Dinamica estructural de macromolecules

(LI. Cornudella, ed.)

Treballs de la SCB . Vol. 48 (1998) 13-23

CRISTAL•LOGRAFIA DE PROTEINES

ALICIA GUASCH, NURIA VERDAGUER, F. XAVIER GOMIS-RUTH, IGNASI FITA I MIQUEL COLL.

Institut de Biologia Molecular de Barcelona. CSIC

Jordi Girona, 18. 08034 Barcelona.

SUMMARY

X-ray diffraction applied to protein crystals allows the determination of the atom posi-

tions to approximately 2 A resolution and the observation of the polypeptide fold. In the

structure resolution process there are two critical steps, the growth of protein crystals and

the determination of the phases. With the help of molecular biology in the first case and new

synchrotron facilities in the second, protein cristallography is a booming area of research.

RESUM

L'aplicacio de la difraccio de raigs X als cristalls de proteina permet la determinacio de

les posicions atomiques amb una resolucio aproximada de 2A i l'observacio del plegament

de la cadena polipeptidica. Dins del proces de resoluci6 d'una estructura, hi ha dues etapes

determinants, l'obtenci6 de cristalls de proteina i la determinacio de les fases. Amb l'ajut de

la biologia molecular en el primer cas i l'us dels sincrotrons en el segon, la cristal•lografia de

proteines esta experimentant una explosio sense precedents

DIFRACCIO DE RAIGS X I BIOLOGIA

Les aplicacions dels raigs X en el camp quantitat d'objectes potencials d'estudi fa

de la biologia han avancat espectacularment que, a hores d'ara, la immensa majoria d'a-

des del seu comencament, tot i que la gran quests romangui sense esser caracteritzats

1-! I//( IA (,I IM //. \( RI 1 10I)I(,I 1,R I A 117ER GOSIIS-RC 1/1, IG\.ISIIl/:I /.l/IOI H (ULI.

des del punt de vista atomic. Durant lesquatre decades que han seguit a la determi-naci6 de les primeres estructures, corn son ladel DNA (Watson i Crick, 1953), la mioglo-bina per John Kendrew el 1958 (Kendrew etal., 1960) i l'hemoglobina analitzada perMax Perutz durant quasi be trenta anys (Pe-rutz et al., 1960), les tecniques de difracci6 deraigs X s'han anat aplicant a una selecci6 di-versa de problemes interessants, lentamentals inicis i de manera exponencial els darrersanys. Els resultats obtinguts han establertmolts principis basics tant de 1'estructura demacromolecules corn de la bioquimica i labiofisica dels processos biologics.

El gran nombre d'estructures resoltes,cada cop mes complicades, es deu sobretot adues coses: una es la tecnologia del DNA re-combinant, l'altra son els sincrotrons. Laprimera permet obtenir quantitats adients

de qualsevol proteYna, malgrat que siguimolt minoritaria a la cel-la. A mes, es potmodificar la proteYna at nostre gust per talque cristal-litzi, per exemple, expressantnomes un domini. Tambe es pot modificarla proteYna amb I'objectiu que es pugui re-soldre la seva estructura amb facilitat, perexemple, substituint alguns residus per al-tres que continguin atoms pesants. D'altrabanda, els sincrotrons, que produeixen ra-diaci6 X d'altissiina intensitat i de longitudd'ona a la carta, permeten recollir dades dedifracci6 a alta resoluci6 de proteYnes o en-samblatges de proteYnes de gran pes mole-cular, inclosos els virus. Son maquines cos-toses, que de vegades necessiten I'esforceconomic de molts paIsos -com es el cas de1'ESRF, a Grenoble- per6 amb una demandad'usuaris tal que no la poden cobrir. I la de-manda anira creixent.

Hi ha un altre aspecte de l'alianca entrela cristal•lografia i les tecniques del DNA re-combinant que resulta d'aplicar aquestesultimes, no ja per resoldre les estructures,sin6 per modificar les proteYnes un cop co-

neixern la seva estructura en detall. Aixi po-dem canviar les seves caracteristiques i, finsi tot, la seva funci6. Aix6, 6bviament, to apli-cacions biotecnol6giques o industrials. Enaquest terreny tambe hi ha el disseny de far-macs basat en el coneixement de l'estructu-

ra tridimensional. No es una visi6 de futur,s'esta fent ja i amb exit. El cas mes especta-cular ha estat el disseny de farmacs contra laproteasa aspartica de l'HIV, utilitzats ara enels famosos c6ctels contra el virus de laSIDA. Aquesta protema es ara mateix la mesestudiada per difracci6 de raigs X: s'han fetprop de mil estructures de complexos ambinhibidors diferents, gairebe totes en com-panyies farmaceutiques, encara que I'es-tructura inicial de la proteasa es va resoldreen un centre public (Wlodawer et al., 1989).

Els raigs X no son l'unica eina per estu-diar 1'estructura molecular -i en aquest Ili-

bre se'n descriuen d'altres-, per6 la fisica dela seva difracci6 fa que sigui la tecnica mesimportant, ara per ara, per investigar estruc-tures biol6giques a resoluci6 at6mica. Enefecte, les estructures resoltes per raigs X te-nen un gran impacte perque poden donaruna visi6 a la vegada global i increIblementdetallada de sistemes molt complexos.

