Real time PCRبیان ژن و

تدوین و تالیف:

بختیار مجرومی )اکرشناس ارشد بیوتکنولوژی(

6931خردادماه _ویرایش اول

@Gene_Expression

بیان ژن

ژن جزء جدانشدنی بیان تحلیل و تجزیهملکولی مدرن است. شناسیزیستمطالعه الگوی بیان ژن یکی از مراحل مهم

کی چیده، مسیرهای متابولیشناخت بهتر فرآیندهای بیولوژیکی پی بوده که زنده موجودات همه در کاربردی ژنومیکس مطالعات

نوین، شناسییستزدر .( et al.,Jain 2006)دهد های محیطی و رشد و نمو هستند، افزایش میها را که زمینه پاسخو پیام

با هاوشترون. این یابدبا سطح بیان پایین روز به روز اهمیت بیشتری پیدا می ییهارونوشتبرای جستجوی آنالیز بیان ژن،

.(,Bustin (2000 ها کاربرد دارندیا تشخیص بیماری فناورییستزمقادیر بسیار کم در

های بیان ژندر آزمایش محدودکنندهخالص، یک روش بسیار مهم و یک عامل نسبتاًاستخراج اسیدهای نوکلئیک

اسیدهای یسازخالصکند. را با مشکل مواجه می RNAکه استخراج ای گیاهی دارای ترکیبات مختلفی بودههباشد. بافتمی

این عوامل های ثانویه همراه است کههای پلی ساکاریدی، پلی فنلی و متابولیتهای گیاهی اغلب با آلودگینوکلئیک از بافت

نوردرن بالت، هاییشآزمابرای RNAبعدی از یهااستفادهها در این آلودگیشود. می یفیتباک RNAآوردن به دستمانع

سعی بر کاهش ،RNAهای مختلف استخراج د که با استفاده از روشنشومشکل میویسی معکوس و بیان ژن باعث بروز رون

توسط mRNAباید ،برای نمونه ها گیری بیان ژن. قبل از اندازه( et al.Dal cin, 2005)د گیرمیصورت ها این آلودگی

ها گیری کمی سطوح بیان ژناندازه هرحالبه .( et al.Stahlberg, 2004)د تبدیل شو cDNAواکنش رونویسی معکوس به

ی به ژن ها میزان بیان از ژنملکولی تبدیل شده است. برای بسیاری از ژن شناسییستز هاییشآزماترین به یکی از اصلی

.Fraga) ,(2008کند چشمگیری تغییر می طوربهدیگر و از سلولی به سلول دیگر و یا در طول شرایط آزمایشی مختلف

-رایهآگیرند، شامل روش نوردرن بالت، ریزها مورد استفاده قرار میرایج برای ارزیابی بیان ژن طوربههایی که ترین روشمهم

Real timeو cDNAهای باشند که در این میان، دو روش ریزآرایهمی Real time PCR و cDNA، SAGE1های

PCR های ریزآرایه ژن در یک نمونه با روشهستند. میزان بیان تعداد زیادی برخورداراز محبوبیت باالییcDNA قابل

یریگاندازهقابل time PCR Realبا حساسیت و دقت بسیار باال با روش شدهانتخابهای باشد ولی بیان ژنبررسی می

1 Serial Analysis of gene expression

Real time PCR بیان ژن و

2

برای مطالعه بیان برخی Real time PCR. با توجه به اینکه در این تحقیق از روش ( et al.,Stahlberg 2004(باشد می

ود.شاست، لذا این روش توضیح داده می شدهاستفادهتنش سرما یرتأثهای دخیل در بیوسنتز ترپنوئیدها تحت ژن

واقعي( زمان در پلیمراز ایزنجیره واكنش) Real time PCR روش

آنالیز مطالعات خصوصاً مولکولی، شناسییستز هایروش در انقالبیسبب Real time PCR روش معرفی و اختراع

et Jain) نمود اشاره دقیق سنجی کمیتباال و حساسیت به توانمی روش این یمزایا ینترمهم از .است گردیده ژن بیان

