Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 477-83

Tema de inters

Guas del laboratorio parascreening, diagnstico y monitoreode la injuria heptica*

EDITORD. Robert DufourChief, Pathology and Laboratory MedicineService, VA Medical Center, Washington, DC;Professor of Pathology, George WashingtonUniversity School of Medicine.

GUIDELINES COMMITTEEJohn A. Lott. Professor of Pathology, The OhioState University College of MedicineFrederick S. Nolte. Associate Professor ofPathology and Laboratory Medicine, EmoryUniversity School of MedicineDavid R. Gretch. Associate Professor ofLaboratory Medicine, University of WashingtonSchool of MedicineRaymond S. Koff. Professor of Medicine,University of Massachusetts Medical CenterLeonard B. Seeff. Senior Scientist, Hepatitis CPrograms, National Institute of Diabetes,Digestive, and Kidney Diseases, NationalInstitutes of Health; Professor of Medicine,Georgetown University School of Medicine.

* Este documento ha sido traducido con per-miso de la Nacional Academy of Clinical Bio-chemistry (NACB), Washington, DC. LaNACB no se hace responsable de la exacti-tud de la traduccin. Los puntos de vistapresentados son los de los autores y no ne-cesariamente los de la NACB.

Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana

Incorporada al Chemical Abstract Service.

Cdigo bibliogrfico: ABCLDL.

ISSN 0325-2957

SECCIN II

Pruebas de cidos nucleicos ymarcadores serolgicos en hepatitis

Virus de la Hepatitis A (HAV)

El virus de la Hepatitis A es un virus a ARN de la familia de los picor-navirus. El HAV se disemina por va oral-fecal, y causa injuria hepticaluego de un perodo de incubacin de unas pocas semanas. El ARNHAV se presenta en materia fecal y plasma antes del perodo de mani-festacin de los sntomas clnicos, pero desaparece rpidamente luegode la manifestacin clnica de la enfermedad. Anticuerpos IgM paraHAV (anti-HAV IgM) estn presentes tpicamente al comienzo de laaparicin de los sntomas, y permanecen detectables por un promediode 3 a 6 meses luego de la infeccin (rango < 30-420 das, con un 13,5%de positivos ms all de 4 meses) (128). El anti-HAV total persiste porlargos perodos luego de la infeccin, tal vez durante toda la vida (129);la seroprevalencia aumenta con la edad, con un rango del 11% en ni-os menores de 5 aos a 74% en los mayores de 50 aos (130). La va-cuna contra HAV induce anti-HAV detectable dentro de las 2 a 4 sema-nas de la dosis inicial de vacunacin (131) y el anticuerpo permanecedetectable a los 5 aos en el 99% de los individuos con vacunacincompleta (132). No hay disponibles en el mercado tests para la detec-cin de antgeno o cido nucleico para HAV. Los mtodos de inmu-noensayo e inmunoelectromicroscopa han sido usados para detectarel antgeno de HAV en filtrados de materia fecal y en otros especme-nes y se han utilizado en ensayos para ARN de HAV se han utilizado pa-ra documentar estudios epidemiolgicos y de investigacin.

Recomendaciones: Se debe utilizar IgM anti-HAV para el diagnstico dela infeccin aguda por HAV (IB).

La medicin de anticuerpos totales debe ser usada para determinar elestado inmune para HAV (IB).

The National Academy of Clinical Biochemistry

Virus de la Hepatitis B (HBV)

El virus de la Hepatitis B es un virus a ADN del gru-po de los hepadnavirus. Estos virus se replican forman-do un ARN intermediario, que es copiado usando laenzima transcriptasa reversa para regenerar las hebrasdel ADN. El HBV es transmitido por intercambio defluidos corporales; se transmite principalmente a travsde suero, relaciones sexuales y transmisin de la madreal nio (generalmente ocurre luego del nacimiento).Mientras la infeccin de HBV es tpicamente agudacon recuperacin completa en adolescentes y adultosinmunocompetentes, la infeccin crnica tambinpuede ocurrir. Aproximadamente 1-3% de los adultossanos, 5-10% de los adultos inmunocomprometidos y90% de los neonatos expuestos al HBV desarrollan unainfeccin crnica.

