Revista Mexicana de ngeniería uímica2 Inmovilizacion de enzimas´ La tecnolog´ıa de inmovilizaci...

Revista Mexicana de Ingeniería Química

CONTENIDO

Volumen 8, número 3, 2009 / Volume 8, number 3, 2009

213 Derivation and application of the Stefan-Maxwell equations

(Desarrollo y aplicación de las ecuaciones de Stefan-Maxwell)

Stephen Whitaker

Biotecnología / Biotechnology

245 Modelado de la biodegradación en biorreactores de lodos de hidrocarburos totales del petróleo

intemperizados en suelos y sedimentos

(Biodegradation modeling of sludge bioreactors of total petroleum hydrocarbons weathering in soil

and sediments)

S.A. Medina-Moreno, S. Huerta-Ochoa, C.A. Lucho-Constantino, L. Aguilera-Vázquez, A. Jiménez-

González y M. Gutiérrez-Rojas

259 Crecimiento, sobrevivencia y adaptación de Bifidobacterium infantis a condiciones ácidas

(Growth, survival and adaptation of Bifidobacterium infantis to acidic conditions)

L. Mayorga-Reyes, P. Bustamante-Camilo, A. Gutiérrez-Nava, E. Barranco-Florido y A. Azaola-

Espinosa

265 Statistical approach to optimization of ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae in the

presence of Valfor® zeolite NaA

(Optimización estadística de la fermentación etanólica de Saccharomyces cerevisiae en presencia de

zeolita Valfor® zeolite NaA)

G. Inei-Shizukawa, H. A. Velasco-Bedrán, G. F. Gutiérrez-López and H. Hernández-Sánchez

Ingeniería de procesos / Process engineering

271 Localización de una planta industrial: Revisión crítica y adecuación de los criterios empleados en

esta decisión

(Plant site selection: Critical review and adequation criteria used in this decision)

J.R. Medina, R.L. Romero y G.A. Pérez

Revista Mexicanade Ingenierıa Quımica

1

Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenierıa Quımica, A.C.

Volumen 13, Numero 1, Abril 2013

ISSN 1665-2738

1Vol. 13, No. 1 (2014) 129-150

UTILIZACION DE MATERIALES A BASE DE QUITINA Y QUITOSANO EN LAINMOVILIZACION DE PROTEASAS: EFECTOS EN SU ESTABILIZACION Y

APLICACIONES

UTILIZATION OF CHITIN AND CHITOSAN BASED MATERIALS FOR PROTEASEIMMOBILIZATION: STABILIZATION EFFECTS AND APPLICATIONS

J.A. Salazar-Leyva1, J. Lizardi-Mendoza1, J.C. Ramırez-Suarez1, G. Garcıa-Sanchez1, J.M. Ezquerra-Brauer2,E.M. Valenzuela-Soto1, M.G. Carvallo-Ruiz1, M.E. Lugo-Sanchez1 y R. Pacheco-Aguilar1∗

1Centro de Investigacion en Alimentacion y Desarrollo A.C. Carretera a la Victoria, C.P. 83304. Hermosillo,Sonora, Mexico.

2Departamento de Investigacion y Posgrado en Alimentos, Universidad de Sonora. Rosales y Ninos Heroes S/N.Hermosillo, Sonora, Mexico.

Received September 17, 2013; Accepted November 20, 2013

ResumenLas enzimas proteolıticas poseen un amplio campo de aplicacion en diversas areas de la industria, por lo quela busqueda de estrategias para optimizar su desempeno catalıtico es de gran importancia. La inmovilizacion deenzimas en soportes solidos es una tecnologıa que induce cambios a nivel estructural en los sistemas catalıticosinmovilizados, ocasionando que las caracterısticas de reaccion de estos se vea mejorada notablemente, permitiendo,ademas, la posibilidad de utilizar repetidamente a las enzimas inmovilizadas en un mismo proceso. La quitina ysu derivado el quitosano, son compuestos que poseen propiedades funcionales que los convierten en excelentesmateriales para ser utilizados como soportes en la inmovilizacion de enzimas. Este artıculo de revision discutelos efectos que causa el proceso de inmovilizacion en materiales a base de quitina y quitosano sobre la estabilidadbioquımica y operacional de enzimas proteolıticas; de igual forma, se presentan algunas aplicaciones de los sistemascatalıticos inmovilizados.

Palabras clave: inmovilizacion, proteasas, quitina, quitosano, estabilidad.

AbstractProteolytic enzymes have a wide range of applications in different industrial fields therefore the developmentof strategies focused in the optimization of their catalytic performance is a topic of great interest. Enzymeimmobilization onto solid supports induces changes at structural level in the immobilized systems, and consequentlysome reaction characteristics can be enhanced; furthermore, immobilized enzymes can be reused in the sameprocess. Due to the unique physicochemical and functional properties that chitin and its derivate chitosan possess,these biopolymers are an excellent option as support for enzyme immobilization. This review discusses the effectson the biochemical and operational performance of proteases immobilized in chitin and chitosan based materials.Some aspects related with the industrial applications of the immobilization systems are also mentioned.

Keywords: immobilization, proteases, chitin, chitosan, stability.

∗Autor para la correspondencia. E-mail: [email protected]/Fax. 662-280-04-21Ext. 525

Publicado por la Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenierıa Quımica A.C. 129

Salazar-Leyva y col./ Revista Mexicana de Ingenierıa Quımica Vol. 13, No. 1 (2014) 129-150

1 IntroduccionLas enzimas se consideran un grupo de moleculasaltamente especializadas, las cuales poseen un granpoder catalıtico mucho mayor al de catalizadores deorigen inorganico (Nelson y col. 2008). Comparandocon catalizadores quımicos de naturaleza no proteica,las enzimas son especıficas en su modo de acciony capaces de operar bajo condiciones suaves detemperatura, presion y pH, ayudando a crear procesosde manufactura de menor costo debido al ahorro deenergıa (Krajewska, 2004). Tomando en cuenta loanterior, actualmente muchas aplicaciones industrialesse ven apoyadas en gran medida por el uso de latecnologıa enzimatica, lo cual ha provocado que lasventas de enzimas a nivel mundial crezcan anualmenteen aproximadamente un 7.5 % (Beilen y Li, 2002;Rasmussen y Morrissey, 2007; Ferraro y col. 2010;Wohlgemuth, 2010).

Las enzimas del grupo de las hidrolasas,particularmente las proteasas, representan al menosel 60% de las ventas globales de enzimas en el mundo.Lo anterior debido a que estos biocatalizadores poseenmultiples aplicaciones en procesos industriales comola produccion de detergentes, alimentos, textiles ymedicamentos (Gupta y col. 2002; Kirk y col. 2002;Tavano, 2013).

En la mayorıa de los procesos industriales lasenzimas operan en sistemas de una sola fase, es decir,se encuentran disueltas con el sustrato el cual a suvez es transformado en producto. Por lo anterior,resulta difıcil separar a las enzimas del resto de loscomponentes de la mezcla de reaccion y por ende,en un proceso continuo, la enzima soluble puede serarrastrada junto con el producto obtenido. Este tipode proceso no es conveniente desde el punto de vistaeconomico ya que por lo general el precio de lasenzimas es elevado (Novick y Rozzell 2005).

