WAHANA. Volume 52. Nomer 1, Juni 2009

Perbedaan Motilitas Dan Kadar Reactive Oxygen Species Antara Normospermia Dengan Spermatozoa Yang Terkontaminasi Escherichia coli

Oleh :

Sukarjati Dosen Prodi Biologi FMIPA Universitas PGRI Adi Buana Surabaya

ABSTRACT

Genitourinary tract infection is one of the important causes of male infertility Influence Escherichia coli on human spermatozoa has been extensively studied. However; the eject Escherichia coli on production of Reactive Oxygen Species (ROS ) were ’n known. Semen samples were obtained from 40 infertile men. Semen were divided into 3 fraction. Each fraction were used to identzficated species of bacteria, semen analysis, determinate production of ROS. Identification species of bacteria performed by standart culture technique, conventional semen analysis according WHO criteria, Luminol-mediated chemiluminicence assay were used to determine ROS generation by non stimulated or stimulated with 12 myristate 13 acetate (PMA) or N F ormyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP). Result of this research: Production of ROS on semen contaminated by Escherichia coli higher than normospermia and Escherichia coli decrease sperm motility Conclutions of this study that Escherichia coli infection of semen may induce increase production of ROS , subsequently impaired of sperm motility. Keyword : Escherichia coli, ROS, sperm motility, normospermia PENDAHULUAN Infeksi traktus genitalis pria merupakan penyebab infertilitas sebesar 10 % (Khanna, et al., 1992). Infeksi traktus genitalis pria umumnya bersifat asymtomatis. Indikator bahwa telah terjadi infeksi traktus genitalis adalah adanya bakteri saat dilakukan kultur semen (bakteriospermia) dan ditemukannya lekosit > 1 juta/ml semen pada saat dilakukan analisa sperma (Lekositospermia). Adanya lekosit pada traktus genitalis tersebut akibat rusaknya blood testis barier akibat infeksi yang mengakibatkan kebocoran lekosit pada tubulus seminiferus dan epididimis sehingga konsentrasi lekosit dalam semen bertambah (Alvarez, et a1., 2002). Hasil studi yang telah dilakukan oleh beberapa peneliti menunj ukkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara spesies bakteri dan jumlah lekosit terhadap kualitas spermatozoa. Escherichia coli dapat menurunkan motilitas spermatozoa (Diemer, et al. 1996, Huwe et al.,l998) menyebabkan aglutinasi spermatozoa (Wolff, 1993). W015 et al.,_(1990) melaporkan bahwa teljadi penurunan motilitas spermatozoa pada lekositospermia, hiperaktivasi spermatozoa yang mana merupakan langkah penting dalam kapasitasi secara signifikan berkurang (Chan

eta1., 1994), serta rata-rata fertilisasi in vitro berkurang pada pasien yang ejakulatnya terkontaminasi oleh lekosit dalam jumlah yang tinggi (Sukeharoen et al., 1995) Pada peristiwa fagositosis oleh lekosit akan terjadi oxygen burst yang mengakibatkan dikeluarkannya dalam jumlah besar Reactive Oxygen Species (ROS) ke sekitar gamet pria secara langsung (Frazeck, et al., 2004 ). ROS mempunyai sifat sebagai oksidator. Spermatozoa merupakan sel yang amat peka terhadap oksidasi. Sasaran ROS adalah lipid, protein dan DNA (Sulaiman et al., 1996). Menurut Ochsendorf (1998) membran plasma spermatozoa berisi sejumlah besar asam lemak tak jenuh (> 50 °o docasahexaenoic acid ) yang mudah teroksidasi. Akibat dari peroksidasi lipid pada membran spermatozoa adalah terputusnya rantai asam lemak tidak jenuh. Malondialdehid (MDA) adalah produk akhir yang stabil dari peroksidasi lipid (Koksal et al., 2003 ). Sumber ROS dalam semen dapat berasal dari lekosit ,spermatozoa maupun bakteri. Dilaporkan oleh Potts, et al., (2000) bahwa pasien yang terinfeksi Ureaplasma urealyticum mempunyai kadar ROS yang lebih tinggi dibandingkan dengan yang tidak terinfeksi.