FONAMENTS DE LA DIFRACCIO

Els principis fonamentals de la difracci6,en particular de la difracci6 de raigs X, estanmolt ben definits (figura 1). En una situaci6ideal, la imatge de difracci6 ( F) d'un objectepot obtenir-se corn la transformada de Fourier(F) de ]a densitat electronica (p) de I'objecte

F(S) = F[p(r)]

on S es relaciona amb la direcci6 de difrac-ci6 i r indica un punt de l'objecte. Si dispo-sem de la imatge de difracci6 completa, espossible calcular la distribuci6 de ]a densitat

CRISTAL LOGRAFIA DE PROTEINES 15

electronica en l'objecte mitjancant la trans-

formada de Fourier inversa (F -')

p(r) = F ' [F(S)]

Coneixer totalment una imatge de difrac-

cio implica coneixer la intensitat i la fase de

la radiaci6 difractada en totes les direccions.

La intensitat es proporcional al nombre de

fotons dispersats en cada direcci6. La fase es

relaciona amb la disposicio relativa de les

ones difractades en les deferents direccions.

A la majoria dels experiments de difracci6

nomes es poden mesurar les intensitats

pero, en general, es perd totalment la infor-

maci6 relativa a les fases. Aquesta perdua

d'infor nacio es la principal dificultat amb

que s'entrebanquen les tecniques de difrac-

cio, i es coneix com el «problema de la fase» .

4 Representacio de la molecula

COMPUTER

En les tecniques de microscopia, el proble-

ma de la fase es resol experimental ment mit-

jancant la utilitzacio de lents (optiques o elec-

tromagnetiques segons es tracti d'aparells

que treballin amb Hum, com son els microsco-

pis optics, o be amb electrons, com els micros-

copis electronics) que realitzen fisicament el

proces equivalent a la transformada de Fou-

rier inversa (figura 1). Amb tot, pel que fa als

raigs X, no ha estat possible encara construir

lents eficients i, per tant, no existeixen micros-

copis d'alta resoluci6 de raigs X. La impossibi-

litat de superar experimentalment de manera

directa el ,problema de la fase» quan s'utilit-

zen raigs X ha obligat a cercar, per a calla tipus

de problema, una soluci6 concreta.

Quan l'objecte que difracta to una orga-

nitzacio interna que es repeteix periodica-

ment (com es el cas dels cristalls moleculars)

MAPA de DENSITAT ELECTRONICA

TRIDIMENSIONAL CALCULAT

(Sintesi de Fourier)Atoms representats per regions d'elevadadensitat electronica

FASES

ORDINADOR

Radiaciodispersada

OBJECTE(cristall)

RAIGS X

CRISTAL•LOGRAF/FA

DETECTORDetector electronic o fotografic.

Els raigs X difractats no poden ser

reenfocats per formar una imatge.

Per tant , son interceptats i mesurats

mitjanpant un comptador o una pel-licula

sensible a raigs X

Sintesi de Fourier

Hot iin 1. lsqucma del proces do la difracci6 do raigs X.

I(, ilI(lJ (;( MII. A( R/ I URIM,( 1:R. 1.1'.•IIYI:RGotI1 -Rt 711.16A ISII II I IIIIc)( II ((M.L

la radiacio difractada solament es distintade zero en determinades direccions , anome-nades reflexions ( figura 2, annex 1). La sepa-racio entre reflexions continues es inversa-ment proporcional a ]a periodicitat en elcristall : les grans macromolecules tenen pe-riodicitats de diversos centenars d'angs-troms i, per tant, la imatge de difraccio potesser de milers o centenars de milers de re-flexions molt properes entre si.

La determinacio de 1'estructura tridi-mensional d'una molecula biologica, mit-jancant la cristal • lografia de proteines, se-gueix una sequencia d'etapes experimentalsi analftiques molt ben establertes : a) obtenircristalls de la macromolecula adequats per aestudis d'alta resolucio ; b) mesurar les in-tensitats de les reflexions d'aquests cristalls;c) determinar -ne les fases corresponents;d) construir un model atomic que s'ajusti almapa de densitat electronica experimental; ie) afinar el model optimitzant l'acord ambles dades experimentals . Malgrat tots elsprogressos, la determinacio de 1'estructurad'una macromolecula presenta sovint rep-tes dificilment superables , principalment ales etapes de cristal-litzacio i determinaciode les fases.

a) Cristal-litzacio. L'obtencio de cristallses un proces empiric; 1'experiencia acumu-lada proporciona indicacions cada cop mesOtils, pero continuen essent necessaris ungran nombre d'assaigs en els quals la sensi-bilitat de 1 ' investigador to un paper moltimportant. Les tecniques de purificacio i ob-tencio de biomacromolecules han experi-mentat un gran desenvolupament , la qualcosa ha facilitat o ha permes l'obtencio demostres molt pures en les quantitats (dese-nes de milligrams ) que es requereixen perendegar els intents de cristal•litzacio . En l'a-partat de la cristal•litzacio cal inclouretambe la preparacio de cristalls isomorfs alsde la prote'ina nativa pero en els quals s'hanintroduit metalls pesants, necessaris en al-

gunes de les tecniques mes emprades per re-soldre el problema de la fase.

b) La mesura de la intensitat difractada esforca directa en molts casos ; pot estar al limitde la tecnologia en casos extrems . Un proble-ma tipus pot donar lloc a poques desenes demilers de reflexions amb una precisio tanbona com un 2-3% i, en general , no per sotad'un 6-8 %. Tant els detectors com la font deradiacio son importants . Practicament totsels detectors actualment en us son detectorsd'area i els mes utilitzats son del tipus de pla-ca d'imatgesi els CCD. La intensa radiacio desincrotro , en particular pel que fa als sincro-trons de tercera generacio, esta permetent re-collir dudes de raigs X que abans eren impen-sables amb generadors convencionals.

