Trabajo de fin de grado. Grado en biología.

Trabajo de fin de grado. Grado en biología.

Comparación de la septación e integridad celular entre

Schizosaccharomyces pombe y Schizosaccharomyces

japonicus creciendo en presencia de equinocandinas.

Comparison of septation and cell integrity between

Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces

japonicus growing in the presence of echinocandins.

Autor: Juan Hernández Vázquez

Facultad de Biología, Grado en Biología, 2019 – 2020

Índice

Resumen................................................................................................................................................

Summary...............................................................................................................................................

Palabras clave.......................................................................................................................................

A. Introducción..................................................................................................................................𝟏

1. Schizosaccharomyces pombe y Schizosaccharomyces japonicus...............................................𝟏

2. Ciclo celular de S. pombe y S. japonicus.................................................................................... 𝟏

3. Citocinesis.................................................................................................................................... 𝟏

4. Pared celular de S. pombe.......................................................................................................... 𝟐

5. Estructura del septo de división de S. pombe........................................................................... 𝟐

6. Separación celular...................................................................................................................... 𝟑

7. Biosíntesis del (1,3)-β-D-glucano en S. pombe.......................................................................... 𝟑

7.1. Bgs1...................................................................................................................................... 𝟒

7.2. Bgs2...................................................................................................................................... 𝟒

7.3. Bgs3...................................................................................................................................... 𝟒

7.4. Bgs4...................................................................................................................................... 𝟒

8. Antifúngicos que inhiben la actividad (1,3)-β-D-glucán sintasa............................................. 𝟓

8.1. Anidulafungina (Eraxis® o Ecalta®, Pfizer)...................................................................... 𝟔

8.2. Caspofungina (Cancidas®, Merck Sharp & Dohme, MSD).............................................. 𝟔

8.3. Micafungina (Mycamine®, AstellasPharma)..................................................................... 𝟔

B. Objetivos........................................................................................................................................ 𝟔

C. Resultados...................................................................................................................................... 𝟕

1. Comparación de la susceptibilidad de S. pombe y S. japonicus a diferentes concentraciones

de equinocandinas....................................................................................................................... 𝟕

2. Comparación de la dinámica de la septación en las dos especies a lo largo de 3 horas de

crecimiento en presencia de concentraciones letales y subletales de los tres antimicóticos… 𝟗

3. Comparación de las diferencias fenotípicas de muerte celular en las dos especies a lo largo

de 3 horas de crecimiento en presencia de concentraciones letales y subletales de los tres

antifúngicos................................................................................................................................ 𝟏𝟎

D. Discusión..................................................................................................................................... 𝟏𝟓

E. Conclusiones................................................................................................................................ 𝟏𝟕

F. Materiales y métodos.................................................................................................................. 𝟏𝟕

1. Microorganismos utilizados................................................................................................... 𝟏𝟕

2. Medios de cultivo..................................................................................................................... 𝟏𝟕

3. Condiciones y estimación del crecimiento............................................................................. 𝟏𝟕

4. Ensayo de susceptibilidad y determinación de la concentración mínima inhibitoria de

Anidulafungina, Micafungina y Caspofungina con cada cepa............................................ 𝟏𝟖

5. Técnicas de microscopía de campo claro, de contraste de fases y de fluorescencia............ 𝟏𝟖

G. Bibliografía................................................................................................................................. 𝟏𝟗

Resumen.

Las levaduras de fisión Schizosaccharomyces pombe y Schizosaccharomyces japonicus presentan un

gran interés como organismos modelo para el estudio de múltiples procesos celulares. A diferencia

de lo que ocurre con S. pombe, aún desconocemos la composición, arquitectura y como se sintetiza

la pared celular y el septo de división en S. japonicus. Los antifúngicos Anidulafungina, Caspofungina

y Micafungina son equinocandinas aprobadas para el tratamiento de ciertas micosis que actúan

inhibiendo la síntesis del (1,3)-β-D-glucano de la pared celular fúngica. Aunque estos antifúngicos

claramente bloquean la síntesis del (1,3)-β-D-glucano inhibiendo la actividad (1,3)-β-D-glucán

sintasa, todavía desconocemos los detalles moleculares de su mecanismo de acción. S. japonicus tiene

4 subunidades catalíticas de la (1,3)-β-D-glucán sintasa de función desconocida que presentan una

alta identidad con las de S. pombe. En este estudio tratamos a estas dos especies con distintas

concentraciones de equinocandinas a fin de comparar sus susceptibilidades, la progresión de la

septación y los fenotipos de muerte celular. Hemos encontrado que las dos especies muestran una

susceptibilidad diferente a estos fármacos, induciendo un comportamiento opuesto en la progresión

de la septación y en el porcentaje de muerte celular entre las dos especies.

Summary.

The fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus arouse a great

interest as model organisms for the study of multiple cellular processes. Unlike S. pombe, we still do

not know the composition, architecture and how the cell wall and the division septum are synthesized

in S. japonicus. The antifungals Anidulafungin, Caspofungin and Micafungin are echinocandins

approved for the treatment of certain mycosis which act by inhibiting the synthesis of (1,3)-β-D-

glucan from the fungal cell wall. Although these antifungals clearly block the synthesis of (1,3)-β-D-

glucan by inhibiting the (1,3)-β-D-glucan synthase activity, we still do not know the molecular details

of their mechanism of action. S. japonicus has 4 catalytic subunits of (1,3)-β-D-glucan synthase of

unknown function that present a high identity with those of S. pombe. In this study we treated these

two species with different concentrations of echinocandins in order to compare their susceptibilities,

the progression of septation and the phenotypes of cell death. We found that the two species show a

different susceptibility to these drugs, inducing an opposite behavior in the progression of septation

and in the percentage of cell death between the two species.