2006 al.,). روش Real time PCR شود. اساس این روشی مناسب و دقیق برای مطالعه بیان ژن استفاده می عنوانبه

از طریق مرحله تصاعدی واکنش و سنجش میزان نشر نور PCRدر یرشدهتکثهای روش مبتنی بر سنجش کمی نسخه

معرفی شد. 1991در سال و همکاران Higuchi (. این روش ابتدا توسط1811باشد )منصوری و همکاران، فلورسانس می

های بت به روششود؛ ریسک آلودگی نساسیدنوکلئیک تکثیر یافته و مراحل تشخیص در یک محیط بسته انجام می کهییازآنجا

، مشاهده PCRیابد. سرعت در انجام آزمایش، حذف مرحله ردیابی محصول پس از کاهش می PCRکالسیک و معمولی

باعث تحول عظیم Real time PCRلحظه به لحظه واکنش و قطع آن در هر زمان، حساسیت و اختصاصیت باال در روش

ز ها، افتراق آللی و بسیاری اارزیابی درمان، تشخیص جهشا، هها، بررسی بیان ژندر تشخیص مولکولی میکروارگانیسم

(SNP) های تک نوکلئوتیدیناشی از جهش هاییچندشکلهمچنین این روش در تشخیص های دیگر شده است.کاربرد

. (Klein, 2002)کاربرد دارد

رود اما هم بکار می PCRReal timeاست؛ در یازموردنمعمولی PCRگرهایی که برای یک تمامی اصول و واکنش

ول، شوند که در صورت تکثیر محصطراحی می یاگونهبهها یک گزارشگر فلورسنت نیز در واکنش حضور دارد. این گزارشگر

اگر واکنش عموالًمنسبت مستقیم دارد. آمدهدستبهدر دستگاه با میزان محصول شدهثبتنور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور

1شود. که به این ناحیه، خط پایهچرخه ابتدایی تغییر چندانی در شدت فلورسنت دیده نمی 11تا 8 شده باشد، در سازیینهبه

2 Base line

Real time PCR بیان ژن و

3

ی افزایش نمای صورتبهیابد. مقدار سیگنال تولیدی در ابتدای مرحله دوم شدت فلورسنت افزایش می ،گویند. ولی در ادامه

کمکمشوند و های پلیمراز محدود میتعداد مولکول رود،سمت فاز خطی پیش مییابد و زمانی که تکثیر از فاز نمایی به می

چند مرحله دارد: Real time PCR یطورکلبه. et al.(Kubista, (2006رسد به اتمام می Real time PCRواکنش

نیست. یابیردقابلای وجود دارد ولی نور آن محصول دو رشته ینکهباوجودا :(Linear ground)فاز اول

شود و رشد نمایی مربوط به واکنش شروع ای در هر چرخه دو برابر میمحصول دو رشته :(Early exponential) فاز دوم

یابد.نسبت به فاز اول افزایش می یاعمدهطور میزان فلورسنس به شود ومی

ها رو به اتمام است.: ترکیبات واکنش و کارایی آنlinear)-(Logفاز سوم

Tichopad), شودافزایش در میزان فلورسنت مشاهده نمی روند وها از بین می: ترکیبات و کارایی آن(Plateau)فاز چهارم

(4-1)شکل .(2004

Real time PCR 2005), (Wong and Medrano مراحل مختلف واكنش -1شکل

@Gene_Expression

Real time PCR بیان ژن و

4

ها در فاز خطی است، انجام گیرد. سطحی از سیگنال نمونهای که تکثیر در تمام میزان بیان باید در مرحله یریگاندازه

ود، شداری به لحاظ آماری نسبت به سیگنال سطح پایه مشاهده میافزایش معنی Real time PCRفلورسنت که در واکنش

Threshold 2015گویندمی) et al.,(Heid . که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه باشد، چرخه آستانه ییهاچرخهبه اولین

اولیه را تخمین زد. mRNAتوان مقدارو از روی آن می دارد دارییمعنبا مقدار الگوی اولیه رابطه TCگویند. عدد TC8یا

