Perfiles de expresión de ARNm en sangre periférica predicen g p p

supervivencia en cáncer de próstata resistente a castración (CRPC)( )

David Olmos1,3, Elena Castro2,4, Jeremy Clark5, Daniel Brewer5, Chris Parker3, Alison Reid1, Shahneen Sandhu1, Robert Jones7, Colin Cooper5, Johann de Bono1,6

1 Prostate Cancer Team, Drug Development Unit, 2 Academic Urology, Th R l M d NHS F d ti T t L d & S tt R i U idThe Royal Marsden NHS Foundation Trust, Londres & Sutton, Reino Unido

3 Molecular Cytogenetics team, 4 Cancer genetics team, 5 Prostate molecular carcinogenesis team, 6 Cancer Biomarkers team, The Institute of Cancer Research, Sutton.

7 G it i C it Th B t W t S tl d C C t Gl R i U id7 Genito-urinary Cancer unit, The Beastson West Scotland Cancer Centre, Glasgow, Reino Unido.

Introducción

Cada año se diagnostican ~900.000 nuevos casos de cáncer de próstata (CaPr)1.

El pronostico de los pacientes con CaPr es muy variable:La mayoría son diagnosticados en fases tempranas y con tumores poco

agresivos y/o indolentes2agresivos y/o indolentesOtros se presentaran o desarrollaran enfermedad avanzada, y en muchos

casos fallecerán por resistencia adquirida a las terapias disponibles3. 2ª causa de muerte por cáncer en varones en USA y 3ª en España.p y p

Los marcadores de riesgo tradicionalmente usados en esta enfermedad son deficientes y limitados a la hora de establecer pronósticos individualizados.

En el CaPr el acceso directo a tejido tumoral es muy limitado, la sangre periférica podría constituir una alternativa para el estudio de biomarcadores4:

Son test repetibles;Poco invasivos;Fácilmente aplicables a la practica clínica.

IntroducciónEl antígeno prostático especifico (PSA) es un ejemplo de marcador fácilmente

evaluable y reproducible.Depende de la actividad androgénica e informa de la carga tumoral.Depende de la actividad androgénica e informa de la carga tumoral.Util como herramienta diagnostica y a veces pronostica.No es un marcador adecuado de agresividad, supervivencia, o beneficio

terapéutico en la enfermedad avanzada5p

Nuevas tecnologías como las células tumorales circulantes7, 8:informan sobre el pronostico y la respuesta terapéutica en el CaPr avanzado.No se pueden aislar en todos los pacientes, y son de difícil caracterización.

Los perfiles de expresión de ARNm son otro ejemplo de marcador9, 10:Han contribuido a la clasificación y pronostico de los tumoresSu aplicación se encuentra limitada por la necesidad de tejido fresco.

L él l í (CS) d 16 000 20 000 tLas células sanguíneas (CS) expresan de 16.000 a 20.000 genes en respuesta a cambios micro- y macro-ambientales como los generados por el CaPr11

aberraciones cromosómicas y metilación anormal en CS en el CaPr.ARNm de alta calidad procedente de CS se ha utilizado para el diagnósticoARNm de alta calidad procedente de CS se ha utilizado para el diagnóstico

diferencial múltiples enfermedades16

Material y MétodoEstudio de cohortes prospectivo, reclutamiento Agosto 2007 - Marzo 2008

Objetivo: Identificar patrones de expresión de ARNm en SP de pacientes con CaPr y estudiar su valor pronostico.

Pacientes diagnosticados de CaPr ~100 pts en 2 cohortes (1-30%, 2-70%)Cohorte 1 seguimiento activo (PSA cada 6 m + re-biopsia cada 24-30 m)Cohorte 1 – seguimiento activo (PSA cada 6 m + re-biopsia cada 24-30 m)

T1-T2, Gleason <3+4, PSA≤10, CaPr en <50% de las core-biopsiasCohorte 2 – CRPC con progresión al tratamiento actual (x3 PSAs)

Extracción sanguínea al menos cuatro semanas después de la interrupción del ultimo tratamiento para el CaPr – 2 tubos PAXgeneTM 2.5 mL

Arrays de oligonucleotidos: Affymetrix U133 Plus 2.0

RT-PCR mediante sondas TaqManCTC d l l t f V idCTC usando la plataforma VeridexTranslocacion TMPRSS2/ERG mediante nested PCR y FISH

Análisis estadístico y bio-informático con SPSS 18.0 y “R”á s s estad st co y b o o át co co S SS 8 0 y

PacientesCaracterísticas basales

í iTodos (n=94) Seguimiento activo (n=30) CRPC (n=64)

CaracterísticasTodos (n 94) Seguimiento activo (n 30) CRPC (n 64)

N % N % N %AgeMedian (range) 68.6 yrs (46.0-83.1) 69.8 yrs (49.7-82.6) 68.5 yrs (46.0-83.1)

Performance status ECOG 0 42 45% 23 77% 19 30%ECOG 0 42 45% 23 77% 19 30%ECOG 1 49 52% 7 23% 42 65%ECOG 2 3 3% 0 - 3 5%

