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“UNIVERSIDAD PERUANA LOSANDES”

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUDCARRERA PROFESIONAL DE OBSTETRICIA

PRESENTADO A LA CÁTEDRA DE MICROBIOLOGIA YPARASITOLOGIA

PRACTICA Nº 03 - 04

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y TECNICAS DE SIEMBRA

INTEGRANTES :PATILLA MACHA MILAGROS LOURDES

QUINCHO MACHA YOLIZA KARINACRISOSTOMO PAZ ISAMAR

DOCENTE DE PRÁCTICA :Mblgo. Jaime Wester Campos

SEMESTRE :

III

TURNO :

MAÑANA

HUANCAYO – PERÚ-2009-

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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE SIEMBRA

INTRODUCCION

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que enconcentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permitenel crecimiento de los microorganismos.Estos medios son realizados en el Laboratorio de Microbiología por loque el control de su fabricación, preparación, conservación y uso,asegura la exactitud, confiabilidad y reproductibilidad de los resultadosobtenidos.En los laboratorios de microbiología se utilizan diferentes tipos demedios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida, sólida osemisólido.Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquidoal que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o lasílicagel.La práctica se desarrollo para adquirir conocimientos de cómo seprepara un medio de cultivo y aplicación de técnicas de siembra para ladistribución de colonias de microorganismos.

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MATERIALES Y MÉTODO

A. MATERIAL➢ Placa Petri➢ Tubos de ensayo 13 x 100; es decir de

3.5 ml➢ Matraz➢ Estufa➢ Varilla➢ Balanza

➢ Pipeta➢ Hornilla➢ Probeta➢ Pizeta➢ Gradilla➢ Espátula➢ Asas bacteriológicas(en orquilla y punta)

A. MEDIOS DE CULTIVO➢ Agar BHI➢ Caldo nutritivo

A. OTROS➢ Pabilo➢ Papel Kraft➢ Algodón

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PROCEDIMIENTOSe ha de considerar el procedimiento dependiendo del estado en el quese encuentra el medio de cultivo, ya que es fundamental saber el estado

para relacionar con que material a de trabajarse.

Para la preparación de medios de cultivo (AGAR BHI)Nos ubicaremos en la tabla que procedimientos seguir, para ellodescribimos a continuación:

Primero esterilizar las placas ya que

necesita estar exento de microorganismosambientales.

ACTIVIDADSOLIDOS ( AGARES) LIQUIDOS

(CALDOS)Placas Tubos Tubos

Esterilizar placas / - -Pesar el medio decultivo

/ / /

Medir el aguadestilada

/ / /

Mezclar en... Matraz Matraz BalónCalentar enhornilla

/ / -

Disolver al medioambiente

- - /

Repartir en tubos - / /Auto clavar elmedio de cultivo

/ / /

Servir cultivos / - -Acondicionarmedios

- / -

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Autoclavar

Servir los medios de cultivo en las placas esteriles y con la ayuda del mechero mantener suesterilidad.

Para la preparación de caldo nutritivo

Calcular el peso del medio de cultivo, para ello hacemos la sgteoperación:Formula de hidratación: 8 gr/lCapacidad del tubo: 8 mlPara esta práctica utilizamos seis tubos de ensayo para ello se necesitaexactamente:(Capacidad del tubo) (N° de tubos) = ( 8 ml )( 6 )= 48 ml

Para la elaboración del medio de cultivo se redondea a la decena máspróxima, en este caso 50 ml.Pesar el medio de cultivo para el cual realizamos la siguiente operación:8 gr 1000 ml0.8 gr 100 ml0.4gr 50 ml

Por lo tanto: necesitaremos 0.4 gr de CALDO NUTRITIVO para 50ml de agua destilada.

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Pesando el medio de cultivo(CALDO)

0.4 gr

Medir el agua destilada a utilizar

Mezclar en balón y disolver al medio ambiente.

Repartir en tubos en formaequitativa.

Preparación paraautoclavar.

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NOTA: Para lo cual se utilizara una lata para su protección.Rotular, es decir poner datos para identificar nuestro medio de cultivo.

SIEMBRA DE CULTIVO

Preparar el área de trabajo,haciendo una desinfección con

fenol.

Preparación del INOCULO:

Para la preparación del inoculo (conjunto de microorganismo)utilizaremos los microbios de la tierra.

