januar 1952)

Es werden zwei einfache Verfahren zur Extraktion von Bakterien mit Phenol'Wasser an-gegeben. Nach Behandlung von gramnegativen Bakterien mit Phenol/Wasser-Emulsionen in der Kälte während weniger Minuten erhält man in der wäßrigen Phase die somatischen Glykoproteide der Bakterien (hauptsächlich O-Antigene) in praktisch quantitativer Ausbeute. Nach Extraktion der Bakterien mit erwärmten, homogenen Phenol/Wasser-Mischungen und Trennen der Phasen in der Kälte finden sich in der wäßrigen Phase die proteinfreien Poly-saccharide neben Nucleinsäuren. Einige chemische und immunologische Eigenschaften der nach den beiden Verfahren dargestellten Glykoproteide. und Polysaccharide werden beschrieben.

Es ist bekannt, daß sich bakterielle Proteine und Polysaccharide dadurch voneinander trennen las-

sen, daß man ihre selektive Löslichkeit in Phenol und Wasser ausnützt. Proteine sind in Phenol, Poly-saccharide dagegen besser in Wasser löslich.

P a 1 m e r und G e r 1 o u g h 1 haben gezeigt, daß man durch fraktionierte Phenol- und Wasser-Extraktion von Typhusbazillen ein (für Mäuse) sehr wirksames Poly-saccharid-Antigen (O-Antigen) isolieren kann. Die getrock-neten Bakterien werden zunächst mehrfach mit 88—95-proz. Phenol ausgezogen; bei der anschließenden Extrak-tion mit Wasser gehen 10—15% der bakteriellen Trocken-

masse in Lösung, aus welcher eine hcchantigene poly-saccharidische Substanz mit 3,4—3,6% Stickstoffgehalt isoliert werden kann. P a 1 m e r und G e r 1 o u g h 1 be-tonen, daß diese Methode allgemeiner anwendbar sei. Das Verfahren diente z. B. zur Herstellung der typen-spezifisdien Kapselpolysaccharid-Antigene der Pneumo-kokken für praktischen Gebrauch als Impfstoffe

1 J. W. P a 1 m e r u. T. D. G e r 1 o u g h , Science [New York] 92, 155 [1940].

2 C. M. M a c L e o d , R. G. H o d g e s , M . H e i -d e l b e r g e r u. W. G. B e r n h a r d . J. exp. Medicine 82, 445 [1945].

M o r g a n und P a r t r i d g e 3 fanden, daß manche Glykoproteide aus Bakterien, wie das phospholipoidfreie 0-Antigen von Ruhrbazillen 3> 4, in 90-proz. Phenol gelöst werden können und dabei Dissoziation in die Polysac-charid- (undedraded polysaccharide) und Protein-Kom-ponente (simple amphoteric protein) erleiden. Durdi an-schließende Dialyse der phenolischen Lösung gegen Was-ser lassen sidi die Protein- und die Polysaccharid-Kempo-nente weitgehend voneinander trennen, indem hierbei das Protein ausfällt, während das Polysaccharid in Lösung bleibt.

Aus Typhusbazillen, Pseudomonas aeruginosa und Proteus vulgaris haben R o b i n s o n und F l u s s e r 5

Polysaccharide extrahiert und dadurch hochgereinigt, daß sie in die konzentriert-wäßrigen Lösungen der Roh-extrakte wiederholt einen Überschuß von 95-proz. Phenol einrührten. Dabei fiel jeweils das Polysaccharid aus, wäh-rend stickstoffhaltige Verunreinigungen in Lösung blie-ben. Endprodukt der mehrfach wiederholten Operation waren die völlig proteinfreien (Stickstoffgehalt 0%) Poly-saccharide.

M o r g a n und P a r t r i d g e 6 versuchten, das 0-anti-gene Glykoproteid von Typhusbazillen durch Schütteln gleicher Teile Phenol und Wasser in die Protein- und Polysaccharid-Komponente aufzutrennen; allerdings ohne Erfolg. Neuerdings konnten dagegen H o r m a n und L e n s 7 mit dem gleidien Verfahren in einfacher Weise die Abtrennung unerwünsditen Proteinmaterials von Heparin-Präparaten erreichen.

Seit einigen Jahren haben wir uns mit Verfahren zur Extraktion hochmolekularer Inhaltsstoffe, insbe-sondere von Glykoproteiden und Polysacchariden, aus Bakterien befaßt. Wir haben dabei gefunden8, daß sich Bakterien (A) durch Schütteln mit Phenol/ Wasser-Emulsionen in der Kälte 9 oder (B) durch Extraktion mit homogenen Phenol/Wasser-Gemischen bei erhöhter Temperatur in einfacher Weise und sehr rasch aufschließen lassen. Aus gramnegativen Bakte-rien, welche wir hauptsächlich bearbeiteten, erhält man nach Schütteln mit Phenol/Wasser-Emulsionen eine Glijkoproteid-Fraktion in der wäßrigen Phase. Nach Extraktion der Bakterien mit erwärmten, homo-genen Phenol/W asser-Mischungen, anschließendem Kühlen und Trennen der Schichten erhält man da-gegen in der wäßrigen Phase proteinfreie Poly-saccharide neben Nucleinsäuren.

