Title リン酸欠乏に応答した根毛伸長におけるシロイヌナズナのPIP5K遺伝子の機能解析( Dissertation_全文 )

Author(s) 和田, 悠貴香

Citation 京都大学

Issue Date 2015-03-23

URL https://doi.org/10.14989/doctor.k18840

Right 許諾条件により本文は2015/05/31に公開

Type Thesis or Dissertation

Textversion ETD

Kyoto University

リン酸欠乏に応答した根毛伸長における

シロイヌナズナの PIP5K遺伝子の機能解析

和田 悠貴香

1

目次

目次 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

要旨 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

略語一覧 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

第１章 序論 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 緒言 ............................................................................................................................. 6 １．根毛 ..................................................................................................................... 6

1−1 . 根毛形成に関わる因子 .................................................................................. 8 1-2. シロイヌナズナの PIP5K ........................................................................... 12

２． リン酸欠乏 ....................................................................................................... 17 2-1. リン酸欠乏に応答した根系の形態 .............................................................. 18 2-2. リン酸欠乏シグナル .................................................................................... 20 2-3. リン酸欠乏応答を制御する機構 .................................................................. 22

まとめ ....................................................................................................................... 24

第２章 結果 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 １．リン酸欠乏条件の検討 ....................................................................................... 25 ２．PIP5Kの転写解析および組織化学的解析 ......................................................... 27 ３．PHR1の欠損変異体を用いた解析 .................................................................... 29 ４．PIP5K3および PIP5K4の変異体、二重変異体の表現型解析 ......................... 32 ５．完全相補ラインと限定的な相補ラインの作製と解析 ........................................ 35 ６．長期的なリン酸欠乏に応答した根毛伸長における PIP5K3と PIP5K4の関与 39

第３章 考察 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 １．リン酸欠乏時の根毛伸長の促進における PIP5Kの機能 .................................. 41 ２．リン酸欠乏シグナル .......................................................................................... 46 ３．リン酸欠乏応答と鉄ストレスの関連性 ............................................................. 47 ４．リン酸欠乏に応答した根毛伸長の促進の生理学的意義 .................................... 48 まとめ ....................................................................................................................... 50

第４章 材料と方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 １． 分子生物学的手法 ............................................................................................ 51

1-1. 試薬類 ........................................................................................................... 51

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1-1-1. 酵素 ......................................................................................................................................... 51 1-1-2. 抗生物質 .................................................................................................................................. 51 1-2.ベクター類 ...................................................................................................... 51 1-3. 大腸菌およびアグロバクテリウム株 ............................................................ 51 1-4. 遺伝子組み換え実験の方法 ........................................................................... 51 1-4-1. 基本的な方法 ........................................................................................................................... 51 1-4-2. PCR法 ..................................................................................................................................... 51

２．植物材料 ............................................................................................................ 52 2-1. 生育条件 ....................................................................................................... 52 2-2. 培地 ............................................................................................................... 53 2-2-1. 高リン酸培地 ........................................................................................................................... 53 2-2-2. リン酸欠乏培地 ....................................................................................................................... 53 2-3. 形質転換植物の作成 ..................................................................................... 54

３．プロモーター-GUS融合遺伝子を用いた発現解析 ............................................ 55 3-1. コンストラクトの作製 .................................................................................. 55 3-1-1. PIP5K3p-GUS ......................................................................................................................... 55 3-1-2. PIP5K4p-GUS ......................................................................................................................... 56 3-2. GUS染色の方法 ............................................................................................ 56

４．変異体の表現型解析 .......................................................................................... 57 4-1. T-DNA挿入変異体 ........................................................................................ 57 4-2. 表現型の解析 ................................................................................................ 58

５．リアルタイム PCR解析 .................................................................................... 58 5-1. RNAの抽出 ................................................................................................... 58 5-2. cDNAの合成 ................................................................................................. 58 5-3. RT—PCR解析 .............................................................................................. 59

６．相補ラインの作製 .............................................................................................. 60 6-1. コンストラクトの作製 .................................................................................. 60 6-1-1. PIP5K3gおよび pip5k3gmpの作製 ......................................................................................... 61 6-1-2. PIP5K4gおよび pip5k4gmpの作製 ......................................................................................... 63 6-2. 変異体への導入 ............................................................................................. 65

参考文献 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

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要旨

リン酸は、植物にとって不可欠な三大栄養素の一つである。しかしながら、植物が利用できる形態のリン酸は、土壌中において欠乏しやすいことが知られる。

植物のリン酸欠乏応答で最も顕著なのは根系の形態の変化である。特に、根の

表皮細胞から突出する根毛の発生および伸長が促進される。シロイヌナズナの

根毛伸長は一細胞系での先端成長のモデルとして精力的に研究されてきた。 ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸(PI(4,5)P2)を生成するホスファチジルイノシトール-4-リン酸-5-キナーゼ(PIP5K)の一つである PIP5K3は根毛伸長を正に制御する重要な因子であることを明らかされている。シロイヌナズナ

には PIP5K３が属する B-type PIP5K遺伝子が９つあり、環境刺激に応答に関与することが示唆されている。近年、PHR1 とそのパラログである PHL1 がリン酸欠乏応答遺伝子群をそれらのプロモーター領域に存在する P1BS というcis-配列を介して転写制御することが明らかにされているが、リン酸欠乏時に特異的な根毛伸長の促進を制御する経路は未だ明らかではない。私は、この根毛

伸長の促進の制御に PIP5Kが関わるのではないかと考え、リン酸欠乏に応答した根毛伸長の促進を制御する一連の機構を明らかにすることを目指した。 高リン酸条件とリン酸欠乏条件のそれぞれの発芽後３日の植物の根における

B−type PIP5K遺伝子の転写レベルをリアルタイム PCR(RT-PCR)で調べた。９つの遺伝子のうち PIP5K3と PIP5K4の転写レベルが有意に上昇していた。次に PIP5K3、PIP5K4のそれぞれの上流領域をプロモーター領域とし、β-グルクロニダーゼ(GUS)をコードするレポーター遺伝子を融合した遺伝子を導入した植物を作製し、組織化学的に解析したところ、GUS活性は根毛細胞でみられた。これらの結果から、リン酸欠乏によって、根毛細胞における PIP5K3と PIP5K4の転写が正に制御されることが強く示唆された。 PIP5K3 と PIP5K4 それぞれのプロモーター領域にも P1BS が存在していることから、リン酸欠乏条件下で PHR1 によって直接制御される可能性が高い。このことを確かめるために、リン酸欠乏条件下で発芽後３日の PHR1 欠損変異体(phr1)における PIP5K3と PIP5K4の転写レベルを調べた。phr1の根において、リン酸欠乏による PIP5K3 の転写レベルの上昇は一部抑制され、PIP5K4の転写レベルの有意な上昇はみられなかった。この結果から PHR1 は PIP5K3と PIP5K4のリン酸欠乏に対する応答に関与することが示唆された。 リン酸欠乏条件下での根毛伸長の応答における PIP5K3と PIP5K4の機能を

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解明するために、T-DNAが挿入した変異体；pip5k3と pip5k4を用いた。リン酸欠乏条件下において発芽後 3 日でどちらの変異体も、野生型に比べて根毛が有意に短かったことから、PIP5K3 と PIP5K4 が根毛伸長に関与することが示された。しかし、いずれの変異体においても根毛のリン酸欠乏に対する応答が

残っていた。一方、pip5k3pip5k4二重変異体の根毛は単一の変異体よりも短く、リン酸欠乏に対する応答も有為なレベルではみられなかった。このことから、

幼苗期でのリン酸欠乏に応答した根毛伸長において PIP5K3と PIP5K4が重複的に必要であることが示唆された 上記の結果から PHR1が、PIP5K3と PIP5K4の上流にある P1BSを介して転写を活性化することで、リン酸欠乏に応答した根毛伸長を促進することが考

えられた。この仮説を確かめるために、上流配列とタンパク質をコードする領

域を含むゲノム DNA断片から、PIP5K3gと PIP5K4gを作製するとともに、それらのP1BSを置換した改変遺伝子 pip5k3gmpと pip5k4gmpをそれぞれ作製し、pip5k3と pip5k4にそれぞれ導入した。PIP5K3gと PIP5K4gのそれぞれの遺伝子導入ラインは変異体の欠損の完全な相補を、pip5k3gmp と pip5k4gmp のそれぞれの遺伝子導入ラインはリン酸欠乏に対する応答性を除いた変異体の欠損

の限定的な相補を狙った。さらに、PIP5K3 と PIP5K4 の機能重複による根毛伸長のリン酸欠乏応答性を抑制するために、完全な二重相補ライン

pip5k3pip5k4/PIP5K3gPIP5K4g と限定的な二重相補ライン pip5k3pip5k4/ pip5k3gmppip5k4gmpを作製し、それぞれを解析した。高リン酸条件下ではどちらの二重相補ラインにおいても、野生型と同様の根毛伸長を示した。一方、リ

ン酸欠乏条件下では完全な相補ラインではリン酸欠乏に応答し、根毛の長さも

有意な差を示したが、限定的な二重相補ラインではリン酸欠乏に応答した根毛

伸長を示さなかった。リン酸欠乏条件下で発芽後 3 日のこれらの相補ラインにおける PIP5K3g と PIP5K4g の転写レベルはリン酸欠乏に応答して上昇し、pip5k3gmp と pip5k4gmp の転写レベルに変化がなかった。これらの結果から、幼苗期のリン酸欠乏に応答した根毛伸長に、P1BS を介して PHR1 が PIP5K3と PIP5K4の転写を活性化することが示された。 本研究では、リン酸欠乏に応答した根毛伸長の促進は、リン酸欠乏時に転写

因子 PHR1が PIP5K3と PIP5K4のそれぞれのプロモーター配列中の認識配列を介して転写制御しており、根毛細胞列での PIP5K3と PIP5K4の活性が上昇することで根毛伸長が促進されるという一連の機構を解明した。

