Le tecniche di Le tecniche di coltura coltura in vitroin vitro

Francesco SunseriFrancesco Sunseri

2

La definizioneLa definizione

“… “… the aseptic culture of plant protoplasts, the aseptic culture of plant protoplasts, cells, tissues or organs under conditions cells, tissues or organs under conditions which lead to cell multiplication or which lead to cell multiplication or regeneration of organs or whole plants “regeneration of organs or whole plants “

(Murashige, 1963)(Murashige, 1963)

3

1.1. Concetti fondamentali / StoriaConcetti fondamentali / Storia

2.2. Tipi di cellule o tessutiTipi di cellule o tessuti

3.3. Processi di crescitaProcessi di crescita

4.4. Regolatori di crescitaRegolatori di crescita

Argomenti da trattareArgomenti da trattare:

4

La coltura di cellule e tessuti di La coltura di cellule e tessuti di piante trova il suo fondamento nella piante trova il suo fondamento nella

totipotenza cellularetotipotenza cellulare In tutte le piante vascolari In tutte le piante vascolari

l’embrione si evolve in una struttura l’embrione si evolve in una struttura bipolare per la presenza di due bipolare per la presenza di due

meristemi apicalimeristemi apicali Durante il ciclo della pianta tali Durante il ciclo della pianta tali

meristemi producono continuamente meristemi producono continuamente nuovi organi che si aggiungono a nuovi organi che si aggiungono a

quelli prodotti durante quelli prodotti durante l’embriogenesil’embriogenesi

Che cosa sono Che cosa sono

5

Le piante vascolari sono state Le piante vascolari sono state pertanto definite organismi a pertanto definite organismi a

ontogenesi ricorrente,ontogenesi ricorrente, a causa di a causa di tale fenomeno nelle piante non si tale fenomeno nelle piante non si assiste alla separazione tra linea assiste alla separazione tra linea

somatica e linea germinalesomatica e linea germinale Durante lo sviluppo gli apici Durante lo sviluppo gli apici

vegetativi possono modificarsi in vegetativi possono modificarsi in apici riproduttivi, sviluppando le apici riproduttivi, sviluppando le

strutture tipiche della riproduzionestrutture tipiche della riproduzione Per entrambe queste ragioni nelle Per entrambe queste ragioni nelle

piante vascolari qualsiasi cellula piante vascolari qualsiasi cellula somatica può considerarsi un somatica può considerarsi un

progenitore potenziale di un nuovo progenitore potenziale di un nuovo individuo … individuo …

Che cosa sono Che cosa sono

6

Il termine sottende a differenti Il termine sottende a differenti metodologie che consentono la metodologie che consentono la crescita e lo sviluppo di cellule, crescita e lo sviluppo di cellule,

tessuti ed organi vegetali su terreni tessuti ed organi vegetali su terreni sinteticisintetici

La crescita e la moltiplicazione di La crescita e la moltiplicazione di nuove cellule si può indurre anche da nuove cellule si può indurre anche da

tessuti già differenziati che tessuti già differenziati che subiscono un processo di subiscono un processo di

sdifferenziamentosdifferenziamento Si formano quindi ammassi amorfi, Si formano quindi ammassi amorfi,

definiti definiti callicalli, che possono essere , che possono essere mantenuti indefinitamente mantenuti indefinitamente in vitro in vitro o o possono essere indotti a rigenerare possono essere indotti a rigenerare

organi o piante intereorgani o piante intere

Coltura Coltura in vitroin vitro

7

CalloCallo Rappresenta la naturale risposta Rappresenta la naturale risposta

della pianta ad una ferita della pianta ad una ferita E’ una massa di cellule in attiva E’ una massa di cellule in attiva

divisione per la produzione di cellule divisione per la produzione di cellule indifferenziate prodotte da espianti indifferenziate prodotte da espianti di tessuto vegetaledi tessuto vegetale