3 W. T. J. M o r g a n u. S. M. P a r t r i d g e , Bio-chemie. J. 35, 1140 [1941].

4 W. T. J. M o r g a n u. S. M. P a r t r i d g e , Bio-chemie. J. 34, 169 [1940].

5 E. S. R o b i n s o n u. B. A. F l u s s e r , J. biol. Chemistry 153, 529 [1944].

6 W. T. J. M o r g a n u. S. M. P a r t r i d g e , Brit. J. exp. Pathol. 23, 151 [1942],

7 J. D. H. H o r m a n u. J. L e n s , Biochim. biophys. Acta 2, 333 [1948],

Die Züchtung der nachstehend erwähnten Bakterien er-folgte im allgemeinen unter Leitung von Dr. E. K r ö g e r (Medizinal-Untersuchungsamt, Göttingen) in 24—30-stdg. dauerbelüfteten Traubenzucker-Bouillon-Kulturen. Pro-teus-Bakterien wurden in halbsynthetischer Nährlösung (Hottinger-Bouillcn, Glucose, Salze) unter Zusatz von Nicotinsäure9'10 gewonnen. Die verarbeiteten Fluoreszenz-bakterien überließ uns Dr. L. B i r k o f e r (Max-Planck -Institut für Medizinische Forschung, Heidelberg), der diese Keime in einem vollsynthetischen, flüssigen Nähr-boden züchtete.

A. Extraktion von Bakterien mit Phenol/Wasser-Emulsionen in der Kälte

Verteilt man Bakterien in einer Phenol/Wasser-Emulsion (etwa gleiche Teile Phenol und Wasser), so findet an der Phasengrenzfläche ein sehr rascher Auf-schluß der Bakterienzellen statt, und ein großer Teil der Zellsubstanz geht fast augenblicklich in Lösung. Durch Zentrifugation erhält man eine obere wäßrige, eine untere phenolische Lösung und einen ungelösten Rückstand. Die wäßrige Phase kann durch Dialyse oder Ätherextraktion von gelöstem Phenol befreit werden; sie enthält im wesentlichen eine Glykoproteid-Fraktion. Die phenolische Phase enthält (teilweise de-naturierte) Proteine, welche z. B. durch Fällung mit Alkohol in der Kälte isoliert werden können.

Die Ausführung des Verfahrens ist nachstehend am Beispiel der von uns in früheren Jahren im Zu-sammenhang mit dem Fleckfieber-Problem viel be-arbeiteten Proteus-Bakterien (Stamm 0 X 19) 8> 9 be-schrieben. Die Ausführungsform ist bei anderen Bak-terien prinzipiell die gleiche.

Eine Suspension von etwa 10 g Bakterien (bez. auf Trockensubstanz) in 160 ccm Wasser* wird in einer weithalsigen 500-ccm-Stöpselflasche auf 2° C vorgekühlt. Hierzu werden 265 ccm einer auf etwa 5° C gekühlten 75-proz. Phenol/Wasser-Mischung (etwa 200 g Phenol und 65 ccm Wasser) unter Umschwenken hinzugefügt. Die Emulsion wird kräftig geschüttelt und unter gelegent-lichem Aufschütteln 10—30 Min. lang bei 3—5° C stehen gelassen. Danach wird der Ansatz bei 3000—4000 T./Min.,

8 Kurze Mitt.: O. W e s t p h a l , Angew. Chem. 57, 57 [1944]; O. W e s t p h a l u. F. B i s t e r , Angew. Chem. 57, 128 [1944]; H. S c h m i d t u. O. W e s t p h a l , Fiat Rev. of German Science II, 96 [1947]; O. W e s t p h a l et al., Z. Naturforschg. 2 b, 25 [1947].

9 Ausführl. Darst. d. Emulsions-Verfahrens: F . B i s t e r , Dissertation, Göttingen 1944 '45.

Vgl. P. F i 1 d e s , Brit. J. exp. Pathol. 19, 239 [1938]: E. F. M ö l l e r u. L. B i r k o f e r , Ber. dtsch. ehem. Ges. 75, 1108 [1942],

* Es kann mit gleichem Ergebnis auch mehr Wasser hinzugefügt werden. Die Konsistenz der Suspension soll nicht zu dick sein. Es ist gleichgültig, ob man von frischen feuchten oder von (aceton)-vorgetrodcneten Bakterien ausgeht.

Präparat Ausbeute /o

N [u/(1] P[">] Kohlenhydrat [%]

n. Hagedorn-Jensen (als Glucose)

Serolog. in Wirksamkeit

Hemmung-E/mg9

Proteus OX 19 Trockensubstanz (acetongetr.) 11—13 1,6—2,0 6—8 1000

Wäßrige Phase (Glykoproteid) 8—12 5,5 2,5—3,5 30—35 10—20000

Phenol-Phase (Proteine) 20—25 14—14,5 0 , 3 - 0 , 6 2—4 - 50

Unlöslicher Rückstand 50—60 13—13,5 1,5—1,8 3 - 6 - 50

Tab. 1. Übersicht über die bei der Extraktion von Proteus 0X 19 erhaltenen Rohfraktionen.

möglichst in der Kälte, zentrifugiert und die oben ab-gesetzte wäßrige Lösung abgehoben. Das übrige Zentri-fugat wird in die Flasche zurückgegeben, mit 50 ccm Wasser durchgeschüttelt und wieder zentrifugiert. Die hierbei erhaltene wäßrige Schicht wird mit der ersten vereinigt, 2—3 Tage lang gegen fließendes Leitungs-wasser und 1 Tag gegen dest. Wasser dialvsiert. Das Innendialysat engt man im Vakuum (12—20 mm Hg) bei 25—35° C auf ein Volumen von 40—50 ccm ein. Die viskose, opaleszierende Lösung wird kurz zentrifugiert, wobei sich geringe Mengen unlöslichen Materials ab-setzen. Anschließend wird in das 6-fache Vol. Alkohol oder Aceton'Alkohol eingegossen. Zur Vervollständigung der Fällung gibt man 10 ccm gesättigter alkoholischer Natriumacetatlösung hinzu. Die Substanz fällt in weißen Flocken oder feinen Fäden aus, welche abzentrifugiert, mit Alkohol und Aceton gewaschen und im Vakuum-exsikkator getrocknet werden. Man kann auch vorteilhaft die alkoholische Fällung in etwas Wasser aufnehmen und nach F 1 c s d o r f 11 lyophil trocknen. Ausbeute 0,8—1.2 g (bei Proteus 0X 19).