La inmovilizacion de enzimas en soportes solidosse ha posicionado como una metodologıa capazde aumentar la eficiencia de un bioproceso, yaque al compararse con el uso de enzimas libres(sin inmovilizar) esta metodologıa ofrece diversasventajas. La inmovilizacion, en la mayorıa de loscasos, estabiliza la estructura de las enzimas ypor consecuencia su capacidad catalıtica aumenta encondiciones extremas de pH y temperatura. Ademas,la facil separacion de la enzima inmovilizada facilitasu reutilizacion permitiendo la implementacion deprocesos continuos de catalisis en reactores (Chiou ycol. 2007; Brady y Jordaan, 2009; Hanefeld y col.2009; Mahmoud y Helmy, 2009).

Las propiedades de las enzimas inmovilizadas son

regidas por las caracterısticas del sistema enzimaticoy del material utilizado como soporte (Bickerstaff,1997). De la gran variedad de materiales que hansido estudiados y utilizados para inmovilizar enzimasdestacan la quitina y el quitosano, debido a quela estructura quımica de estos compuestos poseeuna gran disponibilidad de grupos funcionales quepueden reaccionar con las enzimas o que sonsusceptibles a ser modificados quımicamente paraaumentar su reactividad (Kurita, 2001; Zohuriaan-Mehr, 2005; Mourya e Inamdar, 2008). Ademas, estosbiopolımeros son abundantes, biodegradables y nopresentan toxicidad (Krajewska, 2004; Macquarrie yHardy, 2005; Kurita, 2006).

Debido al gran potencial de aplicacion tecnologicaque poseen las proteasas y a que la quitina y elquitosano presentan caracterısticas adecuadas comosoportes para inmovilizar enzimas, en esta revision semuestra el estado del arte en lo referente a los efectosde la inmovilizacion de proteasas en materiales a basede quitina y quitosano sobre los siguientes aspectos:estabilidad al pH y la temperatura; parametroscineticos; estabilidad operacional y aplicaciones.

2 Inmovilizacion de enzimasLa tecnologıa de inmovilizacion de enzimas data deprincipios del siglo XX, siendo en los anos de 1910y 1930 cuando ciertas proteınas fueron fısicamenteadsorbidas en superficies como carbon, caolinita,celulosa y esferas de cristal (Nelson y Griffin, 1916;Nelson y Hitchcocks, 1921; Langmuir y Schaefer,1938). Esta tecnologıa es generalmente definida comoel aprisionamiento de una molecula de enzima enuna fase que permite el intercambio o difusion desustancias. El proceso de inmovilizacion confina olocaliza a la enzima en una region definida del espacio,debido a que en la mayorıa de los casos se lleva a cabola interaccion de la enzima con un soporte dando lugara formas insolubles que retienen su actividad catalıticay que pueden ser utilizadas repetidamente (Novick yRozzell 2005).

2.1 Metodos para la inmovilizacion deenzimas

De manera general, los metodos de inmovilizacionde enzimas se clasifican en fısicos y quımicos. Sudiferencia radica en que en los fısicos las interaccionesentre la enzima y el soporte son debiles, mientras queen los quımicos, la enzima y el soporte se unen a travesde enlaces covalentes (Tischer y Wedekind, 1999).

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Fig. 1. Metodos de inmovilizacion de enzimas mas utilizados en la actualidad.

A traves del tiempo se han disenado diferentesmetodologıas para la inmovilizacion de enzimas. Sinembargo, es importante mencionar que no existe unsistema universal de inmovilizacion, ya que para uncaso dado es necesario evaluar varias metodologıas

en funcion de la enzima que se desea inmovilizar ydel proceso en el que se pretende utilizar el sistemacatalıtico. Inclusive, a pesar de que los diferentesprocesos de inmovilizacion son conceptualmentedistintos, se puede decir que frecuentemente se

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traslapan entre ellos, utilizandose en algunos casossistemas de inmovilizacion multiples (Novick yRozzell 2005).

De acuerdo a Bickerstaff (1997), existen cincometodos principales de inmovilizacion de enzimas,a saber: adsorcion, union covalente, atrapamiento,encapsulacion y entrecruzamiento (Fig. 1). Acontinuacion se describen los principales aspectos delos metodos mencionados anteriormente.

2.1.1 Adsorcion

Este metodo de inmovilizacion es relativamentesimple y barato. No implica una modificacion quımicade la enzima inmovilizada, por lo que mantiene demanera aceptable su actividad (Castro y col. 2013).Su principal desventaja es que en algunos casos puedeocurrir un desprendimiento de la enzima del soportedebido a las condiciones de proceso (Kirkkopru y col.2006; Brady y Jordaan, 2009).

Las interacciones que se llevan a cabo entre laenzima y el material utilizado como soporte son,la mayorıa de las veces, de caracter reversible.Las fuerzas de atraccion que predominan en lainmovilizacion por adsorcion son diversas, entre lasque se encuentran las de van der Waals, interaccionesionicas, puentes de hidrogeno y enlaces hidrofobicos.Estas interacciones son de caracter debil aunque losuficientemente grandes en cantidad para asegurar unaunion adecuada con el soporte (Bickerstaff, 1997).El proceso de adsorcion es altamente dependiente delas interacciones moleculares que se llevan a caboentre la superficie del material utilizado como soportey la enzima, por lo que las propiedades de cargay polaridad del biocatalizador a inmovilizar tienenque ser tomadas en cuenta para asegurar una unionadecuada de este con el soporte (Moehlenbrock yMinteer, 2011).

2.1.2 Union covalente

La union de enzimas a traves de enlaces covalentescon un soporte insoluble es una de las metodologıas deinmovilizacion mas empleadas, ya que lo que se buscaes evitar el desprendimiento de la enzima del soporte.La gran ventaja de la utilizacion de esta metodologıaes la estabilidad del enlace formado entre el soporte yla enzima, la cual usualmente queda unida a traves devarios puntos de su estructura, confiriendole rigidez ypor lo tanto aumentando la estabilidad del sistema ala temperatura, pH, fuerza ionica, solventes organicosy proteolisis (Brena y Batista-Viera, 2006; Homaei y

col. 2013).Las enzimas poseen una gran variedad de grupos

funcionales capaces de unirse vıa covalente a losgrupos quımicos presentes en la superficie delsoporte, entre los que destacan el grupo amino (-NH2), carboxilo (-COOH) y sulfidrilo (-SH) de suscadenas laterales. Es muy importante que los gruposfuncionales del sitio activo de la enzima no participenen el enlace covalente formado con el soporte, ya queesto provocarıa una disminucion significativa en laactividad enzimatica.

La principal desventaja de la inmovilizacioncovalente de enzimas radica en que esta metodologıaes mas costosa y compleja comparada con otras,ya que el soporte utilizado necesita ser activadoquımicamente con reactivos quımicos especıficosprevio al procedimiento de inmovilizacion. Noobstante lo anterior, la gran estabilidad estructural yel mınimo desprendimiento de la enzima del soportejustifican, en muchos de los casos, su utilizacion(Novick y Rozzell 2005).

2.1.3 Atrapamiento

La inmovilizacion por atrapamiento difiere de laadsorcion y union covalente en que las moleculas deenzima estan libres en solucion, pero restringidas enmovimiento por el “enrejado” formado por un gel.Generalmente se utilizan polımeros organicos paraformar dichos enrejados (Bickerstaff, 1997; Sheldon,2007).

La forma mas usual para llevar a cabo estainmovilizacion es mezclando a la enzima de interescon una solucion de algun material polimerico, elcual es posteriormente insolubilizado o entrecruzadomediante cambios de pH o el uso de polımerosmultivalentes. Ademas de la simplicidad metodologicade esta forma de inmovilizacion de enzimas, otra granventaja es la proteccion de la enzima del contactodirecto con el ambiente minimizando ası aquellosfactores que afectan la actividad enzimatica comolas burbujas de aire y el contacto con solventeshidrofobicos (Alloue y col. 2008; Brady y Jordaan,2009).