E’ formato da cellule totipotenti E’ formato da cellule totipotenti

8

Tutti i vegetali possono essere Tutti i vegetali possono essere considerati sorgenti potenziali di considerati sorgenti potenziali di

cellule per coltura cellule per coltura in vitroin vitro Alcune specie sembrano fare Alcune specie sembrano fare

eccezione a tale regola, ma è eccezione a tale regola, ma è probabile una erronea scelta delle probabile una erronea scelta delle

condizioni colturalicondizioni colturali Infatti le condizioni colturali possono Infatti le condizioni colturali possono

mostrare differenze significative in mostrare differenze significative in relazione a sostanze specifiche e relazione a sostanze specifiche e

condizioni microambientali utilizzaticondizioni microambientali utilizzati

Coltura Coltura in vitroin vitro

9

Principali caratteristichePrincipali caratteristiche

Si effettuano:Si effettuano: su micro scalasu micro scala in condizioni in condizioni ambientali ambientali ottimizzate (nutrienti, ottimizzate (nutrienti, luce, temperatura)luce, temperatura)

in assenza di in assenza di microrganismi microrganismi (funghi, batteri, (funghi, batteri, virus).virus).

10

Teoria cellulare e totipotenza Formazione del callo e sostanze di crescita Prime colture cellulari Prime colture di tessuti vegetali Colture di organi vegetali

1. Storia1. Storia

11 Cork tissue as observed by Robert Hooke in 1664

Teoria cellulare ….Le cellule furono Le cellule furono osservate per la prima osservate per la prima volta nel 1664 da volta nel 1664 da Robert Hooke, che Robert Hooke, che studiò con un studiò con un microscopio microscopio rudimentale sottili rudimentale sottili fettine di sughero e fettine di sughero e vide che esse erano vide che esse erano formate da elementi di formate da elementi di forma regolare. Egli forma regolare. Egli chiamò cellule questi chiamò cellule questi elementi (dal latino elementi (dal latino cellula, "piccola cellula, "piccola stanza"), perché esse stanza"), perché esse avevano l'aspetto di avevano l'aspetto di piccole scatole. piccole scatole.

12

…Haberlandt .. agli inizi del 1900 … propose il concetto di totipotenza … cellule allevate in adatte conditizioniCallo coltivato a partire dal cambio (Gautheret, Nobecourt, Whire nel 1930)

… le cellule restavano vive ma non si moltiplicavano

Le prime colture cellulari….

13

Distensione Distensione cellularecellulare …… ruolo ruolo delle delle auxineauxineDivisione Divisione cellulare ... ruolo delle cellulare ... ruolo delle

citochininecitochinine

- in funzione della scoperta dei - in funzione della scoperta dei “ “Regolatori di crescitaRegolatori di crescita””

Le prime colture di tessuti Le prime colture di tessuti ….….

Rigenerazione Rigenerazione di tabacco ....di tabacco ....

(Skoog and Miller) …. interazione tra auxine(Skoog and Miller) …. interazione tra auxine

e citochinine dava e citochinine dava differenziazionedifferenziazione..

14

GA GA per per la crescita dei la crescita dei germogligermogli

Aux + Cyt + zuccheroAux + Cyt + zucchero > sviluppo vascolare > sviluppo vascolare

Colture di ‘strati sottili’Colture di ‘strati sottili’ … … interazione con altri fattori es. interazione con altri fattori es. pHpH

Successivi sviluppi …

15

Il primo uso commerciale Il primo uso commerciale di piante propagate su di piante propagate su mezzo artificiale è stato mezzo artificiale è stato fatto per la germinazione e fatto per la germinazione e lo sviluppo di orchidee nel lo sviluppo di orchidee nel 1920 1920

16

Pianta di carota da cellule radicali – Stewart in 1964Pianta di carota da cellule radicali – Stewart in 1964

17

Pianta di tabacco da singola cellulaPianta di tabacco da singola cellula – Vasil & Hilderbrandt 1965 – Vasil & Hilderbrandt 1965

18

Coltura di organi vegetali ….