Die Aufarbeitung der phenolischen Phase erfolgt z. B. durch Eingießen in die 6—10-fache Menge gekühlten Alkohol, wobei das gelöste Material zum größten Teil ausfloekt. Etwas Lipoidmaterial bleibt in Lösung. Man erhält 2—2.5 g Substanz, im wesentlichen Proteine, die z. Tl. in Wasser, teilweise nur in schwach alkalischem Me-dium. teilweise ganz unlöslich sind. — Der in Phenol'Was-ser ungelöste Rückstand beträgt 5—6 g.

Aus Tab. 1 ist zu ersehen, daß in der wäßrigen Phase rund 5 0 % der Gesamtkohlenhydrate angerei-chert sind; die übrigen 5 0 % entfallen zum großen Teil auf Pentose aus Nucleinsäuren. Nur etwa 4 — 5 % des Gesamtstickstoffs finden sich in der wäßrigen Lösung; über 9 0 % liegen in der phenolischen Phase

11 E. W. F l o s d o r f , Freeze Drving, Reinhold Puhl. Corp., New York 1949.

12 A. W i n k 1 e r u. O. W e s t p h a 1, Z. Immunitäts-forsdig. exp. Therap. 105, 155 [1944]; F . B i s t e r , Diplom-arbeit 1943, Univ. Göttingen.

13 Vgl. R. C a s t a ñ e d a , J. exp. Medicine 60. 119 [1934],

und dem Rückstand in Form von Proteinen und Nucleoproteiden vor.

E x t r a k t i o n s d a u e r u n d - t e m p e r a t u r . W7ir variierten die Extraktionszeiten von 5 Min. bis zu 3 Tagen und die Temperaturen zwischen 5 ° und 3 8 ° C. Die Ausbeuten wurden gewichtsmäßig (Tab. 2) und mittels eines quantitativen -serologischen Hem-mungstests an Hand der Agglutinationshemmung von Proteus 0 X 19-Bakterien durch menschliches Fleckfieberserum und durch spezifisches Kaninchen-0 X 19-Antiserum 8> 9 ' 1 2 bestimmt. Aus Tab. 1 ist an Hand der spezifischen serologischen Hemmungswir-kung (angegeben in Hemmungs-Einheiten) zu er-sehen, daß praktisch das gesamte serologisch (0- und X-Faktor 1 3 ) aktive Material, im wesentlichen 0-Antigen, in die wäßrige Phase geht, und zwar be-reits nach einmaliger Behandlung der Bakterien mit Phenol/Wasser in der Kälte während weniger Minu-ten. Für die serologische Spezifität der 0-antigenen Glykoproteide der gramnegativen Bakterien ist be-kanntlich der Polysaecharidanteil maßgeblich 14, den man auf diese Weise quantitativ erfassen kann.

Variationen des pjj-Wertes der wäßrigen Phase von Pu 6,3 bis 8,5 (phenolgesättigt bei 5° C ergibt Wasser: Pu 6,3; 7i-Natriumacetat: p^ 7,2; 0,5 n.-Socalösung: pn 8,5) hatten keinen Einfluß auf die Ausbeute und serologische Wirksamkeit der Präparate.

E x t r a k t i o n a n d e r e r g r a m n e g a t i v e r K e i m e. Nach dem gleichen Verfahren wurden u. a. auch einige Chargen von Bact. typhosum, Bact. dysen-teriae (Shiga) und Bact. coli mit Phenol/Wasser-Emulsionen aufgeschlossen15. Die Ausbeuten an

14 Vgl. z.B. O. W e s t p h a l , Angew. Chem. 57, 57 [1944].

13 Teilweise bearbeitet mit J. K ö h n e c k e , Diplom-arbeit 1944'45, Univ. Göttingen.

Species Extraktion Ausbeuten in °/o,

bezogen auf bakt. Trockensubstanz

Dauer Temp. ° C Charge I II III IV

B. proteus OX 19 3 Min. 30 Min.

6 Stdn. 6 Stdn.

24 Stdn. 72 Stdn. 72 Stdn. 72 Stdn.

5 5 5

38 5 5

20 38

10,2

11,3

11,0 10,8

8,0

8.7 9.8

7,5

8,3 10,5

9,2 7,1

9,9 13,0

Bact. typhosum 30 Min. 5 6,1 7,0

B. dysent. (Shiga) 30 Min. 5 13,0 12,6 9,0

B. coli 30 Min. 5 9,3 7,8

Tab. 2. Ausbeuten der Glvkoproteid-Rohfraktion aus der wäßrigen Phase der Phenol/Wasser-Extraktion.

wasserlöslicher Glykoproteid-Fraktion sind in Tab. 2 angegeben. Die analytischen Daten der erhaltenen Substanzen ähneln denjenigen von Proteus OX 19. Ein Präparat aus Typhusbazillen enthielt 2 , 9 3 % N, 3 ,28% P und ~ 3 5 % Zucker (als Glucose nach H a g e d o r n - J e n s e n), ein entsprechendes Präpa-rat aus Ruhrbazillen 4 , 1 3 % N, 2 ,84% P und ~ 3 8 % Zucker; jenes aus Coli 3 ,92% N, 3 , 4 2 % P und - 4 2 % Zucker.