Gleason ScoreGleason ≤6 39 42% 28 93% 11 17%Gleason ≤6 39 42% 28 93% 11 17%Gleason 7 15 16% 2 7% 13 20%Gleason ≥8 34 36% 0 - 34 54%Unknown 6 6% 0 - 6 9%

Stage at study entry (TNM)Stage I 30 32% 30 100% 0 -Stage IV 64 68% 0 - 64 100%- Bone MTS 55 59% 0 - 55 86%- Visceral MTS 9 9% 0 - 9 14%

Baseline PSA (ηg/mL)Baseline PSA (ηg/mL)Median (range) 34 (1-3683) 7.2 (3-20) 178 (1-3683)

PSA doubling time PSADT <3 mo 37 39% 0 - 37 58%PSDT 3-6 mo 17 18% 0 - 17 26%PSADT >6 mo 40 43% 30 100% 10 16%

Previous systemic treatment historyCastration 64 68% - 64 100%Anti-androgens 47 50% - 47 73%Steroids 22 23% 22 34%Steroids 22 23% - 22 34%Chemotherapy 27 29% - 27 42%- Docetaxel 19 20% - 19 30%

Variación intra- e interpaciente

Diferencias técnicas intrapacienteduplicados del mismo día

VOLCANO PLOT

(n=8)

Diferencias biológicas intrapacientedos tomas separadas un mes

( 9)

On log2 scale

(n=9)

1.0On log2 scaleOn log2 scale

Diferencias en Log2 >1 son relevantes, en 54,613 sondas por array:Dif i té i i t i t 2 8% i b >1Diferencias técnicas intra-paciente: 2,8% variaban >1 Diferencias biológicas intra-paciente: 4.4% variaban >1Diferencias biológicas inter-paciente: 9.1% variaban >1

Fuentes de variabilidadtécnica < biológica intra-paciente << biológica inter-paciente (p=0,00001)

Latent Process DescompositionMétodo bio-informático de análisis bayesiano no supervisado:Método bio informático de análisis bayesiano no supervisado:

1º identifica el numero optimo de procesos latentes en la población2º asigna una probabilidad a cada muestra para pertenecer a cada uno de

los grupos ( a diferencia de Hierachical clustering o PCA).os g upos ( a d e e c a de e ac ca c us e g o C )

Estos perfiles no se encuentran en pacientes con Ca Vejiga o enf reumatoideEstos perfiles no se encuentran en pacientes con Ca Vejiga o enf. reumatoide comparación “in silico” con perfiles publicados de ARNm en sangre

LPD 1 y Supervivencia en CRPC

10 pacientes no fueron clasificables en ningún grupo LPD (7 CRPC)10 pacientes no fueron clasificables en ningún grupo LPD (7 CRPC)

LPD 1 - 14 pacientes todos CRPC

LPD 2 16 pacientes CRPC 1 en seguimiento activo ► prostatectomia radicalLPD 2 - 16 pacientes CRPC, 1 en seguimiento activo ► prostatectomia radical

LPD 3 - 15 pacientes CRPC, 16 en seguimiento activo

LPD 4 - 12 pacientes CRPC 9 en seguimiento activoLPD 4 - 12 pacientes CRPC, 9 en seguimiento activo

Supervivencia Globalen CRPC

n=57n 57

LPD 1 factor pronostico independientep

Características p -valor HR CI-95%

i LPD 1 0 0001 4 8 2 18 9 6

parámetros significativos en el análisis univariante

pertenencia a LPD 1 <0.0001 4.58 2.18-9.65

ECOG PS s ?1 0.0099 2.4 1.23-4.67

PSA basal* 0.0016 1.001 1.000-1.01

Albumina sérica* 0.0001 0.87 0.81-0.93Albumina sérica 0.0001 0.87 0.81 0.93

Fosfatasa alcalina* 0.0008 1.001 1.000-1.01

Células tumorales circulantes ?5 0.0098 2.88 1.27-7.19

Numero total de tratamientos sistémicos* 0.014 1.23 1.05-1.45

Anti-andrógenos 0.0246 2.57 1.13-5.84

Numero total de quimioterapias* 0.0136 1.62 1.10-2.38

Docetaxel previo 0.0045 2.52 1.33-4.77

Translocación TMPRSS2 ex1/ERG ex5 0 0359 2 09 1 05 4 16Translocación TMPRSS2 -ex1/ERG -ex5 0.0359 2.09 1.05-4.16

pertenencia a LPD 1 0.00026 5.02 2.11-11.94Anti andrógenos 0 04991 2 23 1 00 4 99

Análisis multivariable (stepwise Cox)

Anti-andrógenos 0.04991 2.23 1.00-4.99

Numero total de quimioterapias* 0.01598 0.2 0.05-0.73

Docetaxel previo 0.01306 10.39 1.64-65.98

ECOG PS s ?1 0.09576 1.81 0.90-3.63

Translocación TMPRSS2 -ex1/ERG -ex5 0.12356 1.94 0.83-4.51

*Analizadas como variables continuas

LPD 1: Significado biológicoPrincipales genes asociados a LPD 1 por magnitud de

Gene symbol

Principales genes asociados a LPD 1 por magnitud de cambio (p ajustada< 0.05)