… ma la coltura delle piante la coltura delle piante in vitro in vitro ha visto ha visto il suo pieno sviluppo grazie alla messa a il suo pieno sviluppo grazie alla messa a punto di un mezzo di coltura artificiale da punto di un mezzo di coltura artificiale da parte di Murashige & Skoog nel 1962parte di Murashige & Skoog nel 1962

micropropagazione

19

Molti tipi di celluleMolti tipi di cellule Grado di specializzazione Grado di specializzazione

diversificatodiversificato- Meristematico- Meristematico- Embrionale- Embrionale- Riproduttivo- Riproduttivo

2. Tipi di cellule e tessuti

20

Germoglio Germoglio ... apicale, ... apicale, … ascellare… ascellare

Tessuti meristematici ...Tessuti meristematici ...

21

leaf trace

procambium

tunicanew leaf

corpus

pithcortex

apical meristem

axillary meristem

22

Germogli ... apicali, … ascellari

Foglie Radici

Tessuti meristematici ...Tessuti meristematici ...

23

Tessuti embrionali ...Tessuti embrionali ...

Piante pre-formatePiante pre-formate Germinali / somaticiGerminali / somatici GiovanileGiovanile

24

Tessuti riproduttivi ...Tessuti riproduttivi ...

Diploide / AploideDiploide / Aploide Femminile / MaschileFemminile / Maschile

25

MoltiplicazioneMoltiplicazione Dominanza apicale Differenziazione

CrescitaCrescita Divisione cellulare Distensione cellulare

Fasi di sviluppoFasi di sviluppo Giovanilità Dormienza

3. Processi di crescita

26

FotosintesiFotosintesi Traspirazione e assorbimento dell’acquaTraspirazione e assorbimento dell’acqua Instabilità citologicaInstabilità citologica Meccanismi fisiologiciMeccanismi fisiologici Manipolazioni fisicheManipolazioni fisiche AmbienteAmbiente GenotipoGenotipo

3. Altri processi

27

Le auxineLe auxine Le citochinineLe citochinine Le gibberelline (GA)Le gibberelline (GA) L’acido abscissico (ABA) L’acido abscissico (ABA) L’etileneL’etilene

4. Regolatori di crescita

28

Regolatori di crescitaRegolatori di crescitaAuxineAuxine

Essenziali (non sono noti effetti Essenziali (non sono noti effetti mutageni)mutageni)

Il solo composto naturale è lo IAA Il solo composto naturale è lo IAA (Indole-3-Acetic Acid). Altri prodotti (Indole-3-Acetic Acid). Altri prodotti sintetici sono NAA, IBA, 2,4-D, sintetici sono NAA, IBA, 2,4-D, 2,4,5-T, Pichloram) – meno costosi e 2,4,5-T, Pichloram) – meno costosi e più stabilipiù stabili

Stimolazione della distensione Stimolazione della distensione cellulare in fusti e coleoptilicellulare in fusti e coleoptili

Promuovono la radicazione Promuovono la radicazione Sono sintetizzate nei meristemi, Sono sintetizzate nei meristemi,

specialmente in quelli apicali specialmente in quelli apicali ((inibizione della crescita delle inibizione della crescita delle gemme laterali)gemme laterali)

29

Essenziali (non sono noti effetti Essenziali (non sono noti effetti mutageni)mutageni)

Un solo composto naturale la Zeatina; Un solo composto naturale la Zeatina; analoghi sintetici sono: Benzyladenine analoghi sintetici sono: Benzyladenine (BA) e Kinetin(BA) e Kinetin

Stimola la divisione cellulareStimola la divisione cellulare Promuove la formazione di gemme Promuove la formazione di gemme

avventizieavventizie Sono sintetizzate nel meristema radicale Sono sintetizzate nel meristema radicale

e trasportate nel floema sotto forma di e trasportate nel floema sotto forma di Zeatin-ribosideZeatin-riboside

CitochinineCitochinineRegolatori di crescitaRegolatori di crescita

30

Questa classe comprende più di Questa classe comprende più di 70 composti, varie forme dell’ 70 composti, varie forme dell’ acido gibberellicoacido gibberellico