El HBV produce varios antgenos proteicos que pue-den inducir una respuesta de anticuerpos. El ms abun-dante, el antgeno de superficie HBV (HBsAg) es produ-cido en exceso junto con partculas virales, pero tambinse puede presentar cuando HBV ADN es integrado den-tro del ADN celular y ya no produce viriones infecciosos.El antgeno core HBV y los antgenos e (HBcAg y HBeAg)son producidos por la misma regin gentica en el vi-rus y se encuentran en partculas infecciosas. En la Fi-gura 6 se observa el curso serolgico y clnico tpico deuna infeccin aguda por HBV (133).

El anticuerpo IgM para HBcAg (anti-HBc) es gene-ralmente considerado de mxima utilidad para el diag-nstico de la hepatitis B aguda (134). Tambin puedeestar presente en ttulos bajos y fluctuantes en pacien-tes con hepatitis B crnica, particularmente cuando lospacientes tambin tienen positivos en plasma HBeAg,HBV ADN o episodios de aumentos de ALT indicandoreactivacin de la enfermedad (135). El anti-HBc totalpersiste tpicamente durante toda la vida (136). HBsAg se presenta en forma caracterstica y anti-HBs estausente en la presentacin en pacientes con la infec-cin HBV aguda, pero ambos estn ocasionalmente au-sentes (134), dejando a la IgM anti-HBc como el nicomarcador de infeccin (ventana core). Resultados po-sitivos aislados para anti-HBc tambin pueden repre-sentar un bajo nivel de viremia, prdida del anti-HBsmuchos aos despus de la recuperacin, o un resulta-do falso positivo (136-138). Hay dos factores asociadoscon la probabilidad de resultados falsos positivos: bajonivel de reactividad de anti-HBc y ausencia de anti-HBsusando inmunoensayos sensibles. En varios estudios,virtualmente ninguno con bajos niveles de anti-HBc ynegatividad para anti-HBs mostr una respuesta anam-nsica para una inyeccin nica de vacuna con HBsAg,mientras que 35-40% de aquellos con dbil positividadpara anti-HBc y 50-80% de aquellos con alto nivel deanti-HBc, respondieron (137)(139) (140). La convale-cencia de la infeccin es indicada por la prdida de

HBsAg y el desarrollo de anti-HBs. Concomitantemen-te, HBsAg y anti-HBs pueden ser vistos en un nmerode pacientes con infeccin crnica de HBV. Este fen-meno parece ser particularmente comn en pacientesque se mantienen con hemodilisis (7%) comparadocon otros pacientes positivos para HBsAg (2%) (141).La presencia de anti-HBs en estos grupos no parece te-ner importancia clnica. Patrones de marcadores sero-lgicos en varias formas y fases de la infeccin por HBVse muestran en la Tabla IX (142).

Ejemplos de discordancia o perfiles de hepatitisno comunes se pueden observar en la Tabla X.

Los tests con resultados discordantes deben ser re-petidos y testeados para marcadores serolgicos adi-cionales que deben ser indicados para establecer eldiagnstico correcto (143).

En pacientes con presencia crnica de HBsAg,HBcAg y anti-HBe son pruebas tiles para determinar elestado de la infeccin. HBV ADN se puede presentar enlos hepatocitos en dos formas: como virus replicante,conduciendo a la produccin de partculas infecciosas,o integrado al ADN del husped, en una forma no re-plicativa. HBeAg slo es producido como parte de virus

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Marcador Incubacin Infeccin Post Infeccin Vacuna- aguda infeccin crnica cin

HBsAg +a + - + - HBcAg + + - +/- - HBV ADN + + -b +/- -IgM anti-HBc - + - +/-c - Total - + + + -Anti-HBe - - +/- +/-d -Anti-HBs - - + - +

Tabla IX. Diagnstico serolgico de la infeccin viral de HepatitisB (modificada a partir de la referencia 142).

a+ detectable; - no detectable; +/- puede ser detectable.b Sin mtodos PCR (mtodos no basados en PCR).c Puede ser positivo en 10-15% de los pacientes con reactivacin de la

infeccin.d Pacientes con infeccin HBV crnica generalmente tienen HBeAg o Anti-

HBe detectables.

Recomendaciones: Tests para HBsAg, anti-HBs, y anti-HBcdeben ser realizados para el diagnstico de infeccin HBVactual o pasada. En caso de sospecharse infeccin aguda porHBV se deben utilizar test para IgM anti HBc (IB).

