5/20/2018 Prinsip Dasar DNA Sequencing

1/3

Prinsip Dasar DNA Sequencing

DNA sequencing menggunakan metode PCR ( Polymerase Chain Reaction) sebagai

pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (

template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip

dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi t ertentu. Proses inidinamakan cycle sequencing.

Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:

Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti

PCR

ddNTPs ( dideoxy-Nucleotide Triphosphate) a dalah modifikasi dari d NTPs dengan

menghilangkan gugus 3-OH pada ribosa.

Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template

dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Nah, jikayang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena

ddNTP tidak memiliki gugus 3 -OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5 -fosfat dNTP

berikutnya membentuk ikatan fosfodiester.

Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang

bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan

terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa.

Metode Maxam-Gilbert

Metode ini dikembangkan oleh A.M Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1987. Prinsip dari

metode ini adalah DNA yang akan diurutkan terlebih dahulu harus diberi label di salah satu

ujung saja. Hal ini dilakukan dengan pemberian enzim kinase dengan 32P ATP di ujung 5.

Bahan kimia yang digunakan akan merusak DNA di masing-masing empat basa nukleotida

dalam kondisi hanya satu rantai yang rusak yang dibuat. DNA yang dimodifikasi kemudian

dapat dipecah oleh piperidin panas (CH2)5NH. Lalu empat tabung disiapkan yang masing

masing berisi Adenin, Timin, Guanin, dan Sitosin. Fragmen dalam empat reaksi yang

dielektroforesis berdampingan pada denaturasi gel akrilamida untuk pemisahan ukuran.Untuk memvisualisasikan fragmen, gel diberi film sinar-X untuk autoradiografi yang

menghasilkan serangkaian band gelap yang masing-masing menunjukkan lokasi molekul

DNA radiolabeled identik. Dari keberadaan dan tidak adanya fragmen tertentu urutan

mungkin disimpulkan. Setelah elektroforesis gel dan autoradiografi hanya fragmen yang

memiliki gugus 5 terminal 32P grup fosfat muncul pada gel pada posisi dasar dimodifikasi.

5/20/2018 Prinsip Dasar DNA Sequencing

2/3

Prinsip prosedur Maxam-Gilbert. Gambar menunjukan hanya untuk satu basa Adenin

Sumber: http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_14.htm

Pembacaan sekuens pada gel

Sumber: http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_14.htm

http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_14.htmhttp://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_14.htmhttp://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_14.htmhttp://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_14.htmhttp://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_14.htmhttp://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_14.htm

5/20/2018 Prinsip Dasar DNA Sequencing

3/3