La principal limitante de la utilizacion deesta metodologıa es que el enrejado polimericoformado puede en ocasiones provocar problemas detransferencia de masa; es decir, el enrejado, siendouna barrera, puede llegar a disminuir la interaccionadecuada entre la enzima y el sustrato, teniendo asıuna implicacion directa en la cinetica de reaccion(Bickerstaff, 1997; Brena y Batista-Viera, 2006).

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2.1.4 Encapsulacion

La encapsulacion de enzimas es una metodologıasimilar a la de atrapamiento debido a que laenzima inmovilizada esta confinada en una matrizpolimerica. En la encapsulacion, los materialesutilizados como soporte presentan poros por lo que sonsemipermeables (Moehlenbrock y Minteer 2011).

Un aspecto determinante para aplicar de maneraexitosa la encapsulacion de enzimas es la eleccionadecuada del tamano de poro del soporte. Si el tamanode poro es el adecuado, tanto el sustrato como elproducto podran entrar y salir, respectivamente, atraves de la capsula semipermeable la cual seguirareteniendo a la enzima por tener un mayor tamano quelos poros de la capsula (Novick y Rozzell 2005).

La principal ventaja de este metodo es que laenzima inmovilizada presenta una alta actividad yaque esta ocluida en la capsula en forma soluble. Estametodologıa puede presentar problemas de difusiondebido a que en algunos casos los productos formadosde la reaccion enzimatica pueden acumularse demanera rapida causando el rompimiento de la capsula.Otra limitante de la encapsulacion es que no puede seraplicada para catalizar procesos donde el sustrato seade alto peso molecular, ya que estos pueden presentarproblemas de transferencia a traves de la capsula(Bickerstaff, 1997; Novick y Rozzell, 2005; Brady yJordaan, 2009).

2.1.5 Entrecruzamiento

Algunos autores consideran a este metodo deinmovilizacion como libre de soporte debidoa que implica la interaccion de las enzimasentre ellas mismas, formando grandes complejostridimensionales. La formacion de estas estructurasse logra por metodos fısicos o quımicos (Novick yRozzell, 2005; Brady y Jordaan, 2009).

El entrecruzamiento de enzimas a traves demetodos quımicos es el mas utilizado. Para ellos seutilizan reactivos como el glutaraldehıdo, el cual escapaz de unir a la enzimas entre ellas mismas a travesde enlaces covalentes. La capacidad de entrecruzarenzimas utilizando glutaraldehıdo, radica en que estecompuesto se une covalentemente a los grupos aminolibres localizados en la superficie de moleculas deenzima “vecinas”, provocando la formacion de enlacescovalentes inter- e intra- moleculares (Sheldon, 2011).

El entrecruzamiento libre de soporte raramentese utiliza para inmovilizar enzimas ya que presentalimitantes como la falta de propiedades mecanicas

y baja estabilidad de los agregados molecularesenzimaticos formados (Bickerstaff, 1997). En anosrecientes se desarrollo una nueva clase de enzimasinmovilizadas libres de soporte conocidas comoCLEAs por sus siglas en ingles (cross-linked enzymeaggregates). Lo que caracteriza a esta metodologıaes que a traves de una precipitacion selectiva (porejemplo con sulfato de amonio) se puede alcanzarla purificacion y la inmovilizacion de las enzimasen un solo paso (Cao y col., 2000; Sheldon, 2011).De acuerdo a Cui y Jia (2013) el uso de CLEAs esun metodo muy atractivo para la inmovilizacion deenzimas debido a su simplicidad y a que presenta laposibilidad de utilizar extractos enzimaticos crudos;ademas, permite la co-inmovilizacion de diferentesenzimas.

2.1.6 Inmovilizacion de enzimas en nanomateriales

Si bien la inmovilizacion de enzimas ennanomateriales no representa por sı misma unametodologıa para inmovilizar enzimas, resulta degran importancia su mencion debido a que en anosrecientes se ha demostrado que los sistemas catalıticosa nanoescala poseen gran potencial de aplicacionen diversas areas relacionadas con la biotecnologıa(Ansary y Husain, 2012).

La principal ventaja de utilizar estructuras ananoescala para inmovilizar enzimas, radica en quese reducen de manera importante las limitantesrelacionadas con la difusion de sustratos y productos,ademas de que se maximiza la union de la enzima conel soporte debido a que el nanomaterial posee una gransuperficie de contacto (Jia y col., 2003). Por lo tanto,actualmente existe mucho interes en la utilizacionde materiales nanoestructurados como soportes parainmovilizar enzimas (Huang y col., 2007).

Los procedimientos desarrollados para inmovilizarenzimas en nanomateriales estan basados en losconceptos y mecanismos de los metodos tradicionalesde inmovilizacion de enzimas anteriormentemencionados. Por ejemplo, la union de enzimas ala superficie de nanopartıculas fue uno de los primerosprocedimientos utilizados y sigue siendo muy aplicadoen la actualidad. Otras formas de inmovilizacion sonel atrapamiento de enzimas en materiales nanoporosospor adsorcion fısica o por uniones quımicas en dichosnanomateriales (Wang, 2006).

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2.2 Inmovilizacion de enzimas comoestrategia para aumentar la estabilidadproteica

En lo concerniente a proteınas, el termino estabilidadse refiere a la resistencia que posee la estructuraproteica hacia factores adversos tales como el calory otros agentes desnaturalizantes. Se considera queuna proteına es estable cuando preserva su integridadmolecular, y con ello su funcion biologica, a pesarde haber sido expuesta a un agente desnaturalizante.Las enzimas, al ser en su mayorıa proteınas, poseenuna estabilidad limitada, por lo que experimentanreacciones de desnaturalizacion durante su extraccion,almacenamiento y aplicacion en la industria (Iyer yAnanthanarayan, 2008).

De acuerdo a Fagain (1995), existen dosdefiniciones muy utiles para entender la estabilidadproteica in vitro: la estabilidad termodinamica yla estabilidad cinetica. La estabilidad termodinamica(o conformacional), se relaciona con la resistenciaque presenta la conformacion plegada de la proteınahacia la desnaturalizacion; mientras que la estabilidadcinetica (o a largo plazo), representa la resistenciaque ofrece la estructura proteica a una inactivacionirreversible (ejemplo: mantenimiento de la actividadbiologica). Ambos tipos de estabilidad, puedenrepresentarse de acuerdo al siguiente esquema:

NK� D

k−→ I

Donde N representa a la estructura nativa de laproteına, D a la estructura desnaturalizada e I a laestructura proteica inactivada de forma irreversible. Latransicion reversible de N hacia D corresponde a laestabilidad termodinamica, mientras que la transicionirreversible de D a I representa a la estabilidadcinetica.

Relacionado a lo antes expuesto, la inmovilizacionde enzimas se considera como una metodologıaque permite la obtencion de “enzimas estables”(Janecek, 1993; Cowan y Fernandez-Lafuente, 2011),o expresado en terminos de estabilidad proteica, elproceso de inmovilizacion puede llegar a favorecerla estabilidad conformacional y a largo plazode las enzimas que se encuentran unidas a unsoporte solido. De manera mas especıfica, Singhy col. (2013) explican que la estabilidad de lasenzimas inmovilizadas depende directamente deefectos relacionados con cambios conformacionalesde la estructura proteica, sobre todo a nivel deestructura terciaria. Ademas, el hecho de que lainteraccion entre el sustrato y la enzima inmovilizadase lleve a cabo en un microambiente muy diferenteal de la enzima libre, puede provocar efectosestabilizantes en los sistemas catalıticos (Brena yBatista-Viera, 2006). En la Fig. 2, se muestranlos principales efectos estabilizantes que causala inmovilizacion de enzimas en soportes solidos(Novick y Rozzel 2005; Mateo y col. 2007).