HBeAg y anti-HBe no son requeridos para el diagnsticode Hepatitis B aguda o para la evaluacin de rutina del es-tado HBV (IIIB, E).

En pacientes con resultados discordantes, los tests deben serrepetidos; resultados discordantes persistentes deben serevaluados por un hepatlogo o gastroenterlogo (IIIB).

replicativo, y as puede ser utilizado para determinar in-directamente el estado de la produccin de ADN HBVdel hepatocito. En el paciente positivo para HBeAg, laprdida de HBeAg y la seroconversin a anti-HBe posi-tivo estn tpicamente asociadas con la prdida de ADNHBV circulante por mtodos distintos de la reaccinPCR, normalizacin de aminotransferasas y mejora-miento histolgico, implicando un estado de replica-cin bajo y mejoramiento clnico significativo (144).Las medidas de ADN HBV son ms tiles para seguir apacientes con hepatitis B crnica que reciben terapiaantiviral. La prdida de ADN HBV detectable por unmtodo de hibridizacin en fase de solucin es un indi-cador ms temprano de respuesta a la terapia antiviral

que la prdida de HBcAg (143). Varios ensayos para ladeteccin de ADN HBV estn disponibles; los lmites desensibilidad estn dados en la Tabla XI. Generalmenteno hay estandarizacin de los ensayos del ADN HBV en-tre laboratorios.

El ADN HBV circulante puede ser detectado pormtodos sensibles como PCR en un alto porcentaje depacientes con HBsAg negativo y anti-HBs, anti-HBe, yanti-HBc positivos, meses o aos posteriores a la recu-peracin clnica de una hepatitis aguda (145) o hepa-titis crnica (146). La significancia no es clara, ya quela mayor parte del ADN viral se encuentra en comple-jos inmunes (145), y puede no representar al genomaentero. Un estudio reciente de 7 dadores hepticospotenciales que eran HBsAg negativos y anti-HBs y an-ti-HBc positivos encontr formas replicantes del virusdentro de los hepatocitos en 6 de los 7 individuos(147). Similarmente, en pacientes con hepatitis C cr-nica, el ADN viral HBV es encontrado comnmente(usando mtodos PCR sensibles) tanto en hgado co-mo en suero, particularmente en pacientes con anti-HBc como un marcador aislado HBV (137) (138). Es-tos estudios sugieren que muchos pacientes que sesupuso se haban recuperado de HBV realmente tie-nen niveles bajos pero controlados de replicacin viralpersistentes por muchos aos luego de la recupera-cin clnica. No est claro qu nivel de viremia ADNHBV debe ser usado para considerar a un pacientecurado de la infeccin HBV para propsitos clnicos.

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Guas del laboratorio para screening, diagnstico y monitoreo de la injuria heptica 479

Figura 6. Curso de los marcadores serolgicos en la infeccin agudade hepatitis B con resolucin. Luego de la infeccin, el primer mar-cador de infeccin que aparece es el antgeno de superficie (HBsAg),de 1 a 3 meses luego de la exposicin. Aproximadamente 1-2 mesesms tarde, la primera respuesta de anticuerpos son anticuerpos IgMpara el antgeno core de la hepatitis B (IgM anti-HBc), generalmen-te alrededor del tiempo de incremento en las actividades de AST yALT en plasma. En el momento de aparicin de la ictericia, la mayo-ra de los pacientes tienen ambos HBsAg y IgM anti-HBc. Con la eli-minacin del virus el anti-HBs se hace detectable. En un pequeoporcentaje de pacientes, suele haber un perodo de transicin en elque no se pueden medir ni HBsAg ni anti-HBs. El nico marcadorcomnmente presente en este tiempo es IgM anti-HBc, un patrn de-nominado la ventana core. Aunque no se ilustra en este diagrama,estos pacientes generalmente son positivos para anti-HBe, si un se-gundo test es necesario para confirmar el resultado de anti-HBc. Conla recuperacin de la infeccin HBV, anti-HBc y anti-HBs persistendurante toda la vida en la mayora de los individuos.

HBsAg positive / anti-HBc negativo. HBsAg, anti-HBs, y anti-HBc positivos. Solamente anti-HBc positivo. Anti-HBs positivo slo en paciente no inmunizado. HBsAg negativo / HBcAg positivo. Positivo para HBcAg y anti-HBc. Anti-HBc total negativo / IgM anti-HBc positiva.