En un vaso de precipitación (100ml) someter aebullición a la muestra y 50ml de agua, ello serealiza con constantes movimientos con lavarilla. Y así disminuir la sobrecarga demicroorganismos.

Tipos de siembra:

A. EN PLACAS

Técnica: estría simpleEs la ejecución de líneas, con la ayuda de una asa bacteriológicaen orquilla introduciendo esta al inoculo preparado, en lasuperficie del medio de cultivo (AGAR) para obtener coloniasaisladas.

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a. Esterilizar la asa bacteriológica elevando a T ° haciendo un conteo mental hasta 15.

b. Introducir la asa bacteriológica al inoculo preparado.

c. Hacer dos puntos al extremo delmedio de cultivo y homogenizar esa zona y proceder a ejecutar lasestrías.

d. Mantener un mechero encendido almomento de realizar la técnica,

para impedir la entrada demicroorganismos ambientales.

A. En TUBOS:

TECNICAS: Picadura profunda (aplicada con Asa B. en punta)Homogenización (aplicada con Asa B. en orquilla)

En los tubos con medio de cultivo SIM se aplico la técnica depicadura profunda para lo cual se realizo los mismosprocedimientos anteriores(a-b-d) con asa bacteriológica en punta.La técnica se hace introduciendo el asa con firmeza hasta loprofundo del tubo de ensayo.

En los tubos con CALDO NUTRITIVO se aplico la técnica dehomogenización para lo cual se realizo los mismos procedimientosanteriores (a-b-d) con asa bacteriológica en orquilla.

Se introduce con firmeza la asabacteriológica y se hace un leveagitamiento para que el inoculoquede en ella.

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Seguidamente luego del sembrío en tubos se procede a tapar conun tapón de algodón.

Agitar entre las manos con movimientos rotatorios.

Preparar para llevarlo a la estufa, para que los microorganismos sedesarrollen; pero para evitar laconfusión de intercambio inconcientede materiales se apuntara en ella:

Nombre del cultivo-carrera- semestre-cátedra-fecha

Introducir los cultivos a la estufa auna temperatura de temperatura de 37°C por 24 horas.

RESULTADOS

✔ Es de vital importancia realizar un pequeño calculo considerandola formula de hidratación del medio de cultivo y capacidad de los

materiales a utilizar, para hallar medios propicios en la cual sesembrara.✔ La esterilización de los materiales y manejo de ellos juega un

papel importante, de ello depende el buen desarrollo de losmicroorganismos a cultivar.

✔ Al elevar la temperatura del inoculo preparado se hace con lafinalidad de reducir la sobrecarga de microorganismos.

✔ La aplicación de una técnica de cultivo dependerá del medio de

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cultivo.✔ El objetivo de las técnicas de siembra es obtener colonias aisladas.

COMENTARIOS

✔ Contar siempre con los medios de protección posible(guardapolvo, guantes, gorro, etc.).

✔ Mantener la limpieza del ambiente (uso de mechero) donde serealizar la técnica de siembra y también de nuestras manos parareducir la probabilidad de ingreso de microorganismos delambiente.

✔ Poner en la posición correcta la placa cuando esta va a ingresar ala estufa.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Apuntes tomados en clase de prácticahttp://images.google.com.pe/imgres?imgurlhttp://mail.fq.edu.uy/~microbio/MGral/practico/siembra.html

ANEXOSMedios de cultivo

DefiniciónSon nutrientes que vienen en polvo, granulaciones para ser hidratados,cuya finalidad es hacer posible el crecimiento de microorganismos.

CaracterísticasA) Una composición de nutrientes ad ecuada a las necesidades de ese

microorganismo.Como fuentes de energía tenemos:a. Fuente de carbono: otras azucares simples y complejos, otros

gas carbónico, hidrocarburos o incluso hidrocarbonados diferentes.b. Fuente de nitrógeno: Esta fuente de energía la van a formar las

proteínas, péptidos o aminoácidos.Otros requerimientos no energéticos de los m.o son:

a. Fuentes de azufre: Lo hacen mayoritariamente en forma desulfatos.

b. Fuente de fósforo: En forma de fosfatosc. Iones metálicos: A concentraciones muy bajas (cinc, manganeso,

cobre, cobalto, molibdeno)d. Factores de crecimiento: Corresponden a algún tipo de

aminoácido (cisteína), factores específicos (F. X o F. V) o inclusovitaminas o bases púricas, pirimídicas,…