برآورد کمی از مقدار الگوی اولیه ود. اگر بخواهیم با کمک این روششکم می TCهر چه مقدار الگوی اولیه بیشتر باشد، مقدار

گاه تکثیر و و با دست شخصی از یک نمونه معلوم تهیههای مغلظت ر استاندارد رسم کنیم. ابتداداشته باشیم، باید یک نمودا

به دستاولیه را توان غلظت رونوشتبرای نمونه مجهول می TCکنیم و با تکثیر و ارزیابی سپس منحنی استاندارد رسم می

را روی Real time PCRتوان برای صحت انجام تکثیر، محصول ؛ میReal time PCRواکنش آورد. پس از انجام

Wong; 2006 ,et al.Michael )د را مشاهده کر موردنظرداری، باند برالکتروفورز ژل آگارز بررسی نموده و پس از عکس

2005 and Medrano,). (1-1)شکل

et al.,(Heid (2015 روی آن مشخص استTCوThresholdكه Real time PCRواكنشمنحني -2شکل

3 Threshold Cycle

Real time PCR بیان ژن و

1

Real time PCR درحاصل از تکثیر یهافرآوردههای شناسایي روش

های مبتنی و روش DNAهای متصل شونده به های مبتنی بر استفاده از رنگد: روشنشوبه دو دسته تقسیم میها این روش

شود.که در ذیل توضیح داده می هاکاوشگربر

DNA های متصل شونده بههای مبتني بر استفاده از رنگروش

اشاره نمود. Eva Greenو SYBR Green I ،1-PRO-YOتوان به می DNAهای متصل شونده به از رنگ

شود لذا در این موارد بازتاب ضعیفیمتصل نمی یارشتهتکورسنت بوده و به الگوهای های فلاز رنگ I Green SYBR رنگ

دت افزایش شمتصل شده و در نتیجه هاآنبه شود، این رنگای تولید میکه محصول دو رشته PCRهای طی چرخه دارد. در

شود. این رنگ غیراختصاصی بوده لذا برای ای متناسب بوده که توسط دستگاه ثبت میدو رشته DNAفلورسنت با غلظت

توان به عدم تداخل با پلیمرازها، ساده و غیر سمی بودن آن اشاره نمود. است. از مزایای آن می استفادهقابل هایشآزماتمامی

دایمر را به کمک این رنگ تشخیص داد. البته استفاده از آغازگرتوان وجود محصوالت غیراختصاصی یا به همین دلیل نمی

Real timeخالصه واکنش طوربه های امروزی، این مشکل را تا حدودی مرتفع کرده است.نمودار منحنی ذوب در دستگاه

PCR باشد:با رنگ سایبرگرین شامل مراحل زیر می

شود.، فلورسنت ضعیفی ساطع میاندنشدهمتصل DNAهای رنگی به . در ابتدای واکنش که مولکول1

شوند که به محض جذب ای متصل میدو رشاته DNAهای رنگی به شایارهای کوچک ها، مولکولآغازگر. بعد از اتصاال 1

کند. نانومتری را ساطع می 111نانومتر، نور 491 موجطول

محضهبشود. در میزان فلورسنت مشاهده میشوند و یک افزایش می های رنگی بیشاتری متصل . در طول بساط، مولکول 8

یابد. این رنگ تحتشوند و تشعشعات فلورسنت کاهش میهای رنگی آزاد میبعدی مولکول چرخهشادن، برای واسارشات

)شااود می موجطولماند. سااطح مطلوبی از درجه حرارت موجب تنظیم القاء و نشاار ، پایدار و باثبات باقی میPCRشاارایط

2001,Dubrana). (6-1)شکل

Real time PCR بیان ژن و

6

@Gene_Expression

(Dubrana, 2001)ن گری با سایبر Real time PCRشمایي از انجام -3شکل

Hydrolysis یكاوشگرهاهای مبتني بر روش

و رنگ فلورسنت دیگری 1'در انتهای 4گزارشگر ها در این است که یک رنگ فلورسنت به نام کاوشگرتفاوت یطورکلبه