Tabla X. Perfiles discordantes o poco usuales de hepatitis B querequieren evaluacin posterior.

Tabla XI. Lmites de deteccin inferiores para ensayos de HBV ADN

a Los resultados pueden tambin ser expresados como pg/mL de ADN HBVdividiendo por 2.85 * 105.

Mtodo Lmites de deteccin (copias/mL)a

Captura hbrida 3,0 x 106

ADN branched 0,7 x 106

Hibridizacin lquida 4,0 x 104

Reaccin de polimerasa en cadena (PCR) 102 - 103

Recomendaciones: HBeAg y anti-HBe son tiles para mo-nitorear pacientes con positividad crnica HBsAg (IB).

El ensayo cuantitativo de ADN HBV debe ser usado paramonitorear la respuesta a la terapia antiviral (IIB).

Un estndar internacional para los tests de ADN HBV de-be ser establecido y los fabricantes deben calibrar sus kitscontra ese estndar.

Los tests para ADN HBV deben ser cuantitativos y se debedefinir la utilidad clnica del rango dinmico para los testsde ADN HBV (IIIB).

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Lmitededetec-cin

Valo

r rf

elat

ivo

Anti-HBs

Anti-HBc Total

Sntomas

Aumentode ALT

IgManti-HBc

HBsAg

Virus de la Hepatitis C (HCV). El virus de la hepa-titis C (HCV) es un virus de ARN de la familia flaviviri-dae. Hasta ahora el HCV no ha sido cultivado; fue re-conocido por deteccin de secuencias virales a travsde la tecnologa recombinante, y el genoma entero hasido ahora secuenciado. Al momento que este docu-mento se escribe, no hay ensayos comerciales disponi-bles para detectar los antgenos HCV, aunque ha sidodesarrollada un ensayo altamente sensible para la pro-tena del core HCV (148).

La mayora de los tests para HCV miden anticuerposcontra HCV. Los tests de screening para la infeccin porHCV detectan anticuerpos contra las protenas delHCV, aparentemente en un promedio de 80 das (ran-go 33 - 129) luego de la infeccin usando enzimoin-munoensayos de segunda generacin anti-HCV (EIA-2) (149). Los pacientes inmunocomprometidos yaquellos sometidos a dilisis raramente pueden care-cer de anticuerpos detectables por EIA-2 a pesar deotra evidencia de infeccin viral activa (150). Un EIAde tercera generacin (EIA-3) para anti-HCV ha sidoaprobado por la FDA para el screening de productos he-mticos; contiene antgenos reconfigurados del core yNS3 y un antgeno adicional (NS5) no encontrado porEIA-2. EIA-3 provee un ligero aumento en la sensibili-dad pero menor especificidad que EIA-2, y acorta eltiempo de deteccin de anticuerpos a un promedio de7 - 8 semanas luego de la infeccin (151). En los pa-cientes que han eliminado el HCV de la circulacin,los ttulos de anti-HCV caen gradualmente (152), yeventualmente se tornan negativos en el 6-10% de losindividuos infectados (153)(154). Para evaluar una po-sible transmisin perinatal de HCV, hay que conside-rar que los anticuerpos maternos son eliminados alre-dedor de los 12 meses en el 90% de los infantes noinfectados y alrededor de los 18 meses en el 100%(155). Aproximadamente el 90% de los infantes infec-tados tiene ARN HCV detectable en plasma alrededorde los 3 meses de edad (156).

Tests suplementarios para anti-HCV ayudan a resol-ver resultados por EIA sospechados de falsos positivos.Ensayos por inmunoblot recombinante (RIBA) contie-nen los mismos antgenos HCV que los tests EIA, juntocon superxido dismutasa (SOD) para detectar anti-cuerpos no especficos contra protenas de levaduras(los antgenos recombinantes HCV son tpicamentederivados usando las levaduras como vector). Un RIBApositivo es definido como reactividad contra dos o msantgenos HCV de diferentes regiones del genoma, sinreactividad para SOD. Reactividad contra un nico an-tgeno HCV o reactividad multibanda con reactividadpara SOD es considerada indeterminada. En poblacio-nes de alto riesgo para infeccin de HCV menos del1% de los especmenes positivos por EIA-2 sern falsospositivos. Adicionalmente, en individuos recientemen-te infectados, RIBA es positivo en slo 85% de los casos

(157). Por lo tanto, los tests RIBA en poblaciones de al-to riesgo no son necesarios para el diagnstico de he-patitis C (158).