c) La determinacio de la fase es un dels as-pectes que fins ara han diferenciat qualitati-vament la cristal-lografia de macromoleculesde la de petites molecules. Les tecniques uti-litzades mes sovint per resoldre el problemade la fase en cristal-lografia de macromolecu-les son: a) el reemplacament isomorf, b) el re-emplacament molecular i c) les tecniques dedifraccio anomala. En el reemplacament iso-morf es necessari disposar de dades de di-fraccio, no solarnent dels cristalls natius singtambe de cristalls en els quals s ' hagi introduituna petita quantitat d'atoms pesants. Les di-ferencies entre els espectres dels cristalls na-tius i els derivats, un cop localitzats els atomspesants , ens donen informacio sobre les fasesde les diferents reflexions. Quan la moleculaque s ' estudia esta relacionada amb una altrad'estructura ja coneguda, poden utilitzar-seles tecniques de reemplacament molecular.Finalment , cal comentar que les tecniques dedifraccio anomala son cada cop mes impor-tants gracies a les possibilitats que esta oferintla radiacio de sincrotro.

d) La interpretacio dels mapes de densitatelectronica per construir un model molecu-lar depen de la resolucio disponible i de laprecisio en la determinacio de les intensitats

CRIST.•IL LOGR.II l l I>f I'RQTI:l V'E I'

i, sobretot, de les fases. Els sistemes grafics i

els programes de modelatge sofisticats, com

son els 0 i FRODO (Jones, 1985), faciliten

molt la interpretaci6 dels mapes i la construc-

cio dell models inicials. El concepte de reso-

lucio Os molt important. Si les fases son molt

bones, la cadena polipeptfdica pot seguir-se a

una resolucio d'aproximadament 3,5 A. Amb

una resolucio d'aproximadament 1,2 A els

atoms s'individualitzen. Les resolucions

amb les quals es treballa en macromolecules

oscil.len, en general, entre 2 i 3 A.

e) En l'optimitzacio dels models molecu-

lars en cristal•lografia de macromolecules

les principals dificultats venen donades peI

redu'it nombre de reflexions respecte al

nombre de parametres que es necessiten per

descriure, en 1'ambit atomic, una rnacromo-

lecula. Per tal de superar aquesta situaci6

existeixen dues alternatives extremes: a) re-

duir el nombre de parametres independents

que s'utilitzen per descriure l'estructura, o

b) augmentar el nombre de dades disponi-

bles amb informacio addicional sobre l'es-

tructura. Altres alternatives es deriven, na-

turalment, de la combinaci6 d'aquestes

dues alternatives extremes. El proces d'afi-

nament es un dels aspectes en els quals s'ha

treballat mes en els darrers anys, donat que:

a) no s'ha assolit l'afinament total de practi-

cament cap estructura molecular pel fet que

el desacord obtingut entre els millors mo-

dels afinats i les dades de difracci6 ha estat

sempre superior a Terror experimental en

les dades, i b) bona part de la informacio que

es vol obtenir en plantejar la determinacio

d'una estructura nomes apareix quan es dis-

posa de models moleculars hen afinats.

ESTRUCTURES RELLEVANTS EN

L'AMBIT INTERNACIONAL

En el camp dels enzims les primeres es-

tructures cristal•lografiques descrites a fi-

nals dels anys seixanta i comencaments dels

setanta del lisozim (Blake et al., 1965), la

ribonucleasa (Kartha et al., 1967), la carboxi-

peptidasa A (Lipscomb et al., 1968), 1'a-qui-

motripsina (Matthews et al., 1967)), la papa'i-

na (Drenth et al., 4968), la subtilisina (Wright

et al., 1969), 1'elastasa (Shotton i Watson,

1970)) i la tripsina (Stroud et al., 1972) van

ser cabdals per entendre els seus mecanis-

mes d'acci6.

La immunologia es un altre ambit on la

cristal.lografia ha fet una contribucio deci-

siva. Les estructures de fragments d'anti-

cossos i els seus complexos amb antigens

proteics han permes explicar moltes carac-

teristiques de la defensa immunologica.

Destaca especialment l'impacte dels resul-

tats estructurals de les molecules presenta-

dores de peptids a la superficie cellular, ja

que van proporcionar les bases per a ]a im-

munologia molecular (Poljak,1975).

Els virus constitueixen l'area de la cris-

tal.lografia de raigs X en que s'han analitzat

les estructures mes grans, ja que estan for-

mats per un elevat nombre de copies rela-

cionades per sirnetria interna d'una mateixa

entitat basica i mes petita, asimetrica. Les

primeres estructures viriques a alta resolu-

cio es van determinar a finals dels anys se-

tanta (Champness et al., 1976; Olson et al.,

1983). D'aquests conglomerats macromole-

culars destaca-el virus associat a tumors en

els simis,l'SV40 (fig. 3c, annex 1), que repre-

senta l'estructura simetrica mes voluminosa

de les analitzades fins ara, amb 900.000

atoms ordenats (sense tenir en compte els

atoms d'hidrogen) (Liddington et al., 1991).