خاموشگر در فاصله نزدیکی از هم قرار دارند )در حالت گزارشگر و کهیهنگامشود. تعبیه می 8'در انتهای 1خاموشگربه نام

شدن این جدا محضبهگردد، ولی و ثبت نمی شدهجذب(، اگر نوری از گزارشگر ساطع شود، توسط خاموشگر کاوشگرعادی

نیست و توسط ذبجقابلوسیله خاموشگر توسط گزارشگر، به شدهساطع( نور کاوشگرتکثیر و شکسته شدن یجهدرنتدو رنگ )

گیری است.صورت فلورسانت قابل ارزیابی و اندازهدستگاه به

Taq Man كاوشگر

های رکاوشگاز کاوشگررود؛ یک کار می سنتی برای تکثیر رشته الگو به PCRی که در آغازگردر این روش عالوه بر دو

سمت قدارای دو کاوشگراین شود.به ناحیه هدف متصل می آغازگر دستیینپاطور اختصاصی در محلی در به هیدرولیزی

آن. تا زمانی که گزارشگر و خاموشگر 8'متصل شده و رنگ خاموشگر در انتهای کاوشگر 1'ست؛ رنگ گزارشگر که به انتهای ا

لیمراز شروع پ DNA آنزیم تک کهیوقتکند. در واقع در فاصله مناسبی از هم باشند، خاموشگر از تشعشع فلورسنت ممانعت می

کند و تخریب می 1'را از قسمت کاوشگررسیده و با فعالیت اگزونوکلئازی کاوشگربه کند،می آغازگر 8'به سنتز از قسمت

(7-1شکل ) (Dubrana, 2001)شود فلورسنت ساطع می یتدرنهافاصله دو قسمت مذکور افزایش یافته و

4 Reporter 5 Quencher

Real time PCR بیان ژن و

7

Real time PCR (Dubrana, 2001)روشدر TaqMan كاوشگرچگونگي عملکرد -4شکل

Scorpions كاوشگر

باشد. دو طرف می 6رفت آغازگرشود که مکمل تعدادی از نوکلئوتیدها بعد از محل اتصال طوری طراحی می کاوشگرتوالی

صورت ساقه به 1'نماید. انتهای می ایاست که در دمای محیط ایجاد ملکول دو رشتهشامل توالی شش نوکلئوتیدی کاوشگر

اسکورپین، یک کاوشگربا آغازگرباشد. همچنین در محل اتصال به خاموشگر متصل می 8'کوواالن به گزارشگر و انتهای

د.پلیمراز قادر به بسط از این قسمت نخواهد بو DNAوجود دارد که شامل مونومری است که آنزیم مسدودکنندهقسمت

آن 1'صورتی است که انتهای به کاوشگرگیری . جهتشوداست، نور ساطع نمی ایدو رشتهصورت به کاوشگر کههنگامی

هیرشدتکثباز و به قسمت کاوشگرها، لوپ آغازگر بااتصال زمانهم PCR هایچرخهباشد. در طول هدف می 8'مکمل انتهای

از گرکاوششود. در مرحله بعد، علت جدا شدن گزارشگر از خاموشگر نور ساطع می به یجهدرنتشود و از چرخه قبل متصل می

6 Forward

Real time PCR بیان ژن و

8

با افزایش محصول مقدار فلورسانس نیز افزایش ، مرحله از اتصال در هر ترتیبینابه. آیدیدرمحالت خاموش الگو جدا شده و به

(.1-1)شکل et al., (Thelwell(2000یابد می

Real time PCR (Mcpherson and Moller, 2006)در Scorpions كاوشگرچگونگي عملکرد -5شکل

Hybridization روش مبتني بر

شود و رنگ صورت دو قطعه مختلف طراحی میبه کاوشگرشود، نیز نامیده می FRET 7در این سیستم که اصطالحاً

در کنار هم قرار کاوشگرگیرد. وقتی این دو رنگ پس از چسبیدن دیگری قرار می 8'یکی و انتهای 1'فلورسانت در انتهای