La infeccin activa por HCV se define por la pre-sencia de ARN HCV en plasma. ARN HCV puede serdetectado dentro de 1 - 2 semanas luego de la infec-cin aguda, semanas antes que la ALT se torne anor-mal y previo a la aparicin de anti-HCV (152). El cur-so en el tiempo de los marcadores en una infeccinpor HCV tpica se ilustra en la Figura 7.

Figura 7. Curso en el tiempo de los marcadores serolgicos de in-feccin de hepatitis C aguda. Siguiendo la infeccin, el primermarcador en aparecer es el ARN HCV usualmente detectable lue-go de 1-2 semanas de la exposicin al virus. La concentracin deARN HCV aumenta gradualmente, pero comienza a disminuir conel desarrollo de la respuesta de anticuerpos; puede ser transitoria-mente negativo en aproximadamente 15% de los casos. Anti-HCVaparece en promedio a las 8 - 10 semanas luego de la exposicin;el tiempo es ms corto con los ensayos anti-HCV de tercera gene-racin que con los de segunda generacin. Luego del episodio agu-do, que es clnicamente silencioso en la mayora de los individuos,75-85% de ellos desarrollar la infeccin crnica. Durante la tran-sicin de la infeccin aguda a la crnica tanto ALT como el ARNHCV pueden ser intermitentemente positivos; es ms probable quepersistan positivos durante muchos aos luego de la infeccinaunque el 15-25% de los individuos crnicamente infectados pue-den tener ALT normal.

Aunque no han sido aprobados por la FDA los en-sayos de PCR por transcripcin reversa (RT) para ARNHCV se utilizan comnmente en la prctica clnica; losms sensibles pueden detectar > 100 copias/ mL deARN HCV. Los ensayos de ARN HCV no estn estanda-rizados y los resultados cuantitativos pueden variar sig-nificativamente entre diferentes laboratorios usandodiferentes ensayos (158)(159). ARN HCV es muy sus-ceptible a la degradacin por las altas actividades deARNasa presente en la sangre; por lo tanto, los espec-menes de suero para ARN HCV deben ser centrifuga-dos tan pronto como sea posible luego de la forma-

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Anti-HCVALT

Sntomas

HCV RNA

Lmitededetec-cin

Valo

r re

lativ

o

cin del cogulo. Se prefieren especimenes obtenidoscon EDTA o citrato de sodio para los tests de ARN HCV.El plasma heparinizado es inhibitorio de muchos ensa-yos de amplificacin de cidos nucleicos, y los espec-menes en suero proveen estabilidad subptima a me-nos que el suero sea congelado rpidamente luego dela recoleccin de las muestras. Si la centrifugacin esrealizada inmediatamente, menos del 10% de ARNHCV se pierde an si el plasma o suero no es separa-do de los elementos de la sangre antes de 6 horas co-mo mximo (160). Si se utiliza un tubo separador desuero, los especmenes son estables luego de la centri-fugacin por 24 horas (160). Es aceptable el almacena-miento por corto tiempo (< 7 das) de suero o plasmaa 4 C. Una vez congeladas, las muestras son establespor lo menos durante tres ciclos de congelamiento descongelamiento (160) Los ensayos cuantitativos pa-ra ARN HCV son a menudo menos sensibles que lastcnicas de ARN cualitativas usando la misma tecnolo-ga, pero esto no es universal. La versin actual del en-sayo de ADN branched es la de menor sensibilidad,con un lmite inferior de deteccin de 200.000 co-pias/mL; sin embargo, los anlisis de ADN branchedtienen mejor linealidad y reproducibilidad que los en-sayos por PCR. Un ensayo de ADN branched estsiendo introducido comercialmente en los EstadosUnidos. En pacientes con HCV crnica que no han si-do tratados, es inusual encontrar especimenes conARN HCV no detectable por ADN branched, peropositivos por PCR. Resultados de diferentes mtodosno pueden ser comparados directamente porque seutilizan diferentes estndares. Actualmente est dispo-nible un estndar de la Organizacin Mundial de laSalud para ARN HCV para ensayos de amplificacinde cidos nucleicos (161) y est siendo introducido pa-ra su uso por los fabricantes de kits.