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略語一覧 ETC1 ENHANCER OF TRY AND CPC1 GL2 GLABRA2 GR-PHR1 glucocorticoid receptor domain-PHR1 GUS β-glucuronidase HRS1 hypersensitivity to low Pi-eliciited primary root shortening LPR1 LOW PHOSPHATE ROOT1 LPR2 LOW PHOSPHATE ROOT2 P1BS PHR1-binding sequence Phi phosphite PHL1 PHR1 LIKE1 PHR1 PHOSPHATE STARVATION RESPONSE 1 PHT1 PHOSPHATE TRANSPORTER 1 Pi inorganic phosphate PI(4,5)P2 phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate PI4P phosphatidylinositol-4-monophosphate PIP5K phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase PLC phospholipase C RAM root apical meristem RHD2 ROOT HAIR DEFECTIVE 2 RHD6 ROOT HAIR DEFECTIVE 6 RHE root hair-specific cis-elemnts ROS reactive oxygen species RT-PCR real time PCR SCN1 SUPERCENTIPEDE 1 SUMO small ubiquitin-like modifier

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第１章 序論 緒言 リン酸は体内のエネルギー通貨である ATPや、生体膜の主要な構成要素であるリン脂質、核酸などの形で、生物の体内に存在する。リン酸は、植物にとっ

て不可欠な 17の栄養素の一つである。植物は、土壌中のリン酸を根表皮に存在するトランスポーターを使って、体内に取り込む。しかしながら、土壌中の植

物が利用できるリン酸は欠乏しやすいことが知られており、これまでに多くの

リン酸欠乏応答に関する研究が行われてきた。植物のリン酸欠乏応答で最も顕

著なのは根系の形態の変化である。特に、根の表皮細胞から突出する根毛の発

生および伸長が促進される。近年、リン酸欠乏応答を制御する機構が徐々に明

らかになりつつある一方、このリン酸欠乏時に特異的な根毛伸長の促進を制御

する経路は明らかになっていない。 根毛伸長は、一細胞系での先端伸長のモデルとして精力的に研究されてきて

おり、PIP5K3が根毛伸長を正に制御する重要な因子であることが、2008年に示されている。そこで本研究では、このリン酸欠乏時に特異的な根毛伸長の促

進において、PIP5K がその制御に関わるのではないかと考えた。さらに本研究を通してこれまで明らかになっていなかった、リン酸欠乏に応答した根毛伸長

の促進を制御する一連の機構を解明できるのではないかと考えた。 第一項では、本研究に取り組むにあたり基礎となる知識として根毛について、

第二項ではリン酸欠乏について記す。 １．根毛 根毛は根の表皮の一細胞からなる、細い円筒状の構造物である。シロイヌナ

ズナの根毛は直径 7〜10µm、長さが最大で 1mmになる(Ryan et al., 2001)。植物は、根毛をつくり、根の表面積を拡大することによって、土壌中の水や無機

栄養塩の吸収効率を上げている。また、根毛は土壌に植物体を固定するアンカ

ーの役割を果たすとともに、土壌中の細菌や菌類との相互作用の場を提供する

(Belford & Preston, 1961)。根毛は根の表面において周りの土壌環境と接しているので、その影響を受けやすい。土壌環境において、無機栄養塩の濃度は根毛

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形成に影響を与える要因であり、栄養塩が欠乏すると、根毛の密度と長さは増

加することが一般的に知られている。根毛伸長を制御する栄養塩としてよく研

究されているものに、主にリン酸(Bates & Lynch, 1996)、鉄(Schmidt et al., 2000)、マンガン(Ma et al., 2001)などがある。 根毛形成過程は、一世紀以上もの間、生理学的、細胞生物学的、発生生物学

的アプローチによって研究されてきた(Leavitt, 1901; Cormack, 1905; Sinnott & Bloch, 1938)。特に 1980年代に双子葉植物のモデルとしてシロイヌナズナが分子遺伝学的解析に使われ始めて以来、その根毛は詳細な解析を以下の点で可

能にした。まず、シロイヌナズナの根の表皮は観察が容易であり、発芽後３日

以内という早期の根毛細胞の形態を解析できる。次に、シロイヌナズナの根の

表皮では個々の細胞の系譜を完全に追うことができ、一つの根毛細胞列上で根

毛形成過程の異なる段階の細胞を同時に観察できる(Dolan et al., 1993, 1994; Scheres et al., 1994)。さらに、通常の実験条件下において、根毛細胞は植物の生存に必須ではないため、変異体の単離、解析に制約がない。また、シロイヌ

ナズナを用いた研究一般にいえることではあるが、データベースやマイクロア

レイなどこれまでに蓄積されたさまざまな研究資源を利用して、大規模な解析

を行なうことができることも大きな利点である(Grierson & Schiefelbein, 2008)。 現在までに、シロイヌナズナにおいて根毛の細胞分化の運命決定、発生、伸

長に関する多くの変異体が単離され、遺伝子が同定されてきた(Schiefelbein & Somerville, 1990; Schiefelbein et al., 1993; Galway et al., 1994; Masucci & Schiefelbein, 1994, 1996; Grierson et al., 1997; Wada et al., 1997; Lee & Schiefelbein, 1999; Favery et al., 2001; Kwak et al., 2005; Carol et al., 2005)。それらを解析することで、微小管の再構成(Miller et al., 1997; Bibikova et al., 1999; Ketelaar et al., 2002)アクチンフィラメントの再構成(Miller et al., 1999; Braun et al., 1999)、エキソサイトーシス(Preuss et al., 2004; Xu & Scheres, 2005)、エンドサイトーシス(Grebe et al., 2003)、カルシウムイオン (Ca2+)の濃度勾配(Wymer et al., 1997)などの根毛形成への関わりが徐々に明らかになりつつある。 根毛は、細胞の先端のみが伸長する先端成長とよばれる過程で形成される構

造である。先端成長は、極性をもった細胞形態形成の最も単純化された例であ

り、細胞内極性の確立と維持を必要とする。そのため、根毛は同じく、先端成

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長によって形成される花粉管とともに、細胞内極性の確立と維持を制御する機

構の解明という観点からも精力的に研究されている。 1−1 . 根毛形成に関わる因子 シロイヌナズナの根毛形成における形態学的開始点は、バルジとよばれる突

起の形成である(序論-図 1)。シロイヌナズナにおけるバルジ形成は常に、根毛細胞外表の根端に近い位置で起きる。このことから、バルジ形成に先立って、根

毛形成細胞での平面内極性を決める機構が働いていると考えられている。平面

内極性を決定する因子のひとつとして、転写因子 GL2が挙げられており、その下流では、根毛形成を開始するいくつかの遺伝子が働いていることが明らかに

なっている(Masucci & Schiefelbein, 1994; Ohashi et al., 2003)。

序論−図１．シロイヌナズナの主根模式図 緑色で示した表皮細胞列が根毛細胞列であり、青色で示した表皮細胞列が非根毛細胞

列である。根毛細胞列は２列の非根毛細胞列と接して並んでいる。

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バルジ形成の後、根毛の先端成長が始まる。先端に限定した細胞壁や細胞膜合

成のための物質輸送には、細胞骨格の再構築と小胞輸送が関与している(序論−図 2)。根毛の細胞骨格は微小管とアクチンフィラメントから構成される。微小管は先端の狭い範囲で局所的に伸長することによって、根毛伸長の方向を調節

し、極性の制御に関わることが示されている(Miller et al., 1997; Bibikova et al., 1999)。また、短いアクチンフィラメントの束が先端の小胞輸送の盛んな領域に存在することが明らかになっている(Miller et al., 1999; Braun et al., 1999)。このことから、小胞はゴルジから、この短いアクチンフィラメントに沿って、先

端の細胞膜へと輸送されるのではないかと考えられている(Ryan et al., 2001)。

序論−図２．根毛先端成長の模式図 破線の矢印で示したのは、細胞膜や細胞壁の物質輸送の流れである。小胞はゴルジ体

からアクチンフィラメントに沿って、先端領域へと輸送されると考えられている。

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根毛細胞質中に先端をピークとする Ca2+濃度勾配があり、細胞骨格や小胞輸送を空間的に制御すると考えられている。この Ca2+濃度勾配は、細胞膜に局在する Ca2+チャネルを介して細胞外の Ca2+が流入することによってつくられる(Bibikova & Gilroy, 2008)。先端に局在する Ca2+チャネルは、NADPHオキシダーゼ RHD2 が生成する活性酸素種(ROS)によって活性化される(Foreman et al., 2003)。その ROSの集積には RhoGDI(RhoGTPaseGDP解離抑制因子)のひとつである SCN1の機能が必要であることがわかっている(Carol et al., 2005)。さらに、植物の RhoファミリーGTPaseである ROPsは、根毛伸長中に先端の細胞膜に局在すること、および恒常的に活性な ROPs の発現は極性伸長を崩壊させることが示されている(Molendijk et al., 2001; Jones et al., 2002) 。これらのことから、ROP によるシグナル伝達は ROS の集積を介して、Ca2+の濃度勾配を誘導するというモデルが提唱されている(Carol & Dolan, 2006)。 また、根毛の先端成長において、ホスホイノシタイドなどのリン脂質も膜上

で位置特異的なシグナルとしてはたらく重要な制御因子である(序論−図 3)。シロイヌナズナにおいて、ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸(PI(4,5)P2)を生成するホスファチジルイノシトール-4-リン酸-5-キナーゼ(PIP5K)の一つである PIP5K3は、根毛伸長時に先端の細胞膜に局在する。pip5k3変異体は根毛が短い表現型を示し、PIP5K3誘導的過剰発現体では根毛伸長が促進される。これらのことから PI(4,5)P2 は根毛伸長の正の制御因子であり、PIP5K3 がPI(4,5)P2の局在を決定することが示されている(Stenzel et al., 2008; Kusano et al., 2008)。また、ペチュニアやタバコの花粉管では、PI(4,5)P2の分解酵素であるホスホリパーゼ C(PLC)が、先端領域より後方の細胞膜に局在し、PI(4,5)P2を先端部に限定していることが示されている(Dowd et al., 2006; Helling et al., 2006)。このことから、PI(4,5)P2の局在を先端領域に限定することが、根毛伸長にも重要であると考えられる。