In commercio sono disponibili In commercio sono disponibili diversi formulati (GAdiversi formulati (GA3, 3, GAGA4, 4, GAGA99))

Stimola l’eziolatura dello steloStimola l’eziolatura dello stelo Sintetizzate nelle giovani foglieSintetizzate nelle giovani foglie

GibberellineGibberellineRegolatori di crescitaRegolatori di crescita

31

Esiste solo un componente Esiste solo un componente naturalenaturale

Promuove l’abscissione delle Promuove l’abscissione delle foglie e la dormienza dei semifoglie e la dormienza dei semi

Gioca un ruolo dominante nella Gioca un ruolo dominante nella chiusura degli stomi in chiusura degli stomi in condizioni di stress idricocondizioni di stress idrico

Ha un ruolo importante Ha un ruolo importante nell’embriogenesi (aiuta la nell’embriogenesi (aiuta la formazione di embrioni formazione di embrioni normali)normali)

Acido abscissico (ABA)Acido abscissico (ABA)Regolatori di crescitaRegolatori di crescita

32

Bilancio ormonaleAuxine CitochinineAlte Basse

Basse Alte

Formazione di radici dopo il taglioFormazione di radici dopo il taglio EmbriogenesiEmbriogenesi

Formazione di radici avventizieFormazione di radici avventizie Induzione a calloInduzione a callo

Formazione di germogli avventiziFormazione di germogli avventizi Crescita di germogli ascellariCrescita di germogli ascellari

33

Rapporto auxine : citochinine

34

Azione dell’ormone per …..Azione dell’ormone per …..

Applicazione + assorbimentoApplicazione + assorbimento Endogeno + applicatoEndogeno + applicato Accumulazione e assuefazioneAccumulazione e assuefazione Interazione / Sequenza di Interazione / Sequenza di

applicazioneapplicazione Impulso o esposizione prolungataImpulso o esposizione prolungata

35

Elementi minerali (17 elementi Elementi minerali (17 elementi essenziali)essenziali)

Fonte d’energia e di carbonio Fonte d’energia e di carbonio (saccarosio)(saccarosio)

Regolatori di crescita (fitormoni)Regolatori di crescita (fitormoni) VitamineVitamine Composti organici Composti organici AcquaAcqua pH (5.0-5.7)pH (5.0-5.7) Gelling agents: Agar, agarose, gellan gumGelling agents: Agar, agarose, gellan gum

Mezzo di coltura Mezzo di coltura in vitroin vitro

36

Composti inorganici Composti inorganici

Macroelementi (>mg/l di Macroelementi (>mg/l di N, P, K, N, P, K, Ca, Mg e SCa, Mg e S) e microelementi ) e microelementi (<mg/l (<mg/l Fe, Cu, Mn, Co, Mo, B, I, Fe, Cu, Mn, Co, Mo, B, I, Zn, Cl e alcune volte Al, Ni e SiZn, Cl e alcune volte Al, Ni e Si).).

Disponibili formulazioni Disponibili formulazioni commerciali in polverecommerciali in polvere

Murashige and Skoog Medium Murashige and Skoog Medium (1965) è il mezzo di coltura più (1965) è il mezzo di coltura più comunecomune

Il mezzo Gamborgs B5 è più Il mezzo Gamborgs B5 è più diffusamente utilizzato per diffusamente utilizzato per colture cellulari in sospensione.colture cellulari in sospensione.