Un altre cas paradigmatic s6n les estructu-

res de les proteines que constitueixen la cap-

sida del virus de la grip humana, ja que van

demostrar com els virus pollen enganyar el

sistema immunitari (Rossmann et al., 1985);

aquest concepte es va estendre mes tard en

el cas del virus del refredat, que mostra corn

el hoc d'uni6 al receptor esta protegit.

l v I / l ( l 1 ( I ( 1 1 ( 7 / \ ( R / I I / 7 / ) I (, 1 / Al / \ I I / / 1 ( 1 0 M^R( llll(,\I)////I/C/lr)(1/(()//

Una visio espectacular del mecanisme

fotoquimic de conversio energetica ha estat

proveIda per l'estructura del centre de reac-

cio fotosintetic bacteria (figura 3a, annex 1,

Deisenhofer et al., 1985). La cristal•litzacio

d'aquesta proteina integral de membrana

va representar una fita historica per si ma-teixa, que recentment ha estat acompanya-

da amb la resolucio d'altres protemes inte-

grals de membrana, com son el citocrom Coxidasa (figura 3f Iwata et al., 1995), que es

un complex multimodular que redueix l'oxi-

gen molecular a aigua en el darrer pas del

metabolisme de nutrients, i la porina (Weiss

et al., 1991). El centre de reaccio fotosintetic

va suposar fins fa poc 1'estructura asimetri-

ca mes gran resolta per cristal-lografia, amb

10.288 atoms (sense considerar els hidro-

gens), fins que va esser rellevada d'aquesta

posicio en el podi primer per la (3-galactosi-

dasa (figura 3, annex 1), amb 1.023 aminoa-

cids (Jacobson et ill., 1994), i molt recentment

pel proteosoma eucariotic (figura 3d, annex

1), amb 2 x 24.444 atoms (Gro11 et al., 1997).

Aquest es un complex proteolitic intrace-

lul.lar involucrat en el processat d'antigens

intracel•lulars que provoquen respostes im-

munologiques citolitiques.

Altres proteines resoltes per cristal-lo-

grafia de raigs X son les que intervenen en la

unio i el reconeixement dels acids nucleics,

com les polimerases (Joyce i Steitz, 1994;

Ollis et al., 1985) o les aminoacil t-RNA sin-

tetases (Cavarelli et al., 1993), que conjun-tament amb l'estructura del t-RNA van

permetre «veure» com es «Ilegeix» el codi

genetic en les operacions de la replicacio, la

transcripcio i la traduccio. L'estructura de la

transcriptasa reversa (figura 3h, annex 1),

una DNA polimerasa dependent de RNA,

que es utilitzada, per exemple, pel virus de

la SIDA per integrar-se en el genorna de la

cel•lula hoste, va ser molt util per al dissent'

d'inhibidors destinats a millorar el tracta-

ment d'aquesta malaltia (Kohlstaedt et al.,

1992). En aquest camp relacionat amb ma-

lalties, tambe cal mencionar 1'estructura

dels productes genies dels oncogens ras i

163, entre altres, associats al desenvolupa-

ment de diversos tipus de cancer (de Voss et

al., 1988), i el factor de transcripcio NFKB, un

homodimer de 50 kDa que reacciona davant

de processos de fosforilacio en el citoplasma

translocant-se al nucli, on activa gens

(Ghosh et al., 1995).

Finalment, ressaltem algunes altres es-tructures que han representat fites des del

punt de vista metodologic i bioquimic, cornson el subfragment I de la miosina, respon-

sable de la generacio de forca en el muscul

(Rayment et al., 1993); la F1 ATPasa, un hete-

roheptamer que to un paper central en el me-

tabolisme energetic, i converteix gradients

de protons en molecules d'ATP (Abrahams

et al., 1994); el complex ciclina A-CDK2, res-

ponsable de la coordinacio de la divisio en elcicle cellular (Jeffrey et (71., 1995); i el nucleo-

soma (Luger et al., 1997).

ESTRUCTURES REPRESENTATIVES

RESOLTES A BARCELONA

Anticossos

La cristal-lografia de complexos d'anti-

gens virals i anticossos esta proporcionant

una millor comprensio de com els virus sonreconeguts pels anticossos i dels mecanis-mes pels quals aquests virus escapen a la

pressio immune. En aquesta linia, s'ha dut a

terme la cristal•litzacio i la determinacio del'estructura de diferents complexos entre

anticossos neutralitzants dirigits contramembres de la familia dels picornavirus iels peptids sintetics que simulen els hoes an-tigenics d'aquests virus (Tornio et al., 1994;

Verdaguer et ill., 1996; 1 iewat eta!., 1997). La

possibilitat de combinar les tecniques decristallografia de raigs X i criomicroscopia

(RIS111. LUGRAF1.l 1)li I'RO71:l\E. 19

ha permes d'obtenir informacio estructural

de complexos sencers virus-anticos des del

punt de vista de la resolucio quasi atOrnica.

Aquests grans complexos macromoleculars

son molt inestables i, per tant, diffcilment

cristal•litzables. L'aplicacio d'aquestes tec-

niques combinades als nostres complexos

ha permes d'esbrinar els mecanismes de

neutralitzacio utilitzats per aquests anticos-

sos (figura 4a, annex 1).

Catalases

La catalasa (peroxid d'hidrogen oxidore-

ductasa, EC1.11.1.6) es troba en tots els or-

ganismes aerobis. Aquest enzim serveix, en

part, per protegir la cel•lula dels efectes to-

xics de petits peroxids, encara que la totali-

tat de les seves funcions biologiques no son

del tot Glares. Es coneixen dos tipus life-

rents de catalases: les que contenen Mn2*

com a grup prostetic i les que contenen el

grup herno. Les catalases que contenen

Mn`' es presenten nomes en alguns organis-

mes procariotes i son enzims hexamerics

amb un plegament en helix a. Les catalases

que contenen el grup hemo son presents a la

major part d'organismes procariotes i euca-

riotes i presenten una estructura d'homo-

tetramers amb uns pesos moleculars entre

200 i 350 kD. La catalasa hidroxiperoxidasa

II (HPII) (Bravo ct al., 1995) d'Esccrichia coli

pertany a aquest darrer grup. Els tetramers

d'aquesta catalasa presenten una acurada

sirnetria molecular (figura 46, annex 1).