Palabras clave.

Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicus, Anidulafungina, Caspofungina,

Micafungina, (1,3)-β-D-glucano.

Trabajo de Fin de Grado en Biología Juan Hernández Vázquez

1

A. Introducción.

1. Schizosaccharomyces pombe y Schizosaccharomyces japonicus.

Las especies usadas en este trabajo son las levaduras de fisión S. pombe y S. japonicus pertenecientes

al phylum Ascomycota. Estos hongos, pese a estar evolutiva y genéticamente muy cercanos tienen

varios rasgos diferenciales. S. japonicus es una levadura dimórfica de morfología esférica,

considerablemente más grande que S. pombe, con cromosomas mas condensados y un tiempo de

generación y de cruzamiento genético notablemente menor (Klar, 2013, Aoki et al., 2017). Pese a que

todos estos rasgos hacen de S. japonicus un organismo interesante para el estudio de múltiples

procesos celulares, está mucho menos investigada que S. pombe. Esta última es considerada un

organismo modelo debido a que presenta un ciclo celular conservado, de muy corta duración, no es

patógena y presenta un patrón de crecimiento muy polarizado (Hayles & Nurse, 2018).

2. Ciclo celular de S. pombe y S. japonicus.

En condiciones favorables S. pombe crece como una célula haploide, de morfología cilíndrica y

alargada cuyo diámetro y longitud varían según el punto del ciclo celular en el que se encuentre,

alargándose de forma lineal por sus extremos (crecimiento polarizado) hasta que la célula entra en las

etapas de mitosis y citocinesis. Durante esta última etapa se inicia la formación de un septo en la

región ecuatorial de la célula. Una vez formado el septo es degradado dando lugar a la separación

celular por fisión transversal, originando dos células hijas genéticamente idénticas. Dado que estas

células hijas mantienen siempre la forma de la célula madre progenitora, esta especie es muy usada

en estudios morfogenéticos (Brunner & Nurse, 2000). S. japonicus presenta un ciclo de vida

dimórfico, en el que según las condiciones en las que crezca puede presentar una transición de

crecimiento de levadura a micelio (M. Sipiczki et al, 1998, K. Aoki et al, 2017). En este estudio se

ha trabajado exclusivamente con la forma de levadura, caracterizada por un crecimiento bipolar y

simétrico similar a S. pombe.

3. Citocinesis.

La citocinesis es la última etapa del ciclo celular donde la célula se divide en dos células hijas que

contienen la misma información genética. Para la realización de este proceso es necesaria la

contracción de un anillo de actomiosina coordinada con la deposición de nuevo material de membrana

celular en la zona de división. En el caso de los hongos, al presentar una pared celular que rodea a la

célula, también se produce la formación de una estructura especial denominada septo de división. En

las levaduras, la citocinesis concluye con disolución del septo de división y la separación física de las

dos células hijas (Pérez et al., 2016; Cortés et al., 2016). S. pombe y S. japonicus presentan diferencias


2

en la regulación y el inicio temporal del ensamblaje del anillo de actomiosina en la zona ecuatorial

durante la mitosis (Gu et al., 2015).

4. Pared celular de S. pombe.

La pared celular es una estructura extracelular que rodea a la célula, común a todos los hongos, plantas

y bacterias, que constituye una barrera física que aporta resistencia osmótica y mecánica. Es una

estructura dinámica con la capacidad de variar su composición según los distintos estímulos, internos

y externos, que reciba la célula. Esta estructura juega un papel clave como principal protección ante

la presión de turgencia ejercida por el citoplasma de la célula, además de desempeñar funciones

durante el crecimiento celular y la citocinesis. Todos estos factores hacen de ella una diana de estudio

ideal para el desarrollo de nuevos tratamientos fungicidas sin dañar al hospedador (Cortés et al.,

2019).

La pared celular de S. pombe constituye un 15-25% del peso seco total. Está compuesta

principalmente por cuatro tipos de glucanos y galactomanoproteínas. Los glucanos que encontramos

son el (1,3)-β-D-glucano ramificado (R-BG) que constituye del 48 al 54% de la pared celular, el (1,3)-

α-D-glucano (αG, 28-32%), (1,6)-β-D-glucano (14%) y una pequeña cantidad de (1,3)-β-D-glucano

lineal (L-BG) (Cortés et al., 2019). Cuando se observa la pared celular mediante microscopia

electrónica de transmisión comprobamos que se trata de una estructura trilaminar en la que su lámina

central está compuesta por fibras de α y β-glucano, y las dos laminas que la rodean están compuestas

por las galactomanoproteínas (Cortés et al., 2019). Un aspecto que destacar es que, al contrario de la

mayoría de las especies fúngicas, la pared celular de las células vegetativas de S. pombe parece que

no presenta quitina. En cuanto a S. japonicus todavía no se han realizado estudios específicos que

analicen la composición y arquitectura de su pared celular, por lo que es aún más interesante

investigar sobre este campo.