Enzima libre

Inmovilización

Enzimainmovilizada

Estabilización

• Prevención de agregación, y proteólisis causada por otras proteasas presentes en el extracto

• Reducción del desdoblamiento de la estructura de la enzima inducido por agentes desnaturalizantes (temperatura y pH´s extremos, solventes orgánicos)

•Minimización del contacto de la enzima con interfaces hidrófobicas, tales como burbujas de aire las cuales pueden inactivar a las enzimas solubles

Fig. 2. Efectos estabilizantes causados por la inmovilizacion de enzimas en soportes solidos.

3 Quitina y quitosano: Estructuraquımica, fuentes de obtencion ypropiedades funcionales

Algunos tipos de polisacaridos son obtenidos apartir de fuentes naturales. Estos biopolımeros llegan

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a poseer caracterısticas estructurales y propiedadesfisicoquımicas muy interesantes y diferentes a lasque presentan algunos polımeros sinteticos. Debidoa lo anterior, estas macromoleculas de origen naturalposeen un amplio rango de aplicacion en diversasareas (Kurita, 2006).

La quitina es un polisacarido estructural que seencuentra ampliamente distribuido en la naturaleza,particularmente en el exoesqueleto de artropodos(crustaceos e insectos) y en la pared celular de algunoshongos y otros organismos (Dıaz-Rojas y col., 2006).

Kurita (2006), menciona que desde el puntode vista quımico la quitina es un polımero deglucosas que se encuentran unidas por enlaces β-(1-4),diferenciandola de la celulosa en que posee un grupoacetamida como sustituyente en el carbono numero2 (Fig. 3a). El principal derivado de la quitina es elquitosano, el cual estructuralmente se considera comola forma desacetilada de la quitina (Fig. 3b).

La materia prima mas utilizada para la obtencionindustrial de quitina y quitosano son los desechosgenerados por la industria pesquera (caparazonesde crustaceos, principalmente). De acuerdo a Ravi-Kumar (2000), Oregon, Washington, Virginia (EEUU)y Japon son los mayores productores de quitina yquitosano en el mundo, mientras que paıses comoNoruega, Mexico y Chile poseen una gran cantidad derecursos marinos que no son explotados en su totalidadpara este proposito.

La quitina y el quitosano son materiales altamenteatractivos y con un gran potencial de aplicacion encampos tan diversos como la industria cosmetica,biomedica, ambiental y de alimentos, entre otros.La diversidad de sus aplicaciones se debe a que seobtienen facilmente y de manera economica a partirde desechos de la pesca, a que son biodegradables,biologicamente compatibles y no toxicos. En laTabla 1 se muestran las principales propiedadesfuncionales de la quitina y el quitosano, ası comosus distintos campos de aplicacion (Ravi-Kumar,2000; Khor y Lim, 2003; Synowiecki y Al-Khateeb;2003; Krajewska, 2004; Bautista-Banos y col., 2006;Kurita, 2006; Rinaudo, 2006; Harish-Prashanth yTharanathan, 2007; Honarkar y Barikani, 2009;Hernandez-Ochoa y col., 2011).

a)

b)

Fig. 3. Estructura quımica de la quitina (a) y elquitosano (b).

4 Quitina y quitosano comosoportes de inmovilizacion deenzimas

Como se menciono anteriormente, existe una granvariedad de metodologıas disponibles para inmovilizarenzimas, ası como de materiales utilizados comosoportes. Generalmente, tanto la metodologıa deinmovilizacion como el soporte se eligen de maneraempırica, pero siempre con el objetivo de que seretenga al maximo la actividad enzimatica y suestabilidad operacional (Bickerstaff, 1997).

Entre las principales caracterısticas que debe tenerun material para ser utilizado como soporte en lainmovilizacion de enzimas destacan las siguientes:alta afinidad por las proteınas, disponibilidad degrupos funcionales reactivos para reaccionar con lasenzimas o susceptibles a modificaciones quımicas,facil preparacion en diferentes formas fısicas, noser toxicos y presentar compatibilidad fisiologicasi es requerido. Esto ultimo, para aplicaciones enbiomedicina o industria de alimentos principalmente.La quitina y el quitosano cumplen con la mayorıa delas caracterısticas mencionadas anteriormente debidoal origen natural y caracterısticas estructurales de estosbiopolımeros (Krajewska, 2004).

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Tabla 1. Principales propiedades funcionales y aplicaciones de la quitina y el quitosano

Propiedad funcional Principales aplicaciones

• Bioactividad

– Actividad anti-colesterolemica

– Control de peso (efecto fibra dietaria)

– Actividad anti-oxidante

– Actividad anti-microbiana

– Estimulante sistema inmune

– Actividad anti-proliferativa

– Capacidad cicatrizante

– Capacidad humectante

• Caracter policationico

– Capacidad de adsorcion

– Quelante de metales

• Capacidad de formacion de geles y pelıculas

• Reactividad de grupos funcionales

• Ingredientes en alimentos funcionales

• Fabricacion de empaques activos de alimentos

• Aditivos antimicrobianos en industria textil

• Control de enfermedades en hortalizas

• Biomedicina

– Materiales de curacion aceleradores delproceso de cicatrizacion

– Regeneracion de tejidos

• Industria cosmetica

• Reduccion de contaminantes en aguas residuales(fenoles, metales pesados)

• Recuperacion de metales valiosos

• Inactivacion de metalo-enzimas que causandeterioro en alimentos

• Clarificacion de jugo

• Fabricacion de resinas cromatograficas

• Inmovilizacion de enzimas

• Fabricacion de membranas de dialisis y fluidosdentales

• Sistemas de liberacion controlada de medicamentosy moleculas bio-activas

La quitina posee una gran disponibilidad de gruposhidroxilo, ademas de ser un solido practicamenteinerte e insoluble en agua. Por su parte, el quitosanopresenta grupos hidroxilo y aminos capaces de sermodificados quımicamente. La presencia de gruposamino en su forma primaria (-NH2), le proporcionaal quitosano la caracterıstica de ser un polielectrolitocationico (pK ≈ 6.5), por lo que es soluble enmedio acido, en particular a pH’s por debajo de 6.5.Esta caracterıstica de solubilidad le confiere, bajociertas condiciones, la capacidad de formar gelesy membranas que presentan propiedades mecanicasaceptables (Agullo y col., 2003; Krajewska, 2004).

Otro aspecto interesante de la quitina yparticularmente del quitosano, es que pueden servir debase para disenar materiales compuestos creando con

ello estructuras de inmovilizacion con propiedadesmuy especıficas. Algunos ejemplos de este tipode estructuras son las microesferas de poliestirenocubiertas de quitosano (Talbert y Hotchkiss, 2012) ynanopartıculas magneticas de quitosano-Fe3O4 (Ju ycol., 2012), entre otros.