است که یورتصبه کاوشگرها در این شود. انتخاب یکی از رنگمی یریگاندازهتوسط دستگاه شدهساطعگیرند، فلورسنت می

(.9-1کند )شکل عنوان محرک دیگری عمل میاز یکی به شدهساطع موجطول

7 Fluorescent resonance energy transfer

Real time PCR بیان ژن و

9

شود . متصل نمی DNAبه کاوشگرها به نحوی است که در صورت تفاوت حتی در یک نوکلئوتید، کاوشگرطراحی این

مکمل باز یافتهجهشای چون باز های نقطهباشد. در جهشمی هاSNPها در تشخیص کاوشگریکی از کاربردهای این

. Bernard and wittwer) (2000 ,گیردموردنظر نیست، اتصال صورت نمی

( al. etHaugland, 2002)با روش هیبریداسیون Real time PCRشمایي از انجام -6شکل

Real time PCR در هاداده یسازنرمال

های آزمایشی جهت به حداقل رساندن خطای نمونه یسازنرمال، هانالیز بیان ژن در سطح رونوشتدر مطالعات آ

، استخراج یبردارنمونهدر طی مراحل آزمایش شامل مراحل اصوالًباشد. این خطاها ، بسیار حائز اهمیت مییبردارنمونه

RNA ساخت ،cDNA ددهنمیو غیره رخ (2004 ,.et alDheda ). های مختلفی برای برآورد و رفع این خطاها روش

های کیت سنجی دقیق بوده که خود نیاز به روش RNAدر سطح یسازنرمالها، روش ینترسادهپیشنهاد شده است. یکی از

.گیردیبرنمو غیره را در PCR، کارایی cDNAمراحل بعدی آنالیز یعنی ساخت یسازنرمالدارد. از این گذشته، این نوع

عنوانبه خود کهشود طور گسترده استفاده میباشد که امروزه بهمییا مرجع مرجعهای ، استفاده از ژنیسازنرمالروش دیگر

در بین مرجعهای سطوح بیان ژن یطورکلبه شود.ارزیابی می Real time PCRروش در مخاطرات ینترمهم از یکی

صورت در که. ( et al.Thellin, 1999)شود های مختلف و تحت شرایط مختلف آزمایشی ثابت فرض میهای بافتسلول

,Bustin) بود نخواهد ذهن از دور اشتباه نتایج و قرارگرفته شعاع تحت آزمایشی هاینمونه یسازنرمال فرض، این نقض

هایژن اندک اختالفات تعیین امکان عدم به منجر هانمونه بین در مرجع هایژن تصادفی نوسانات که نحو بدین (.2000

@Gene_ExpressionReal time PCR بیان ژن و

10

یندفرآ محیطی، و آزمایشگاهی شرایط به نسبت هاژن این مستقیم یرپذیریتأث صورت در گذشته این از. گردید خواهد هدف

های مرجع درگیر در با استفاده از ژن یسازنرمالیند فرآ (. et al.,Dheda 2004) گرددمی مواجه چالش با یسازنرمال

و گلیسرآلدهید( TUB)10بتاتوبولین ،(ACT)9اکتین ،(UBQ) 1کوئیتین، یوبی18S rRNAفرآیندهای ساختاری سلولی، نظیر

). al.et Jain, (2006گیردکه از بیان یکنواختی برخوردار هستند، انجام می (GAPDH)11فسفات دهیدروژناز -8

باشد:های مرجع شامل این موارد میهای ژنویژگی

باید موردنظر( بیان ژن مرجع و ژن 8ها بیان شود. ( در همه سلول1ها تعداد کپی یکسانی داشته باشد. ( در همه سلول1

ین صورت زیادی دارد. در اشود؛ نباید ژن مرجعی انتخاب کنیم که بیان به میزان کم بیان می موردنظرمتناسب باشند. اگر ژن