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さらに、PI(4,5)P2はバルジ形成の起点となる平面内極性の確立にもその関与が指摘されている。PIP5K3はバルジ形成の前に、その位置の細胞膜に局在することが示されている(Kusano et al., 2008)。一方、植物の RhoGTPaseの一つである ROP2も同様の局在を示すことが明らかになっている(Jones et al., 2002)。これらのことから、根毛形成の全ての過程を通して、ROP を中心とするRhoGTPase シグナル伝達とともに、PI(4,5)P2 シグナルも重要な役割を担っていると考えられる。

序論−図３．ホスファチジルイノシトールの代謝経路 ホスファチジルイノシトー-4-キナーゼ(PI4K)はホスファチジルイノシトー-4-リン酸(PI4P)を、ホスファチジルイノシトール-4-リン-5-キナーゼ(PIP5K)はホスファチジルイノシトール -4,5-二リン酸 (PI(4,5)P2)を生成する。ホスホリパーゼ C(PLC)は

PI(4,5)P2を分解して、1,2-ジアシルグリセロール(DAG)とイノシトール-1,4,5-三リン酸(IP3)を生成する。黄色の Pはリン酸である。

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1-2. シロイヌナズナの PIP5K シロイヌナズナには、PIPK 触媒ドメインをもつタンパク質をコードする遺伝子が 11個存在する(序論−図 4)。

序論−図４．シロイヌナズナの PIP5Kファミリーのアミノ酸配列の比較 シロイヌナズナの 11 個の PIP5K と酵母の Mss4p、ヒトの PIPK1b、PIP5KIIbのそれぞれのアミノ酸配列の全長を、ClustalWを用いてアライメントを行った。 青色の線で示した部分は MORNモチーフであり、８回繰り返す。

1 2

3 4 5 6 7

8

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序論−図４．シロイヌナズナの PIP5Kファミリーのアミノ酸配列の比較 緑色で示した部分はヒトの PIP5KIIbの触媒領域の最初のa-helixである。赤色で示した部分はタンパクキナーゼや typeII PI4Kに保存された CXXGモチーフである。

CXXG motif

αhelix

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アミノ酸配列から、Aタイプ(PIPK10、11)と Bタイプ(PIP5K1〜9)の 2つのサブファミリーに分けられる(Mueller-Roeber & Pical, 2002)。シロイヌナズナのBタイプの PIP5Kは C末端側に、動物や酵母の PIP5Kに保存されている二量体形成ドメインと触媒ドメインをもち、N末端側には、動物や酵母の PIP5Kには存在しないMORNモチーフをもっている(Mikami et al., 1998)。MORNモチーフをもつ PIPK 以外のタンパク質は、ジャクトフィリンと呼ばれており、MORN モチーフを介して細胞膜に結合することが明らかになっている

序論−図４．シロイヌナズナの PIP5Kファミリーのアミノ酸配列の比較 オレンジ色で示した部分は、ヒトの typeIと typeIIの PIPKに保存された activation loopを示す。

Activation loop

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(Takeshima et al., 2000)。このことから、植物の PIP5Kは、MORNモチーフを介して細胞膜に結合し、細胞質側に触媒ドメインを出すことで、細胞膜内葉

で PI(4,5)P2を生成していると考えられる(Mueller-Roeber and Pical, 2002)。 また、シロイヌナズナの Bタイプの PIP5Kは触媒ドメインのアミノ酸配列から、PIP5K1〜3、4〜6、7〜9の 3つのグループに分けることができる(序論−図5)。PIP5K1 と 2、4 と 5、7 と 8 で、それぞれアミノ酸配列の相同性が高く、過去に重複が起きたのではないかと考えられている(Mueller-Roeber and Pical, 2002) 。

序論−図 5．シロイヌナズナの PIP5Kの分子系統樹 アミノ酸配列に基づいた分子系統樹を p-distance法を用いて作製した。

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シロイヌナズナの Bタイプの PIP5Kは、異なる組織での発現や、異なる環境刺激に対する細胞応答時の発現から、植物ホルモンや環境ストレスに対する特異

的な機能を持っていることが示唆されている(Lin et al., 2004)。現在までに明らかになっているそれぞれの PIP5Kの生物学的機能について、以下に示す。 根毛形成の制御に関わる因子として、PIP5K3と PIP5K2が報告されている。PIP5K3は根毛伸長時に先端付近の細胞膜に局在し、細胞内極性の確立と維持に必要であることが明らかになっている。PIP5K3はバルジ形成時に根毛予定位置の細胞膜に局在することから、平面内極性の確立にも関与することが示唆され

ている(Kusano et al., 2008; Stenzel et al., 2008)。PIP5K2はバルジと根毛予定位置の細胞膜上に局在し、RabGTPase のひとつである Rab-E GTPase とMORNモチーフを介して結合することが明らかになっている。Rab-E GTPaseはゴルジに局在するが、細胞膜で PIP5K2 と結合して、小胞輸送の目印になっている可能性が示唆されている(Camacho et al., 2009)。 一方、主根の伸長の制御に関わる因子として、PIP5K9 が報告されている。PIP5K9は糖が調節する主根の伸長を、cytosolic invertase(CINV1)を抑制することでネガティブに制御することがわかっている(Lou et al., 2007)。 また、根毛と同様に先端成長で形成される花粉管において、その伸長の制御に

関わる因子として、PIP5K4と PIP5K5が報告されている。PIP5K4と PIP5K5は、頂部のペクチン分泌を制御することによって花粉管の伸長を調節すること

が示されている(Ischebeck et al., 2008)。 PIP5K6は、シロイヌナズナとタバコの花粉管において、先端の細胞膜上に局在し、クラスリンに依存したエンドサイトーシスを制御していることが報告さ

れている。PIP5K6過剰変異体において、PLC2とホスファチジルイノシトール４リン酸(PI4P)を産生するホスファチジルイノシトール-4 キナーゼ(PI4Kβ2)のそれぞれを過剰発現すると、その花粉管先端領域の細胞膜の変形が部分的に相

補されることが示されている。これらのことから、花粉管の先端領域における

クラスリンに依存したエンドサイトーシスには、PI4P と PI(4,5)P2のバランスが重要であることが示唆されている(Zhao et al., 2010)。 これらのことから Bタイプの PIP5Kはさまざまな組織で発現し、根毛伸長や花粉管伸長などの先端成長の制御機構や、根系の形態形成の制御機構などにお

いて重要な役割を担うことが示唆される。

17

２． リン酸欠乏 植物の生存に不可欠な 17 の栄養素のうち、無機リン酸(Pi)は様々な形態で存在するが、植物には H2PO4-の形で土壌中から取り込まれる(Hawkesford et al., 2012)。Pi の大半は土壌中の Ca2+や Al3+、Fe2+などのカチオンと結合し、難溶性の塩として存在している(Fried & Shapiro, 1961; White & Hammond, 2008)。また、リンはフィチンなどの有機リン酸の形でも存在している(Diest, 1968)。1960年代から、植物が利用できるリン酸の土壌中の濃度は 0.01〜10µMであるという報告がいくつかある(Fried & Shapiro, 1961; Bieleski, 1973)。一方、植物細胞での Piの濃度は 5〜20mMといわれており(Bieleski,1973)、Piを獲得することは植物の生存において、非常に重要である。陸上植物の約 80~90%が共生菌としての菌根菌を持っており、菌根菌を介して Piを可溶化して吸収している(Smith & Read, 2008)。アブラナ科は共生菌根菌を持たず、土壌中にクエン酸やリンゴ酸などの有機酸を放出して周囲の pH を下げる(Jones & Darrah, 1994, 1995; Hoffland et al., 2006)、ホスファターゼを分泌する(Li et al., 2002; Hurley et al., 2010)などして Piを可溶化・吸収している。Piはリン酸トランスポーターを介して、体内に取り込まれると考えられている。シロイヌナズナに

は、主な Piトランスポーターとして酵母の PiトランスポーターPHO84のホモログである PHT1ファミリーがある(Muchhal et al., 1996; Rausch & Bucher, 2002)。PHT1はH+共役型トランスポーターをコードしており(Mitsukawa et al., 1997)、９つの相同遺伝子が全て根で発現することが示されている(Karthikeyan et al., 2002; Mudge et al., 2002; Misson et al., 2004)。このうち PHT1;1とPHT1;4 は特に根毛が発達した領域の表皮に発現することが複数の研究から明らかにされている(Mudge et al., 2002; Karthikeyan et al., 2007)。PHT1のオルソログはシロイヌナズナ以外にジャガイモ(Leggewie et al., 1997)、ホワイトルーピン(Liu et al., 2001)、トマト(Daram et al., 1998)、タルウマゴヤシ(Liu et al., 1998; Xiao et al., 2006)、オオムギ(Huang et al., 2011)、タバコ(Baek et al., 2001)、ハス(Nakamori et al., 2002)、イネ(Paszkowski et al., 2002; Ming et al., 2005)、トウモロコシ(Nagy et al., 2006)、コムギ(Tittarelli et al., 2007)、ポプラ(Loth-Pereda et al., 2011)などで報告されており、植物の Piトランスポーターとして広く保存されている(Nussaume et al., 2011)。