10 Prinipales regulados al alza

10 Principales regulados a la baja

Gene Symbol cambio Log2 Cambio Log2

Top 5 canonical Pathways associated with LPD group 1

10 pacientes no fueron

Gene symbolEBF1MACROD2OSBPL10PAX5

-1.87-1.72-1.72-1.67

-3.88-3.85-3.75-3.7

GYPARHAGIFI27MMP8

Gene Symbol cambio Log2 Cambio Log2 p -value

0.00003

0.00003

Ingenuity Canonical Pathways

iCOS-iCOSL Signaling in T Helper Cells

Calcium-induced T Lymphocyte Apoptosis

LOC283663FCRL5MS4A1IGHD

-1.61-1.6

-1.65-1.61-3.52

-3.46-3.35

CRISP3RAP1GAP

-3.55CRISP2MAOA

0.00012

0.00012

0.00014

Role of NFAT in Regulation of the Immune Response

CD28 Signaling in T Helper Cells

Methane Metabolism

Análisis funcionales (USCG database & http://biogps.gnf.org ) junto con el análisis de CTCs

FCRLAPRSS33

-1.58-1.57

-3.35-3.33

RHDMMP8

( p gp g g ) jy separación de diferentes fracciones celulares mediante FACS apuntan que el origen de estos cambios esta en las CD45+ y en la fracción mononuclear (CD71+) no CD45+

Tendencias funcionales en los perfiles

1 ↑↑ ↓ ↓

CD71+eritroides* Células-B Células-T

Tendencias funcionales en los perfiles de expresión de los grupos LPD 1-4

LPD * Indican movilización anómala de los precursores de MO 1 ↑↑ ↓ ↓

2 ↑ - -3 - ↓ -4 ↓ - -

p ecu so es de O

Firma de expresión para LPD 1Sondas Symbol Firma de 9

Como traducimos este perfil de expresión a

random forest algorithm

Sondas Symbol201174_s_at TERF2IP213096_at TMCC2204467_s_at SNCA209046

Firma de 9 genes clasifica*

LPD 1

S %perfil de expresión a una simple firma?

209046_s_at GABARAPL2202129_s_at RIOK3212330_at TFDP1203040_s_at HMBS

Sen- 93%Esp- 100%

*Validación 1552713_a_at SLC4A1201060_x_at STOM

a dac ócruzada múltiple

RT-PCR cuantitativa

Validación Técnica de la firma y genes principales por 

cuantitativa

magnitud de cambio

Firma LPD 1 mediante TaqMan

Supervivencia Globalen CRPC

64n=64

LOOCVLOOCV(validación interna)

% clasificación correcta

mediana 26.5 mCI-95% 18.1-34.9

correcta0.88

LPD 1 vs otrosHR 5.0, CI-95% 2.1-11.9, p=0.0002mediana 10.7 m

CI-95% 4.2-17.2

Conclusiones

Este estudio demuestra que es posible analizar datos de expresion génica ensangre periféricasangre periférica

Se pueden identificar patrones propios de CaPr, diferentes de otrasenfermedades y tumores urológicos, y con valor pronostico independiente.enfermedades y tumores urológicos, y con valor pronostico independiente.

Aquellos pacientes con CRPC con un perfil de expresion adversos se asocian aalteración de las células B y T, y posiblemente a una deficiencia inmune, así comoy , y p ,alteración de micro-ambiente medular.

Una firma de 9-genes, validada internamente en nuestra serie, permite clasificara estos pacientes de muy mal pronostico mediante una simple qRT-PCR usandosondas TaqMan/tarjetas microfluidicas.

éLa expresion de perfiles de expresion en sangre periférica de pacientes conCaPr merece una mayor valoración como posible herramienta pronostica ypredictiva, o como marcador farmacodinámico en el desarrollo de nuevas terapias,i l d t i i ló iincluyendo nuevas terapias inmunológicas.

AgradecimientosAgradecimientosThe Royal Marsden NHS &

F d ti T tThe Institute of Cancer Research

Foundation Trust

• Drug Development Unit– Prof Stan Kaye

• Molecular Cytogenetics– Dr. Janet Shipley

Mr Chris SheppardProf. Stan Kaye– Prof. Johann de Bono– Dr. Nikhil Babu-Oomen– Dr. Alison Reid

– Mr. Chris Sheppard

• Prostate molecular carcinogenesis

– Dr. Shahneen Sandhu

• Prostate cancer BiomarkersProf Johann de Bono

g– Prof. Colin Cooper– Dr. Jeremy Clark– Dr. Daniel Brewer

– Prof. Johann de Bono– Dr. Gerhardt Attard– Dr. Susanna Carreira– Ms. Lorna Pope

The Beatson Cancer Institute

Funding:

• Academic Urology/Cancer Genetics– Prof. Rosalind Eeles

D El C t

Funding:

– Dr. Elena Castro– Dr. Chris Parker