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e. Factores de arranque: Son sustancias que van a permitir a labacteria salir de su fase de latencia. Esto se consigue con glucosa oiones que estimulen su crecimiento.

f. Factores inhibidores: Son componentes que van a impedir elcrecimiento como la azida sódica (gran-), los antibióticos, la eosina azulde metileno (gram +)B) Condiciones físico-químicas apropiadas:

a. Temperatura óptima: Hay tres tipos de bacterias dependiendodel grado de temperatura a las que crezcan:

* Psicrófilas: < 20ºC* Mesófilas: 18-45ºC* Termófilas: > 45ºC

b. Grado de humedad: La cantidad de agua que va a necesitar elm.o para su desarrollo. La liofilización o cualquier método dedeshidratación es un buen medio de conservación.

c. pH: Los buffers o tampones son los encargados de estabilizar elpH del medio a un pH cercano a la neutralidad que es el pH óptimo,aunque hay m.o que crecen mejor en pH ácidos (tiobacilos) o pHalcalinos (Proteus o Vibrio cholerae)

d. Presión osmótica: En condiciones de isotonía (300miliosmoles), aunque hay bacterias halófilas en las cuales sucrecimiento se produce en concentraciones muy altas de cloruro sódico(10%) como el Género Staphylococcus; o en condiciones osmófilas enlas que requieren un 70% de azúcar.

e. Presencia o ausencia de oxígenoComposición de medios de cultivo utilizados

*Agar nutritivo:Su composición es: extracto de carne 1 gr/l, extracto de levadura 2gr/l,peptonas 5gr/l, cloruro sódico 5gr/l y agar 15gr/l.

*Caldo nutritivo:Su composición es: extracto de carne 1 gr/l, extracto de levadura 2gr/l,peptonas 5gr/l y cloruro de sódico 5gr/l.Condiciones generales

Disponibilidad de nutrientes adecuados: debe de contener C-N-S-k ysales inorgánicos. También es necesario ciertas vitaminas y sustanciasconductoras del crecimiento.y añadirotras sustancias dependiendo delmicroorganismo a cultivar.

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Tipos

* Por su estado:

Solido.- Agar (1.5% agar) Este da solidez al medio de cultivo y atemperatura del ambiente es sólido; sus componentes son algasmarinas, carbohidratos. Se prepara en placas petri o tubos de ensayo.Liquido.-Caldo (0% agar) No contiene agar es por eso que su estado esliquido. Se prepara en tubos de ensayo.Semi solido.- Medio o Agar (<0.5% agar) no son líquidos ni sólidos por lacantidad de agar presente .Se prepara en tubos de ensayo.

*Por su composición:

-Simples.-S u composición es simple, es decir están presentes losnutrientes básicos.-Enriquecidos.- Combinación compleja de nutrientes.-Selectivos.- Su composición restringe el crecimiento.-Diferenciables.- Distinguir a los microorganismos.-Bioquímica.- Analiza las capacidades bioquímicas y de metabolismo.-Antibiograma.- Permite el crecimiento de cualquier microorganismo

SIEMBRA

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra(inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivomicrobiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a unatemperatura adecuada para el crecimiento.

La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido,utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estéril.

AISLAREs separar un tipo de microorganismo a partir de un población que loscontiene de varios tipos. En habitats naturales, raramente encontramosa los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo),por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento paraseparar e identificar los distintos tipos de m.o. presentes.

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Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:a) Aislamiento por estrías

A: Consiste en cargar el ansa con lamuestra y hacer estrías paralelas en lacuarta parte de la superficie de la placa;se quema el ansa, se enfría, se gira laplaca 90º y se vuelve a estriar tocando 3o 4 veces el área sembrada inicialmente ycubriendo otro cuarto de placa. Porúltimo, sin quemar el ansa, se estría elresto de la superficie sin sembrar.

B: Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estrías;se quema el ansa, se hacen 3 o 4 estrías

perpendiculares a las anteriores, se quema elansa y se repite el procedimiento hasta agotarla superficie de la placa.

b) Aislamiento por dilución

Se emplean tanto el método de siembra incorporada como el de siembraen superficie. Suele ser necesario diluir la muestra. Para ello se puedepreparar las diluciones decimales en condiciones asépticas usando suerofisiológico o algún otro diluyente.

También se pueden preparar las diluciones directamente en tubos de

agar fundido y termostatizado (20 mL) se agita por rotación entre lasmanos y se vierte en placas de Petri estériles.