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2-1. リン酸欠乏に応答した根系の形態 シロイヌナズナのリン酸欠乏応答の表現型としては、根系の形態の変化(López-Bucio et al., 2003)やアントシアンの蓄積(Lei et al., 2011)がある。さらに代謝の応答としては、葉などの地上部の生長量の減少(Hermans et al., 2006)、細胞膜での Pi の転用(Nakamura, 2012)、土壌中での有機酸の放出(Jones & Darrah, 1994, 1995; Hoffland et al., 2006)などがある。 リン酸欠乏時における根系の形態の変化は、トウモロコシ(Mollier & Pellerin, 1999; Li et al., 2012)、イネ(Kirk & Van Du, 1997; Shimizu et al., 2004)、ホワイトルーピン(Johnson et al., 1996; Keerthisinghe et al., 1998)などの多くの植物で報告されている。この根系の形態の変化は非常に顕著であり、シロイヌナ

ズナにおいても、その制御機構については精力的に研究されてきた

(López-Bucio et al., 2003; Péret et al., 2011)。根系の形態の変化としては①主根の伸長阻害、②側根形成の促進、③根毛の発生および伸長の促進がある(序論−図6)。

リン酸欠乏時における①主根の伸長阻害と②側根形成の促進という大きな根

序論−図 6．シロイヌナズナのリン酸欠乏時の模式図 左側が通常生育条件下、右側がリン酸欠乏条件下でのシロイヌナズナの様子を示す。

リン酸欠乏時には、獅子尾状の根系形態を呈することが知られる(López-Bucio et al.,2003)。

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系形態の変化はよく研究されてきた(Williamson et al., 2001; López-Bucio et al., 2002; Linkohr et al., 2002)。この主根の伸長阻害は根端分裂組織(RAM)の活性の喪失による(Sánchez-Calderón et al., 2005)。この RAMの活性の喪失は、根端における過度のオーキシンの蓄積を引き起こすと考えられている(Nacry et al., 2005)。また、全身にわたるリン酸欠乏応答の大きさを決定することも示唆されている(Lai et al., 2007)。この主根の伸長阻害には、鉄(Ward et al., 2008)や、活性酸素種(ROS)の蓄積(Chacón-López et al., 2011)が関与していることも示唆されているが、根端分裂組織の活性を制御する詳しい機構は明らかにはな

っていない。 側根形成は発芽７〜１１日後では促進されるが、それ以降は側根の数および

長さの増加は通常時と比べて減少する(Nacry et al., 2005)。Nacryらは、主根や若い側根の根端でのオーキシンの過剰な蓄積によって、側根原基でのオーキシ

ン感受性が変化し、新たな側根形成やそれらの伸長が阻害されるというモデル

を提唱している。このリン酸欠乏時の主根の伸長阻害および側根形成の阻害と

いう根系の形態の変化は、シロイヌナズナの７３の生態型のうち、およそ半数

で認められている。よく研究に利用される Columbia や Landsberg、Wassilewskijaといった生態型では、前述した根系形態の変化が認められている 一方で、異なる形態を示す生態型が 25%ほど存在する(Chevalier et al., 2003)。この異なる戦略を取る生態型と地理的起源との間に明確な相関が見つかってお

らず、今後の研究に期待される。 ③根毛密度の増加と根毛伸長の促進は、特にリン酸欠乏時には顕著である

(Bates & Lynch, 1996; Ma et al., 2001)。播種後１３日、リン酸欠乏条件に移植後９日のものでは根毛細胞列が増加する(Ma et al., 2001)。さらに播種後１４日、リン酸欠乏条件に移植後９日のものでは、非根毛細胞列からも異所的な根毛の

形成がみられる(Müller & Schmidt, 2004)。発芽後６日で、通常生育条件のものよりもリン酸欠乏条件のものは根毛が長く、0.3〜0.5mmに達する。１６日後にはリン酸欠乏条件のものでは 1mmに達し、通常生育条件の約３倍の長さになる(Bates & Lynch,1996)。野生型と根毛形成の変異体を用いた実験から、リン酸欠乏時の Piの取り込みに根毛伸長が重要であることが確かめられている(Bates & Lynch, 2000a,b)。シロイヌナズナ以外でもセイヨウアブラナやトマト、ホウレンソウ(Foehse & Jungk, 1983)でもリン酸欠乏時に根毛の伸長が促進される。またリン酸欠乏時に、根毛ではないが似た形状のクラスター根を形成する植物

20

もある。クラスター根を形成する植物は多く、ヤマモガシ科やマメ科、クワ科、

カバノキ科、モクマオウ科、ヤマモモ科、ウリ科、カヤツリグサ科でみられる

(Vance, 2008)。 2-2. リン酸欠乏シグナル リン酸欠乏を最初に感知するセンサーが何かはわかっていないが、根端が感知に関与することが確かめられている(Svistoonoff et al., 2007)。細胞内の Piの感知に関与するものとして PHOSPHATE DEFICIENCY RESPONSE2(PDR2)と LOW PHOSPHATE ROOT1(LPR)と LPR2が示されている。PDR2は ERで発現する P5-typ ATPaseをコードしており、根端において根の分化を制御する転写因子 SCARECROWの適切な発現を調節している(Ticconi et al., 2009)。マルチ銅オキシダーゼをコードする LPR1と LPR2は分裂組織と根冠を含む根端で発現し、PDR2と遺伝学的に相互作用することが示されている(Reymond et al., 2006)。二重欠損変異体 lpr1lpr2はリン酸欠乏に応答した主根の伸長阻害が起きないが、pdr2 はリン酸欠乏に過敏に応答した表現型を示す(Svistoonoff et al., 2007)。近年、リン酸欠乏シグナルとリン酸欠乏に応答した根毛伸長とを結びつける証拠が徐々に明らかになりつつある。初期の根毛形成を促進する

basic-helix-loop-helix(bHLH)転写因子である ROOT HAIR DEFECTIVE 6(RHD6)は、根毛伸長に関わる別の bHLH 転写因子をコードするRHD6-LIKE4(RSL4)を直接、活性化する。この RSL4 はリン酸欠乏条件下でLPR1 と LPR2 の機能に依存して、転写レベルが正に制御される。複数の遺伝子欠損変異体を用いた遺伝学的解析から、この RSL4 が調節するリン酸欠乏に応答した根毛伸長は RHD6 の機能とは独立していることが示唆されている(Yi et al., 2010)。これらのことから、RSL4は LPRを介してリン酸欠乏シグナルとつながり、リン酸欠乏に応答した根毛伸長の制御に関与することが考えられる。

しかし、リン酸欠乏に応答して直接 RSL4 を活性化させる因子については未だ明らかではない。別の研究では、植物のホメオドメイン転写因子をコードする

ALFIN-LIKE 6/PI DEFICIENCY ROOT HAIR DEFECTIVE 2(AL6/PER2)が根毛伸長を含むリン酸欠乏時の様々な応答に関与することが報告されている

(Chandrika et al., 2013)。Chandrika らによって、AL6欠損変異体の根を用いた全ゲノム転写解析から、根毛の分化において細胞パターン形成時に働くMYB

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転写因子をコードするENHANCER OF TRY AND CPC 1(ETC1)がAL6/PER2の下流で活性化されることが示された。これらのことから、AL6/PER2 からのリン酸欠乏シグナルは ETC1 を介して、根毛伸長を促進させることが示唆されるが、AL6/PER2が ETC1を直接制御するかどうかは、明らかではない。 リン酸欠乏を伝えるシグナルとしていくつかの低分子化合物が示唆されてい

る。多くの研究から、外来性のフォスファイト(Phi)；PO3-は取り込まれた後、体内で輸送されリン酸欠乏シグナル伝達に関わることが示されてきた。Phi がPi(H2PO4-)のアンタゴニストとして作用することから、Piそのものが Pi欠乏を伝えるシグナル分子としての側面を持つことが考えられている(Varadarajan et al., 2002)。 Pi 欠乏時に篩管でのシュートから根へのショ糖流入が増加し、その直後に根の表現型の変化が起きることから、リン酸欠乏応答とショ糖との間に何らかの

相関があるのではないかと考えられてきた(Liu et al., 2005)。ショ糖が Piトランスポーターをコードする PHT1;4と PHT3;1の発現を誘導すること(Lejay et al., 2008)や、 Pi 欠乏時に根毛の形成と伸長を促進することが示されている(Jain et al., 2007)。 近年、いくつかの miRNA 分子がリン酸欠乏時に誘導されることがわかってきた。特に miRNA399 が Pi ホメオスタシスの制御に関わることが多くの研究から示されている。miRNA399のシグナル伝達経路の詳細については後述する。 複数の研究からリン酸欠乏に応答した根毛伸長の制御にオーキシン(Bates & Lynch.,1996)やジベレリン(Jiang et al., 2007)、エチレン(Zhang et al., 2003; He et al., 2005; Lei et al., 2011)などの植物ホルモンが関与することが示唆されている。しかしながら、リン酸欠乏シグナルと植物ホルモンのシグナルがどの

ように結びつき、根毛伸長を制御するのかということについては、全貌は未だ

明らかではない。

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2-3. リン酸欠乏応答を制御する機構 シロイヌナズナにおいてリン酸欠乏応答を制御する機構で中心的に機能してい る の は 、 Chlamydomonas reinbardtii の 転 写 因 子 PHOSPHATE STARVATION RESPONSE1(PSR1)の相同遺伝子 PHR1 である(序論−図 7)。PHR1は R2R3 MYBタンパクであり、リン酸欠乏応答性の遺伝子群の転写を制御している(Rubio et al., 2001)。PHR1とそのホモログ PHL1はターゲットとな る 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 配 列 中 の P1BS と 呼 ば れ るcis-element(GNATATNC)を介して、転写を制御している(Rubio et al., 2001; Bustos et al., 2010a)。PHR1 はリン酸欠乏時に、microRNA の一種であるmiR399の転写量を上げる(Fujii et al., 2005)。miR399は低分子 RNA干渉により、PHOSPHATE2(PHO2)の転写を抑える(Fujii et al., 2005; Bari et al., 2006)。PHO2はユビキチン結合 E2酵素をコードしており、 Piの輸送や再配置に関与するタンパク質の活性を負に制御している。miR399 により PHO2 の転写が抑えられると、リン酸トランスポーターPHT1;8とPHT1;9が機能する(Aung et al., 2006; Bari et al., 2006)。さらに、PHR1 は non-coding RNA をコードするIPS1/AT4の転写量も上げる(Rubio et al., 2001)。この IPS1の non-coding RNAは miR399 と部分的に相補する 22 ヌクレオチドを保存しており、miR399 のPHO2 へのターゲティングを模倣するような動きで干渉する(Franco-Zorrilla et al., 2007)。この模倣的にターゲティングする機構をもつことで、体内の Piホメオスタシスを制御していると考えられている(Chiou & Lin, 2011)。 PHR1は SUMO E3リガーゼである SIZ1によって、SUMO化される。SIZ1欠損変異体では、PHR1 の下流にある遺伝子群の転写レベルが変化しており、強調されたリン酸欠乏応答を示すことから、SIZ1が PHR1の SUMO化を介して、リン酸欠乏応答の制御に関与することが示唆されている(Miura et al., 2005)。 miR399と IPS1はシロイヌナズナ以外にも、イネ(Dai et al., 2012)、セイヨウアブラナ(Pant et al., 2008)、カボチャ(Pant et al., 2008)、オオムギ(Huang et al., 2011)、インゲンマメ(Valdés-López et al., 2010)にも保存されていることから、植物のリン酸欠乏応答に共通の機構だと考えられる。