Hay 6 genotipos principales y ms de 90 subtipos deHCV que varan en su distribucin mundial. Adems,el HCV tiene una alta velocidad de mutacin espont-nea, produciendo cuasi especies discretas que varande un individuo a otro (162).

Los genotipos 1a y 1b dan cuenta de alrededor de2/3 de las infecciones en los Estados Unidos; el geno-tipo I representa el 90-95% de las infecciones en losafroamericanos comparadas con alrededor del 60%en pacientes blancos (163). La amplificacin y el se-cuenciamiento genmicos, seguidos por comparacinde secuencias y la construccin del rbol filogenticoes el mtodo de referencia para la determinacin delgenotipo (164). Una variedad de ensayos de screeningde genotipos han sido descriptos incluyendo PCR queutiliza primers genotipo especficos (165), fragmentosde polimorfismos de restriccin de secuencias amplifi-cadas (166), y una tcnica con una sonda comercial-mente disponible (167).

Estos mtodos se comparan favorablemente con elmtodo de referencia para determinar el genotipoHCV (168).

Virus de la Hepatitis D

HDV es un virus ARN defectuoso que se replica s-lo en presencia de HBsAg. Las pruebas para la eviden-cia de la infeccin por HDV deben ser consideradas enpacientes con HBsAg positivo con sntomas de hepati-tis aguda o crnica, particularmente en aquellos conhepatitis fulminante o donde hay un alto riesgo parainfeccin por HDV. El nico test serolgico para HDVampliamente disponible en el comercio detecta anti-HDV total. En los pacientes en los cuales el virus ha si-do eliminado, el anticuerpo desaparece tpicamenteentre 1 y 5 aos (169). En la mayora de las situacionesclnicas anti-HBsAg, IgM anti-HBc y anti-HDV total sonadecuados para diagnosticar la infeccin por HDV. Lospacientes con co-infeccin aguda por HDV son gene-ralmente positivos para anti-HBc IgM, mientras que lospacientes con superinfeccin HDV son usualmente ne-gativos para IgM anti-HBc.

Virus de la Hepatitis E. El HEV es un virus a ARNque causa hepatitis epidmica aguda y espordica en lospases en desarrollo; no causa hepatitis crnica. En losEstados Unidos la infeccin por HEV se ha visto rara-mente como causa de hepatitis, predominantementeentre aquellos que han realizado un viaje a reas end-micas, aunque al menos ha ocurrido un caso sin antece-dentes de viaje (170). Se han desarrollado inmunoensa-yos para anti-HEV para uso diagnstico (171). Unaevaluacin de los mltiples mtodos anti-HEV mostruna variacin significativa en los ttulos reportados, ydiscordancia entre mtodos, aunque los tests que detec-

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Guas del laboratorio para screening, diagnstico y monitoreo de la injuria heptica 481

Recomendaciones: Los tests de screening EIA para anticuerposHCV son adecuados para el diagnstico de infeccin porHCV actual o pasada en una poblacin de pacientes con altaprevalencia de la enfermedad; no se necesita testeo suple-mentario en tales pacientes. Si se necesita la confirmacin dela infeccin activa, se debe utilizar ARN HCV (IIB, E).

Deben ser utilizados tests suplementarios anti-HCV (RIBA)en poblaciones con baja prevalencia de la enfermedad, o pa-ra confirmar infeccin previa por HCV en un paciente quees ARN HCV negativo (IIIB, E).

Se requiere un mejoramiento de la concordancia intermto-do y de la precisin para los tests de ARN HCV; los mtodosdeberan utilizar un estndar tal como el desarrollado por laOrganizacin Mundial de la Salud (IIB).

Los especmenes para ARN HCV deben ser plasmas con ED-TA o citrato, o ser rpidamente centrifugados para prevenirfalsos resultados bajos (IIB).

tan anticuerpos para ORF2 fueron ms seguros (172).Se encontr un anticuerpo reactivo para antgenosHEV en 15-25% de hombres homosexuales, usuarios dedrogas intravenosas, y dadores de sangre en Baltimore,sugiriendo falta de especificidad de los ensayos (173).

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