Es importante mencionar que ademas de laquitina y el quitosano existen otros polisacaridosde origen natural que pueden ser utilizados comosoportes en la inmovilizacion de enzimas, entrelos que destacan el alginato, la carragenina, lacelulosa, el almidon y la pectina. Sin embargo,estos polisacaridos no poseen de forma individual laspropiedades funcionales de la quitina y el quitosano,por lo que en muchos estudios se propone el uso demateriales compuestos para mejorar las propiedades

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de los soportes de inmovilizacion, creando sistemasde inmovilizacion del tipo alginato-pectina, quitosano-alginato y alginato-almidon, entre otros (Al-Adhami ycol., 2002; Girigowda y col., 2006; Matto y Husain,2006; Matto y Husain, 2009; Flores-Maltos y col.,2011).

Haciendo referencia a lo antes expuesto, Tanakay col. (1984) mencionan que los geles de alginato alposeer poros muy grandes pueden presentar fugas deenzima de los soportes a base de este polisacarido.Una estrategia util para reducir este problema es laformacion de complejos poli-electrolıticos entre elalginato como polımero anionico y el quitosano comopolımero cationico. De esta manera, el soporte deinmovilizacion al estar “recubierto” por el quitosanominimiza las fugas de enzima (Azarnia y col., 2010).En otro estudio, Betigeri y Neau (2002) compararonla influencia del tipo de polımero (quitosano yalginato) en las fugas y actividad enzimatica de unalipasa inmovilizada por atrapamiento. Los autoresencontraron que el soporte de alginato presentomayores fugas de enzima del soporte y una reducidaactividad enzimatica al compararla con las esferas dequitosano.

5 Inmovilizacion de proteasas enmateriales a base de quitina yquitosano

Las proteasas catalizan reacciones de hidrolisisproteica es decir, rompen enlaces peptıdicos mediantela accion de moleculas de agua (Barberies y col.,2008). Este grupo de enzimas son ampliamenteutilizadas en diversas areas de la industria, por lo quevarios grupos de investigacion realizan estudios querevelan el gran potencial de aplicacion que poseenlas proteasas inmovilizadas en comparacion con sucontraparte soluble. A continuacion se discutiran losefectos que imparte la inmovilizacion de proteasasen materiales a base de quitina y quitosano sobre laestabilidad bioquımica y operacional de los sistemascatalıticos inmovilizados.

5.1 Estabilidad a la temperatura

La temperatura es un factor de suma importanciaen todos los procesos que son catalizados porenzimas, debido a que estas biomoleculas poseenuna temperatura optima en la cual su efectocatalıtico es el maximo. Esta actividad se ve

afectada de manera negativa a temperaturas mayoreso menores a la temperatura optima, debido a quela estructura proteica puede pasar de un estadonativo a un estado desnaturalizado. Generalmente,la mayorıa de las enzimas son desnaturalizadasa altas temperaturas (60-70◦C), a causa de queel calor provoca un debilitamiento de las fuerzasintramoleculares responsables de la preservacion de laestructura terciaria de la proteına (Illanes y col., 2008).

Un aspecto de sumo interes en el campo dela tecnologıa enzimatica es el mejoramiento dela termoestabilidad de las enzimas. Las reaccionesenzimaticas que se llevan a cabo a altas temperaturasposeen mayor velocidad de catalisis, favoreciendoademas la transferencia de masas debido a que alaumentar la temperatura se incrementa la solubilidaddel sustrato y se disminuye la viscosidad del mediode reaccion (Bruins y col., 2001; Matsumoto y Ohasi,2003).

A este respecto, la inmovilizacion es unade las estrategias mas utilizadas para estabilizartermicamente a las enzimas. Varios autores coincidenen que la formacion de interacciones covalentesy/o no covalentes entre la enzima y el soporte deinmovilizacion incrementa la rigidez conformacionalde la estructura proteica, y por ende, su resistenciaa ser desnaturalizada por un tratamiento termico(Hanefeld y col., 2009; Datta y col., 2013; Singh ycol., 2013).

A manera de ejemplo, Altun y Cetinus (2007),inmovilizaron pepsina en esferas de quitosanoentrecruzadas con glutaraldehıdo, encontrando quea 50◦C la pepsina inmovilizada retuvo alrededordel 100% de su actividad, mientras que la pepsinalibre retuvo solo el 60% a la misma temperatura.Adicionalmente se encontro que la temperaturaoptima de la pepsina inmovilizada fue alrededorde 10◦C mayor que la de la pepsina libre. Enotro estudio, Singh y col. (2011) inmovilizaron unacisteına-proteasa en esferas de quitosano activadascon glutaraldehıdo, encontrando que la enzimainmovilizada retuvo mas del 80% de su actividad atemperaturas superiores a los 70◦C, mientras que laproteasa soluble mostro el mismo comportamientopero a temperaturas no mayores a 65◦C. En otrainvestigacion realizada por Zhang y col. (2008),se inmovilizo tripsina covalentemente en esferas dequitosano observandose que no existio un cambiosignificativo en la temperatura optima de reaccionde la enzima libre con respecto a la inmovilizada,pero esta ultima presento una mayor estabilidadtermica a 55◦C que la tripsina soluble. De forma

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similar, Manrich y col. (2008) observaron una marcadatermoestabilidad de tripsina inmovilizada en geles dequitosano activados con glicidol.

Debido a su alta reactividad, el quitosano puedeser modificado quımicamente y/o interaccionar conotros compuestos para crear materiales compuestosque pueden influir positivamente en la estabilidada la temperatura de las enzimas inmovilizadas. Enrelacion a lo anterior, Liu y col. (2005), inmovilizarontripsina en nanopartıculas de quitosano modificadohidrofobicamente, observando que despues de 100minutos de reaccion a 50◦C, la tripsina inmovilizadaperdio tan solo el 30% de su actividad, mientras quebajo las mismas condiciones la tripsina libre perdio eldoble de su actividad enzimatica.

La estabilidad termica de las enzimasinmovilizadas en materiales a base de quitosanoreportada en los trabajos de investigacion antesdiscutidos, tambien puede ser explicada desdeun punto de vista termodinamico. Por ejemplo,bajo condiciones normales de temperatura unamolecula de enzima sin inmovilizar se encuentraen su estado nativo (N) y en equilibrio con suestado desnaturalizado (D). Conforme la temperaturaaumenta por arriba de la temperatura optima decatalisis, la enzima tiende a desdoblarse en un procesocooperativo y con ello se da la transicion al estadoD, viendose afectada negativamente su funcion (Iyery Ananthanarayan, 2008). En cambio, si la enzima

se encuentra inmovilizada en un soporte solido, latransicion hacia el estado D a altas temperaturas sepuede ver disminuida. En la Fig. 4 se presenta unesquema que ilustra como los enlaces covalentesformados entre el soporte de inmovilizacion y laenzima pueden influir positivamente en la estabilidadtermica de la estructura proteica.

De acuerdo a lo antes expuesto, es posibleaseverar que los procesos de inmovilizacion aplicadosincrementan la estabilidad termica de las proteasas, loque a su vez les confiere una mayor posibilidad de seraplicadas en procesos industriales donde se requieranaltas temperaturas.

5.2 Estabilidad al pH

Las propiedades de carga de los materiales utilizadoscomo soportes de inmovilizacion de enzimas tienenun efecto sobre el pH optimo y estabilidad estructuralde las enzimas. Dicho efecto se encuentra relacionadocon el desarrollo de un gradiente de iones OH− y/oH+ entre el solvente y el soporte de inmovilizacion. Elgradiente de iones es generado por las propiedades decarga de la superficie del soporte y la concentracionde iones en la solucion, dando como resultado lageneracion de un “pH localizado” en la superficie delsoporte y que difiere del valor de pH de la solucion(Talbert y Goddard, 2012).

Fig. 4. Efecto de la formacion de enlaces covalentes entre la enzima y el soporte sobre la estabilidad termica de unaenzima inmovilizada.