5. Estructura del septo de división de S. pombe.

Observado por microscopía electrónica de transmisión, el septo presenta una estructura trilaminar

compuesta por una lámina central denominada septo primario (PS), que será la primera en formarse

de forma centrípeta a partir de una estructura inicial denominada rudimento anular. A ambos lados

de este septo primario se encuentra el septo secundario (SS) que se forma a posteriori y que termina

con un proceso de maduración en el que el septo adquiere un grosor similar al de la pared celular.

Estas tres laminas se forman de manera simultánea. Este proceso supone un punto crítico en la

supervivencia e integridad de la célula. De forma similar a la pared celular externa, el septo está

formado por (1,6)-β-D-glucano (exclusivo del SS), L-βG (localizado en grandes cantidades y


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únicamente en el PS), el R-βG y el αG (en el PS y SS) (Cortés et al., 2019). El polisacárido L-βG es

especialmente útil en el análisis espacial y temporal de la síntesis del septo debido a su tinción

especifica por el fluorocromo Calcofluor White (CW) (Cortés et al., 2016).

6. Separación celular.

Este proceso comienza con la abscisión de las membranas celulares adyacentes al septo, la disolución

de la pared celular en la zona externa del septo y la degradación del PS. Por último, al separarse las

células hijas y debido a la presión de turgencia ejercida por el citoplasma de las células, el SS se curva

de forma similar al polo opuesto de la célula. La correcta formación de todas las estructuras

involucradas en este proceso es vital para asegurar la integridad celular y evitar así la lisis celular

(Sipiczki, 2007; Cabib et al., 2001).

7. Biosíntesis del (1,3)-β-D-glucano en S. pombe.

El (1,3)-β-D-glucano está formado por unas 70 glucosas unidas linealmente por enlaces (1,3)-β-D.

En todas las especies fúngicas examinadas esta unión es catalizada por el complejo proteico (1,3)-β-

D-glucán sintasa (βGS), que está compuesto por una subunidad reguladora localizada en la cara

interna de la membrana celular y una subunidad catalítica embebida en la membrana celular. La

subunidad reguladora es constituida por la GTPasa Rho1, la cual activa a la subunidad catalítica al

unirse a GTP (Arellano et al., 1996; Díaz et al., 1993). La subunidad catalítica está formada por las

proteínas de la familia Fks/Bgs (Cortés et al., 2019; Drgonova et al., 1999). En el caso de S. pombe

se ha comprobado la existencia de 4 genes esenciales (bgs1+, bgs2+, bgs3+ y bgs4+) que codifican 4

Esquema 1. Comparación del perfil

hidropático (izquierda) e identidad

(derecha) de las proteínas Bgs1p, Bgs2p,

Bgs3p y Bgs4p entre S. pombe y S.

japonicus mediante el programa Basic

Local Alignment Search Tool (BLAST)


4

subunidades catalíticas diferentes: Bgs1, Bgs3 y Bgs4 se encuentran en la zona ecuatorial durante la

septación y en los polos de crecimiento durante el crecimiento polarizado, mientras que Bgs2

únicamente se expresa y funciona durante la fase sexual del ciclo de vida de la levadura. Todas las

proteínas Bgs/Fks son proteínas integrales de la membrana celular (Esquema 1), formadas por hélices

transmembranales distribuidas en dos regiones hidrofóbicas rodeando a una región hidrofílica central

caracterizada por su alto grado de identidad en toda la familia Fks/Bgs (Cortés et al., 2019). S.

japonicus también presenta en su genoma 4 genes que codifican 4 proteínas Bgs con un alto grado de

identidad con las de S. pombe (Esquema 1). Sin embargo, aún se desconoce si estas subunidades son

esenciales para la célula y si participan en los mismos procesos celulares que las de S. pombe:

7.1. Bgs1.

Esta subunidad es la responsable de la síntesis de L-βG lineal del PS. La característica distintiva del

L-βG lineal de unirse selectivamente al fluorocromo CW permite observar cómo en ausencia de Bgs1

y por tanto de este glucano, las esporas germinadas presentan múltiples septos carentes de PS que no

se tiñen con CW (Cortés et al., 2007).

7.2. Bgs2.

Está subunidad se sitúa en la membrana celular de las ascosporas y únicamente se ha comprobado

que esta subunidad es esencial para la formación de la pared celular durante esta fase sexual de su

ciclo de vida (Cortés et al., 2016).

7.3. Bgs3.

Se desconoce la función celular de esta subunidad, sin embargo, su ausencia produce un fenotipo de

células redondeadas e hinchadas que hace suponer que desempeña alguna función en el crecimiento

polarizado y en el mantenimiento de la morfología celular (Martín et al., 2003).

7.4. Bgs4.

Bgs4 es responsable de la síntesis del R-BG mayoritario de la pared celular y el septo de división,

siendo esencial para la integridad celular durante la citocinesis y el crecimiento polarizado, juega un

papel fundamental en la correcta síntesis y coordinación del PS, el anillo de actomiosina y la

membrana celular. Su ausencia induce una disminución del contenido de R-BG de la pared celular,

lo que conduce a una pared celular debilitada en los sitios de crecimiento activo, que al no poder

soportar la presión de turgencia interna de la célula da lugar a un fenotipo de lisis celular por rotura

de la membrana plasmática y posterior liberación del contenido citosólico en los polos de crecimiento


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y mayoritariamente en la zona del septo al comienzo de la separación celular. (Cortés et al., 2005;

Martins et al., 2011; Muñoz et al., 2013).