37

Un ampio Un ampio range range di vitamine sono di vitamine sono disponibili e possono essere usatedisponibili e possono essere usate

Generalmente, più è piccolo Generalmente, più è piccolo l’espianto, più appropriata deve l’espianto, più appropriata deve essere la scelta della/e vitamineessere la scelta della/e vitamine

Un Un cocktail cocktail di vitamine è spesso usatodi vitamine è spesso usato L’inositolo di solito deve essere L’inositolo di solito deve essere

aggiunto a maggiori concentrazioni aggiunto a maggiori concentrazioni (100mg/l)(100mg/l)

VitamineVitamine

38

VitamineVitamine

TiaminaTiamina PiridossinaPiridossina Acido nicotinicoAcido nicotinico BiotinaBiotina Acido Citrico Acido Citrico Acido Ascorbico Acido Ascorbico Myo-inositoloMyo-inositolo

39

La rigenerazione può La rigenerazione può avvenireavvenire

via via organogenesi organogenesi via via embriogenesi embriogenesi

somaticasomatica

40

OrganogenesiOrganogenesi L’organogenesi prevede la L’organogenesi prevede la

formazione di germogli, foglie e formazione di germogli, foglie e radici e si verifica quando si radici e si verifica quando si differenziano differenziano in vitro in vitro centri centri meristematici unipolari quali le meristematici unipolari quali le gemme avventiziegemme avventizie

Questi organi possono derivare Questi organi possono derivare da meristemi preesistenti o da da meristemi preesistenti o da cellule indifferenziate cellule indifferenziate

Come per l’embriogenesi può Come per l’embriogenesi può aversi una fase intermedia di aversi una fase intermedia di callo, ma spesso si osserva senza callo, ma spesso si osserva senza il passaggio da questo stadioil passaggio da questo stadio

41

La differenziazione di radici e germogli in La differenziazione di radici e germogli in colture di tessuto di tabacco era funzione colture di tessuto di tabacco era funzione del rapporto auxine-citochinine, e la del rapporto auxine-citochinine, e la differenziazione dell’organo potrebbe differenziazione dell’organo potrebbe essere regolato dal cambiamento delle essere regolato dal cambiamento delle concentrazioni relative delle due sostanze concentrazioni relative delle due sostanze nel mezzo di colturanel mezzo di coltura

1957 Skoog and Miller 1957 Skoog and Miller

OrganogenesiOrganogenesi

42

Embriogenesi SomaticaEmbriogenesi Somatica L’embriogenesi somatica consiste nella produzione di L’embriogenesi somatica consiste nella produzione di

embrioni da cellule somatiche o non germinanti, la embrioni da cellule somatiche o non germinanti, la rigenerazione comporta la successione delle fondamentali rigenerazione comporta la successione delle fondamentali fasi di sviluppo che caratterizzano la differenziazione fasi di sviluppo che caratterizzano la differenziazione dell’embrione zigotico dell’embrione zigotico

Si assiste quindi alla comparsa di una struttura bipolare, Si assiste quindi alla comparsa di una struttura bipolare, priva di connessioni vascolari con il tessuto originario, che priva di connessioni vascolari con il tessuto originario, che evolve in un embrione cotiledonareevolve in un embrione cotiledonare

43

AcclimatamentoAcclimatamento

Le piante ottenute Le piante ottenute in vitroin vitro devono essere preparate devono essere preparate alla sopravvivenza alla sopravvivenza in vivo in vivo

Alta umidità Alta umidità LuceLuce Temperature tra 20-25°C Temperature tra 20-25°C Elementi nutritiviElementi nutritivi Terreno adattoTerreno adatto

44

45

micropropagazione e rapida micropropagazione e rapida moltiplicazione di clonimoltiplicazione di clonirigenerazione e rigenerazione e trasformazione trasformazione geneticageneticainduzione di variazione somaclonaleinduzione di variazione somaclonaleottenimento di aploidi da micro e ottenimento di aploidi da micro e macrosporemacrosporeallevamento e mantenimento di piante allevamento e mantenimento di piante virus esentivirus esentimanipolazione di protoplasti ed manipolazione di protoplasti ed ibridazione somaticaibridazione somaticaconservazione del germoplasmaconservazione del germoplasmaproduzione di metaboliti di interesse produzione di metaboliti di interesse industrialeindustriale