Glutati6 S-transferasa

S'ha resolt l'estructura del glutatio

S-transferasa classe Pi de fetge de ratoli, tant

de la prote"ina lliure modificada com de la

proteina complexada amb diferents inhibi-

dors i analegs de substrat. Les GST son en-

zims desintonxicadors que catalit7en l'atac

nucleofilic de I'atom de sofre del glutatio al

grup electrofilic d'un ampli ventall de subs-

trats toxics de tipus hidrofobic, incloent-hi

els carcinogenics i altres substancies xeno-

biotiques. Endemes, aquests enzims estan

implicats en el transport intracellular i en

l'emmagatzemament de molecules hidrofo-

biques del tipus haernatina, sals biliars i bili-

rubina.

La GST classe Pi de ratoli es un dfiner de

47 kD de pes molecular . El centre actiu de

les GST presenta dues zones d'unio al subs-

trat, I'anomenat subseti G d'unio al glutatio

i el subseti H d'unio al compost hidrofobic.

S'han descrit cinc classes diferents de GST

solubles de mamifer i se'n coneix I'estruc-

tura tridimensional de cadascuna , i s'obser-

ven Glares diferencies en el centre actiu i es-

pecialment en el subseti hidrofobic. La Tyr7

del centre actiu es l'unic residu que esta

prou a prop de 1'atoin de sofre del glutatio,

i per tant s'ha postulat que actuaria com a

base general, encara que estudis recents ens

fan pensar que aixo no es cert (figura 4d,

annex 1).

En el grup s'han determinat diferents es-

tructures de GST amb hexilglutatio a 2,2 A,

acid glutatio sulfonic a 1,9 A, s-(p-nitroben-

zil)glutatio a 1,8 A (Garcia-Saez et al., 1994) i

glutatio a 2,4 A que han permes l'observacio

de les interaccions que tenen Iloc en el centre

actiu de l'enzim, especialment en el seti hi-

drofobic.

Per rao de 1'elevada afinitat de l'enzim

pet glutatio i del fet que aquest es purifiqui

amb columnes d'afinitat amb glutatio, es

dificil I'obtencio de cristalls d'enzim Iliure.

Pero aquests es poden obtenir modificant la

Cvs47. La modificacio quimica de la Cys47

porta a la inactivacio de l'enzim. En 1'estruc-

tura tridimensional s'observa que la Cys47esta a 12 A del centre actiu, situada en una

zona helicoidal. En l'estructura de la GST

amb la Cvs47 carboxi metilada, s'observa

que la zona on es troba el residu modificat

esta desordenada. Aquesta zona inclou resi-

VI I I I ( l ( ; ( I S ( 7 / ,//%I RI ! 1 1k!) l ( i ( hK / V I I I l i 111, I(, A !JI 11I I/ I//O( El (01!.

dus que participen en la unio del glutatio.Quan 1'enzim carboxi metilat se 1'uneix ambs-(p-nitrobenzil)glutatio en el centre actiu,observern una reestructuracio de la zona ones troba situada la Cys-47. La unio del subs-trat indueix 1'estructuraci6 del centre actiu(Vega et al., 1998).

Proteines de transduccio de senyal enbacteris

Una altra de les linies d'investigacio dellaboratori esta centrada en les proteines bac-terianes implicades en sistemes de trans-duccio de senyal. Aquestes proteines tenenuna elevada homologia de sequencia en eldomini fosforilable.

La CheY (figura 4c, annex 1) es una pro-teina reguladora de resposta en els sistemesde transduccio de senyal de la quimiotaxiabacteriana, i s'activa amb la transferenciad'un grup fosfat que li proporciona la com-ponent quinasa CheA, la qual esta en con-tacte amb els receptors de membrana. Per ala transferencia d'aquest grup fosfat cal lapresencia del catio Mg''. S'ha suggerit quel'activacio de la proteina CheY consisteix enun canvi conformacional en punts de la sevasuperficie que s'ha demostrat que interac-tuen amb la base del motor flagel-lar. L'es-tructura tridimensional de la proteina unidaal cofactor magnesi mostra canvis confor-macionals en aquests punts quan es compa-ra amb 1'estructura de I'apoproteina (Bellso-lell et al., 1994,1996).

La proteina PhoB es el component regu-lador d'un sistema de transduccio de senyalde dos components, es activada per la qui-nasa PhoR i actua coin un factor de trans-cripcio que activa Bens relacionats amb eltransport i 1'assimilaci6 del fosfat. En el la-boratori s'ha clonat, expressat, purificat,cristal•litzat i resolt 1'estructura tridimensio-nal de la proteina PhoB, utilitzant la tecnicade MAD.

CONCLUSIO I PERSPECTIVA

Tot fa pensar que el creixement expo-nencial d'estructures resoltes per difracciode raigs X no s'aturara en els propers anys.Els avencos en l'instrumental han estat moltgrans i son responsables, en part, del boomestructural actual. Tambe ho seran on el fu-tur proxim. Hem mencionat la radiacio desincrotro. Ara s'estan construint sincrotronsde tercera generacio, amb multitud de liniesde hum dedicades a ]a cristal-lografia deproteines. Cal tambe mencionar els detec-tors de raigs X d'area, que disminueixen no-tablement el temps necessari per a la presade dades; les tecniques de criocristal-logra-fia, que s'estan generalitzant i que per-meten conservar els cristalls malgrat queestiguin sotmesos a una radiacio molt in-tensa; les estacions grafiques i els ordina-dors parallels cada cop mes potents, queacceleren el proces de determinacio i afina-ment de les estructures.