8. Antifúngicos que inhiben la actividad (1,3)-β-D-glucán sintasa.

Las diferentes funciones esenciales de las proteínas Bgs en la morfogénesis hacen de ellas una diana

ideal para el descubrimiento de nuevos antifúngicos y la mejora de aquellos ya disponibles. En este

estudio se ha trabajado con 3 antifúngicos de la familia de las equinocandinas: la Anidulafungina, la

Caspofungina y la Micafungina (Esquema 2). Estas drogas constituyen los únicos fármacos

específicos de la pared celular aprobados para el tratamiento clínico de diversas micosis. Las

equinocandinas son sustancias naturales sintetizadas por diferentes hongos que se diferencian en el

ácido graso (lineal o ramificado, saturado o insaturado, color verde en el Esquema 2) unido a un

hexapéptido cíclico. Las diferentes conformaciones de este ácido graso son vitales, ya que se sospecha

que es la estructura que se intercala en la membrana celular fúngica cerca de la subunidad catalítica

de la βGS. (Cortés et al., 2019).

Debido a la alta toxicidad de las equinocandinas naturales, los compuestos usados en clínica son

compuestos semisintéticos derivados. Aunque estos antifúngicos producen una inhibición de la

actividad βGS es una incógnita si el mecanismo por el que producen esta inhibición es por unión

directa a la subunidad catalítica de la glucán sintasa y cuál sería la cara de la membrana por la que

actuarían (Cortés et al., 2019). Al reducir los niveles de (1,3)-β-D-glucano tanto en la pared como en

Esquema 2. Estructura química de las equinocandinas aprobadas para uso clínico Anidulafungina (A),

Caspofungina (B) y Micafungina (C).


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el septo, estas equinocandinas producen un aumento de la sensibilidad osmótica en las zonas de

crecimiento y remodelación de la pared celular y la consecuente muerte celular. En S. pombe se ha

observado que las equinocandinas producen dos fenotipos de muerte celular, uno claramente de lisis

e idéntico al que presentan células carentes de Bgs4, que encajaría con una unión directa a la enzima

y otro de muerte celular sin lisis similar al que presentan mutantes de la subunidad reguladora Rho1,

que encajaría más con la teoría de la unión a la membrana celular y la consecuente pérdida de

permeabilidad de esta (Viana et al., 2013, Yagüe, 2020).

8.1. Anidulafungina (Eraxis® o Ecalta®, Pfizer)

Derivada de la Equinocandina B sustituyendo la cadena de ácido graso lateral por una cadena de

alcoxitrifenilo (Esquema 2). Este antifúngico es insoluble en agua (a diferencia de la Caspofungina

y la Micafungina) y es utilizado mayoritariamente en infecciones por los géneros Candida y

Aspergillus. Su uso fue aprobado en EE. UU. y en Europa en 2006 y 2007, respectivamente (Ribas et

al., 2014).

8.2. Caspofungina (Cancidas®, Merck Sharp & Dohme, MSD)

Derivada de la Pneumocandina B0 por modificación química de la estructura hexapeptídica

(Esquema 2). Al igual que la Anidulafungina se usa contra Candida y Aspergillus, mostrando efectos

fungicidas en la primera y fungistáticos con la segunda. En 2001 fue la primera equinocandina

aprobada para su uso terapéutico en EE. UU. y Europa (Cortés et al., 2019).

8.3. Micafungina (Mycamine®, AstellasPharma)

Es un derivado de la Equinocandina B por sustitución de la cadena lateral de ácido graso por una

cadena de complejos aromáticos (Esquema 2). Es usada tanto para prevenir candidiasis en individuos

inmunodeprimidos por trasplante de células madre hematopoyéticas como para tratar candidiasis

esofágicas. Su uso fue autorizado en el 2005 (Ribas et al., 2014).

B. Objetivos.

Aunque las equinocandinas claramente inhiben la actividad de la subunidad catalítica de la (1,3)-β-

D-glucán sintasa (βGS), todavía se desconocen los mecanismos moleculares que causan esta

inhibición. Este trabajo es una continuación de otros trabajos de fin de grado en el laboratorio (San

Quirico, E. 2019; Yagüe, N. 2020) que analizan los efectos de las equinocandinas exclusivamente en

S. pombe.


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Dado que S. japonicus contiene las mismas subunidades catalíticas de la βGS de S. pombe, para

intentar profundizar en el funcionamiento de las equinocandinas he realizado un examen comparativo

de la susceptibilidad y efectos en la septación de células de S. pombe y S. japonicus expuestas a las

equinocandinas usadas en clínica:

Por lo tanto, los objetivos planteados en este trabajo son:

1. Comparar la susceptibilidad de S. pombe y S. japonicus a diferentes concentraciones de

Anidulafungina, Caspofungina y Micafungina.

2. Comparar la dinámica de la septación en las dos especies a lo largo de 3 horas de crecimiento en

presencia de concentraciones letales y subletales de los tres antimicóticos.

3. Comparar las diferencias fenotípicas de muerte celular en las dos especies a lo largo de 3 horas de

crecimiento en presencia de concentraciones letales y subletales de los tres antifúngicos.

C. Resultados.

1. Comparación de la susceptibilidad de S. pombe y S. japonicus a diferentes concentraciones

de equinocandinas.

Se ha comparado la susceptibilidad de S. pombe y S. japonicus creciendo en presencia de 1, 2, 4, 10,

20 y 40 μg/ml de Anidulafungina, Caspofungina y Micafungina durante 24 horas. Con ello se

pretende conocer la concentración mínima inhibitoria (MIC, del inglés “Minimal Inhibitory

Concentration” y Materiales y Métodos). Este estudio se realizó en dos condiciones de crecimiento

exponencial diferentes:

1) Partiendo de cultivos de células con una densidad óptica de crecimiento baja (0.05).

