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Molekulare Diagnostik 1 Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane...
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Molekulare Diagnostik
1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Krankheitserreger und Diagnose
•Bakterien
•Parasiten
•Pilze
•Prionen
•Viren
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Molekulare Diagnostik
2Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Bakterien (Krankheiten)• Cholera• Pest• Tuberkulose• Keuchhusten (Pertussis)• Botulismus• Lepra• Tetanus• Streptokokken• Staphylokokken• Neisserien
Gonokokken
Meningokokken
• Enterokokken
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Molekulare Diagnostik
3Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
A macrophage extends a semiliquid projection (a so-called pseudopodium) towards some bacteria in the foreground.
Image by Lennert Nilsson, Karolinska Inst., Stockholm© Boehringer Ingelheim International GmbH
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Molekulare Diagnostik
4Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
• A series of images shows (top left to bottom right) the process – called phagocytosis – by which some bacteria are ingested by a macrophage.
Image by Lennert Nilsson, Karolinska Inst., Stockholm© Boehringer Ingelheim International GmbH
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Molekulare Diagnostik
5Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Parasiten (Krankheiten)• Schweinebandwurm• Trichinellen• Egel (Lungen-, Leber-)• Fadenwürmer• Hakenwürmer• Bandwürmer• Toxoplasmose (Toxoplasma gondii)• Malaria (Plasmodium malariae-Anophelesmücke)• afrikanische Tryponosomiasis, Schlafkrankheit
(Trypanosoma brucei-TseTse-Fliege)
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Molekulare Diagnostik
6Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Vor dem Essen, nach dem Essen, Händewaschen nicht vergessen." – diese Faustregel der Kindererziehung zielt ins Zentrum des Themas "Parasiten". Diese sind nur mikroskopisch erkennbare Krabbler, Saugmilben, Rebläuse etc. Auf eine freilebende Tierart kommen vier Parasitenarten - Parasiten sind damit die Gewinner der Evolution.
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Molekulare Diagnostik
7Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Mit ihrem Stich kann eine Sandmücke den Menschen mit Leishmanien infizieren. Zwei dieser Parasiten sind links abgebildet. Es handelt sich um einzellige Organismen, so genannte Flagellaten. Fotos: Moll, Uni Würzburg
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Molekulare Diagnostik
8Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Verlauf der Elephantiasis
In Afrika und anderen Ländern der Dritten Welt kann schon ein einfacher Mückenstich Elephantiasis verursachen. Manche Stechmücken übertragen die Larven des Fadenwurms Wuchereria bancrofti, der im menschlichen Organismus diese Erkrankung des Lymphsystems auslösen kann.
Filzläuse (Phthirus pubis, rechts) in unseren Haaren wirken wie Drahtseilakrobaten
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Molekulare Diagnostik
9Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Prionen
• Rinderwahn (BSE)
• Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
• Kuru (Papua Neuguinea)
• Scrapie (Traberkrankheit)
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Molekulare Diagnostik
10Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Viren• DNA Viridae
Parvo- (Fetusfehlbildung, Hauterkrankungen)
Papova- (Papillomaviren: Warzen, Zervixkarz.)
Adeno- (Erkältungen, Durchfall)
Herpes-
Alpha-Virinae (orale, genitale Erkrankung, Windpocken)
Beta-Virinae (CMV: Fieber, Lungen-, Leber-, Netzhautentzündg.)
Gamma-Virinae (Epstein Barr Virus: Pfeiffer-Drüsenfieber)
Pox- (Pocken)
• BakteriophagenViren, deren Wirte Bakterien sind
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Molekulare Diagnostik
11Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
• RNA ViridaePicorna-
Enterovirus Poliomyelitis V-Kinderlähmung, Coxsackie-V-abakterielle Meningitis, FieberHepatitis A (Serotyp 72)-Hep A
Revo- Rota- und Coloradoviren (Magen-Darmtrakt)
Paramyxo-Paramyxo V
Mumps-VirusMorbilli V
Masern-VirusRinderpest-VirusHundestaupe-Virus
Pneumo VMäusepneumonie-Virus
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Molekulare Diagnostik
12Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
• RNA ViridaeRhabdo-
Vesiculo V
Lyssa V
Tollwutvirus (Virus gelangt ins ZNS-bis zur Herzlähmung)
Bunya- (fieberhafte Erkrankungen)
Toga-
Alpha-V ( Malaria z.B.)