Els avencos en els metodes de detenni-nacio estructural van on parallel amb elsavencos tecnologics. Aixi passa, per exem-ple, amb l'avenc metodologic impor-tant dels ultims anys i que esta revolucio-nant la forma coin es resolen les estructures:la difraccio anomala de longitud d'onesmultiples (MAD). Aquest metode requereixajustar la longitud d'ona de la radiacio sin-crotronica, donat que s'ha de repetir la reco-llida de dades a diverses longituds d'ona.Amb onduladors insertats on el recorregutdels electrons (o positrons) on els tunels dcIsincrotro es possible variar la longitud d'o-na sense perdre la intensitat desitjada. Elmetode MAD tambe va Iligat a la criocris-tal.lografia. La congelacio dels cristalls fapossible recollir totes les dades, durant di-versos dies, amb un sol especimen, cosa queobvia els problemes de no-isomorfisme en-tre els diferents conjunts de dades.

Altres avencos metodologics, encara que

(RI.ST.II. LOCR.!{'1:1I)!I I? )TFI^F..1' 21

no son tan impartants corn el MAD, no dei-

xen de ser notables: les millores en els meto-

des d'afinament d'estructures, en cis meto-

des de reemplacament molecular i en els

programes d'ajust grafic, cada cop mes au-

tomatics.

No es previsible que als cristal•lografs

se'ls acabi el material per estudiar en els

propers anys. MOs aviat al contrari. Nomes

el projecte del genorna huma ajudara a de-

finir mes de 100.000 gens. Els productes

genies seran motiu d'estudi funcional i es-

tructural. Aixo sense comptar tota la resta

d'essers vius amb variants interessants de

les mateixes proteines o altres de diferents.

En el terreny biotecnologic la cristal-lo-

grafia de proteYnes tindra un paper creixent

en el futur. Avui dia, les companyies quimi-

ques i farmaceutiques mes importants del

mon tenon grups de cristal-lografia de pro-

teines. De moment, a les empreses catalanes

o espanvoles d'aquests sectors no n'hi ha cap

-encara que si que tenen equips de modelat-

ge molecular-, potser a causa de la primesa

dels departarnents de recerca a les empreses

del nostre pais. Pero tard o d'hora la situacio

haura de canviar si es vol innovar i competir.

El futur de la cristal.lografia tambe ens

deparara la determinacio d'estructures cada

cop mes complexes, sobretot d'agregats mo-

leculars. En aquest sentit interaccionara

cada cop mes amb la microscopia electroni-

ca. Els models de criomicroscopia electroni-

ca pollen servir corn a models inicials per a

]a determinacio d'estructures atomiques

per a raigs X. Tambe la microscopia electro-

nica dels cristalls pot permetre la localitza-

cio de la particula o molecula dins de la

cel•la cristal•lina. Els grans agregats molecu-

lars corn el proteosoma (Groll et al., 1997), la

proteina de plegament GroEL (Braig et al.,

1994) o els virus icosahedrics (Abad-Zapate-

ro et al., 1980; Harrison et al., 1980; Ross-

mann ct al., 1985) s'han pogut solucionar a

alta resolucio i per raigs X grades al fet que

posseeixen una alta simetria interna o local.

Altres agregats moleculars, corn per exem-

ple el ribosoma, no tenen pas simetria inter-

na. Ara per ara no sabem si la seva determi-

nacio per raigs X sera possible, en tot cas hi

ha cristal.lografs que ho estan intentant.

REFERENCIES

AB.AD-ZAPATERO, C.; ABDEL-MEGUID, S. S.; JOHNSON, J. E.;

LESLIE, A. G. W.; RAYMENI, Y.; RCKSMANN, M. G.;

SUCK, D.; TSUKIHARA, T. (1980). ,Structure of south-

ern bean mosaic virus at 2.8 A resolution ". Nature,

mini . 286, pag . 33-39.

ABRAHAMS, J. P.; LESLIE, A. G. W.; LUUTER, R.; WAI.KI'N, J. E.

(1994). ,Structure at 2.8 A resolution of Fl-ATPase

from bovine heart mitochondria ". Nature, num.

370, pig. 621-628.

BiLLSOLELL, L.; CRONE'I, P.; MAIOLERO, M.; SERRANO, L.;

Coii , M. (1996). ,The three-dimensional structure

of two mutants of the signal transduction protein

Che Y suggests its molecular activation mech-

anism " . J. Mel. Biol., num. 257, pag. 116-128.

BI'.LLSOI,I:LL, L.; PRIETO, J.; SFRRANO , L.; CULL, M. (1994).

,,Magnesium binding to the bacterial chemotaxis

protein Che Y results in large conformational

changes involving its functional surface". J. Mel.

Biol., num . 238, pag. 489-495.

BIAKE, C. C.; KOF.NIC, D. F.; MAIR, G. A.; NORIiI, A. C.;

Piiu.I.ips, D. C.; SARMA, V. C. (1965). , Structure of

hen egg-white lysozyme. A three-dimensional

Fourier synthesis at 2 A resolution >>. Nature, num.

206, pag . 757-761.

BRAIC, K.; OrwiNOWSKI, Z.; HEIx;i, R.; Bois ERI, D. C.; JOA-

CHIMIAK , A.; HORWICH, A. L.; SIGIFR, P. B. (1994).

<<The crystal structure of bacterial chaperonin

GroEL at 2.8 A». Nature, nuns. 371, pag. 578-586.

BRAVO, J.; VERI)AGCER, N.; ToRMO, J.; BE rzr _, C.; SW I ALA,

J.; LOEWEN, 1'. C.; FHA. 1. (1995). ,Crystal structure of

catalase HP11 from Eschcrichia roll». Structure, num.