Demikian juga Azenabor, (2000) juga melaporkan bahwa kadar peroksidasi lipid bertambah pada kultur sel yang di infeksi dengan Chlamydia trachomatis dibanding dengan kontrol yang tidak terinfeksi. Spesies bakteri yang menginfeksi traktus genitalis pria dapat digolongkan menjadi bakteri patogen dan non patogen . Bakteri patogen dan non patogen mempunyai kemampuan yang berbeda. Diantara bakteri patogen, derajad patogenitasnya juga berbeda. Hal ini disebabkan toksigenitas, daya invasi :an adhesivitas masing -masing spesies bakteri juga berbeda. Menurut Michelmann, (1998) spesies bakteri yang bebeda dan jumlah bakteri yang berbeda akan menghasilkan spektrum patologisyang berbeda. Hasil studi peneliti, dengan menggunakan 4 spesies bakteri yaitu Staphylococcus epidermidis, Streptococcus faecalis, Enterobacter aerogenes dan Escherichia coli yang dikontaminasikan pada spermatozoa manusia secara in vitro di dapatkan hasil bahwa Staphylococcus epidermidis dan Streptococcusfaecalis tidak berpengaruh terhadap kualitas spermatozoa, sedangkan Enterobacter aerogenes dan Escherichia coli berpengaruh terhadap motilitas dan menyebabkan aglutinasi spermatozoa (Sukarjati, 2002 ), dan menyebabkan penurunan vitalitas spermatozoa (Sukarjati, 2001). Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa yang berpengaruh terhadap kualitas spermatozoa adalah Enterobacter aerogenes dan Escherichia coli. Yang masih dipertanyakan adalah Bagaimanakah motilitas dan kadar ROS pada sperma yang tercemar oleh Escherichia coli ? Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji lebih lanjut tentang perbedaan motilitas spermatozoa dan kadar ROS pada semen yang terkontaminasi oleh Escherichia coli. BAHAN DAN CARA KERJA Bahan Semen pria infertil sejumlah 40 sampel. Cara Kerja Pengumpulan semen. Semen diperoleh dengan cara masturbasi dan ditampung” ke dalam botol kaca atau plastik steril yang bermulut lebar. Semen diambil setelah abstinentia sedikitnya 48 jam dan tidak lebih lama dari 7 hari. Sebelum mengeluarkan ejakulat, pria tersebut

dianjurkan untuk mengeluarkan air seninya terlebih dahulu kemudian mencuci tangan dan penisnya sebelum ejakulat ditampung dalam botol steril. Semen yang diperoleh setelah teijadi liquifaksi dibagi 3 bagian ( A,B, dan C ). Masing-masing bagian digunakan .untuk pengamatan sebagai berikut : A: dikerjakan kultur bakteri untuk identifikasi bakteri B: pengamatan Kadar ROS C: analisa kualitas spermatozoa. Identifikasi Bakteri Satu tetes semen ( l/20m1 ) diratakan dengan ose pada agar darah, kemudian di inkubasi pada 370 C selama 24 jam. Setelah itu biakan dipindah pada medium NA dan EMB dan di inkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam dilakukan pewarnaan gram. Selanjutnya dilakukan uji fisiologi atau biokimia, meliputi indol, Metil Red (MR), Voges Proskauer (VP), sitrat, Hidrogen sufida (H28), Urea, lysin, motilitas, produk asam dan gas pada glukosa, laktosa, Maltosa, dan Manosa. Penentuan Kadar ROS Suspensi sperma yang akan diperiksa ( 0,4 ml ) ditambah 8,5 µl luminol (25 mM dalam Dimethyl Sulfoxide (DMSO) dengan konsentrasi akhir 250 µM), 12 µl horseradish peroxide (2mg/ml PBS) dan 29,5 µl media earle’s. Diamati khemiluminisen selama lima menit. Untuk pengamatan selama sepuluh menit, Suspensi sperma yang diperiksa (0,4 ml) ditambah 8,5 µl luminol, 12 µl horseradish peroxide (2mg/ml PBS) dan ditambahkan 21,7 µl. Formil-l-metionil-lleusil-l-fenilalanin (10 mM dalam DMSO dengan konsentrasi akhir 50 µl l ), 7,81 media earle’s. Pengamatan 15 menit, suspensi sperma yang akan diperiksa (0,4 ml) ditambah 8,5 µl luminol 12 µl horseradish peroxide (2mg/ml PBS) dan 3 ul larutan phorbol-12-miristatl3-asetat ( lmM dalam DMSO) dan 27 µl media earle’s. Pengamatan motilitas spermatozoa. Pengamatan motilitas dikerjakan sesuai dengan standar WHO, 1999. Semen yang mengalami liquifaksi, diambil satu tetes sperma di buat hapusan pada object glass lalu ditutup cover glass dan diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali'. Motilitas ditentukan dengan kategori

