Raccomandazioni di AIOM e SIAPEC-IAP

Nicola Normanno

ISTITUTO NAZIONALE PER LO STUDIO E LA CURA DEI TUMORI

FONDAZIONE G. Pascale – NAPOLISC Biologia Cellulare e Bioterapie

CENTRO RICERCHE ONCOLOGICHE MERCOGLIANO (AV)

Laboratorio di Farmacogenomica

BRIM-3 (NO25026): Phase III Study in Previously Untreated Patients with Metastatic Melanoma

• International, multicenter, randomized, open-label Phase III study• This study is currently ongoing

• Co-primary endpoints:– Overall survival– PFS

• Key secondary endpoints:– Efficacy: BORR, time to response, duration of response, time to treatment failure– Safety and tolerability– Pharmacokinetics– Contribute to validation of cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test

Vemurafenib(960 mg BID orally)

Dacarbazine(1000 mg/m2 IV q3w)

1:1

o Estimated enrollment: 680 patients o Unresectable metastatic melanoma (stage

IIIc/IV, AJCC) o BRAFV600 mutation positive, determined by

cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Testo Chemo-naïve for advanced disease

N=680

NCT01006980. Available at www.clinicaltrials.gov (last accessed August 10, 2010).

Chapman P. et al Abs LBA4 ASCO 2011

100908070605040302010

0

Prog

ress

ion-

free

sur

viva

l (%

)

0 6 12 18 24

338337

63186

2277

316

00

100269

37113

1449

03

No. at risk

1.6 6.9

Hazard ratio 0.38 (95% CI: 0.32–0.46)Log-rank p<0.001 (post-hoc)

Dacarbazine (n=338)

Vemurafenib (n=337)

Progression-free survival (February 01, 2012 cut-off) censored at crossover

Time (months)

DacarbazineVemurafenib

Chapman P. et al. abs 8502 ASCO Ann. Meeting Chicago 2012

100908070605040302010

0

Ove

rall

surv

ival

(%)

0 6 12 18 24

Vemurafenib (n=337)Median f/u 12.5 months

Dacarbazine (n=338)Median f/u 9.5 months

338337

173280

79178

2444

01

244326

111231

50109

47

9.7 13.6

Overall survival (February 01, 2012 cut-off) censored at crossover

Hazard ratio 0.70 (95% CI: 0.57–0.87)p<0.001 (post-hoc)

Time (months)

DacarbazineVemurafenib

No. at risk

Chapman P. et al. abs 8502 ASCO Ann. Meeting Chicago 2012

The trial enrolled 20 patients with non-V600E mutations (19 with V600K and 1 with V600D)

4 of 10 patients with the BRAF V600K mutation had a response to vemurafenib

BRAF Mutations Affect Kinase Activity• Ninety percent of BRAF mutations in melanoma result in

substitution at position V6002

– All tested mutations at V600 are classified as high-activity mutants when compared with BRAFwild-type (WT)3,4

– These mutations constitutively stimulate ERK phosphorylation3

• A unifying feature of the high- and intermediate-activity BRAF mutants is that they disrupt the hydrophobic interaction between the P loop and the activation segment of the kinase domain4

– This results in destabilization of the inactive conformation of BRAF, thus stimulating its kinase activity and leading to increased ERK phosphorylation

BRAF = rapidly accelerated fibrosarcoma isoform B; ERK = extracellular signal―regulated kinase; WT = wild-type.1. Forbes SA, et al. Nucleic Acids Res 2010;38:D652–7 2. Garnett MJ, et al. Cancer Cell 2004;6:313–9.

BRAF Mutation at Position V600

Melanomas (Total 2,651 V600X)1

Relative Frequency (%)1

V600E 2,436 91.9

V600K 162 6.1

V600D 35 1.3

V600R 18 0.7

3. Wan PTC, et al. Cell 2004;116:855–67. 4. Pritchard C, et al. Biochem Soc Trans 2007;35:1329–33.

BRAF kinase domain structure. Position 600 is indicated in yellow. The BRAF activation segment is shown in purple; dashes indicate the region that was not resolved. The P loop is shown in green (adapted from Garnett MJ, et al).2