R e i n i g u n g d e r G l y k o p r o t e i d - F r a k -t i o n a u s d e r w ä ß r i g e n P h a s e . Aus der 2-proz. wäßrigen Lösung kann die Substanz mit Alko-hol unter Zusatz von Natriumacetat fraktioniert wer-den. Die Hauptmenge des Materials (bei Proteus OX 19), etwa 8 0 % , fällt scharf bei 6 8 — 7 0 % Alkohol-gehalt. Nach Wiederholung derselben Operation ist die erhaltene Substanz (Proteus WA e 8 ) weitgehend einheitlich. Dies ergab sich auch aus Messungen in der Ultrazentrifuge, über die wir noch gesondert be-richten werden*. Die Substanz enthielt 4 , 9 2 % N, 3 .14% P und 3 3 % Zucker, nach Hydrolyse. Auch die Glykoproteid-Fraktionen aus anderen Keimen (Ty-phus. Shiga. Coli u. a.) ergaben bei der Fraktionie-rung Hauptfraktionen, welche sich als weitgehend einheitlich erwiesen. In dieser Form stellen die Sub-stanzen weiße Pulver dar (am besten lyophil-getrock-net), welche in Wasser farblose, opaleszierende Lö-sungen bilden. Die rel. Viskosität 1-proz. Lösungen in 0 ,9% NaCl ist 1 ,3—1,5 (Lösungsmittel: 0 , 9 % NaCl = 1,0).

Wir haben Herrn Doz. Dr. G. S c h r a m m (Max-Planck-Institut für Biochemie, Abt. Virusforschung, Tübin-gen) für die Durchführung der Messungen zu danken.

S p a l t u n g d e r G l y k o p r o t e i d e m i t v e r d . E s s i g s ä u r e . M o r g a n und P a r t r i d g e 3> 4> 6

haben gezeigt, daß die 0-antigenen Glykoproteide aus Shiga- und Typhusbakterien durch Erhitzen in 1-proz. Essigsäure in die Protein- und Polysaccharid-Komponente gespalten werden können. Wir haben einige der mit Phenol/Wasser-Emulsionen erhaltenen und durch alkoho-lische Fraktionierung gereinigten Glykoproteide (Extrak-tion: 30 Min., 5 °C) nach dem gleichen Verfahren mit verd. Essigsäure behandelt, um die Proteinkompcnente zu isolieren. 2-proz. Lösungen der Glykoproteide wurden in 1-proz. Essigsäure im Wasserbad auf 95-—98° C gehalten. Nach ~ 1 Stde. fiel jeweils ein flockiger Niederschlag aus und die opaleszierende Lösung klärte sich auf. Nach wei-teren 2 Stdn. wurde gekühlt und zentrifugiert. Die je-weiligen Niedersdiläge wurden mit wenig 1-proz. Essig-säure gewaschen, anschließend in eiskaltem Wasser suspendiert und tropfenweise mit 0,5-n. Natronlauge auf Pn 8,5 gebracht, wobei der größte Teil des Materials sich klar mit schwach gelber Farbe löste. Die Lösungen wur-den in der Kälte tropfenweise mit 0,5-/i. Essigsäure ver-setzt, eine erste Fällung (wenig) bei pj[ ~ 6 wurde ab-zentrifugiert; bei p^ 4—5 fiel der Hauptteil in weißen Flocken aus. Die isoelektrische Fällung bei p^ 4—5 wurde wiederholt und ergab dann aus dem Shiga-Glykoproteid 17% Protein (N 11,9%, P 0 :8%), aus Proteus 0X 19 12% Protein (N 12,1%, P 0,9%) und aus Coli 16,5% Roh-protein (N 11,54%). Diese Proteine ähneln dem von M o r g a n 3 » 4 . 6 beschriebenen „conjugated protein" aus dem 0-Antigen von Shiga- und Typhusbakterien (N 11,2%, P 1,07%) auch hinsichtlich ihrer Unlöslichkeit im sauren Gebiet jenseits des isoelektrischen Punktes. Ein Versudi, das so erhaltene Shigaprotein mit der genuinen gruppen-spezifischen Substanz A aus Schweinemagen 1(i nach den von M o r g a n angegebenen Verfahren 17 zu kuppeln.

's W. T. J. M o r g a n u. H. K. K i n g , Biochemic. J. 37, 640 [1943].

17 W. T. J. M o r g a n u. Mitarbb., Brit. ]. exp. Pathol. 23, 84 [1942]; 24, 41 [1943]; 25, 221 [1944]; 26, 247 [1945],

verlief jedoch negativ; es wurde bei der Immunisierung am Kaninchen keine signifikante Steigerung des Anti-A-Titers beobachtet. Wir halten es für wahrscheinlich, daß die Proteinkomponente durch die vorhergehende .Phenol' Wasser-Behandlung verändert wird, so daß das isolierte Protein (jedenfalls bei Shiga) nicht mehr die Kupplungs-fähigkeit des mittels Diäthylenglykols darstellbaren genuinen Proteins besitzt.

Indessen erwiesen sich die Glvkoproteide beim Kanin-chen noch als gute Antigene.

A n t i g e n i t ä t d e r G l v k o p r o t e i d e a u s d e r w ä ß r i g e n P h a s>e *. Kaninchen erhielten intravenöse Injektionen der folgenden Dosen von Proteus WAes: Am 1. Tag 0,01 mg, am 2. Tag 0.02, 3. Tag 0,04, 6. Tag 0,08 mg und dann jeweils nach 3-tägigen Intervallen 0,15, 0,2 und 0,3 mg. 8 Tage nach der letzten Injektion wurde ent-blutet und der Agglutinationstiter der Seren bestimmt. Es ergab sich, daß die wirksamsten Antiseren mit Agglu-tinationstitern von 1 : 3200 bis 1 : 6400 von jenen Präpa-raten erhalten wurden, die bei niederer Temperatur kurz-extrahiert worden waren (5—30 Min., 5° C). Dagegen war die Antigenität der Präparate, welche über längere Zeit mit Phenol'Wasser-Emulsionen in Berührung gewesen waren, deutlich geringer; die entsprechenden Kaninchen-Antiseren hatten maximale Agglutinationstiter von nur 1 : 400 bis 1 : 800.

