Sod
2
SUPEROKSID-DISMITAZA (SOD) Rastvori: 1. 0,02 M HCl 1,72 ml konc. HCl dH 2 O do 1L 2. 0,05 M NaHCO 3 - /CO 3 2- pufer pH 10,25 sa 1x10 -4 M EDTA 4,2 g NaHCO3 500 µl 200 mM EDTA dH 2 O do 750 ml Dotitrovati pH na 10,25 (početni je oko 8,5) sa NaOH. Dopuniti do 1l, sterilno profiltrovati. 3. 0,01 M Epinefrin u 0,02 M HCl 45,8 mg epinefrina 0,02 M HCl do 25 ml Priprema uzorka: -200 µl eritrocita je lizirano sa 3 zapremine hladne vode (pi). Ostavljeno 15 minuta da stoji u frižideru. 1. Pripremljen ragens za ekstrakciju koji sadrži etanol i hloroform u odnosu 62,5:37,5 (V:V) i držan na 4 ºC (31,3 ml etanola + 18,7 ml hloroforma) 2. Dodaje se 400 µl ovog reagensa na 250 µl lizata u ependorficu. Vortex 30 sekundi, centrifugiranje 3000 g (7000 rpm) na 4 ºC, 5 minuta. 3. Sakupiti gornji vodeni sloj. 4. Ekstrakt se može čuvati u frižideru na 2-8 ºC 24h. U suprotnom zamrznuti. Merenje V 0 - brzine autooksidacije epinefrina ( A=485 nm)
description
Sod protokol
Transcript of Sod
SUPEROKSID-DISMITAZA (SOD)
Rastvori:
1. 0,02 M HCl1,72 ml konc. HCldH2O do 1L
2. 0,05 M NaHCO3-/CO3
2- pufer pH 10,25 sa 1x10-4M EDTA4,2 g NaHCO3500 µl 200 mM EDTAdH2O do 750 mlDotitrovati pH na 10,25 (početni je oko 8,5) sa NaOH.Dopuniti do 1l, sterilno profiltrovati.
3. 0,01 M Epinefrin u 0,02 M HCl45,8 mg epinefrina0,02 M HCl do 25 ml
Priprema uzorka:
-200 µl eritrocita je lizirano sa 3 zapremine hladne vode (pi). Ostavljeno 15 minuta da stoji u frižideru.
1. Pripremljen ragens za ekstrakciju koji sadrži etanol i hloroform u odnosu 62,5:37,5 (V:V) i držan na 4 ºC (31,3 ml etanola + 18,7 ml hloroforma)
2. Dodaje se 400 µl ovog reagensa na 250 µl lizata u ependorficu. Vortex 30 sekundi, centrifugiranje 3000 g (7000 rpm) na 4 ºC, 5 minuta.
3. Sakupiti gornji vodeni sloj.
4. Ekstrakt se može čuvati u frižideru na 2-8 ºC 24h. U suprotnom zamrznuti.
Merenje V0- brzine autooksidacije epinefrina ( A=485 nm)
1. 1950 µl NaHCO3-/CO3
2-, podesiti nulu.2. 50 µl epinefrina, promešati, meriti.
Merenje VSOD- stepen inhibicije autooksidacije adrenalina SOD-om
1. 1850 µl NaHCO3-/CO3
2- pufera2. 50 µl smeše uzorka i pufera:
10 µl uzorka + 40 µl pufera20 µl uzorka + 30 µl pufera itd. Promešati i podesiti nulu.
3. 50 µl epinefrina.Promešati i meriti A na 485 nm.