FDA NEWS RELEASEFor Immediate Release: Aug. 17, 2011

FDA approves Zelboraf and companion diagnostic test for late-stage skin cancer

Second melanoma drug approved this year that improves overall survival The U.S. Food and Drug Administration today approved Zelboraf (vemurafenib), a drug to treat patients with late-stage (metastatic) or unresectable (cannot be removed by surgery) melanoma, the most dangerous type of skin cancer. Zelboraf is specifically indicated for the treatment of patients with melanoma whose tumors express a gene mutation called BRAF V600E. The drug has not been studied in patients whose melanoma tests negative for that mutation by an FDA approved diagnostic.Zelboraf is being approved with a first-of-a-kind test called the cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test, a companion diagnostic that will help determine if a patient’s melanoma cells have the BRAF V600E mutation.The BRAF protein is normally involved in regulating cell growth, but is mutated in about half of the patients with late-stage melanomas. Zelboraf is a BRAF inhibitor that is able to block the function of the V600E-mutated BRAF protein.

Types of BRAF mutation

Arkenau BJC 2011

Classificazione Istopatologica

• Istotipi principali: melanoma a diffusione

superficiale melanoma su lentigo

maligna melanoma acrale

lentigginoso melanoma nodulare

• Varianti con caratteri citologici peculiari quali il melanoma a piccole cellule, a cellule fusate, a cellule ad anello con castone, il melanoma rabdoide, il melanoma plasmocitoide.

• Istotipi rari: melanoma desmoplastico melanoma nevoide melanoma spitzoide melanoma su nevo melanoma mucoso

lentigginoso nevo blu maligno

Fattori prognostici morfologici istopatologici

• Lo spessore del tumore, valutato istologicamente dal punto più profondo di invasione sino allo stato granuloso dell’epidermide;

• La presenza di ulcerazione; • Il numero di mitosi/mm2; • L’evidenza di satellitosi microscopica• La presenza o assenza di metastasi linfonodali o a distanza.

BRAF Mutations in Melanoma

• There is a strong inverse correlation between age and the likelihood of BRAF mutation in melanoma1

– Age <55 years is the single most predictive factor of BRAF mutation reported2

– This group of patients also presented with metastases to regional nodes more frequently2

• Melanomas positive for oncogenic BRAF are reported to show distinct morphological features2

– Increased upward migration and nest formation of intraepidermal melanocytes– Thickening of the involved epidermis, with sharper demarcation to the surrounding skin– Larger, rounder, and more pigmented tumor cells

1. Flaherty KT, et al. Cancer 2010;116:4902–13. 2. Viros A, et al. PLoS Med 2008;5:e120.

Nesting Cell shape Pigmentation

Round Spindled Absent Very high

No nesting

Extensive nesting

Grading of cellular morphological features. Examples indicate the extent of nesting, cell shape, and pigmentation (adapted from Viros A, et al).2

Frequency distribution of genetic alterations in BRAF, NRAS, and KIT in melanoma

Curtin JCO 2006

Il campione istologico

• Il campione istologico può essere rappresentato da lesioni primitive o metastatiche (cutanee, linfonodali o viscerali).

• E’ comunque preferibile un campione di lesioni metastatiche, nelle quali la componente di cellule neoplastiche è in genere maggiormente rappresentata rispetto a quanto osservato nei melanomi primitivi.

• Il tessuto tumorale può essere prelevato mediante una biopsia incisionale o essere costituito da un campione operatorio.

• L’indagine molecolare può essere eseguita: 1) su tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE); 2) su campione tissutale fresco; 3) su tessuto congelato a -80°C.

Consistency Between BRAF/NRAS Mutation Status in Primary and Secondary Lesions in

Patients With Melanoma

Colombino JCO 2012

Polyclonality of BRAF mutations in melanoma

Lin BJC 2011

Heterogeneity of BRAF mutations in melanoma

Yancowitz Plos One 2012

Dissezione tessutale• La possibilità di identificare mutazioni puntiformi in genere è

condizionata dalla percentuale di cellule tumorali ed in parte anche dalla quantità di pigmento melanico.

• È pertanto utile per questo tipo di tumore una “macro-microselezione” al fine di “arricchire” il campione , e di ridurre il più possibile le potenziali interferenze del pigmento melanico sulla qualità del DNA estratto.

• Le procedure di arricchimento contemplano le metodiche di dissezione (micro e macrodissezione tissutale) e/o di carotaggio

• Può essere utile sottoporre le sezioni ad un protocollo di decolorazione (melanin bleach).

Il campione citologico

Il materiale di archivio di campioni citologici è costituito da: • preparati citologici strisciati, colorati e montati su vetrino; • materiale citologico incluso in blocchi di paraffina

(citoinclusi); • campioni citologici in sospensione per allestimento di strisci

su strato sottile.