Die Toxizität der Kurzextraktionsprodukte (Proteus WAg s) für weiße Mäuse war nach i.p.-Injektion bei einer DL 5 0 von 5—10 mg/kg (vgl. 18) höher als bei den lang-extrahierten Präparaten (3 Tage, 5 ° C ) mit einer DL- 0

> 20 mg/kg. Bei der Langextraktion von Proteus 0X 19 veränderte sich auch die rel. Viskosität der erhaltenen Glykoproteid-Lösungen (1-proz.) gegenüber derjenigen nach Kurzextraktion; sie stieg von 1,3—1,4 auf 3,1.

B . Extraktion von Bakterien mit homogenen

Phenol/Wasser-Mischungen in der W ä r m e

Hierzu suspendiert man die Bakterien in der pas-senden Menge Wasser, erwärmt auf 6 5 — 6 8 ° C, und trägt unter Rühren ebenfalls auf 6 5 — 6 8 ° vorgewärm-tes 90-proz. Phenol ein (Phenol : Wasser etwa 1 : 1). Nach 2 0 — 3 0 Min. langem Rühren bei 6 5 ° C wird mit Eiswasser gekühlt, wobei sich zwei Schichten bilden, welche durch Zentrifugation in die obere wäßrige und die untere phenolische Lösung getrennt werden. Die wäßrige Phase enthält eine Polysaccharid- und eine Nucleinsäure-Fraktion, die phenolische Phase Protein-material. Die Aufarbeitung erfolgt wie unter A. Als Beispiel, das entsprechend auch bei anderen Bakterien anwendbar ist, geben wir nachstehend die Extraktion von Colibakterien.

18 A. B o i v i n u. A. D e 1 a u n a y , Bull. Acad. Méd. 128, 357 [1944]; C. R. Séances Soc. Biol. Filiales Asso-ciées 138, 398 [1944]; Ann. Inst. Pasteur 72, 139 [1946]; A. B o i v i n , Ann. Inst. Pasteur 72, 143 [1946]; A. B o i -v i n u. A. D e l a u n a v , Presse méd. 55 Nr. 9 [1947].

10 g Colibakterien (bez. auf Trockensubstanz) werden bei 65—68° (Wasserbad) in 350 ccm Wasser suspendiert und unter Rühren mit 350 ccm auf 68L vorgewärmtem 90-proz. Phenol versetzt. Es wird unter Rühren 20—30 Min. bei 65—68° belassen, anschließend mit Eiswasser auf 5—10° gekühlt und zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wird abgehoben und die untere bräunlich-klare Phenol-schicht nochmals bei 68° mit 300 ccm Wasser während weniger Min. gerührt. Nach erneuter Kühlung und Zentri-fugation werden die wäßrigen Lösungen vereinigt und gegen dest. Wasser dialysiert. Die schwach opaleszierende Innenlösung wird im Vakuum auf 10—15 ccm Volumen eingeengt, von geringen Mengen ungelöster Substanz scharf abzentrifugiert und in die 6—10-fache Menge Alko-hol (Zusatz von etwas Natriumacetat) eingegossen. Die Substanz fällt in weißen Flocken, welche mit Alkohol und Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet oder in wenig Wasser aufgenommen und lyophil-getrocknet wer-den. Ausbeute 0,8—1,3 g (8—13%). Die Substanz löst sich langsam in Wasser und bildet opaleszente Lösungen.

Die klare bräunliche Phenolschicht wird in das vierfadie Volumen kalten Methanols (etwa 1,5 1) unter Zusatz von 15 ccm einer gesättigten methanolischen Natriumacetat-Lösung eingegossen. Nach kurzer Zeit scheidet sich eine feinflockige Fällung ab, welche abzentrifugiert, mit Me-thanol; Aceton und Äther gewaschen und getrocknet wird. Ausbeute: 1,5—1,8 g (15—18%). Es handelt sich um Pro-teine, welche wenig löslich in Wasser, teilweise löslich in verd. Alkali und Säuren, teilweise ganz unlöslich sind. — Der bei der Extraktion verbleibende ungelöste Rückstand wird mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 6—6,5 g (60—65%).

In der gleichen Weise haben wir auch andere gramnegative Keime extrahiert. Die erhaltenen Aus-beuten aus der wäßrigen und phenolischen Phase sowie an ungelöstem Rückstand sind in Tab. 3 auf-geführt ; gleichzeitig ist die Zahl der Extraktionsver-suche angegeben, aus denen die Daten gewonnen wurden.

R e i n i g u n g d e r P o l y s a c c h a r i d - N u -c l e i n s ä u r e - R o h f r a k t i o n (wäßrige Phase). — Das Material aus der wäßrigen Phase besteht meist zu e twa gleichen Teilen aus Polysaccharid und Nuclein-säure. Lediglich bei dem von uns untersuchten, schleimbildenden Stamm von Lactis aerogenes (vgl. Tab. 3) fanden wir viel Polysaccharid und wenig Nucleinsäure. Die Nucleinsäure erwies sich in allen Fällen (mit Ausnahme bei B. flnorescens) als Ribo-nucleinsäure, während sich Desoxy-ribonucleinsäure (D is c h e -Reakt ion) im ungelösten Rückstand nach-weisen ließ. Das Material ergab die typische Ab-sorption bei 2 5 8 — 2 6 0 m / / und konnte so beim Ver-

* Die Immunisierungsversuche wurden zum größten Teil von Prof. Dr. H. S c h m i d t (Behring-Institut, Mar-burg a. d. Lahn) durchgeführt, wofür wir ihm zu großem Dank verpflichtet.sind.

Tab. 3. Ergebnisse der Extraktionsversuche mit Phenol/Wasser-Mischungen in der Wärme.