Flavi-Virinae (West Nil V, FSME: Frühsommer-Meningo-
Enzephalitis, Gelbfieber)
Rubi-V (Rötelnvirus-Missbildungen in Schwangerschaft)
Retro-
Spumavirinae (biolog. Wirkung unbekannt)
Oncovirinae (für Mensch und Tier gefährlich-Krebs)
Lentivirinae (HIV-AIDS)
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Molekulare Diagnostik
13Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Diagnose von Viren
• Virusisolierung (Anzüchten in Tieren, Bakterien- oder Zellkultur)
• Direkter Virennachweis (Elektronenmikroskop)• Indirekter Nachweis (Plaquemethode)• Immunologische Verfahren (ELISA, RIA)• Serodiagnose (Antiköpernachweis: IgG, IgM)
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Molekulare Diagnostik
14Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
VirusisolierungEventuell infiziertes Probenmaterial (z.B. von Menschen) wird auf Testsysteme übertragen:
Hühnerembryonen (bebrütete Hühnereier-selten)SäuglingsmäuseZellkulturen (Monolayer)
Das Auftreten von typischen Krankheitssymptomen im Testsystem zeigt Virus in Probenmaterial an:
CPE (zytopathischer Effekt)Plaques (Lysen)
Hühnereier werden bis heute zur Gewinnung von Impfstoffen verwendet.
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Molekulare Diagnostik
15Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Direkter Virusnachweis
• Elektronenmikroskopie (hohe Viruskonz. nötig)
Pockenviren
Rotaviren
Coronaviren (SARS)
• Elektronenmikroskop. Viruspartikelzählung (Zugabe einer bekannten Menge an Latexpartikeln-interner Standard)
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Molekulare Diagnostik
16Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Indirekter Virusnachweis
• Plaque Methode Aussäen von Monolayer auf festem Nährboden (Agar)
Infektion mit Probenmaterial (verschiedene Verdünnungen herstellen)
Virus lysiert Zelle, diese wiederum nur Nachbarzellen, dabei entstehen Plaques (Löcher im Zellrasen)
Pro Virus entsteht ein Plaque
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Molekulare Diagnostik
17Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Immunologische Verfahren• RIA
Kompetitive Probenbindung-Bekannte radioaktive Antigenprobe (in diesem Fall
der Virus der auch zu bestimmen ist)
-Unbekannte Virus-Antigen Probe-Zugabe von Antikörper, der Antigen bindet-Ausfällung des Antigen-AK Komplexes -Umso mehr Radioaktivität ausgefällt wurde,
umso weniger Virus in der zu untersuchenden ProbeSandwich
• ELISA
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Molekulare Diagnostik
18Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Serodiagnostik
• Komplementbingungsreaktion (KBR)• Hämagglutinationshemmtest (HHT)• Neutralisationstest (NT)• Immunfloureszenz• Nukleinsäurehybridisierung
• Diagnostik Influenza Virus
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Molekulare Diagnostik
19Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Komplementbingungsreaktion (KBR)
• Patientenserumzufügen von Testantigenen in bekannter Menge
• Sind Antikörper im PatientenserumKomplex aus Antigen und Antikörper bildet sich
Zugabe von Komplement und Hammelerythrozyten:
Kein Farbumschlag-Infektion:
Sind Antikörper im Patientenserum, bindet das Komplement zur Gänze an den entstandenen Antikörper-Antigen Komplex-
Kein Kompliment übrig für die Hämolyse der Erys!
Farbumschlag-keine Infektion
Sind keine Antikörper im Patientenserum, bindet Komplement an die Erys, es kommt zur Hämolyse, diese zeigt somit an, dass keine
Infektion besteht!!