Estrazione del DNA• Per l’estrazione e purificazione del DNA da tessuto

paraffinato sono oggi disponibili vari kits commerciali, in genere basati sul principio della cromatografia

• I kit consentono di accorciare notevolmente i tempi necessari per l’estrazione e, al contempo, favoriscono la standardizzazione delle procedure

• Una volta estratto, il DNA viene risospeso in tampone adeguato, quindi valutato sotto il profilo qualità/quantità mediante lettura spettrofotometrica o tramite visualizzazione su gel d’agarosio.

• Per la valutazione dell’amplificabilità del DNA purificato da tessuti in paraffina, una PCR quantitativa può risultare molto più accurata della spettrofotometria

Method Limit of detection(ie, minimum % of mutant alleles in a wild type background required for reliable mutation detection)

Analytical sensitivity

Range of mutations detected

Sequencing/PCR Around 20-30% 80-85% Comprehensive

PLA-LNA clamp Reportedly below 1% Limited

ARMS (Therascreen) Up to 1% 90-95% Limited

PCR Invader® Limited

Pyro-sequencing Reportedly 1-10% 90-95% Near comprehensive

High-ResolutionMelting (HRM) 10-20% 80-85% Near comprehensive

SNaPshot® 5–10%

PCR/flRFLP 5-10%

Fragment analysis Approximately 5% 90-95% Insertions/deletions

CE-SSCP/DHPLC 5-10% 90-95% Near comprehensive

How do methods compare by performance?

Molecular testing in melanoma

Woodman CCR 2012

Kit commerciali o metodiche sviluppate in laboratorio?

• I kit diagnostici presentano numerosi vantaggi rispetto al sequenziamento diretto: risultano più rapidi e sensibili, utilizzano protocolli standardizzati, sono in genere forniti di adeguati controlli positivi e negativi, ed in alcuni casi sono stati anche approvati per l’impiego clinico in Europa (CE-IVD).

• Sebbene quest’ultimo punto non sia al momento un requisito indispensabile per l’attività di diagnostica molecolare, l’approvazione di un saggio per l’impiego clinico rappresenta sicuramente un valore aggiunto rispetto a metodiche sviluppate a scopo di ricerca.

• Per le metodiche sviluppate autonomamente, i laboratori devono dimostrare la loro sensibilità e specificità

Sequenziamento diretto del prodotto di PCR

• Le mutazioni attivanti il gene BRAF, attualmente indispensabili per l’uso di farmaci inibitori di BRAF nel trattamento del melanoma metastatico, sono localizzate nell’esone 15 del gene.

• Pertanto, l’intero esone o parte dell’esone devono essere amplificati prima di procedere all’analisi mutazionale mediante sequenziamento.

Sequenziamento diretto del prodotto di PCR• Allestire le reazioni PCR sotto cappa a flusso laminare, in un ambiente

diverso da quello utilizzato per l’analisi dei prodotti di amplificazione, impiegando materiali dedicati e con le opportune precauzioni onde evitare contaminazioni.

• Introdurre almeno un controllo positivo per mutazione ed un controllo negativo.

• Per ogni campione da analizzare, effettuare due distinte reazioni PCR che saranno sottoposte a sequenziamento in forward e reverse, in modo da ottenere un numero di 3-4 sequenze per campione.

• Considerare il campione come positivo per mutazione solo se questa è presente in almeno due diverse sequenze (una forward ed una reverse) ottenute da PCR indipendenti.

• Ad intervalli di 25-30 sequenze, sequenziare dei DNA di controllo per verificare l’assenza di contaminazioni e la qualità della processo.

• Verificare che l’efficienza della procedura garantisca un corretto risultato in almeno il 97% dei campioni e che la sensibilità del metodo non risulti superiore al 20%.

Analisi mediante Pirosequenziamento

• Le metodiche di pirosequenziamento hanno alcuni vantaggi rispetto al sequenziamento standard, tra cui la maggiore sensibilità (riportata tra il 5 ed il 10%) e la possibilità di sequenziare frammenti piuttosto corti di DNA, superando in tal modo eventuali problematiche legate alla frammentazione del DNA.

• Sono disponibili in commercio alcuni Kit per la determinazione delle mutazioni del gene BRAF basati sul pirosequenziamento

Analisi mediante Real Time PCR

• Le metodiche di RealTime PCR, in generale, possiedono una maggiore sensibilità rispetto agli approcci basati su PCR/sequenziamento.