Ausbeuten in % der bakteriellen Trockensubstanz

Species W ä ß r i g e P h a s e Zahl

der einzelnen Versuche

Species Kohlenhydrat- P h e n o l - P h a s e U n g e l ö s t e r Zahl der einzelnen

Versuche •

Nucleinsäure-Fraktion

Proteine R ü c k s t a n d

Zahl der einzelnen

Versuche

B. coli 8—13 15—18 60—65 20 Abortus equi 8—13 14—20 60—70 5 Enteritis Breslau 7—12 15—20 55—65 8 B. parathyphos. B 8—13 22—27 40—60 3 B. thyphosum 6,5—9 ' 25—28 50—60 5 B.dysent. (Shiga) 4—6 17—20 70—75 2 B. fluorescens 4—6 14—19 50—60 4 Lactis aerogenes 26—35 10—15 35—45 3

gleich gegen reine Standard-Hefenucleinsäure recht genau quantitativ bestimmt werden. Die wäßrigen Lösungen der Phenol/Wasser-Extraktion (homogen, 6 8 ° ) ergeben auf Zusatz von Mineralsäure grobflockige Fällungen, welche den größten Teil der Nucleinsäure enthalten, wobei jedoch immer — auch bei mehr-facher Wiederholung der Operation — etwas Poly-saccharid der Fällung anhaftet. Eine weitgehende Trennung erreicht man durch alkoholische Fraktionie-rung (vgl.1 9), welche wir, wie folgt, durchführten:

4 g Rohextrakt aus Colibakterien (wäßrige Phase) wer-den in 200 ccm Wasser gelöst und die Lösung unter Rühren mit 200 ccm Äthanol versetzt. Die Fällung wird abzentrifugiert, mit 50-proz. Alkohol, dann mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Aus-beute 2,1—2,3 g, hauptsächlich Nucleinsäure. Die Mutter-lauge wird im Vakuum auf 30 ccm Volumen eingeengt und erneut auf 50% Alkoholgehalt gebracht (Zusatz von 30 ccm Äthanol). Die geringe Fällung, 100—150 mg, wird durch Zentrifugation entfernt. Das Filtrat läßt man in das 6-fache Volumen Alkohol (Zusatz von etwas Natrium-acetat) einfließen. Die feinflockige Fällung wird scharf abzentrifugiert, in wenig Wasser aufgenommen und lyophil-getrocknet. Ausbeute 1,2—1,3 g, hauptsächlich Polysaccharid. Diese Fraktion enthält noch etwa 5—10% Nucleinsäure. Durch geeignete Wiederholung der Frak-tionierung kann man die Substanzen weiter reinigen. Die gereinigte Nucleinsäure ist völlig klar in Alkali und bei neutraler Reaktion löslich, während die Polysaccharid-Fraktion schwach opaleszente Lösungen bildet.

Weder die derart gereinigte Nucleinsäure-, noch die Polysaccharid-Fraktion enthalten Proteinmaterial; die üblichen Proteinreaktionen (z .B . S a k a g u s h i -Reaktion u. a.) sind vollkommen negativ. In Tab. 4 sind die analytischen Daten der Polysaccharid-Nuclein-säure-Rohfraktion sowie der nach einmaliger alkoholi-

19 W. F. G o e b e 1, F. B i n k 1 e y u. E. P e r 1 m a n , J. exp. Medicine 81, 315 [1945],

-o O. W e s t p h a l , O. L ü d e r i t z u. E. E i c h e n -b e r g e r , Z. Naturforschg., in Vorbereitung.

scher Fraktionierung erhaltenen Polysaccharid- und Nucleinsäure-Fraktionen aus verschiedenen Bakterien zusammengestellt.

R e i n i g u n g d e r P r o t e i n - F r a k t i o n (Phenol-Phase). — Die Coli-Proteinfraktion aus der Phenolphase (1 g) wird in 18—20 ccm Wasser suspendiert. Durch Zu-gabe von 0,5-n. Natronlauge bei 0° wird auf pg etwa 8,5 eingestellt, wobei ein großer Teil in Lösung geht. Nadi Zentrifugation wird die hellbräunliche, klare Lösung tropfenweise mit 0,5-n. Essigsäure auf 4—5 gebracht; die entstandene flockige Fällung wird mit wenig Wasser gewaschen und mit Aceton'Äther oder lyophil-getrocknet. Ausbeute etwa 0,5 g (50%). Die Substanz bildet ein nahe-zu weißes Pulver, welches in schwachem Alkali und in verd. Säuren (jenseits pjj 3) löslich, bei pn 4—5 unlöslich ist. Sie enthält keine Nucleinsäure (phosphorfrei, keine Absorption bei 258—260 m«) und praktisch kein Kohlen-hydrat (M o 1 i s c h - Reaktion vollkommen negativ). — In Tab. 4 sind die analytischen Daten der phenolischen Rohfraktionen aus verschiedenen Bakterien und der durdi isoelektrische Fällung gereinigten Proteinfraktionen an-gegeben.

Aus Tab. 4 ist ersichtlich, daß bei einmaliger Frak-tionierung der Rohfraktion aus der wäßrigen Phase mit Alkohol bereits eine weitgehende Trennung von Nucleinsäure und Polysaccharid erfolgt. Der Stick-stoffgehalt der angereicherten Polysaccharide entfällt z. Tl. auf restliche Nucleinsäure, teilweise auf Hexosamin *. Der Phosphor liegt in organischer Bin-dung vor, vermutlich als Phosphorsäure-ester, wo-durch die Polysaccharide schwach saure Eigenschaften besitzen und z. B. im elektrischen Felde in alkalischen Pufferlösungen langsam anodisch wandern, weshalb man diese Polysaccharide elektrophoretisch hochreini-gen kann. Über die weitere Reinigung einzelner Polysaccharide, deren Analyse und Molekulargewichte berichten wir in folgenden Arbeiten2 0 . Von den

* Die Präparate aus Coli enthielten 9—13% Glucosamin, ein Präparat aus Ab.equi9,5% (Best, nach Elson-Morgan).