2) Partiendo de cultivos de células con una densidad óptica de crecimiento más alta (0.25-0.30) que

posteriormente se utilizó en los experimentos de microscopía de células in vivo.

Como se observa en la tabla 1, los tres antifúngicos son algo más efectivos en condiciones de

crecimiento con baja densidad óptica. La MIC para Caspofungina, Anidulafungina y Micafungina en

S. pombe aumenta de 2, 2 y 4 μg/ml a 10, 4 y 10 μg/ml, respectivamente cuando se cambia la

condición del ensayo de la densidad óptica inicial de 0.05 a 0.25. Un incremento similar es observado

en la MIC de Anidulafungina y Micafungina en S. japonicus, cuyas MICs pasan de 10 a 20 μg/ml

para ambos compuestos. Por otro lado, la MIC de Caspofungina permanece 1 μg/ml en esta especie

en ambas situaciones de densidad óptica. De esta forma, cuando se parte de una densidad óptica alta

de crecimiento se observa que S. japonicus es más sensible a concentraciones más bajas de


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Caspofungina (1 y 2 μg/ml) donde S. pombe todavía es capaz de crecer (Tabla 1). Por el contrario S.

japonicus es por lo general más resistente a Anidulafungina y Micafungina que S. pombe (Tabla 1).

En el caso de la Micafungina se observa que a concentraciones bajas de la droga (1 y 2 μg/ml) las dos

especies crecieron de forma similar a sus controles correspondientes sin la droga (0 μg/ml)

presentando morfologías similares pese a mostrar ya síntomas de muerte celular a 2 μg/ml. Por el

contrario, a concentraciones altas (10, 20 y 40 μg/ml), se produjo una parada del crecimiento con un

fenotipo de células hinchadas y redondeadas formando agregados en el caso de S. pombe y de células

amorfas y muy vacuolizadas en el caso de S. japonicus (Figura 1). Es a concentraciones intermedias

(celdas en color azul en la Tabla 1) donde se detectan diferencias entre las dos especies, ya que S.

pombe presenta un crecimiento nulo mientras S. japonicus crece perfectamente. Con Anidulafungina,

S. japonicus presenta un comportamiento muy similar a la Micafungina, presentando un crecimiento

residual en presencia de las concentraciones más altas de la droga (Tabla 1). En cuanto a la

morfología, S. pombe presenta células vacuolizadas e hinchadas a concentraciones altas mientras que

Tabla 1. Ensayo de susceptibilidad a Anidulafungina, Caspofungina y Micafungina de S. pombe y S.

japonicus después de un tratamiento de 24 horas.


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en S. japonicus observamos más lisis celular (Figura 1), indicativo de un mayor crecimiento, una

progresión de la septación e inicio de la separación celular.

2. Comparación de la dinámica de la septación en las dos especies a lo largo de 3 horas de

crecimiento en presencia de concentraciones letales y subletales de los tres antimicóticos.

La captación de imágenes mediante microscopía de fluorescencia de una tinción con el fluorocromo

CW permitió examinar y cuantificar el porcentaje de septos abiertos y cerrados a lo largo de las tres

horas de tratamiento con concentraciones letales (20 μg/ml) y subletales (2 μg/ml) para S. pombe de

Anidulafungina, Caspofungina y Micafungina (Figura 2) y usadas en estudios previos del laboratorio

(San Quirico, E. 2019; Yagüe, N. 2020). En las diferentes concentraciones de las drogas analizadas

el porcentaje de septos abiertos en el tiempo 0 es similar en ambas especies (Figura 3). Por lo general

Figura 1. Morfología de S. pombe y S. japonicus tras 24 horas en presencia de distintas concentraciones de

Anidulafungina, Caspofungina y Micafungina.


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se observan unos efectos opuestos de los antifúngicos en las dos especies. Así, en presencia de

Anidulafungina a concentraciones bajas apenas hay variación en el porcentaje de septos abiertos

respecto a cerrados en S. japonicus a lo largo de las 3 horas de tratamiento (Figuras 3 y 4). Sin

embargo, en S. pombe se observa una drástica disminución. A concentraciones altas se invierte el

comportamiento siendo S. pombe el que apenas varia, mientras que en S. japonicus disminuye

(Figuras 3 y 4). En el tratamiento con Caspofungina S. japonicus presenta un aumento de septos

abiertos en etapas intermedias de crecimiento, que disminuye a los porcentajes iniciales a las 3 horas

de tratamiento. A las 3 horas de exposición con 2 μg/ml S. pombe presenta muy pocos septos abiertos,

mientras que en 20 μg/ml alcanza un porcentaje de septos abiertos similar a S. japonicus. Destaca una

fuerte señal de CW en los polos de las células de S. japonicus a partir de las 2 horas de crecimiento

en presencia de esta equinocandina (Figuras 3 y 5). Igualmente, el tratamiento de 3 horas con 2 y 20

μg/ml de Micafungina induce un efecto opuesto en las dos especies, con S. japonicus manteniendo

un porcentaje de septos abiertos mucho más alto que S. pombe a lo largo del tratamiento (Figuras 3

y 6). En general S. japonicus presenta un comportamiento similar en presencia de todas las drogas y

a cualquiera de las dos concentraciones, afectándole más la Anidulafungina, mientras que S. pombe

es en presencia de Caspofungina y Anidulafungina donde presenta un comportamiento diferencial

entre concentraciones altas y bajas, desarrollando muchos más septos abiertos en presencia de 20

μg/ml que en presencia de 2 μg/ml. Lo más interesante es que, salvo en condiciones de crecimiento

con Caspofungina a 20 μg/ml, en el resto de las condiciones se observan efectos opuestos en las dos

especies (Figura 3).