menurut WHO (1999) yaitu (a) gerakan cepat maju lurus ke depan, (b) gerakan lambat atau tak maju lurus ke depan, (c) tidak bergerak maju atau bergerak di tempat, (d) tidak bergerak. Data yang terkumpul dianalisa dengan uji t. Metode Analisis Data Data tentang motilitas kategori a dan kategori a+b pada nonnosp'ermia dan sperma yang tercemar oleh Escherichia coli dianalisa menggunakan uji t. Demikian juga kadar ROS baik yang distimulasi FMLP maupun PMA antara normospermia dan sperma yang

tercemar Escherichia coli juga dianalisa dengan uji t. HASIL PENELITIAN Hasil dari analisa sperma dan kultur spenna di dapat bahwa dari 40 sampel semen ditemukan 4 sampel yang tercemar Escherichia coli dan 5 sampel semen yang mempunyai sperma normal (normospermia) menurut criten'a WHO (1999). Data tentang motilitas kategori a dan kategori a+b pada normospermia dan sperma yang tercemar oleh Escherichia coli disajikan dalam table di bawah ini.

Tabel 1 Perbandingan motilitas spermatozoa (%) dan kadar ROS (epm/jt sperma) antara

Normospermia dan spermatozoa yang tercemar Escherichia coli. Variabel Motilitas a Motilitas a+b ROS : Peroxidase (Px) Px + FMLP Px + PMA

Normopermia

8.0 4.63 63.0 4.84

0.262 0.12 0.280 0.15 0.416 0.32

Sperma tercemar E.coli (Mean SD)

3.5 2.8 36759.91

0.53 0.23 0.399 0.24 4.06 2.9

Signifikansi (Mean SD)

0.136 0.001 0.029 0.040 0.27

FMLP = formyl-methionyl-leucyl-phenylalanie, PMA=12-myristate, 13-acerate phorbol ester. a. Spermatozoa dengan gerakan cepat maju lurus ke depan b. Spermatozoa dengan gerakan lambat atau tak maju lurus ke depan

Dari hasil analisis data di dapat bahwa bila dibandingkan dengan normospermia motilitas spermatozoa baik katagori a maupun a+b lebih tinggi dari pada spermatozoa yang tecemar oleh Escherichia coli. Kadar ROS pada spermatozoa yang tercemar Escherichia coli lebih tinggi daripada kadar ROS normospermia. PEMBAHASAN Hasil penelitian ini di dapat bahwa secara in Vivo motilitas spermatozoa yang tercemar Escherichia coli lebih rendah dari pada normospermia. Secara in vitro pengaruh negatif Escherichia coli terhadap motilitas spermatozoa telah banyak dilaporkan (Auroux et. al., 1991; Diemer et al.,1996; Huwe et al. 1998, Sukarjati, 2002). Faktor Escherichia coli dapat menurunkan motilitas spermatozoa adalah karena kemampuan Escherichia coli melekat ke membran plasma spermatozoa fenga dan Robert, 1994). Menurut Auroux et al. (1991) Escherichia coli berpengaruh terhadap motilitas spermatozoa hanya ketika : Escherichia coli mengadakan kontak dengan

spermatozoa. Interaksi Escherichia coli dengan spermatozoa terjadi 2 tahap yaitu adhesi lalu destruksi membran spermatozoa (Diemer et al., 1996). Adhesi itu diperantari oleh flmbrae tipe 1 (Banoov, 1991). Menurut Wolff et al. (1993): aglutinasi spermatozoa dan adhesi Escherichia coli ke spermatozoa merupakan fenomena yang tampak dan berdampak pada penurunan metilitas spermatozoa. Tetapi-banyak Autors yang menetapkan bahwa fenomena adhesi tidak dapat diperhitungkan untuk immobilisasi spermatozoa. (Diemer et al.; 2000). Paulson dan Polakoski (1977) melaporkan ada faktor terlarut yang mempunyai berat molekul rendah yang diisolasi dari flltrat Escherichia coli sebagai agen penyebab immobolisasi spermatozoa manusia. Tetapi hasil ini tidak pernah dikonfirmasikan oleh peneliti lain. Bakteri gram negatif termasuk Escherichia coli pada dinding selnya terdapat lipopolisakarida (LPS). LPS yang bertanggung jawab dalam mekanisme imun ini menghasilkan bertambahnya produksi sitokin. Sitokin pro-inflamantori ini yaitu interferon