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H+

H+H+H+

Disminuye pH del microambiente

OH-‐

H+

H+

H+

H+

H+OH-‐

OH-‐

H+H+

OH-‐ OH-‐OH-‐OH-‐

OH-‐

OH-‐

OH-‐H+

H+

H+OH-‐

OH-‐

OH-‐

OH-‐Solvente

Soporte catiónico

Aumenta pH del microambiente

Soporte aniónico

a bMicroambiente

Microambiente

Fig. 5. Efecto de las propiedades de carga de los materiales utilizados como soporte en el pH del microambiente delas enzimas inmovilizadas (a) soporte cationico (b) soporte anionico.

A manera de ejemplo, si una enzima esinmovilizada en un material que posee caracterısticascationicas, el pH del microambiente sera mayor que elpH del solvente (debido a la atraccion de iones OH− dela solucion), causando que el pH optimo y estabilidadde la enzima se desplace hacia valores de bajo pH(Bissett y Sternberg, 1978; Krajewska y col., 1990).El comportamiento opuesto, sucede en soportes cuyosmateriales poseen caracterısticas anionicas (Figura 5).

En relacion a lo anterior, varios estudios hanreportado que los grupos amino protonados (-NH+

3 )del quitosano le confieren a este material un caractercationico por lo que las enzimas inmovilizadas enmateriales a base de este polisacarido presentansu maxima actividad a valores de pH mas bajoscon respecto a la enzima libre o soluble. Como eltrabajo de Ju y col. (2012), quienes inmovilizaronα-quimotripsina en nanopartıculas magneticas dequitosano-Fe3O4, observando que el maximo deactividad catalıtica del sistema inmovilizado ocurre enun rango de pH entre 8 y 10 manteniendo mas del 55%de su actividad a pH 4. En contraparte, la enzima librepresento su maxima actividad a valores de pH entre 9y 10; sin embargo, a pH 6 la actividad enzimatica seperdio casi por completo. En otra investigacion Tangy col. (2006), reportaron que la actividad enzimaticade una proteasa neutra inmovilizada en nanopartıculas

de quitosano entrecruzadas con tripolifosfato de sodiose mantiene cerca del 100% a pH 6, mientras que laenzima libre perdio cerca del 40% de su actividad almismo pH. Resultados similares a los antes citadosfueron obtenidos por Kilinc y col. (2002) y Xi ycol. (2005), al inmovilizar papaına en partıculas dequitosano entrecruzadas con glutaraldehıdo y tripsinaen esferas de quitosano con nucleo de sılica gel,respectivamente.

Por otro lado, se ha reportado que en algunoscasos al inmovilizar enzimas en matrices dequitosano activadas con agentes bifuncionales comoel glutaraldehıdo, el cual induce reacciones deentrecruzamiento entre la enzima inmovilizada y elsoporte, el efecto de desplazamiento del pH optimode catalisis hacia zonas acidas no es significativo.Dicho comportamiento se atribuye a que los gruposamino del quitosano estan muy poco disponibles paraprotonarse debido a que interaccionan con los agentesentrecruzadores utilizados (Altun y Cetinus 2007;Dhananjay y Mulimani, 2008).

5.3 Parametros cineticos de las proteasasinmovilizadas

El proceso de inmovilizacion de enzimas puede llegara provocar un efecto en parametros cineticos como la

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constante de Michaelis Menten (Km) y la velocidadmaxima de reaccion (Vmax). De manera general se hareportado que el proceso de inmovilizacion provocaque las enzimas tengan una menor afinidad por susustrato (presentan un aumento en su Km) y presentenuna disminucion en su valor de Vmax (Cooney, 2011).Cetinus y Oztop (2003), mencionan que la perdida deafinidad por el sustrato de las enzimas inmovilizadaspuede deberse, principalmente, a que el soporte generaun impedimento esterico hacia el sitio activo de laenzima provocando una inadecuada transferencia delsustrato hacia dicho sitio. Ademas, el incrementoen la Km puede ser tambien una consecuencia delos cambios conformacionales que sufre la enzimaal unirse al soporte de inmovilizacion. De manerasimilar, la disminucion en el valor de Vmax observadoen las enzimas inmovilizadas puede deberse a queciertos aminoacidos importantes en el sitio activoparticipen en la union de la enzima con el soporte(Bhandari y col., 2009).

Son varios los trabajos que muestran el efecto dela inmovilizacion sobre las variables cineticas antesmencionadas. Li y col. (2012) encontraron que elvalor de Km aumenta casi el doble al inmovilizar unaproteasa neutra en esferas de quitosano modificadasquımicamente (carboxi-metil-quitosano y N-succinil-quitosano) con respecto a la enzima libre. En otroestudio, Bacheva y col. (2008) reportaron que elvalor de Km aumento aproximadamente 9 vecescomparandolo con la Km de la enzima soluble alinmovilizar subtilisina (serina-proteasa) en pelıculasde quitosano entrecruzadas con glutaraldehıdo. Eneste mismo estudio, el valor de Vmax de la enzimainmovilizada fue aproximadamente 100 veces menorcon respecto a la enzima sin inmovilizar. Liu ycol. (2005) inmovilizaron tripsina en nanopartıculasde quitosano modificado hidrofobicamente con acidolinoleico y explican que dicha disminucion del Kmde la enzima inmovilizada esta mas relacionadacon la rigidez conformacional causada por elproceso de inmovilizacion que con la limitacionen la transferencia de sustrato al sitio activo dela enzima, la cual se sabe es disminuida ensistemas de inmovilizacion a nanoescala. De lamisma manera, otros autores han observado el efectoantes mencionado sobre las variables cineticas Kmy Vmax al inmovilizar proteasas en materiales a basede quitosano. Como ejemplo estan los resultadosobtenidos por Ahmed y col. (2007) y Sangeetha yAbraham (2008).

Aun y cuando en varios estudios se han reportadolos efectos negativos que causa el proceso de

inmovilizacion sobre Km y Vmax, existen otros trabajosen los cuales dicho proceso aumenta la afinidad de laenzima por su sustrato y causa ademas un incrementoen su Vmax (Benkhelifa y col., 2005; Zhang y col.,2008; Veselova y col., 2009; Singh y col., 2011).

5.4 Estabilidad operacional de proteasasinmovilizadas en materiales a base dequitina y quitosano

La forma mas usual para evaluar la estabilidadoperacional de las enzimas inmovilizadas esdeterminando: a) la capacidad que poseen estas deretener su actividad catalıtica despues de varios ciclosde uso, b) la capacidad de las enzimas inmovilizadasen reactores para operar de forma continua y c) suestabilidad al almacenamiento (Novick y Rozzell,2005). A continuacion se discuten los efectos de lainmovilizacion sobre la estabilidad operacional de lossistemas catalıticos inmovilizados.

5.4.1. Capacidad de reutilizacion y operacioncontinua en reactores

Desde el punto de vista economico, la capacidad dereutilizacion de las enzimas inmovilizadas representauna gran ventaja con respecto al uso de enzimas enforma soluble, ya que en el caso de las ultimas, estasson desechadas despues de un solo uso, agregandoleun mayor costo financiero al proceso de interes debidoa que la obtencion de enzimas en forma pura requieretambien de una alta inversion monetaria (Li y col.,2006).

De acuerdo a Dwevedi y Kayastha (2009), el usorepetido del sistema catalıtico provoca que la fuerza delos enlaces establecidos entre la enzima y el soportese debilite provocando perdidas en actividad debido aldesprendimiento de la enzima del soporte. Ademas,la alta frecuencia de interaccion entre el sustrato yel sitio activo de la enzima causa que dicho sitiose distorsione resultando en una disminucion en laeficiencia catalıtica.