3, pag. 491-502.

CAVARELLI, J.; Ri i,,, B.; RUFi', B.; THIFRRY, J: C.; MORAS, D.

(1993). "Yeast tRNA" i' recognition by its cognate

class II aminoacyl -tRNA synthetase ,,. Nature, num.

362, pag . 181-184.

CiIAMPNESS, J. N.; BI_cxe<ilR, A. C.; BRICIX,N , G.; Berl iR,

P. C.; KLUG, A. (1976). , The structure of the protein

disk of tobacco mosaic virus to 5 A resolution". Na-

ture, num. 259 , pag. 20-24.

DF. Vos, A. M.; ToNC, L.; MILBURN, M. V.; MAnAS, P. M.;

JANCARIK, J.; NocUCiii, S.; NISIIIMCRA, S.; MIURA, K.;

--' 11,1( /1 G(.15( /1, %1 RIA I /iR/) I1,1 LR, /' 11171:8 (;Uill) R( 11/. lG A.1SI l ll.1 / 111()( 0, ( oil,

OHTSUKA, E.; KIM, S.-H. (1988). "Three-dimensional

structure of an oncogene protein: catalytic domain

of human c-H-ras p2l,. Science, num. 239, pag. 888-

893.

DFISENHOFER, J.; EPP, 0.; MIKI, K.; HUBER, R.; MICHFI., H.

(1985). ,Structure of the protein subunits in the

photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomo-

nas viridis at3 A resolution" . Nature, num. 318, pag.

618-624.

DRFNTH, J.; JANU,NIUs, J. N.; KOEKOEK, R.; SWFN, H. M.;

Wot F ! (ERR, B. G. (1968). ,Structure of papain". Na-

ture, num. 218, pag. 929-932.

GARCfA-SAE:z, I.; PARRA(,A, A.; PHn.l.us, M. F.; MANFLF,

T.J.; Cot 1, M. (1994). ,Molecular structure at 1.8 A

of mouse liver class Pi glutathione S-transferase

complexed with S-(p-nitrobenzvl)glutathione and

other inhibitors". J. Mol. Biol., num. 237, pag. 298-

314.

GHCxH, G.; VAN DUYNF, C.; GI losH, S.; SIGLER, P.B. (1995).

"Structure of NF-K B p50 homodimer bound to a

KB site)) . Nature, num. 373, pag. 303-310.

GROI.L, M.; Di [zEI., L.; LH1VI:, J.; SFO( K, D.; Bo ltit I R, M.;

BARTUNIK, H. D.; FHUBER, R. (1997). "Structure of 20S

proteasome from yeast at 2.4 A resolution)). Nature,

num. 386, pag.463-471.

HEwAI, E.A.; VERDAGUFR, N.; FI IA, I.; BI AKE:MORE, W.;

BROOKES, S.; KING, A.; NEwMAN, J.; DoMINuo, E.; MA-

FEU, M. G.; S TART. D. (1997). "Structure of the com-

plex of an Fab fragment of a neutralizing antibody

with foot-and-mouth disease virus: positioning of

a highly mobile antigenic loop". EMBO J., num. 16,

pag. 1492-1500.

IwATA, S.; OSFFRMEIER, C.; LUDWIG, B.; MICHFL, H. (1995).

,Structure at 2.8 A resolution of cvtochrome c oxi-

dase from Paracoccus denitrificlms». Nature, num.

376, pag. 660-669.

JACOBSON, R. H.; ZHANC, X.-J.; DLBoxi, R. F.; MArrHEWs,

B. W. (1994). ,Three-dimensional structure of (3-ga-

lactosidase from E. coli". Nature, num. 369, pag.

761-766.

JEFFREY, P. D.; Russo, A. A.; POLYAK, K.; GIBBS, E.; HuR-

wlTZ, J.; MASSAC,UE, J.; PAVLEncH, N. P. (1995). ,Mech-

anism of CDK activation revealed by the structure

of a cyclinA-CDK2 complex, >. Nature, num. 376,

pag. 313-320.

JONES, T. A. (1985). ,Interactive computer graphics:

FRODO». Methods Enzymol., num. 115, p5g. 157-

171.

JOYCE, C. M.; Sri117, T. A.; (1994). ,Function and struc-

ture relationships in DNA polymerases". Annu.

Rev. Biochem., num. 63, pag. 777-822.

KARTHA, G.; BEI.Lo, J.; HARKER, D. (1967). "Tertiary struc-

ture of ribonuclease". Nature, num. 213, pag. 862-

865.

KENDREW, J. C.; DICKERtisN, R. E.; SFRANDBFRG, B. E.; I IARI,

R. J.; DAVIE,,, D. R.; PIirLLIPS, D. C.; SHORT, D. C.

(1960). ,Structure of myoglobin". Nature, num.

185, pag. 422-427.

KOIIItir.4FT>I, L.A., WAN(,, J.; FRIEDMAN, J. M.; RICE, P. A.;

SrEnz, T.A. (1992). <Crystal structure at 3.5 A reso-

lution of HIV-1 reverse transcriptase complexed

with an inhibitor,,. Science, num. 256, pag. 1783-

1790.

LIDDINu ION, R. C.; YAN, Y.; Mc1C I Al, J.; SAHLI, R.; BENJA-

MIN, T. L.; HARRISON, S. C. (1991). ,Structure of si-mian virus 40 at 3.8-A resolution,,. Nature, num.

354, pag. 278-284.