Species

Wäßrige Phase

Rohfraktion

(Polysaccharid Nucleinsäure)

n/ IM o

Nach einmaliger alkoholischer Fraktionierung

N u c l e i n s ä u r e -f r a k t i o n

N P

P o l y s a c c h a r i d -f r a k t i o n

Zucker*

Phenol-Phase

Rohfraktion

N P

P r o t e i n f r a k t i o n nach isoelektr. Fällg.

(PH 4 - 5 ) N P Asche

B. coli Ab. equi Ent. Breslau B. fluoresceins Lact, aerogerxes

6—8,5 6.7

5,3—7,3 8,5—9,5

3.8

3—5 4,8

3,4—4,9 7—9 2,0

12—13 12,2 13',4

14,1—14,7

7.5—8,5 7,8 8,1

8.6—9,1

1.3—1,8 1,5—2,0 1.4—1,6 2.5—3,5

2,3

~ 2,4 3,1—3,2

~ 2,2

1,5

75—80 55—60 65—70

15—16 15—16 15—16

15,6

- 0,5

- 0,5 0,6

15,8—16,2 16,1

15,7—15,9 16,3 16,1

0 0 0 0 0,3

c 1 0,6

c 1 - 0,5 1,1

Nach H a g e d o r n - J e n s e n als Glucose. Tab. 4. Analytische Daten.

Nucleinsäuren stellten wir bisher nur die Fraktion aus B. fluorescens rein dar, d. h. protein- und poly-saccharidfrei; entsprechend zeigt sie die für Nuclein-säuren (Na-Salze) charakteristischen N- ( 1 4 , 7 % ) und P-Werte ( 9 , 1 % ) und das typische Verhältnis N / P = 1,62. Das Absorptionsspektrum zeigt bei 258 m / / das charak-teristische Maximum.

Über die aus der Phenolphase durch isoelektrische Fällung darstellbaren Proteine bringen wir weitere Beobachtungen in einer späteren Mitteilung2 1 .

A n t i g e n i t ä t d e r P o l y s a c c h a r i d e aus d e r w ä ß r i g e n P h a s e . Entgegen unserer Erwartung er-wiesen sich in vorläufigen Untersuchungen die hochgerei-nigten und sicher proteinfreien Polysaccharide bei Kanin-chen als Antigene. Kaninchen erhielten z. B. während 15—20 Tagen tägliche intravenöse oder intraperitoneale Injektionen von jeweils nur 1 g des Abortus-equi-Poly-saccharids, im ganzen also nicht mehr als 0,015—0,02 mg. Einige Tage nach der letzten Injektion wurde entblutet. Die Seren ergaben spezifische Agglutinationstiter gegen-über Abortus-equi-Bakterien bis zu 1 : 4000. Die serolo-gisdie Spezifität der Polysaccharide ist jedoch voll erhal-ten: die Substanzen zeigen mit geeigneten Kaninchen-0-Antiseren Präcipitation bis zu Verdünnungen von 1 : 105

bis 1 : 106. Antigenitätsprüfungen an Mäusen haben wir ncch nicht angestellt (vgl. 18). Über weitere biologische Eigenschaften dieser Polysaccharide und Untersuchungen am Menschen beridrten wir a. a. O.

Diskussion

Bei der Behandlung von Bakterien mit flüssigem Phenol gehen somatische Proteine in Lösung. Hier-durch wird im allgemeinen die Zellstruktur derart verändert, daß die anschließende Extraktion mit wäßrigen Mitteln den größten Teil der Polysaccharide in Lösung bringt, bei gramnegativen Keimen (Glatt-formen) hauptsächlich 0-antigenes Material. Diese zweistufige Extraktion nach P a 1 m e r und G e r -

21 O. W e s t p h a l , O. L ü d e r i t z u. E . K r ö g e r , Z. Naturforschg., in Vorbereitung.

1 o u g h 1 läßt sich, wie wir zeigen konnten, rascher und einfacher in einer Operation durchführen.

Die genuinen 0-Antigene der gramnegativen Bakterien stellen, wie M o r g a n und P a r t r i d g e 3> 4> 6 bei Typhus- und Shigaruhr- und G o e b e 1 19 bei Flexnerruhr-Bazillen zeigen konnten, tertiäre Symplexe dar, welche aus einer Phospholipoid-, einer Polysaccharid- und einer Proteinkomponente bestehen. M o r g a n und P a r -t r i d g e 3' 4' 6 haben in mehreren Untersuchungen die einzelnen Komponenten rein dargestellt. Sie fanden Be-dingungen, unter denen der ternäre Symplex dissoziiert, und konnten andrerseits auch Verfahren ausarbeiten 17, mit deren Hilfe die Einzelkomponenten sich zu Symplexen wieder rekcmbinieren. Nun stellen aber sowohl das genuine Protein („conjugated protein"), welches sich bei Typhus- und Ruhrkeimen als identisch erwies, als auch das jeweilige Polysaccharid („undegraded Polysaccharide") wiederum dissoziable Substanzen dar, d. h. unter dem Einfluß verschiedener Agenzien (vgl. auch 19) können sie weiter zerfallen und bilden dann Abbaustufen, die bisher nicht wieder zum entsprechenden genuinen Ausgangsmate-rial zurückverwandelt werden konnten. So geht das kon-jugierte Protein (11,2% N, 1,1% P) in Phenollösung in ein amphoteres Protein (13,8% N, 0% P) („simple amphoteric protein") über, welches die Fähigkeit verloren hat, sich mit bakteriellen Polysacchariden zu Glykoproteiden zu vereinigen.