3. Comparación de las diferencias fenotípicas de muerte celular en las dos especies a lo largo de

3 horas de crecimiento en presencia de concentraciones letales y subletales de los tres

antifúngicos.

Figura 2. Microscopía de

contraste de fases y de

fluorescencia por tinción

de Calcofluor White (CW)

mostrando muerte celular

(asterisco amarillo), septo

abierto (flecha roja) y septo

cerrado (flecha verde) de S.

pombe y S. japonicus.


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Figura 3. Cuantificación del porcentaje de septos abiertos respecto al número de septos totales (gráficas a la

izquierda) y de muerte celular (gráficas a la derecha) en S. pombe y S. japonicus con diferentes

concentraciones y tiempos en presencia de las diferentes equinocandinas.


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Como se ha explicado previamente en la introducción, en S. pombe la inducción de muerte celular

(con o sin lisis celular) por parte de las equinocandinas a tiempos cortos de exposición depende

principalmente de su efecto en la progresión de la septación. Así, en esta levadura el tratamiento

durante 3 horas con 20 μg/ml de Anidulafungina o Caspofungina induce un bloqueo o enlentecimiento

de la septación y por lo tanto una reducción del porcentaje de la muerte celular debido a la ausencia

Figura 4. Microscopía de contraste de fases y de fluorescencia por tinción con CW de S. pombe y S. japonicus

creciendo con 2 y 20 μg/ml de Anidulafungina. Los paneles superiores muestran ejemplos de las células control

tratadas con el solvente DMSO.


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de separación celular en las tres horas de tratamiento. Por el contrario, una concentración de 2 μg/ml

de los dos antifúngicos permite la progresión de la septación, la formación de septos completos y

muerte por lisis celular al inicio de la separación celular. En el caso de la Micafungina, se observan

septos completos y una muerte celular mayoritaria al inicio de la separación celular tanto con 2 μg/ml

como con 20 μg/ml (San Quirico, E. 2019; Yagüe, N. 2020). De esta forma y debido a los resultados

descritos en el apartado anterior, en este trabajo comparamos los fenotipos de muerte celular en las

dos especies después de 3 horas de exposición a concentraciones letales y subletales de los tres

antimicóticos. Aquí, y de forma similar a lo descrito previamente (Yagüe, N. 2020), observamos que

después de 3 horas de exposición la levadura de fisión S. pombe presenta muerte celular

principalmente con 2 μg/ml de Anidulafungina y Caspofungina, mientras que la Micafungina induce

el fenotipo de muerte celular tanto con 2 μg/ml como con 20 μg/ml (Figura 3). De forma similar a lo

que sucedía con la septación, S. japonicus presenta un fenotipo de muerte celular opuesto a S. pombe,


creciendo con 2 y 20 μg/ml de Caspofungina.


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presentando porcentajes bajos de muerte celular (≈20%) con 2 μg/ml de cada una de los tres

antifúngicos, mientras que el tratamiento con 20 μg/ml induce un porcentaje más alto de muerte

celular, a excepción de la Caspofungina, donde se observa menor muerte celular tanto a altas como a

bajas concentraciones, probablemente debido que S. japonicus presenta la mayoría de los septos

abiertos en ambas condiciones (Figura 3). En definitiva, se aprecia una relación inversa entre el

porcentaje de septos abiertos y la muerte celular, sobre todo en los tratamientos con Anidulafungina

y Caspofungina. Sin embargo, en presencia de Micafungina, tanto a una concentración de 2 μg/ml

como a una concentración de 20 ug/ml, se observa que, a pesar de que el porcentaje de células de S.

japonicus con septos abiertos se mantiene muy alto, el porcentaje de muerte también se mantiene

relativamente alto a lo largo de las 3 horas de tratamiento (Figura 3). Se comprobó que esto es debido

a que en presencia de este antifúngico muchas células se lisan en interfase (alrededor del 51% del

total de células muertas para ambas concentraciones, datos no mostrados), por lo que a pesar de que


creciendo con 2 y 20 μg/ml de Micafungina.


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existen muchas células con septos abiertos y donde el inicio de la separación celular debería estar

bloqueado, la muerte aumenta debido a aquellas células que mueren en interfase. Así, el porcentaje

de células que se lisan en interfase en presencia de Micafungina suele ser mayor en S. japonicus (58%

a 2 μg/ml y 45% a 20 μg/ml, datos no mostrados) que en S. pombe (19% a 2 μg/ml y 36% a 20 μg/ml,

datos no mostrados).