LIPS( OMB, W. N.; HARTSUCK, J. A.; REEKS, G. N. JR.; QUio-

(HO, F. A.; Brrl K;F, P. H.; LUDWIG, M. L.; STErrz, T. A.;

MuIRHPAD, H.; COPPOLA, J. C. (1968). ,The structure

of carboxvpeptidase A. VII. The 2.0-A resolution

studies of the enzyme and of its complex with

glycyltyrosine, and mechanistic deductions" . B,ook-

haven Symposia in Biology, num. 21, pag. 24-90.

LucEK, K.; MADER, A. W.; RICIIMOND, R. K.; SARCENT, D.

F.; Ri(ilMOND, T. J.; (1997). "Crystal structure of the

nucleosome core particle at 2.8 A resolution,,. Na-

ture, num. 389, pag. 251-260.

MArmEws, B. W.; SIGEER, P. B.; HENDERSON, R.; Blow,

D. M. (1967). ,Three-dimensional structure of

tosyI-a-chymotrypsin<. Nature, num. 214, pag.652-656.

OLLIS, D.L.; BRICK, I'.; HAMLIN, R.; XUONG, N. G.; STErrz, T.

A. (1985). "Structure of large fragment of Escheri-

chin coli DNA polymerase I complexed with

dTMP». Nature, num. 313, pag. 762-766.

OI'A )N, A.J.; BRIax;NE, G.; HARRIW IN, S. C. (1983). Struc-

ture of tomato bushy stunt virus IV. The virus par-

ticle at 2.9 A resolution, >. J. Mol. Biol., num. 171,

pag. 61-93.

PERU I Z, M. F.; ROSSMANN, M. G.; Cull IS, A. F.; MUIRI lEAD,

I I.; Wit I., G.; NoRIII, A. C. T. (1960). ,Structure of

haemoglobin. A three-dimensional Fourier synthe-

sis at 5.5 A resolution, obtained by x-ray analysis" .

Nature, num. 185, pig. 416-422.

POLJAK, R. J. (1975). ,Three-dimensional structure,

function and genetic control of immunoglobulins».

Nature, num. 256, pig. 373-376.

RAYMFNT, I.; RYPNIrwsKI, W. R.; SCHMII'I-BAST, K.; SMITH,

R.; Tom(HICK, D. R.; BFNNIN<;, M. M.; WINKELMANN,

D. A.; WESENBERC, G.; HOLDI[N, H. M. (1993).

,,Three-dimensional structure of myosin subfrag-

ment-1: a molecular motor". Science, num. 261, pag.50-58.

RcrisMANN, M. G.; ARNOI D, E.; ERICKSSON, J. W.; FRA\KF.N-

BERGER, E. A.; GRIHanI, J. I'.; HECIIF, H. J.; JOHNSON, J.

E.; KAMER, G.; Luo, M.; McnsER, A. G.; RUE:CKFRI, R.

R.; Si TERRY, B.; VIol-Nil, G. (1985). ,Structure of a hu-

man common cold virus and functional relation-

ship to other picornaviruses» . Nature, num. 317,

pag. 145-153.

SHllrrON, D. M.; WAISON, H. C. (1970). "Three-dimen-

(RISI:II.1OGR.I/ LII)EPRO IEI\L.

sional structure of tosyl-elastase>>. Nature, num.

225, pag. 811-816.

STROUD, R. M.; KAY, L. M.; DI(KERx0N, R.E. (1972). The

crustal and molecular structure of DIP-inhibited

bovine trypsin at 2.7 A resolution". Cold Sprin<'

Harbour Symp. Quart. Biol., num. 36, pag. 125-140.

TosMo, J.; BI.AAS, D.; PARRY, N. R.; Row%LANDS, D.; STUART,

D.; FrrA, 1. (1994). "Crystal structure of a human rhi-

noviruses neutralizing antibody complexed with a

peptide obtained from virial capsid protein VP2>>.

EMBO J., num. 13, pag. 2247-2256.

Vii ,A, M. C.; W Ai 511, S. B.; MANILE, T. J.; Coci, M. (1998).

,,The three-dimensional structure of Cys-47-modi-

tied mouse liver glutathione S-transferase P1-1» . J.

Biol. Cllem., num. 273, pag. 2844-2850.

ViRDAGUER, N.; MA I i , M. G.; ANDRI:U, D.; GIRAI r, F.;

Doo INco, E.; FITA, I. (1995). ,Crystal structure of

the major antigenic loop of foot-and-mouth dis-

ease virus complexed with a neutralizing anti-

body: direct involvement of the Ala-Gly-Asp mo-

tif in the interaction,,. EMBO J., num. 14, pag.

1690-1696.

WAISON, J. D.; CRICK, F. H. C. (1953). <<Molecular struc-

ture of nucleic acids. A structure for deoxyribose

nucleic acid." . Nature, num. 171, pag. 737-738.

WI:ISS, M. S.; ABELE, U.; WECKESSI R, J.; Wrrr1, W.; S(1 uI rz,

E.; ScnLi.z, G. E. (1991). <<Molecular architecture

and electrostatic properties of a bacterial porin".

Science, num. 254, pag. 1627-1630.

WITIDAWER, A.; MILLER, M.; JASKC)ISKI, M.; S,VInANARA-

YANA, B. K.; BALM IN, E.; WETTER, I. T.; SILK, L. M.;

CLAWSON, L.; SCIINI]DOR, J.; KEN[, S. B. H. (1989).

,,Conserved folding in retroviral proteases: crystal

structure of a synthetic HIV-1 protease». Science,

num. 245, pag. 616-621.

WRIGIII, C. S.; ALDEN, R. A.; KRAUT, J. (1969). "Structure

of subtilisin BPN' at 2.5 A resolution'>. Nature,

num. 221, pag. 235-242.