Applicazioni delle colture Applicazioni delle colture in vitro in vitro

Plant GeneticPlant GeneticTransformationTransformation

47

OverviewOverview IntroduzioneIntroduzione Plant genetic transformationPlant genetic transformation Stato attuale delle PGMStato attuale delle PGM Trends futuri e problemiTrends futuri e problemi

48

IntroduzioneIntroduzione

Potenzialità delle biotecnologie vegetaliPotenzialità delle biotecnologie vegetali Uso di nuovi geni introdottiUso di nuovi geni introdotti Tratti che i Tratti che i plant breeders plant breeders vorrebbero vorrebbero

trasferiretrasferire

49

Tratti genetici di interesse per i Tratti genetici di interesse per i plant plant breedersbreeders

Alta produttivitàAlta produttività Alta qualità Alta qualità

nutrizionale nutrizionale Adattabilità all’inter-Adattabilità all’inter-

croppingcropping Fissazione Fissazione

dell’azotodell’azoto

Resistenza a stress Resistenza a stress idricoidrico

Resistenza a stress Resistenza a stress bioticibiotici

Adattabilità alla Adattabilità alla meccanizzazionemeccanizzazione

Insensibilità al Insensibilità al fotoperiodofotoperiodo

Eliminazione di Eliminazione di composti tossicicomposti tossici

50

Sviluppo dei cibi GMSviluppo dei cibi GM

Pomodoro Flavr-Savr – Pomodoro Flavr-Savr – 1^ FDA approvazione per un cibo1^ FDA approvazione per un cibo

19951995 Soia Roundup della Monsanto approvata Soia Roundup della Monsanto approvata per il commercio negli Stati Unitiper il commercio negli Stati Uniti

19941994

Primo campo di cotone GM condotto con Primo campo di cotone GM condotto con successosuccesso

19901990

PGM resistenti a insetti, virus e batteri PGM resistenti a insetti, virus e batteri sono saggiate in campo per la prima volta – sono saggiate in campo per la prima volta – TRATTI UTILITRATTI UTILI

19851985

1^ pianta transgenica 1^ pianta transgenica : tabacco resistente ad antibiotico: tabacco resistente ad antibiotico19831983

La ricerca sviluppa capacità ad isolare geniLa ricerca sviluppa capacità ad isolare geni19731973

Prima rigenerazione di piante intere da Prima rigenerazione di piante intere da in vitroin vitro culture culture19501950

51

Metodi di trasformazione genetica Metodi di trasformazione genetica

Trasformazione biologicaTrasformazione biologica Biolistico - gene gun o Biolistico - gene gun o

particle gunparticle gun ElettroporazioneElettroporazione Microiniezione Microiniezione

52

Trasformazione biologicaTrasformazione biologica Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens & & A. A.

rhizogenes rhizogenes causano infezione nelle piante causano infezione nelle piante le formazioni tumorali sono la le formazioni tumorali sono la

conseguenza del trasferimento, da parte conseguenza del trasferimento, da parte del batterio, di un segmento di DNA, del batterio, di un segmento di DNA, chiamato T-DNAchiamato T-DNA

53

AgrobacteriumAgrobacterium gene transfer gene transfer

54

Esempio di protocollo per la trasformazione con Esempio di protocollo per la trasformazione con AgrobacteriumAgrobacterium

Sterilizzare

Trasferire su mezzo di induzione del germoglio + carbenicillina; in coltura ~ 2 giorni

Leaf disk

Blot disk dry

Transferire su mezzo per indurre germoglio + carbenicillina + selettivo per il transgene (es. kanamicina), coltivare/subcoltivare fino a che si formano i germogli

Excidere i germogli dal callo, trasferiresu mezzo di radicazione

Trasferire le plantule nel terreno appena si formano le radici

Espianto fogliareIncubare con Agrobacterium

55

Tratti transgenici inseritiTratti transgenici inseriti

•19% resistenza ad insetti 19% resistenza ad insetti (mais, cotone)(mais, cotone)•7% altri caratteri7% altri caratteri

•74% resistenza ad erbicidi 74% resistenza ad erbicidi (soia, canola)(soia, canola)

56

57