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Molekulare Diagnostik
20Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
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Molekulare Diagnostik
21Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Hämagglutinationshemmtest (HHT)• Hämagglutinine sind Oberflächenstrukturen mancher Viren
(Rötelvirus)
• Hämagglutinine verklumpen rote Blutkörperchen (Agglutination)
• Vom Körper gebildete Antikörper richten sich gegen diese Hämagglutinine
• Testprinzip: Patientenserum werden Hämagglutinine zugegeben
Antikörper in der Patientenprobe: Hämagglut. werden gebunden. Eryzugabe führt zu keiner Agglutination
Keine Infektion: Hämagglutinine binden an zugegebene Erythrozyten: Agglutination
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Molekulare Diagnostik
22Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
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Molekulare Diagnostik
23Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Neutralisationstest (NT)• Nutzt die Tatsache, dass der Körper gegen eingedrungenes
Antigen (Virus) Antikörper bildet
• Testprinzip: Patientenprobe wird def. Menge an Antigen (zu testendes Virus z.B.) zugegeben.
Infektion: Antikörper der Patientenprobe neutralisieren zugegebenes Antigen und Lösung ist nicht mehr imstande Zellkultur zu infizieren.
Keine Infektion: Keine Antikörper, damit wird zugegebenes Antigen nicht von Patientenprobe neutralisiert und kann damit Zellen infizieren!!
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Molekulare Diagnostik
24Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Immunfluoreszenz• Nachweis von Antikörpern im Patientenserum• Testprinzip: empfindliche Zellkultur wird mit dem zu
untersuchenden Virus infiziert.
Zugabe von Patientenserum: Bei Infektion: Antikörper des Serum neurtalisieren Virus und Zellen werden nicht cytopathisch.Keine Infektion: keine Antikörper, daher ist Virus
imstande Zellen zu infizieren
Zugabe von fluoreszensmarkierten Antikörpern, die den Erstantikörper binden
Bei Infektion: Antikörper-Antikörper Komplex, damit enststeht Fluoreszenz, im Mikroskop zu beobachten.
Keine Infektion: Kein Erstantikörper, keine Bindung an fluoreszenzmarkierten Antikörper möglich, keine Fluoreszenz
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Molekulare Diagnostik
25Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
NukleinsäurehybridisierungDient dem Nachweis viraler Gene in der
PatientenprobeTestprinzip SB:
DNA aus Patientenprobe wird isoliert, fragmentiert, auf Gel aufgetragen und auf Nitrozellulose geblottet.
Verwendung radioaktiv markierter Gensonden (DNA Fragmente des nachzuweisenden Virus) zur Hybridisierung mit der Blot-DNA.
Infektion: es kommt zu einer Hybridisierung, auf der Photoplatte entstehen Schwärzungen
Keine Infektion: Gensonden sind nicht homolog zur Patientenprobe, keine Hybridisierung, keine Schwärzung.
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Molekulare Diagnostik
26Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Diagnostik Influenza Virus
Nachweis Viraler Antigene
Proben: Nasen-, Rachen-, Alveolarsekret
Nur 1-4 Tage nach Krankheitsbeginn möglich!ImmunfluoreszenzELISAVirusanzucht in Zellkultur
Hoch spezialisiert, nur in wenigen Labors möglich:
PCR Retrospektiv: serologischer Antikörpernachweis
KBR, ELISA, Immunfloureszenz
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Molekulare Diagnostik
27Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Diagnostik HIV: ELISAHIV Antikörper ist festphasengekoppelt
=ErstantikörperZugabe des Patientenserum (Antigen)Zugabe von Antikörper-Enzym-Konjugat
=ZweitantikörperÜberschuß an Konjugat durch Waschen
entfernenSubstratzugabe (an sich farblos), erst
durch Enzym wird Subtrat umgesetzt: Farbreaktion
Umso intensiver die Farbe umso mehr Antigene (HIV) waren in der Probe:
Direkt proportional!!
HIV wird immer durch Western Blot bestätigt!!!!
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Molekulare Diagnostik
28Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss
Influenzavirus
Adenovirus
HIV Virus