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序論−図 7．シロイヌナズナのリン酸欠乏応答制御機構 青色の線は転写後制御を示し、黒色の線は転写制御を示す。SIZ1 による PHR1 の

SUMO 化は負にも正にも働くことで、PHR1 の機能を調節していると考えられている。

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まとめ 上記で述べたように、根毛の機能としては地中への植物体の固定、水や無機

栄養塩の取り込み効率の上昇、共生細菌などとの相互作用の場などが挙げられ

る。また、根毛は土壌環境に応じて伸長が促進され、特にリン酸欠乏時に顕著

に伸長が促進される。その生理学的意義は、リン酸の取り込み効率を上げるた

めではないかと考えられている。しかし、根毛伸長の促進とリン酸の取り込み

効率を上げることとを、直接結びつける証拠は得られていない。さらに、リン

酸欠乏時の根毛伸長を促進する制御機構も明らかではない。 一方、PIP5K3とその生成物である PI(4,5)P2は根毛形成過程を通して、根毛伸長を制御する因子のひとつであることが明らかになっている。また、シロイ

ヌナズナに 9つ存在する Bタイプの PIP5Kは、さまざまな環境刺激に応じて、その機能が使い分けられているのではないかと考えられている。これらのこと

から、リン酸欠乏時に特異的な根毛伸長の促進においても、PIP5K が根毛伸長の制御に関与するのではないかと考えた。 そこで、本研究ではリン酸欠乏時に根毛伸長が促進されることに着目して、

リン酸欠乏時に特異的な PIP5Kの機能の解明を目的とした。 Bタイプ PIP5Kがリン酸欠乏時に特異的な根毛伸長の制御において、どのように寄与しているのか明らかにする。これにより、植物の環境応答、すなわち

環境刺激からリン脂質シグナルを介して形態形成の制御につながる分子機構の

解明を目指す。

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第２章 結果 １．リン酸欠乏条件の検討 序論で述べたように、リン酸欠乏時には根系全体の形態が変化する。そのた

め、根毛とはあまり関連のない組織の機能不全を通して、リン酸欠乏が間接的

に根毛伸長に影響している可能性がある。この間接的な影響による複雑さを避

けるために、高リン酸条件(Pi:1mM)とリン酸欠乏条件(Pi:3µm)のそれぞれに野生型のシロイヌナズナを播種し、発芽後間もない幼苗、すなわちリン酸欠乏条

件下でも植物体自体の生育状態が正常な段階で観察した。発芽後３日では、既

に報告されたように(Williamson et al., 2001; Nacry et al., 2005; Thibaud et al., 2010)、地上部および主根において、リン酸欠乏による生育への影響は確認されなかったが(結果—図１a、b)、リン酸欠乏に応答した根毛伸長は明らかに確認された(結果−図１c)。一方、発芽後７日では RAM領域の減少を伴う根の生育への影響が確認され、リン酸欠乏に応答した根毛伸長は発芽後３日よりも顕著

であった(結果−図 1c、d)。

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結果−図 1. 高リン酸条件下およびリン酸欠乏条件下における野生型植物 (a-c) リン酸(Pi)条件；1 mM および 3 µM 下で発芽後 3日、７日生育させた野生型

植物の全体 (a), 地上部 (b), 根 (c) を示した。Bar = 5 mm (a), 1 mm (b), and 0.5

mm (c). (d) 高リン酸条件およびリン酸欠乏条件下で発芽後 3日、７日生育させた植物の根毛

の長さ(y軸)、根端からの距離(x軸)をそれぞれプロットした。Pi条件；1 mM を赤で、 3 µMを青で示した。

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２．PIP5Kの転写解析および組織化学的解析 次に、高リン酸条件とリン酸欠乏条件のそれぞれの発芽後３日の植物の根に

おける B−type PIP5K遺伝子の転写レベルをリアルタイム PCR(RT-PCR)で調べた。リン酸欠乏のポジティブコントロールである IPS1(Martín et al., 2000)と同様に、９つの遺伝子のうち PIP5K3と PIP5K4の転写レベルが有意に上昇していた(結果−図 2a)。次に PIP5K3、PIP5K4のそれぞれの上流領域をプロモーター領域とし、β-glucronidase(GUS)をコードするレポーター遺伝子を融合した遺伝子を導入した植物を作製し、組織化学的に解析した(PIP5K3p-GUS および PIP5K4p-GUS)。PIP5K3p-GUSと PIP5K4p-GUSのそれぞれの GUS活性は根毛細胞でみられた(結果−図 2b)。高リン酸条件下に比べてリン酸欠乏条件下では、PIP5K3p-GUSの根毛細胞におけるGUS活性が明らかに高くなっていた。PIP5K4p-GUSの根毛細胞におけるGUS活性は高リン酸条件下とリン酸欠乏条件下で、あまり差はみられなかったが、それは低い GUS活性によるものと考えられた (結果−図 2b)。PIP5K3p-GUSおよび PIP5K4p-GUSのどちらも、高リン酸条件下とリン酸欠乏条件下で、根における GUS活性のパターンの変化はみられなかった。これらの RT-PCR と GUS の組織化学的解析の結果から、リン酸欠乏によって、根毛細胞における PIP5K3と PIP5K4の転写が正に制御されることが強く示唆された。

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結果−図 2. 発芽後 3日の野生型植物の根での PIP5Kの発現 (a) RT-PCRによる発芽後 3日の野生型植物における PIP5K および IPS1の転写解析

Pi;3 µM 下における PIP5K3の転写量の平均値を１とした時の相対的な転写レベル(平均値 + S.D., n = 3)を示した。 Pi;1 mM を白で、Pi;3 µM をグレーで示した。 ＊は Pi;1 mM 下のレベルと比較して有意に上昇したことを示した (p < 0.02, Student’s t-test)。 (b) PIP5K3と PIP5K4のプロモーター活性の組織化学的解析 Pi; 1 mM 下および 3 µM下で発芽後 3日生育させた PIP5K3p-GUSと PIP5K4p-GUSにおけるそれぞれの GUS活性を示した。 Bar = 0.5 mm.

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３．PHR1の欠損変異体を用いた解析 リン酸欠乏応答を制御する機構のうち、中心的に働くのは転写因子 PHR1 とそのパラログである PHL1である(Bustos et al., 2010b)。前述したが、PHR1はリン酸欠乏応答転写因子群のプロモーター領域に存在する P1BS とよばれる特定の配列(CNATATNG)を認識し、それらの遺伝子群の転写を制御している。PIP5K3 と PIP5K4 それぞれのプロモーター領域にも P1BS が存在していることから、リン酸欠乏条件下で PHR1 によって直接制御される可能性が高い。このことを確かめるために、リン酸欠乏条件下で発芽後３日の PHR1 欠損変異体(phr1:SALK_067629)におけるPIP5K3とPIP5K4の転写レベルを調べた。phr1の根において、リン酸欠乏による PIP5K3の転写レベルの上昇は IPS1と同様に一部抑制され、PIP5K4 の転写レベルの有意な上昇はみられなかった(結果−図3)。この結果から PHR1は PIP5K3と PIP5K4のリン酸欠乏に対する応答に関与することが示唆され、PHL1は phr1の根で見られた残存する PIP5K3のリン酸欠乏応答に寄与していると考えられる。これまでに、リン酸欠乏条件下で 12日間生育させた phr1は根毛伸長に影響が出ることが報告されている(Bustos et al., 2010)。本研究で用いた高リン酸条件およびリン酸欠乏条件で 3日間生育させた野生型と phr1は外見上、区別がつかないが(結果—図４)、phr1においてリン酸欠乏に応答した根毛伸長は、部分的に抑制されていた(結果−図６)。これらのことから、PHR1 は幼苗期でもリン酸欠乏に対する根毛伸長の応答を調節することが示唆された。

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結果−図 3. PIP5K3と PIP5K4の転写レベルのリン酸欠乏応答における PHR1遺伝子の寄与 発芽後 3 日の野生型植物(wt)および phr1 の根における PIP5K3 と PIP5K4、 IPS1の転写レベルを RT-PCR で解析した結果を示した。Pi;1 mM 下における転写量の平

均値を１とした時の相対転写レベルを、1 mMを白、3 µM をグレーで示した。(平均値 + S.D., n = 3) ＊は Pi;1 mM 下のレベルと比較して有意に上昇したことを示した (p < 0.02, Student’s t-test)。

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結果−図４. 発芽後 3日の phr1の表現型 高リン酸条件下(Pi;1 mM)およびリン酸欠乏条件下(Pi;3 µM)における発芽後 3日の野生型植物(wt)と phr1の(a)地上部、(b)根をそれぞれ示した。 Bar = 1 mm (a) 、 0.5 mm (b).