های واکنش و آزمایش ( ژن مرجع نباید از تیمارگر4شود. مقایسه یک مقدار کم با یک مقدار زیاد باعث افزایش خطای کار می

et al.,.(Tricarico (2002 بپذیرد یرتأث

Real time PCR های تعیین كمیت باروش

های حاصل از مطالعه باشد. آنالیز دادهمی Real time PCRترین کاربردهای یکی از مهم شدهیانبتعیین کمی مقدار ژن

ها به هدف تحقیق از این روش هرکدامگیرد. انتخاب به دو روش نسبی و مطلق انجام می Real time PCRبیان ژن با

وردمطالعهمهای ژن مطلق تعداد واقعی کپیروش شوند. در تحقیقات ملکولی استفاده می اکنونهمبستگی دارد و هر دو روش

شود. باشد و اغلب برای تعیین تعداد کپی ویروسی استفاده میکند و نیازمند تعیین منحنی استاندارد میرا در نمونه مشخص می

رل تنسبت به حالت کن موردمطالعههای باشد. در روش نسبی میزان نسبی بیان ژن یا ژنو دشوار می یمتقگراناین روش

و استفاده ΔΔCTشود و به دو روش شود. این روش بیشتر در مطالعات مربوط به تعیین میزان بیان ژن استفاده میمحاسبه می

شود.گیرد که در ذیل توضیح داده میاز منحنی استاندارد انجام می

8 Ubiqutin 9 Actin 10 B-tubulin 11 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Real time PCR بیان ژن و

11

: 12كمیت سنجي نسبي

یرد. گقرار می موردبحثطور نسبی کاهش یا افزایش بیان ژن بهشود و گیری نمیدر این روش تعداد رونوشت ژن اندازه

ها الزم شود. در کمیت سنجی نسبی اطالع از غلظت نمونهمقایسه می مرجعاین کاهش یا افزایش با یک استاندارد یا ژن

ز دو ها ابیان ژن است. برای محاسبه میزان نسبی صرفهبهمقروننیست. این روش هم از نظر اقتصادی و هم از نظر زمانی

هانسبی بیان ژنمیزان CTΔΔدر روش .(,Pffafi 2001)شود استفاده می استفاده از منحنی استاندارد و CTΔΔ روش

شود:زیر محاسبه می صورتبه

ΔCT )نمونه تیمار شده( = CT )ژن موردنظر در نمونه( - CT )ژن نرمال کننده در همان نمونه(

ΔCT )کنترل( = CT )ژن موردنظر در شاهد( - CT )ژن نرمال کننده در شاهد(

ΔΔCT = ΔCT )نمونه( - ΔCT )کنترل(

R )2 = )میزان نسبی بیان ژن –ΔΔCT

شود و از ژن در نمونه تیمار شده و شاهد استفاده می موردنظربین ژن tCاز تفاوت مقادیر منحنی استاندارددر روش

در این روش برای محاسبه میزان کارایی از دو روش زیر شود.نیز برای تصحیح و افزایش کارایی تکثیر استفاده می مرجع

:شودمیاستفاده

های مختلف.با رقت PCRو با استفاده از انجام خطشیب. بر اساس 1

قبلی کارایی چرخهنسبت به چرخهدر هر تیوب در هر cDNAکه با مقایسه تکثیر LinRegPCR افزارنرمبا استفاده از . 1

(.,Pffafi 2001) شودواکنش محاسبه می

12 Relative quantification

Real time PCR بیان ژن و

12

13كمیت سنجي مطلق

نسبت به یک منحنی استاندارد به Real time PCRبا استفاده از سیگنال معموالًر این روش محاسبات تعداد کپی ژن د

با حداقل سه تکرار Real time PCR یلهوسبهشود و با غلظت مشخص رقیق می DNAیا RNAنمونه آید.دست می

et al.(Guo, گرددشود و غلظت آن مشخص میبا منحنی استاندارد مقایسه مینمونه مجهول tCگیرد و تکثیر انجام می

2008).

13 Absolute quantification

Real time PCR بیان ژن و

13

@Gene_Expression

منابع

1. Bernard, P. S. and Wittwer, C. T. (2000). Homogeneous amplification and variant detection

by fluorescent hybridization probes. Clinical Chemistry, 46(2):147-148.