D. Discusión.

Por sus características morfológicas y celulares S. japonicus es un gran modelo para el estudio de

ciertos procesos celulares. Actualmente, todavía se desconoce la composición y estructura de su pared

celular, por lo que este estudio puede comenzar a aportar información útil para investigaciones futuras

sobre la función de los polisacáridos de la pared celular en está levadura. Este estudio pretende

profundizar en el mecanismo de acción de las equinocandinas Anidulafungina, Caspofungina y

Micafungina, que son los únicos fármacos que inhiben la síntesis de la pared celular fúngica y que

han sido aprobados para el tratamiento de ciertas micosis. Pese a que se conoce que estos antifúngicos

inhiben la actividad βGS, no se sabe con exactitud su mecanismo de acción. S. japonicus contiene en

su genoma 4 genes que codifican posibles subunidades catalíticas de la βGS, que presentan un alto

grado de identidad con las proteínas Bgs/Fks de S. pombe y otros hongos. Sin embargo, se desconoce

la función específica de cada una de ellas, así como su papel en la supervivencia celular. Por ello

estudiar y comparar cómo afectan estos compuestos a estas dos levaduras puede aportar luz sobre las

funciones de estas proteínas Bgs en S. japonicus y sobre el mecanismo de acción general de las

equinocandinas.

En S. pombe la ausencia del R-BG debido a Bgs4 o el tratamiento con ciertas concentraciones de las

equinocandinas debilita la pared celular y desencadena principalmente un fenotipo de muerte por lisis

celular en las zonas de crecimiento activo y sobre todo en la zona de división al inicio de la separación

celular. De esta forma, en estudios anteriores se concluyó que en S. pombe aquellas concentraciones

de Caspofungina y Anidulafungina que paran el crecimiento a tiempos largos de tratamiento, no

inducen porcentajes altos de muerte celular a tiempos cortos debido a una parada o enlentecimiento

de la septación y bloqueo de la separación, y lo contrario, aquellas concentraciones que permiten

crecimiento a tiempos largos, no son capaces de bloquear la septación y producen muerte celular al

inicio de la separación celular a tiempos cortos de tratamiento. También se observó que

concentraciones bajas y altas de Micafungina parecían inhibir específicamente a Bgs4, la

Anidulafungina y la Caspofungina iban perdiendo especificad según se aumentaba su concentración.

Así, concentraciones bajas de estás dos drogas parece que afectan principalmente a Bgs4 causando


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lisis celular, mientras que concentraciones altas parece que inhiben a Bgs1, Bgs3 y/o Bgs4

bloqueando la septación e induciendo un porcentaje mucho menor de muerte celular (Yagüe, 2020).

En S. japonicus hemos observado que a tiempos largos de tratamiento está especie es más sensible a

Caspofungina que S. pombe. Concentraciones altas y bajas de esta droga apenas causan muerte celular

a tiempos cortos de tratamiento. Por el contrario, S. japonicus es más resistente que S. pombe a los

otros dos antifúngicos, Anidulafungina y Micafungina que, si producen un porcentaje alto de muerte

celular a tiempos cortos de tratamiento, la Anidulafungina sobre todo con altas concentraciones y la

Micafungina con las dos concentraciones. La razón por la que S. japonicus es más sensible a la

Caspofungina se puede explicar porque tanto a 20 μg/ml como a 2 μg/ml induce una parada de la

septación (de ahí el bajo porcentaje de muerte celular) y de este modo probablemente del crecimiento

cuando se observan las células a tiempos largos de tratamiento. Es lo mismo que ocurre en S. pombe,

pero exclusivamente con concentraciones altas de Caspofungina, ya que con concentraciones bajas sí

que se completan los septos y se produce mucha muerte celular indicativo de crecimiento celular. Por

el contrario, con Anidulafungina (concentraciones altas) y Micafungina (concentraciones bajas y

altas) sí que hay un aumento del porcentaje de muerte celular (ya sea durante la septación o el

crecimiento polarizado en el caso de la Micafungina) lo que sugiere que con estas drogas no se

produce una parada del crecimiento como con la Caspofungina. Además, dado que la Anidulafungina

y la Micafungina a tiempos cortos de tratamiento producen porcentajes más altos de muerte celular

que la Caspofungina en todas las condiciones testadas, podría ser que en S. japonicus estas dos

equinocandinas inhiban principalmente la función de la subunidad Bgs responsable de la integridad

celular en este hongo, que podría ser el ortólogo de Bgs4 si las funciones de ambas proteínas se

mantienen conservadas en ambas especies. Diferentemente, cualquier concentración de la

Caspofungina induce una parada de la septación en células de S. japonicus, por lo que este antifúngico

podría inhibir conjuntamente a varias subunidades Bgs. De acuerdo con esto, la Caspofungina induce

la aparición de células de S. japonicus que presentan una señal muy intensa de CW en los polos de

crecimiento, lo cual podría deberse a una desregulación de la función de Bgs1 durante el crecimiento

polarizado.

En conclusión, todos estos resultados indican que, aunque los tres fármacos pertenecen a la misma

familia, inducen comportamientos diferentes, tanto entre ellos como entre las dos especies estudiadas.

Dado que las subunidades Bgs son proteínas integrales en la membrana celular, podría ser que las

diferencias observadas en la composición de los esfingolípidos de esta estructura entre las dos

especies, y que se ha sugerido afectan a la disposición de las proteínas en la membrana celular,


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pudieran influir en la actividad de los antifúngicos y causar efectos diferenciales entre las dos especies

(Makarova et al., 2020).

E. Conclusiones.

• El comportamiento mostrado durante el crecimiento en presencia de estas 3 equinocandinas difiere

entre las dos especies. S. japonicus es más sensible a la Caspofungina y más resistente a la

Anidulafungina y la Micafungina que S. pombe

• Las equinocandinas inducen efectos opuestos en la progresión de la septación entre las dos

especies, comportamiento inversamente relacionado con el porcentaje de muerte celular mostrado

a las 3h de crecimiento.