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４．PIP5K3および PIP5K4の変異体、二重変異体の表現型解析 リン酸欠乏条件下での根毛伸長の応答における PIP5K3と PIP5K4の機能を解明するために、T-DNA が挿入した変異体；pip5k3(SALK_000024)とpip5k4(SALK_001138)を用いた。pip5k3 は PIP5K3 の発現が有意に低下したアリル(hypomorphic allele)、pip5k4は PIP5K4の機能欠失アリル(null allele)であると考えられている(Lee et al., 2007; Kusano et al., 2008)。そこでRT-PCR 解析から、pip5k3 と pip5k4 それぞれの機能的な遺伝子の転写レベルが非常に低く、検出できないことを確かめた(結果−図５)。リン酸欠乏条件下において発芽後 3 日でどちらの変異体も、野生型に比べて根毛が有意に短かったことから、PIP5K3と PIP5K4が根毛伸長に関与することが示された。しかし、いずれの変異体においても根毛のリン酸欠乏に対する応答が残っていたことか

ら、機能重複が示唆された(結果−図６)。そこで pip5k3pip5k4 二重変異体を作成し、解析した。二重変異体の根毛は単一の変異体よりも短く、リン酸欠乏に

対する応答も有為なレベルではみられなかった(結果−図６)。このことから、幼苗期でのリン酸欠乏に応答した根毛伸長において PIP5K3と PIP5K4が重複的に必要であることが示唆された。

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結果−図５. 野生型遺伝子および変異遺伝子由来の機能的な転写量の比較 (a) PIP5K3および PIP5K4の構造の模式図。 コーディング領域を箱、非コーディング領域を線でそれぞれ示した。垂直方向の矢印で pip5k3 (SALK_000024)およびpip5k4 (SALK_001138)への T-DNA挿入を示した。水平方向の矢印で RT-PCRに用いたプライマーの位置を示した。 (b)RT-PCRによる転写量の定量。(a)の水平方向の矢印で囲まれた領域を含む、野生型遺伝子 (PIP5K3と PIP5K4)と変異遺伝子 (pip5k3 と pip5k4)の機能的な転写量を示した。高リン酸条件下で発芽後７日生育した野生型植物(wt)および変異体の根の RNAを用いた。相対転写レベルは UBC21で標準化し、野生型に対する変異体の転写レベルを示した(平均値 + S.D.)。

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結果−図６. 発芽後 3日の植物における根毛伸長 (a) 発芽後 3日の野生型植物(wt)と phr1、 pip5k3、 pip5k4、 pip5k3pip5k4の根毛の測定値を示した(それぞれ５個体以上)。 Pi;1 mM 下の平均値を白で、Pi;3 µM下

のものをグレーで示した(平均値 + S.D., n=100) 。＊は Pi;1 mM 下の根毛長と比較して有意に上昇したことを示した (p < 0.01, ANOVAと Tukey’s HSD test)。 #は同じリン酸条件下での野生型植物の根毛長と比較して有意に減少したことを示し

た (p < 0.01, ANOVA と Tukey’s HSD test)。+は同じリン酸条件下での pip5k3および pip5k4 の根毛長と比較して有意に減少したことを示した(p < 0.01, ANOVA とTukey’s HSD test)。

(b)発芽後 3日の野生型植物(wt)と phr1、 pip5k3、 pip5k4、 pip5k3pip5k4の根を示した。Bar = 0.2 mm.

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５．完全相補ラインと限定的な相補ラインの作製と解析 これまでの結果から PHR1が、PIP5K3と PIP5K4の上流にある P1BSを介して転写を活性化することで、リン酸欠乏に応答した根毛伸長を促進すること

が示唆された。この仮説を確かめるために、上流配列とタンパク質をコードす

る領域を含むゲノム DNA断片から、PIP5K3gと PIP5K4gを作製し、それらのP1BSを置換した改変遺伝子 pip5k3gmpと pip5k4gmpをそれぞれ作製し、pip5k3と pip5k4にそれぞれ導入した(結果−図７a)。PIP5K3gと PIP5K4gのそれぞれの遺伝子導入ラインは変異体の機能欠失の完全な相補を、pip5k3gmp とpip5k4gmp のそれぞれの遺伝子導入ラインはリン酸欠乏に対する応答性を除いた変異体の機能欠失の限定的な相補を狙った。完全な相補ラインである

pip5k3/PIP5K3g と pip5k4/PIP5K4g の根毛は、高リン酸条件下およびリン酸欠乏条件下の両方で野生型と同様の根毛伸長を示したことから、導入遺伝子は

高リン酸条件下での根毛伸長と、リン酸欠乏に対する根毛伸長の応答において

正常に機能することが確かめられた (結果−図７b、c)。限定的な相補ラインである pip5k3/pip5k3gmpと pip5k4/pip5k4gmpは高リン酸条件下では野生型と同様の根毛伸長を示したことから、改変遺伝子が高リン酸条件下の根毛伸長におい

て正常な機能をもつことが確かめられた。しかし、リン酸欠乏条件下において

は、いずれの限定的な相補ラインもそれぞれが対応する相補ラインに比べて、

有意に根毛が短かったことから、改変遺伝子はリン酸欠乏に対する応答性に欠

陥があることが示された(結果−図７b、c)。ちょうど pip5k3と pip5k4の根毛のように、どちらの限定的な相補ラインもリン酸欠乏に対する応答が残ることか

らも、根毛伸長応答において PIP5K3と PIP5K4が重複的に機能するという考えを支持している。 次に、pip5k3/PIP5K3g と pip5k4/PIP5K4g、pip5k3/pip5k3gmpと pip5k4/ pip5k4gmp を交配し、完全な二重相補ライン pip5k3pip5k4/PIP5K3gPIP5K4gと限定的な二重相補ライン pip5k3pip5k4/ pip5k3gmppip5k4gmp をそれぞれ作製した。高リン酸条件下ではどちらの二重相補ラインにおいても、野生型と同

様の根毛伸長を示した(結果−図７b、c)。しかし、リン酸欠乏条件下において、完全な相補ラインはリン酸欠乏に応答した根毛伸長を示したが、限定的な二重

相補ラインではリン酸欠乏に応答した根毛伸長を示さなかった (結果−図７b、c)。リン酸欠乏条件下で発芽後 3日のこれらの相補ラインにおける PIP5K3gと

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PIP5K4gの転写レベルはリン酸欠乏に応答して上昇し、pip5k3gmpとpip5k4gmp

では転写レベルに変化がなかった(結果−図８)。これらの結果から、幼苗期のリン酸欠乏に応答した根毛伸長に、それを介して PHR1が PIP5K3と PIP5K4の転写を活性化すると想定される、P1BSが必要であることが強く示唆された。

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結果−図７. 発芽後 3日の完全相補ラインおよび限定的相補ラインの根毛伸長 (a) pip5k3および pip5k4変異体に対する完全相補および限定的相補の導入遺伝子の構造を模式的に示した。コーディング領域を箱、非コーディング領域を線でそれぞれ

示した。垂直方向の矢印で pip5k3 (SALK_000024)および pip5k4 (SALK_001138)への T-DNA挿入を示した。それぞれの P1BSの位置と 改変した配列を下線で示した。

(b)発芽後 3日の野生型植物(wt)と完全相補ライン(pip5k3/PIP5K3g、 pip5k4/PIP5K4g、 pip5k3pip5k4/PIP5K3gPIP5K4g) 、 限定的相補ライン(pip5k3/pip5k3gmp、pip5k4/pip5k4gmp、pip5k3pip5k4/pip5k3gmppip5k4gmp) の根毛の測定値を示した(それぞれ５個体以上)。 Pi;1 mM 下の平均値を白で、Pi;3 µM下のものをグレーで示した(平均値+ S.D., n=100) 。＊は Pi;1 mM 条件の根毛長と比較して有意に上昇したことを示した (p < 0.01, ANOVA と Tukey’s HSD test)。#は Pi; 3

µM条件下のそれぞれ対応する相補ラインの根毛長と比較して有意に減少したことを示した (p < 0.01, ANOVAと Tukey’s HSD test)。+は同じリン酸条件下での pip5k3および pip5k4の根毛長と比較して有意に減少したことを示した(p < 0.01, ANOVAとTukey’s HSD test)。 (c) 発芽後 3日の野生型植物(wt)と完全相補ライン、 限定的相補ラインの根を示した。

Bar = 0.2 mm.

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結果−図８.完全相補ラインと限定的相補ラインの根における転写解析 発芽後 3日および７日の野生型植物(wt)の根における PIP5K3と PIP5K4の転写レベル、完全相補ライン(pip5k3pip5k4/PIP5K3gPIP5K4g) 、 限定的相補ライン(pip5k3pip5k4/pip5k3gmppip5k4gmp) の根におけるそれぞれの導入遺伝子(PIP5K3gと PIP5K4gおよび pip5k3gmpと pip5k4gmp ）の転写レベルを RT-PCRによって解析した結果を示した。Pi;1 mM下における転写量の平均値を１とした時の相対転写レベ

ルを、1 mMを白、3 µM をグレーで示した。(平均値 + S.D., n = 3) ＊は Pi;1 mM 下のレベルと比較して有意に上昇したことを示した (p < 0.02, Student’s t-test)。

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６．長期的なリン酸欠乏に応答した根毛伸長における PIP5K3と PIP5K4の関与 発芽後の長期のリン酸欠乏に応答した根毛伸長に、PIP5K3 と PIP5K4 が関与するのか確かめるために、リン酸欠乏条件下で発芽後 3日から 10日間生育させた野生型および pip5k3pip5k4、pip5k3pip5k4/PIP5K3gPIP5K4g、pip5k3 pip5k4/pip5k3gmppip5k4gmp を 観 察 し た 。 pip5k3pip5k4 と pip5k3 pip5k4/pip5k3gmppip5k4gmp において発芽後５日以前はリン酸欠乏に応答した根毛伸長は認められなかったが、発芽後７日以降はいずれのラインでもリン酸

欠乏に応答した根毛伸長が認められた(結果−図９)。発芽後７日では、リン酸欠乏による pip5k3gmpと pip5k4gmpの転写レベルの正の制御はなかった(結果−図８)。これらのことから、長期のリン酸欠乏に応答した根毛伸長において PIP5K3と PIP5K4以外の制御経路が存在することが示唆された。

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結果−図９. 長期のリン酸欠乏条件下で生育させた植物の根毛伸長 (a)発芽後 3日および 5日、７日、10日の野生型植物(wt)と pip5k3pip5k4、, pip5k3pip5k4/PIP5K3gPIP5K4g、pip5k3pip5k4/pip5k3gmppip5k4gmpの根毛の測定値を示した(それぞれ３個体以上)。Pi;1 mM 下の平均値を白で、Pi;3 µM下のものを

グレーで示した(平均値 + S.D., n=50). ＊は Pi;1 mM 下の根毛長と比較して有意に増加したことを示した(p < 0.05, ANOVA と Tukey’s HSD test)。 (b) 発芽後７日の野生型植物(wt)と pip5k3pip5k4、, pip5k3pip5k4/PIP5K3gPIP5K4g、pip5k3pip5k4/pip5k3gmppip5k4gmpの根を示した。Bar = 0.2 mm.