2. Bustin, S. A. (2000). Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription

polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology, 25(2):169-193.

3. Dal Cin, V., Danesin, M., Rizzini, F. M. and Ramina, A. (2005). RNA extraction from plant

tissues. Molecular Biotechnology, 31(2):113-119.

4. Dheda, K., Huggett, J.F., Bustin, S.A., Johnson, M.A., Rook, G. and Zumla, A. (2004).

Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR.

Biotechniques, 37:112-114.

5. Dubrana, K. (2001). Examining the distribution of telomeric and DNA repair proteins by

ChrIP and real time PCR. Mapping protein/DNA interactions by cross-linking [Internet]. Paris:

Institut national de la sante et de la recherche medicale. 13P.

6. Fraga, D., Meulia, T. and Fenster, S. (2008). Real‐Time PCR. Current Protocols Essential

Laboratory Techniques, 3-10.

7. Guo, X., Xia, X., Tang, R. and Wang, K. (2008). Real-time PCR quantification of the

predominant bacterial divisions in the distal gut of Meishan and Landrace pigs. Anaerobe,

14:224–228.

8. Haugland, R.A., Brinkman, N. and Vesper, S.J. (2002). Evaluation of rapid DNA extraction

methods for the quantitative detection of fungi using real-time PCR analysis. Journal of

Microbiological Methods, 50:319–323.

9. Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J. and Williams, P.M. (2015). Real Time Quantitative

PCR. Genome research, 986-994.

10. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R. (1992). Simultaneous amplification

and detection of specific DNA sequences. Biotechnology, 10(4):413-417.

11. Jain, M., Nijhawan, A., Tyagi, A. K., and Khurana, J. P. (2006). Validation of

housekeeping genes as internal control for studying gene expression in rice by quantitative

real-time PCR. Biochemical and biophysical research communications, 345(2):646-651.

Real time PCR بیان ژن و

14

12. Klein, D. (2002). Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations.

Trends in Molecular Medicine, 8(6), 257-260.

13. Kubista, M., Manuel, B., Bengtsson, M., Forootan A., Jonac, J., Lind, K., Sindelka, R.,

Sjoback, A., Bjorn Sjogreen, D., Linda Stro, M., Stahlberg, A. and Zoric, N. (2006). The

real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine, 27:95-125.

14. Mcpherson, M.J. and Moller, S.G. (2006). PCR Second Edition, Published by: Taylor and

France Group. 209-231.

15. Michael, J., Pherson, Mc. and Moller, S.G. (2006). PCR Second Edition. Published by:

Taylor & Francis Group. PP: 209-231.

16. Pfaffl, M. W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–

PCR. Nucleic acids research, 29(9):e45-e45.

17. Stahlberg, A., Hakansson, J., Xian, X., Semb, H. and Kubista, M. (2004). Properties of the

reverse transcription reaction in mRNA quantification. Clinical Chemistry, 50(3):509-515.

18. Thellin, O., Zorzi, W., Lakaye, B., Borman, B., Coumans, B., Hennen, G., Grisar, T.,

Igout, A. and Heinen, E. (1999). Housekeeping genes as internal standards: use and limits.

Journal of Biotechnology, 75:291-295.

19. Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. and Brown, T. (2000). Mode of action

and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Research, 28(19):3752-3761.

20. Tichopád, A. (2004). Quantitative real-time RT-PCR based transcriptomics: Improvement of

evaluation methods (Doctoral dissertation).

21. Tricarico, C.P., Pinzani, S., Bianchi, M., Paglierani, V., Distante, M., Pazzagli, S., Bustin,

A. and Orlando, C. (2002). Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain

reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human

tissue biopsies. Analytical Biochemistry, 309(2):293-300.

22. Wong, M.L. and Medrano, J.F. (2005). Real-time PCR for mRNA quantitation,

Biotechniques, 39(1):75.

Real time PCR بیان ژن و

15

@Gene_Expression