• Le metodiche di Real Time PCR presentano anche il vantaggio di poter ottenere un buon livello di amplificazione anche in caso di DNA frammentato

• L’impiego della RealTime PCR è facilitato dall’osservazione che nel melanoma le mutazioni predittive di risposta al vemurafenib sono concentrate nel codone 600

Analisi mediante Real Time PCR

• Esistono in commercio numerosi kit per la determinazione delle mutazioni di BRAF mediante RealTime PCR.

• Questi saggi sono in genere basati sulla metodica della discriminazione allelica, alcuni impiegano anche tecniche per la amplificazione preferenziale del DNA mutato (PNA clamp,

• primer ARMS, etc.).• La maggioranza dei kit disponibili è stata disegnata per

individuare la sola mutazione V600E. Tuttavia, alcuni kit presentano una documentata reattività crociata anche per altre mutazioni di BRAF in posizione V600, quali la V600K e la V600D, e pertanto sono in grado di rilevare anche queste mutazioni.

cobas® BRAF V600 Mutation Test

Luke CCR 2012

Analisi mediante Real Time PCR

• È possibile anche progettare e validare in proprio metodiche di Real Time PCR per la individuazione delle mutazioni di BRAF.

• In questo caso, la metodica deve essere disegnata in modo da rilevare le principali mutazioni V600 di BRAF.

• La sensibilità minima raccomandata è del 10%.

Raccomandazioni per l’analisi mediante Real Time PCR

• La elevata sensibilità della Real Time PCR può essere fonte di contaminazioni. Le reazioni devono essere allestite sotto cappa a flusso laminare, in un ambiente diverso da quello utilizzato per l’analisi dei prodotti di amplificazione, impiegando materiali dedicati e con le opportune precauzioni

• Appropriati controlli positivi e negativi devono essere sempre inclusi in ogni singola determinazione

• Le reazioni devono di norma essere eseguite in duplicato• In caso di metodiche sviluppate nei laboratori, queste

devono essere validate, ovvero è indispensabile stabilire la sensibilità e l’ambito di specificità del saggio

Analisi mediante Ibridazione molecolare su filtro

• È disponibile sotto forma di kit commerciale un saggio per l’identificazione della sola mutazione BRAF V600E basato sulla PCR e sull’ibridazione inversa.

• La procedura prevede l’amplificazione tramite PCR con primer biotinilati del DNA in analisi e l’ibridazione dei prodotti amplifi cati su una striscia contenente sonde oligonucleotidiche allele-specifiche.

• Il saggio identifica la mutazione V600E con una sensibilità dell’1% circa ed è stato approvato per l’impiego clinico.

• Il kit è corredato di vari controlli che permettono di monitorare l’efficienza della reazione PCR e dell’ibridazione molecolare.

BRAF mutations: Sequencing vs COBAS

Anderson Arch Pathol Lab Med 2012

BRAF mutations: Sequencing vs COBAS

Halait Diagn Mol Pathol 2012

Refertazione - Diagnostica istopatologica

Il referto istopatologico di melanoma deve comprendere le seguenti informazioni:1. Una descrizione macroscopica che identifichi i margini di

resezione chirurgici e la distanza della neoplasia dal margine più vicino

2. Una descrizione microscopica che indichi i parametri istopatologici prognostici importanti ai fi ni della stadiazione patologica, ed indicazioni ad ulteriori eventuali procedure di stadiazione (biopsia del linfonodo sentinella).

3. Qualora siano eseguite colorazioni immunoisto-citochimiche queste devono riportate specificando gli anticorpi utilizzati e/o eventuali metodiche FISH con l’indicazione del cut-off utilizzato nella valutazione.

Refertazione – Analisi mutazionale di BRAF

• Il referto della determinazione dello stato mutazionale di BRAF deve contenere le seguenti informazioni:

1. Identificazione del paziente2. Identificazione del medico/struttura che ha richiesto l’analisi3. Materiale utilizzato4. Percentuale di cellule tumorali5. Metodica/metodiche impiegata/e6. Mutazioni indagate7. Risultati del test con specificazione del tipo di mutazione eventualmente rilevata.

Refertazione – Analisi mutazionale di BRAF

• Il referto deve essere compilato su un modello prestabilito, e firmato dall’anatomo-patologo e dall’esecutore del test molecolare.

• In considerazione dell’impatto dell’esito del test sulla strategia terapeutica, il tempo per la refertazione non deve superare le due settimane dalla richiesta della determinazione.