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第３章 考察 １．リン酸欠乏時の根毛伸長の促進における PIP5Kの機能 リン酸欠乏に応答した根系の形態変化に関して多くの研究が行われており、

リン酸欠乏の根毛伸長への影響は複数のシグナリング経路から及ぶことがわか

っている。全ての経路にはそれぞれ生物学的意味があると考えられるが、その

間の相互作用が１つ１つの経路に対する理解を妨げている。特に、リン酸欠乏

による RAMの消耗のような厳しい影響は根毛伸長に間接的に影響を与える。多くのリン酸欠乏応答に関する研究では、播種後 10〜14日の植物を用いた例がほとんどであるが、側根の形成は発芽後７日に始まるので、播種後 10〜14日には既に多くの側根が形成されている (Nacry et al., 2005)。この時期の側根原基では主根と同様にオーキシン極大ができ、植物体内のオーキシンフローは大きく

変化していると考えられる。オーキシンレベルの上昇によって、根毛伸長は促

進されることは複数の研究から明らかになっていることから、側根形成が盛ん

な播種後 10 〜14 日では、リン酸欠乏シグナリングのアウトプットとしての根毛伸長の促進をみているのか、オーキシンフローの変化を介した根毛伸長の促

進をみているのかを区別することができないと考えられる。この複雑さを避け

るために、リン酸欠乏の影響が地上部や根の生育にまだ顕われていない発芽後 3日の若い植物を使った。結果で示したように発芽後 3 日の根毛細胞において、PIP5K3 と PIP5K4 はリン酸欠乏に応答し、根毛伸長へ至るリン酸欠乏シグナルはこれらの遺伝子を介していることが明らかになった。 発芽後５日以前の段階では、野生型配列を有する導入遺伝子 PIP5K3g とPIP5K4g によってリン酸欠乏に応答した根毛伸長における pip5k3pip5k4二重変異体の欠陥を相補できたが、P1BS を欠いた改変遺伝子 PIP5K3gmp とPIP5K4gmpの導入では相補できなかった。このことは P1BS を介した PIP5Kの転写活性化が、根毛伸長応答に必要であることを強く示唆する。興味深いこ

とに、PIP5K3 の上流配列に存在する P1BS、および根毛での発現に特異的なcis-element(RHE)(Kim et al., 2006)は、アブラナ科ゲノムにおいて保存されている(考察−図１)。養分吸収の戦略において、アブラナ科の植物は急速な根の成長と根毛の伸長による根圏形成を主に用い、菌根菌などとの共生を行わないと

提唱されてきた(Francis & Read, 1994; Lambers et al., 2008)。アブラナ科のリ

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ン酸欠乏に応答した根毛伸長の促進において、特に根系の発達が未成熟な幼苗

期の根毛伸長において、PIP5K3は重要な役割を担う可能性がある。 発芽後５日以降の長期にわたるリン酸欠乏条件下では、pip5k3pip5k4も明らかな根毛伸長の促進を示した。その理由として、本研究で用いた pip5k3の変異アリル pip5k3-3(SALK_000024)は null ではなかったために、長期のリン酸欠乏条件下で、残された PIP5K3 機能のリン酸欠乏応答が有意に働いた可能性が考えられる。しかしながら、タンパク質産物が in vitroで酵素活性がないことが示されている別の変異アリル pip5k3-4(SALK_026883) (Stenzel et al., 2008)を用いても、発芽後 3日と７日の pip5k3および pip5k3pip5k4の両方で pip5k3-3と同様のリン酸欠乏に応答した根毛伸長がみられた(考察−図２)。このことから、PIP5K3や PIP5K4以外の PIP5K遺伝子もしくは、他のホスホイノシタイド代謝に関わる酵素遺伝子が、長期のリン酸欠乏の応答に関与する可能性も考えら

れる。リン酸欠乏条件下で発芽後７日の野生型植物の根において、PIP5K6の転写産物レベルが PIP5K3のものと同様に上昇している(考察−図３)。このことは長期のリン酸欠乏に対する根毛伸長応答における PIP5K3と PIP5K6の機能重複を示唆している。PIP5K6 の遺伝子内および上流の遺伝子間領域には P1BSは存在しないが、他の研究グループのマイクロアレイ解析から、７日間生育し

た根において、PHR1および PHL1の機能に依存して PIP5K6の転写産物レベルがリン酸欠乏に応答することが示されている (Bustos et al., 2010のトランスクリプトームデータから)。しかしながら、PIP5K の生成物である PI(4,5)P2は同じ細胞内であっても独立したプールが互いに異なる機能を持つ可能性がある

(Heilmann & Heilmann, 2013)ことなどから、リン酸欠乏応答における PIP5K遺伝子の機能重複に関しては更なる詳細な解析が必要である。

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考察−図１ . アブラナ科の PIP5K3 オルソログの上流に保存されたcis-elements (a)アブラナ科における AtPIP5K3オルソログの配列情報 National Center for Biotechnology Information (NCBI: Bethesda, USA) の

GenBankから、シロイヌナズナ(Arabidopsis thliana)とミヤマハタザオ(Arabidopsis lyrata)、ルベラナズナ(Capsella rubella)、アブラナ(Brassica rapa)、Thellungiella parvula,、Thellungiella halophilaの配列を入手し、PIP5K3オルソログの上流遺伝子の終止コドンからPIP5K3の開始コドンまでの遺伝子間配列のアライメントを示した。 保存されたヌクレオチドをグレーで、cis-elements (RHE と P1BS)を黒でそれぞれ示した。

(b) RHEと P1BSの共通配列

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考察−図２. pip5k3-3と pip5k3-4の表現型の比較 (a) pip5k3-3 (SALK_000024)と pip5k3-4 (SALK_026683)における PIP5K3へのT-DNA挿入箇所を模式的に示した。 コーディング領域を箱、非コーディング領域を線でそれぞれ示した。垂直方向の矢印で T-DNA挿入位置を示した。

(b)発芽後 3日および 7日の野生型植物(wt)と pip5k3-3、pip5k3-4、pip5k3-3pip5k4、pip5k3-4pip5k4の根毛の測定値を示した(それぞれ３個体以上)。 Pi;1 mM 下の平均値を白で、Pi;3 µM下のものをグレーで示した(平均値 + S.D., n=50) 。＊は Pi;1 mM

下の根毛長と比較して有意に上昇したことを示した (p < 0.05, ANOVAと Tukey’s HSD test)。いずれの条件でも pip5k3-3 と pip5k3-4 の間でも、pip5k3-3pip5k4とpip5k3-4pip5k4の間でも有意差(p < 0.05, ANOVAと Tukey’s HSD test) はみられなかった。 (c) 発芽後 3日の野生型植物(wt)と変異体の根の写真を示した。Bar = 0.2 mm.

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考察−図 3. 発芽後７日の植物の根における PIP5K遺伝子群の発現 RT-PCR による発芽後７日の野生型植物の根における PIP5K 遺伝子群および IPS1の転写レベルの解析結果を示した。Pi;3 µM 下における PIP5K3の転写量の平均値を１とした時の相対的な転写レベル(平均値 + S.D., n = 3)を示した。 Pi;1 mM を白で、Pi;3 µM をグレーで示した。＊は Pi;1 mM 下のレベルと比較して有意に上昇したこ

とを示した (p < 0.02, Student’s t-test)。

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２．リン酸欠乏シグナル 長期にわたるリン酸欠乏条件下では、PHR1や PHL1以外の他の転写因子が根毛伸長応答に関与する可能性がある。10日生育した根の皮層細胞と根毛細胞を含む表皮細胞で HRS1 のプロモーターがリン酸欠乏によって活性化されることが示されている(Liu et al., 2009)。融合転写因子 GR-PHR1を使ったマイクロアレイ解析から、HRS1は PHR1の直接の標的遺伝子であることが示されている(Bustos et al., 2010のトランスクリプトームデータから)。RSL4は、その転写が LPR1と LPR2の下流シグナルで活性化されることが知られており、リン酸欠乏が起こす主根の伸長阻害を介した根毛伸長応答に寄与する可能性がある

(Reymond et al., 2006; Svistoonoff et al., 2007; Yi et al., 2010)。AL6/PER2もまた、ETC1 を介して長期のリン酸欠乏への応答に関与する可能性がある(Chandrika et al., 2013)。 植物のリン酸欠乏応答は全身的（systemic）、あるいは局所的（local）なリン酸感知システムのどちらかによって調節され、植物全体のリン酸状態または局

所的な組織におけるリン酸供給のそれぞれを反映することが知られている

(Ticconi & Abel, 2004; Doerner, 2008; Thibaud et al., 2010)。リン酸供給の局所的な変化は、植物のリン酸状態と関係なく根毛伸長に影響するので、局所的