• La influencia de la composición de la membrana celular en el efecto de las equinocandinas y la

posible homología de funciones Bgs4 en S. pombe y S. japonicus podrían ser factores clave para

futuros estudios que arrojen luz sobre el mecanismo de acción de las equinocandinas.

F. Materiales y métodos.

1. Microorganismos utilizados.

Durante la realización de este trabajo se han utilizado exclusivamente como modelo de estudio las

estirpes silvestres de las levaduras de fisión S. pombe y S. japonicus:

Estirpe #33: S. pombe 972 h- (origen Juan C. Ribas, Instituto de Biología Funcional y Genómica,

Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Salamanca, España).

Estirpe #6364: S. japonicus matsj-P2028 h- (origen Hironori Niki, Microbial Genetics Laboratory,

Genetic Strains Research Center, National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka, Japón).

2. Medios de cultivo.

Todos los ensayos fueron realizados en el medio no selectivo YES (Yeast Extract with Supplements)

el cual está compuesto por 5 g/L de extracto de levadura, 30 g/L de glucosa y los aminoácidos adenina,

histidina, leucina, lisina y uracilo.

3. Condiciones y estimación del crecimiento.

Las estirpes utilizadas se mantuvieron en medio sólido a temperatura ambiente, siendo sustituidas

cada semana por células nuevas del stock almacenado en glicerol al 30% a una temperatura de -80ºC.


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Todos los ensayos se han realizado partiendo de un preinóculo en medio líquido al que se le han

realizado diluciones continuadas para mantenerlo en fase logarítmica de crecimiento. Solamente se

han utilizado células en fase estacionaria para tomar las fotografías de microscopía de campo claro

que muestran la morfología final en los experimentos cuyo objetivo es analizar la susceptibilidad a

los antifúngicos después de 24 horas de crecimiento. Las células siempre se incubaron a 28°C y el

crecimiento celular se comprobó mediante la lectura de la densidad óptica del cultivo a 600 nm en un

espectrofotómetro Bio-Rad Smart-Spec 3000.

4. Ensayo de susceptibilidad y determinación de la concentración mínima inhibitoria de

Anidulafungina, Micafungina y Caspofungina con cada cepa.

El ensayo se ha realizado tal cual está descrito en (Martins et al., 2011). Partimos de células incubadas

a 28ºC y en fase logarítmica de crecimiento que fueron diluidas para obtener las DO finales de 0.05

o 0.25. A continuación, se distribuyeron 100 μl del cultivo celular en 7 tubos junto con 100 μl del

medio correspondiente al cual se añadió la droga correspondiente (Anidulafungina, Caspofungina o

Micafungina) o el solvente (DMSO) concentrados al doble de la concentración final deseada (0, 1, 2,

4, 10, 20 y 40 μg/ml) para un volumen final de 200 μl. Después de 24 horas de incubación a 28ºC en

tambores giratorios (rollers) se procedió al análisis visual de la turbidez, comparando el crecimiento

con respecto a las células incubadas en ausencia de los antifúngicos a fin de conocer la MIC, es decir,

la concentración mínima de cada antifúngico a la que se observa un bloqueo del crecimiento celular,

correspondiente a una reducción de por lo menos 50% de crecimiento para azoles y equinocandinas

tras 24 horas de incubación a 28 ºC.

5. Técnicas de microscopía de campo claro, de contraste de fases y de fluorescencia.

Las preparaciones analizadas a tiempos largos de exposición (24 horas) a los antifúngicos se

observaron mediante microscopía de campo claro en un microscopio Nikon Eclipse 55i con objetivo

Plan Fluor 40X/0,75 Ph2 DLL. En los experimentos a tiempos cortos de exposición (3 horas) a los

antifúngicos las células fueron observadas mediante microscopía de contraste de fases y fluorescencia

en un microscopio Leica DM RXA con objetivo HCL PL APO 63X/1,40 oil PH3 CS (Leica). Este

microscopio, equipado con los filtros adecuados, permite únicamente el paso de luz de un

determinado rango de longitud de onda, según los espectros de excitación-emisión de los

fluorocromos. La iluminación de las células se realizó gracias a un sistema de epifluorescencia de

fibra óptica, empleando una fuente de iluminación EL6000 (Leica) con una lámpara de mercurio de

100W. Para la captura de imágenes se utilizó una cámara digital modelo DFC350FX y el software de

captación CW4000 cytoFISH (Leica). Los programas utilizados para el procesamiento de las


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imágenes y la cuantificación posterior de la muerte celular y el número de septos, tanto cerrados como

abiertos, son el Photoshop CS5 (Adobe) y el ImageJ 1.49p (U. S. National Institutes of Health). Para

la tinción de la pared se utilizó un stock inicial del fluorocromo CW (Fluorescent Brightener 28,

Sigma-Aldrich) a una concentración de 10 mg/ml. Para realizar la tinción, 500 μl del cultivo con

células en fase logarítmica se concentraron mediante centrifugación en 6-10 μl de CW a una

concentración final de 50 μg/ml. Para realizar las preparaciones se usaron 2 μl de la células

concentradas en CW, colocando el cubreobjetos limpio de impurezas de tal forma que se obtuviera

una única capa de células inmóviles que facilitará la captura y posterior observación morfológica de

las células mediante contrastes de fases o la tinción de CW.

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