Por lo anterior, el tipo de enlace formado entre laenzima y el soporte de inmovilizacion debe de ser losuficientemente estable para evitar desprendimientosde la enzima y con ello mantener la eficiencia catalıticadel sistema durante varios ciclos de uso. A esterespecto en la Tabla 2 se observa que para el casode las proteasas inmovilizadas en materiales a basede quitina y quitosano, la actividad proteolıtica puedeser mantenida en al menos un 60% con respecto a suactividad inicial despues de varios ciclos de uso.

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Tabla 2. Estabilidad operacional y aplicaciones de proteasas inmovilizadasen materiales a base de quitina y quitosano

Enzima Caracterısticas de inmovilizacion Aplicacion Estabilidad operacional Referencia

Pepsina y“rapidase”(proteasasacidas)

Inmovilizacion covalente enesferas de quitosano entrecruzadascon glutaraldehıdo (GA)

Hidrolisis continuade gluten de trigo enbio-reactor para lageneracion de peptidoscon propiedadesespumantes

El rendimiento delproceso se mantuvo amas del 70% durante laoperacion continua delbio-reactor. La vidamedia de la actividadenzimatica fue de 45dıas. No se observocontaminacionmicrobiana durante elperiodo de operacion

Motoi ycol. (2004)

ProteasaXIX

Inmovilizacion covalente enesferas de quitosano entrecruzadascon (GA)

Hidrolisis continua decaseına en bio-reactortipo Torus

La hidrolisis decaseına fue mayorpara la proteasainmovilizada yempacada en elreactor Torus (gradode hidrolisis de 25%)que para la proteasalibre en reactor detanque agitado (gradode hidrolisis de 12%)

Benkhelifay col.(2005)

Proteasaneutra

Inmovilizacion covalente enesferas de carboxi-metil-quitosanoentrecruzadas con GA

Produccion dequitosano de bajopeso molecular

La actividadenzimatica residualde la proteasainmovilizada fuedel 79 % despuesde 30 dıas dealmacenamiento a25◦C, mientras quebajo las mismascondiciones dealmacenamiento laproteasa libre nopresento actividadenzimatica. Retenciondel 78% de actividadenzimatica despuesde 10 ciclos deuso repetido en lahidrolisis de solucionde quitosano

Li y col.(2006)

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Tripsina Inmovilizacion por adsorcion aesferas de sılica gel recubiertasde quitosano funcionalizadas conmetales (Cu2+, Zn2+, Ni2+)

Fabricacion de resinacromatografica parapurificacion deproteınas por afinidada metales

Retencion del80% de actividadenzimatica de latripsina inmovilizadaen esferasfuncionalizadas conZn2+, Ni2+ despuesde almacenamiento a25◦C. La tripsina librepreservo alrededor del20% de actividad bajola misma condicion dealmacenamiento

Wu y col.(2006)

Pepsinaporcina

Inmovilizacion covalente enesferas de quitosano activadas conGA

Coagulacion de leche La pepsina solubleregistro perdida deactividad despuesde 5 dıas dealmacenamiento a 5◦C,mientras que la enzimainmovilizada retuvoel 100% de actividadenzimatica despuesde 30 dıas bajo lasmismas condicionesde almacenamiento.Retencion del 95% deactividad despues de 3ciclos de uso.

Altun yCetinus,(2007)

Tiol-proteasa

Inmovilizacion de la enzima enesferas de quitosano entrecruzadascon GA

Catalisis enmedios acuosos noconvencionales; etanoly dimetil sulfoxido(DMSO)

Retencion del 100%de actividad de laenzima inmovilizadaa concentracionesdel 15% de etanol yDMSO con respectoa la enzima libre, lacual registro perdidasdel 40% y 20% enactividad al incubarseen etanol y DMSOrespectivamente

Bhandari ycol. (2009)

Aminopeptidasa Inmovilizacion capsulas dealginato recubiertas con quitosano

Aceleracion delproceso de maduracionde queso Cheddar

No determinada Azarnia ycol. (2010)

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Papaına Inmovilizacionpor adsorcion enmembranas de nylonrecubiertas conquitosano y queladascon metales

Fabricacion de resinacromatografica parapurificacion de papaınapor afinidad a metales(Cu2+, Ni2+, Zn2+, yCo2+)

El ciclo de elucion depapaına fue realizadotres veces sobrela misma resina,observandose quela capacidad deadsorcion de la enzimase mantuvo casi al100% despues de lostres ciclos de uso

He y col.(2010)

L-metioninasa

Inmovilizacioncovalente en hojuelasde quitina activadascon GA

Produccion continuade metanotiol (CH3-SH)

Retencion del 60% deactividad enzimaticadespues de tres ciclosde reaccion.

El-Sayedy Shindia,(2011)

Tripsina Inmovilizacioncovalente enmicroesferas dequitosano

Resina cromatograficapara purificacion porafinidad de inhibidorde tripsina

La actividad de latripsina inmovilizadadisminuyo 12.5%despues de 20 dıasde almacenamiento a25◦C, mientras que laactividad de la tripsinalibre disminuyo52.6% bajo lasmismas condiciones.Capacidad pararealizar seisoperaciones sucesivasde separacioncromatografica,manteniendo el90% de la actividadenzimatica inicialdespues de los seisciclos de operacion.

Zhang ycol. (2011)

α- quimotripsina Inmovilizacioncovalente ennanopartıculasmagneticas dequitosano-Fe3O4

Sıntesis de peptidos La enzimainmovilizada retuvo el60% de su actividadoriginal despues de 12ciclos de uso.

Ju y col.(2012)

Tripsina Inmovilizacionen nano-capsulasde quitosanoentrecruzadas contripolifosfato

Suplementacion dedietas para acuacultura

No determinada Kumari ycol. (2013)

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Los resultados altamente aceptables de capacidadde reutilizacion mostrados en la Tabla 2, puedenestar relacionados con el que en la mayorıa de loscasos se utiliza glutaraldehıdo para la inmovilizacionde las proteasas a traves de un entrecruzamiento detipo covalente entre los grupos amino presentes en elsoporte y en las enzimas (Fig. 4). El entrecruzamientodel quitosano con glutaraldehıdo provoca que los gelesformados posean una mayor estabilidad y durabilidad(Krajewska y col., 2004; Altun y Cetinus, 2007).

Como se explico anteriormente, una de las ventajasprincipales que ofrece la inmovilizacion de enzimas ensoportes solidos es que estas pueden ser empacadas enun reactor generando con ello procesos continuos decatalisis sin ocasionar perdidas de la enzima al finaldel proceso. Existen pocos estudios relacionados conla hidrolisis continua de proteınas con la ayuda debioreactores que contengan proteasas inmovilizadas.Motoi y col. (2004), consideran que este tipo dehidrolisis se ve limitada por la facil degradacionde la estructura proteica debido a la contaminacionmicrobiana; y ademas, a que el gran tamano molecularde los sustratos de origen proteico generalmenteocasiona problemas de impedimento esterico quereducen la capacidad de hidrolisis de las proteasasinmovilizadas.