なリン酸感知システムが、リン酸欠乏に応答した根毛伸長を調節していると考

えられている(Bates & Lynch, 1996)。一方、リン酸欠乏への全身的および局所的な転写応答に関する遺伝子発現解析の結果は、P1BSに富んだプロモーター領域をもつ遺伝子が全身的な転写応答を示す傾向を明らかにしている(Thibaud et al., 2010)。また、P1BS を多数含む人工プロモーターも全身的に制御された(Bustos et al., 2010)ことなどから、PHR1は全身的なシグナルの下流で機能することが示唆される。しかしながら、これらの状況はリン酸欠乏に応答した根

毛伸長に PHR1 の機能が関わらないことを意味するわけではない。実際、phr1phl1 二重変異体の研究から、根毛伸長応答において PHR1 と PHL1 の機能重複が明らかになっている(Bustos et al.,2010)。少なくとも、根毛細胞において PHR1が PIP5K3と PIP5K4を直接、活性化することから、PHR1の下流については局所的現象であると考えられる。最近、シロイヌナズナの核タンパ

クである SPX1がリン酸依存的に PHR1と結合することで PHR1の阻害因子として働くことが報告された(Puga et al., 2014)。それによると、高リン酸濃度条

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件下ではSPX1はPHR1と結合してPHR1の転写活性化能を抑えるのに対して、低リン酸濃度条件下では SPX1と PHR1の相互作用が低下し、PHR1は標的遺伝子を活性化する。また、イネにおいても SPX1 とそのパラログである SPX2が、リン酸依存的にシロイヌナズナ PHR1のオルソログである PHR２の活性を阻害することが明らかにされている(Wang et al., 2014)。このリン酸濃度に依存した SPX1による PHR1活性の阻害は細胞自律的であり、植物に広く保存されたリン酸感知メカニズムの一つだと示唆される。これらの知見と本研究の結果

から、リン酸欠乏の感知から根毛伸長を促進する一連のプロセスが、根毛細胞

において細胞自律的であると推定できる。 ３．リン酸欠乏応答と鉄ストレスの関連性 低リン酸濃度条件下で主根の伸長阻害が起きることが知られてきた。この主

根の伸長阻害は植物組織におけるリン酸欠乏によるものだと長年考えられてき

たが、鉄の毒性に対する感受性が関与することが Ward らによって明らかになった。Ward らは、リン酸が全く存在せず、鉄が高濃度(100mM)で存在する場合には主根の著しい伸長阻害が起きるが、リン酸が全く存在せず、鉄が低濃度

(10mM)で存在する場合は主根の伸長阻害が起きないことを実験的に証明した(Ward et al., 2008)。リン酸欠乏時に鉄の生体利用能が増加し細胞内で毒性を示した結果、根端分裂組織の活性が阻害されて根毛の長さに影響を与えると考え

られる(Ward et al., 2008; Abel, 2011)。 鉄ストレスは、根毛の発生および伸長の制御にも関与する。Müllerらによってリン酸が十分に存在し(2.5mM)、鉄が存在しない条件下では、根毛の密度および長さが増加することが示されている。若い個体(播種５日後)においても鉄不在時やリン酸不在時での根毛伸長が起こることから、初期の発達段階でこれらの

環境刺激が感知されることが示唆されている(Müller & Schmidt, 2004)。 本研究では、鉄イオンの過多が根系形態に与える影響を最小限にするために、一般に用いられるMS培地での鉄イオンの濃度の 2分の 1(50mM)にして、実験を行った。このMüllerらの実験条件(Fe-EDTA:40 mM, Pi;0)と同様の条件下で、リン酸欠乏時の根毛伸長の促進を確認できた。

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４．リン酸欠乏に応答した根毛伸長の促進の生理学的意義 序論でも述べたが、土壌中で植物が吸収できるとされる H2PO4-(Pi)のリン酸イオン形態は 0.01〜10mMとわずかにしか存在しない (Fried & Shapiro,1961; Bieleski,1973)。土壌中の Pi の大半が、金属イオンと結合して難溶性のリン酸塩として存在するか、糖などの有機物と結合して有機リン酸として存在してい

るからである。植物はクエン酸やリンゴ酸などの有機酸を排出して周辺の pHを下げたり、ホスファターゼを分泌するなどして、吸収できる形態である Piを獲得していると考えられている。根毛形成に大きな欠陥のある変異体をリン酸欠

乏条件下で生育させると、通常生育条件下で生育させた場合よりも生長量が減

少することが報告されている(Bates & Lynch, 2000b)。このことから、リン酸欠乏時の根毛の発生および伸長の促進は、根の表面積を拡大し、Pi を吸収しやすくするためだと考えられていた。しかし、Piは根の表皮細胞膜上に局在する Piトランスポーターによって体内に取り込まれる。したがって、根毛の数や長さ

を増やしても、その細胞膜状に局在する高親和性トランスポーターの量が増え

なければ、Pi を体内に取り込むことはできない。そして、土壌中にトランスポーターが吸収できる Piが存在しなければ、トランスポーターを増やしても吸収することはできない。植物にとって、リン酸を獲得するには、何よりも利用で

きる形態の Piを増やすことが最重要課題だと考えられる。この考えを支持する知見がいくつか得られている。Al2O3P2O5や FePO4などの難溶性リン酸塩をビーズに吸着させた栄養塩が含まれない土壌で、ホワイトルーピンを生育させた

実験ではクエン酸やリンゴ酸が分泌され、Pi が取り込まれることが明らかになっている(Shane et al., 2008)。リン酸が欠乏している実際の土壌を用いた実験からも、クエン酸に代表される有機酸による Pi の可溶化が示唆されている(Oburger et al., 2010)。 近年、土壌中の養分を吸収する際には、根毛の密度よりも長さを増大させる

方が効率的であるというモデルが提唱されている(Zygalakis et al., 2011)。これらのことから、私はリン酸欠乏に応答した根毛伸長の促進はリン酸吸収の場を

増やすためではなく、より広範囲で pHの低い領域を効率的に形成することで、難溶性リン酸塩や有機リン酸から Piを取り出しやすくしているのではないかと考えている(考察−図４)。本研究で作製したリン酸欠乏に応答した根毛伸長のみが失われた限定的な二重相補ライン(pip5k3pip5k4/pip5k3gmppip5k4gmp)と野

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生型植物を、難溶性リン酸塩を含む培地で生育させ、生長量に差が生じるか確

かめる実験を考えた。しかし、pip5k3pip5k4/pip5k3gmppip5k4gmp は幼苗期のみで、リン酸欠乏に応答した根毛伸長が抑制されることが確かめられたので、

前述の仮説を証明する実験として成立しなかった。Pi 吸収の効率化において、リン酸欠乏に応答した根毛伸長が担う役割の解明は、今後の研究に期待される。

考察−図 4. リン酸欠乏に応答した根毛伸長による根圏の形成 黄色の丸は Pi、灰色の丸は金属イオンを示す。左側では、Pi が金属イオンと結合して難溶性リン酸塩として存在しており、Piを取り込むことができない状況を想定している。右側では、pHの低い根圏を形成することで Piを難溶性リン酸塩から取り出す

ことができる状況を想定している。

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まとめ 本研究では、リン酸欠乏に応答した根毛伸長の促進は、リン酸欠乏時に転写

因子 PHR1が PIP5K3と PIP5K4のそれぞれのプロモーター配列中の認識配列を介して転写制御しており、根毛細胞列での PIP5K3と PIP5K4の活性が上昇することで根毛伸長が促進されるという一連の機構を解明した(考察−図５)。リン酸欠乏に応答した根毛形態の変化と Pi吸収への寄与を実験的に証明できれば、今後の育種開発において重要な知見となると考えられる。肥料としてのリンは

リン鉱石から生産されるが、リン鉱石の採掘のピークは 2030年と推定されており、50〜100 年後枯渇するだろうと警鐘が鳴らされている(Elser & Bennett, 2009; Cordell et al., 2009)。本研究は今後の育種開発において、リン酸欠乏時の根毛形態の寄与という新しい観点からのアプローチの基礎となると考えている。

考察−図 5. リン酸欠乏に応答した根毛伸長促進の制御機構 発芽間もないシロイヌナズナでは、リン酸欠乏を感知すると PHR1によって PIP5K3と PIP5K4のプロモーター領域の P1BSを介して、転写が促進される。このことにより、根毛細胞における PIP5K3と PIP5K4の発現レベルが上昇し、その結果、根毛伸

長の促進が起きると考えられる。

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第４章 材料と方法 １． 分子生物学的手法 1-1. 試薬類 1-1-1. 酵素 各種制限酵素はタカラバイオ、TOYOBO、New England Biotechの製品を使用した。耐熱性DNAポリメラーゼはTakara Taq（タカラバイオ）、rTaq(TOYOBO)、KOD(TOYOBO)および KOD-plus-(TOYOBO)を使用した。 1-1-2. 抗生物質 抗生物質は Ampicillin(SIGMA)、Kanamycin(ナカライテスク)、Hygromycin B、(Invitrogen)、Vancomycin(SIGMA)を使用した。 1-2.ベクター類 pUC19(タカラバイオ)、pBI101(CLONTECH)、pHPT121(pBI121 を改変したもの)を使用した。 1-3. 大腸菌およびアグロバクテリウム株 大腸菌は DH5α(F－ φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rK －,mK ＋) phoA supE44 thi -1 gyrA96 relA1 F－ λ－)(Invitrogen)を使用した。アグロバクテリウムは LBA4404株を形質転換植物作製のために使用した。 1-4. 遺伝子組み換え実験の方法 1-4-1. 基本的な方法 アガロース電気泳動、ゲルからの DNA断片の切り出しおよび精製、プラスミドの大腸菌への導入については、Molecular Cloning 3rd ed. (Sambrook etal., 2001)に記載