Extrahiert man jedoch getrocknete Bakterien (Ruhr-bazillen) direkt mit 90-proz. Phenol 3, so findet nur Ab-dissoziation des Phospholipoids statt und es geht ein hoch-antigenes 0-Glykoproteid in Lösung, dessen Proteinkom-ponente alle chemischen Eigenschaften des konjugierten Proteins hat. Das Polysaccharid scheint in diesem Fall das konjugierte Protein vor der weiteren Dissoziation zum einfachen amphoteren Protein zu schützen. Bei wieder-holter Extraktion der wäßrigen Lösung des 0-Glyko-prcteid-Komplexes mit Phenol ergab sich indessen, daß hierbei die Proteinkomponente nach und nach, jedoch nicht vollständig, eliminiert wurde, was aus einer Abnahme des Stickstoffgehaltes und verminderter Antigenität des Rest-komplexes (für Kaninchen) geschlossen wurde.

Bei dem von uns durchgeführten Aufschluß von Bakterien mit PhenoljW asser-Emulsionen in der Kälte

findet zunächst, und zwar offenbar momentan, die Auflösung somatischer Proteine in der Phenolphase statt, während sich antigenes O-Glykoproteid in der wäßrigen Phase löst. Ob hier die Proteinkomponente vollständig in der Form eines genuinen konjugierten Proteins vorliegt, haben wir noch nicht endgültig entschieden. Die Polysaccharid-Komponente liegt in jedem Fall in der undegradierten Form vor.

Beim Erwärmen von Phenol/Wasser-Emulsionen tritt zunehmende Lösung beider Phasen ineinander ein. Im selben Maße findet zunehmend Dissoziation des gelösten Glykoproteids in das einfache amphotere Protein und das undegradierte Polysaccharid statt. Nach dem Abkühlen und Trennen der beiden Phasen findet sich daher die eine Komponente — das ampho-tere Protein — im Phenol und die andere — das Polysaccharid — im Wasser. Verwendet man daher zur Extraktion der Bakterien erwärmte homogene Phenol/Wasser-Mischungen, so erhält man bei der Aufarbeitung proteinfreie Polysaccharide in der wäßrigen Phase. Bei der erhöhten Temperatur (65" C) findet gleichzeitig auch Dissoziation von Nucleo-proteiden statt. Man findet daher neben Polysacchari-den auch Nucleinsäuren in der wäßrigen Phase. Letz-tere fehlen darin nach Emulsionsextraktion in der Kälte. Durch geeignete Fraktionierung oder elektro-phoretische Verfahren kann man die Nucleinsäuren und Polysaccharide voneinander trennen. Auch nach der Phenol/Wasser-Extraktion in der Wärme erhält man das (proteinfreie) undegradierte Polysaccharid, wie wir in einer folgenden Arbeit 2 0 zeigen werden.

Bei allen Anwendungsformen der Phenol/Wasser-Extraktion wird die Phospholipoid-Komponente aus den Symplexen abgespalten; man erhält in jedem Fall phospholipoid-freie Präparate.

22 H. S c h m i d t , Behring-Institut, Marburg (Lahn), unveröffentlicht.

23 M . H e i d e l b e r g e r u. Mitarbb., J. exp. Medicine 85, 227 [1947].

Die mit dem Phenol/Wasser-Emulsionsverfahren in der Kälte erhaltenen Glykoproteide aus gramnegati-ven Keimen sind für Kaninchen antigen. Die gereinig-ten, proteinfreien Polysaccharide, welche man aus homogenen Phenol/Wasser-Mischungen in der Wärme isoliert, scheinen nach unseren bisherigen Unter-suchungen ebenfalls, auch für Kaninchen, antigen zu sein. Wir haben neuerdings gemeinsam mit Doz. Dr. G. S c h r a m m (Tübingen) gefunden, daß das von uns dargestellte proteinfreie Polysaccharid aus Colibakterien ein sehr hohes Molekulargewicht in der Größenordnung von einigen Millionen besitzt. In die-sem Zustand sind die Substanzen offenbar gute Anti-gene. Bei der Einwirkung von verdünnter Essigsäure in der Wärme (vgl. 3' 4> 6) erfolgt, wie wir fanden, sehr rasch eine weitgehende Depolymerisierung dieser Polysaccharide; die so abgebauten Polysaccharide sind für Mäuse noch antigen, wie B o i v i n und D e l a u n a y 1 8 gezeigt haben, dagegen für Kanin-chen ganz unantigen im Sinne agglutinierender oder präcipitierender Antikörper.

H. S c h m i d t 2 2 hat auch grampositive Keime, wie Pneumokokken, mit Phenol/Wasser-Emulsionen in der Kälte extrahiert und gefunden, daß man die typenspezi-fischen Kapselpolysaccharide auf diese Weise in einer Stufe quantitativ in der wäßrigen Phase erhält. Die so in einfacher Weise rein darstellbaren Polysaccharide sind be-kanntlich 2>23 für den Menschen gute Antigene.

Wir haben den Herren Prof. Dr. F. S c h ü t z und Prof. Dr. J. B ü r g e r s (Hygiene-Institut der Universität Göt-tingen) sehr zu danken für die Überlassung von Einrich-tungen des Instituts zur Züchtung größerer Quantitäten von Bakterien. — Besonderen Dank schulden wir Herrn Dr. E. K r ö g e r (Medizinaluntersuchungsamt Göttingen) für wertvolle Hinweise und die Ausführung bakteriolo-gisch- serologischer Teste. — Frau S y b i l l e F i n g e r und Frau G e r t r a u d K i c k h ö f e n haben zahlreiche Bakterien-Extraktionsversuche durchgeführt, wofür wir auch ihnen bestens danken.