En relacion a las limitantes antes expuestas,Motoi y col. (2004) implementaron un sistemacatalıtico compuesto de un bioreactor empacado conpepsina inmovilizada covalentemente en esferas dequitosano para la hidrolisis de gluten. En otro estudio,Benkhelifa y col. (2005) desarrollaron un reactor tipoTorus para llevar a cabo la hidrolisis de caseına conla ayuda de una proteasa XIX de Aspergillus sojaeinmovilizada en esferas de quitosano entrecruzadascon glutaraldehıdo. En la Tabla 2 se muestran laseficiencias en la hidrolisis y capacidad de operacioncontinua de las proteasas inmovilizadas en los estudiosantes citados.

5.4.2. Estabilidad al almacenamiento

De acuerdo a Gianfreda y Scarfi (1991), las proteasaspresentan una gran inestabilidad al almacenamientodebido a que este tipo de enzimas se hidrolizanentre ellas mismas; dicho de otra manera, presentanautolisis. De lo anterior deriva que la inmovilizacionde enzimas sea una de las estrategias mas utilizadaspara estabilizar a estas macromoleculas durante unalmacenamiento prolongado basandose en la premisade que el proceso de inmovilizacion reduce laflexibilidad conformacional de la enzima y por ende

se reduce la velocidad del proceso autolıtico. Aunadoa lo anterior, Mateo y col. (2007) explican que lainmovilizacion de enzimas en un soporte solido porosoocasiona que las moleculas de enzima se dispersen porcompleto en el soporte y por lo tanto, la posibilidadde autolisis o de proteolisis ocasionada por enzimasproteolıticas presentes en el extracto (diferentes a laenzima de interes) es disminuida debido a que estasultimas tambien se encuentran unidas al soporte.

Tomando en cuenta que los materiales a basede quitina y quitosano presentan porosidad ygran afinidad por las proteınas, la estabilidad alalmacenamiento de las proteasas inmovilizadas enestos polisacaridos se ve notablemente mejoradaincluso a temperaturas de almacenamiento de 25◦C.En la Tabla 2 se muestran porcentajes de retencionde actividad enzimatica con respecto al tiempo dealmacenamiento de proteasas inmovilizadas en quitinay quitosano.

5.5 Aplicaciones de sistemas catalıticosconstituidos de proteasas inmovilizadasen materiales a base de quitina yquitosano

En la Tabla 2 se muestran algunas aplicaciones delos sistemas catalıticos conformados por proteasasinmovilizadas en materiales a base de quitina yquitosano. Se observa que estos sistemas puedenser utilizados como herramientas biotecnologicas endiversas areas de la industria tales como procesos deseparacion cromatografica, produccion de compuestosbio-activos, procesos relacionados con la industriaalimentaria y catalisis en medios no convencionales,entre otros. A continuacion se discuten algunas de lasaplicaciones de proteasas inmovilizadas en quitina yquitosano.

En un estudio realizado por Azarnia y col. (2010),se encapsulo una aminopeptidasa en una matrizcompuesta de alginato recubierta con quitosano. Elsistema catalıtico fue aplicado en la maduracionde queso Cheddar como una alternativa al metodotradicional de maduracion que consiste en la adiciondirecta de las enzimas a la leche y que implicauna perdida de alrededor del 90% de las enzimasadicionadas durante la fabricacion del queso. Losresultados de esta investigacion indican que lavelocidad de maduracion del queso Cheddar fueaumentada significativamente con respecto al quesocontrol. El analisis sensorial de los quesos indico queel queso madurado con la enzima encapsulada poseıa

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mayor sabor y aroma que el queso madurado con laenzima libre y los panelistas no detectaron ningunefecto sensorial negativo en los quesos que contenıanlas capsulas de alginato-quitosano.

En un estudio reciente, Kumari y col. (2013)encapsularon tripsina en nanocapsulas de quitosanopara la suplementacion de una dieta dirigida al cultivode carpa hindu (Labeo rohita). De acuerdo a losautores, la suplementacion de enzimas proteolıticasexogenas en la dieta es requerida en ciertascondiciones de enfermedad tanto en humanos comoen animales; sin embargo, tal aplicacion se ve limitadapor la inestabilidad que presentan las enzimas a ciertascondiciones de pH, temperatura, susceptibilidad ainhibidores y a la posibilidad de que la inadecuadaadministracion de estas enzimas cause dano anivel intestinal. Los resultados de esta investigacionindicaron que la dieta suplementada con el sistemananoencapsulado de liberacion prolongada de tripsinatuvo un mejor efecto que la dieta suplementadacon la enzima libre en la digestibilidad y actividadproteolıtica intestinal de carpa hindu.

Dentro del campo de la biotecnologıa un aspectode gran relevancia es la purificacion de enzimas.En este respecto el quitosano ha sido consideradocomo una de las matrices cromatograficas con mayorpotencial por lo que su uso para estos fines haaumentado en anos recientes (Gupta y Jabrail 2006).Por ejemplo, He y col. (2010) desarrollaron un sistemacromatografico consistente de una resina de nylonrecubierta con quitosano y funcionalizada con metales(Cu2+, Ni2+, Zn2+, y Co2+) con la finalidad de purificarpapaına a gran escala. Los autores reportaron queutilizando la resina de afinidad a metales lograronpurificar a la papaına en un solo paso cromatograficocon incrementos en pureza del orden de 26.2, 20.5, 27,y 23.2 para Cu2+, Ni2+, Zn2+, y Co2+ respectivamente.

Conclusiones

Dentro de la amplia variedad de polımeros naturalesutilizados como soportes para inmovilizar enzimas, laquitina y el quitosano se colocan como una de lasmejores opciones debido a las propiedades funcionalesde estos polisacaridos. Por otro lado, las proteasasson enzimas que poseen gran importancia desde elpunto de vista de su aplicacion industrial por lo quesu inmovilizacion puede potencializar aun mas lacapacidad catalıtica de este tipo de enzimas.

La inmovilizacion de proteasas en materiales abase de quitina y quitosano es una estrategia que

permite aumentar la estabilidad de la estructuraproteica y por ende disminuir su desnaturalizaciona altas temperaturas. De igual forma, mejora suestabilidad al almacenamiento debido a que el procesode inmovilizacion disminuye considerablementela autoproteolisis. Tomando en cuenta el efectoestabilizante de la inmovilizacion sobre la actividadproteolıtica, resulta de gran interes el realizarestudios encaminados al diseno de bioreactoresque permitan la hidrolisis continua y especıfica desustratos de origen proteico para la generacion dehidrolizados que posean propiedades funcionales ysensoriales mejoradas (p. ej. capacidad espumante,antihipertensiva, antioxidante, reduccion de saboramargo, etc.).

La reactividad quımica de la quitina y elquitosano permite el diseno de una extensa gamade sistemas catalıticos en los cuales las proteasaspueden ser inmovilizadas de forma covalente, ionica,por atrapamiento o por encapsulacion. Ademas,estos polisacaridos pueden ser combinados conuna extensa variedad de compuestos organicos einorganicos permitiendo tanto el diseno de estructurasde inmovilizacion con propiedades muy especıficascomo el diseno de estructuras catalıticas desde laescala macro hasta el orden nanometrico. Aunadoa lo anterior, las caracterısticas de compatibilidadbiologica de la quitina y el quitosano puedenpermitir el diseno de soportes de inmovilizacionde proteasas para ser utilizados en aplicacionesdonde el ser humano sea el usuario final, como loson las relacionadas con la industria alimentaria yfarmaceutica.

AgradecimientosEl primer autor agradece el apoyo al ConsejoNacional de Ciencia y Tecnologıa (CONACYT) y ala Universidad Politecnica de Sinaloa, por el apoyobrindado para la realizacion de estudios de doctoradoen el Centro de Investigacion en Alimentacion yDesarrollo (CIAD, A.C.).

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