gamma (IFN ), tumor necrosis factor(TNF ), interleukin 8 (IL 8)'dilaporkan memainkan peran yang signifikan dalam infertilitas (Rajasekaran et al., 1995). Hasil studi yang dilakukan Sikka et al., (2001) didapat bahwa masing-masing LPS d‘an IFN tidak mengubah motilitas maupun viabilitas spermatozoa, tetapi kombinasi LPS dan IFN secara signifikan menurunkan motilitas, Viabilitas dan integritas membran spermatozoa tergantung waktu inkubasi. Dengan demikian kombinasi LPS dan IFN merusak spermatozoa manusia dan 'memberikan kontribusi untuk faktor infertilitas pria pada pasien dengan infeksi traktus genitalis kronis. Hasil studi Diemer et al. (2000) didapat bahwa terj adi perubahan morfologi spermatozoa pada spermatozoa yang diinduksi oleh Escherichia coli. Hasil studi ini dapat menjelaskan fenomena adhesi pili type 1 Escherichia coli dengan spermatozoa serta membuktikan bahwa immobilisasi spermatozoa disebabkan oleh kerusakan membran plasma dan struktur sellular yang lain pada spermatozoa. Dinyatakan pula bahwa perubahan proses biokimia pada integritas membran tampaknya lebih mungkin dibanding pengaruh fisik yang dihasilkan dan' adhesi bakteri untuk menghasilkan perubahan morfologi. Agen toksik yang dihasilkan Escherichia coli seperti hemolisin mungkin menyebabkan pcngaruh lokal setelah adhesi bakteri ke permukaan spermatozoa. Tetapi perlu penelitian lebih lanjut untuk membuktikan hal ini. Pada penelitian ini kadar ROS spermatozoa yang tercemar Escherichia coli lebih tinggi dari pada normospermia. Dengan menggunakan mikroorganisme yang berbeda, Potts et al., (2000) melaporkan bahwa pasien yang terinfeksi Ureaplasma urealyticum mempunyai kadar ROS yang lebih tinggi dibandingkan dengan yang tidak terinfeksi. Bakteri yang menginfeksi traktus genitalis mungkin memberikan kontribusi terhadap tingginya kadar ROS. Hal ini sesuai dengan studi yang dilakukan pada Escherichia coli bahwa enzim sitosol Escherichia coli dapat menghasilkan 02, tetapi proporsi terbesar 02datang dari rantai transport elektron (Halliwell dan Gutteridge, 1999). Hasil analisis data di atas tampak bahwa spermatozoa yang tercemar Escherichia coli mempunyai kadar ROS dam motilitas spermatozoa yang lebih renda‘r. dibanding

normospermia. Hal ini dapat dijelaskan bahwa bila texjadi infeksi traktus genitalis maka blood testis barier dapat rusak yang mengakibatkan terjadinya kebocoran lekosit pada tubulus seminiferus atau epididimis, sehingga konsentrasi lekosit dalam semen bertambah (Alvarez et al., 2002). Pada peristiwa fagositosis oleh lekosit akan teljadi oxygen burst yang mengakibatkan dikeluarkannya dalam jumlah besar 02dan H202 atau ROS ke sekitar gamet pria secara langsung (Frazeck et al., 2004). Lekosit yang aktif dapat menghasilkan ROS lOO kali lebih tinggi dari pada lekosit yang tidak aktif. Lekosit ini menjadi aktif karena merespon berbagai stimuli termasuk infeksi dan inflamasi (Agarwal et al., 2003). ROS bersifat sebagai oksidator. Spermatozoa merupakan sel yang amat peka terhadap oksidasi. Umumnya sel dilindungi dari kerusakan oksidatif oleh adanya antioksidan dalam sitoplasmanya. Tetapi pada spermatozoa, sitoplasmanya sangat sedikit (20 m3). Sitoplasma tersebut tidak terdistribusi menyebar tetapi terlokasi 'pada mid piece spermatozoa. Akibatnya spermatozoa mengandalkan antioksidan yang ada pada seminal plasma (Ochsendorf, et al., 1998). Bila terj adi infeksi antioksidan menurun dan situasi ini disebut oxidative stress (Sikka, 1996). Kadar ROS yang tinggi berakibat langsung pada penurunan “motilitas spermatozoa. Kaitan antara ROS yang tinggi dan penurunan motilitas akibat menurunannya posporllasi protein akonema dan immobilisasi sperma, keduanya berhubungan dengan penurunan Huiditas membran yang diperlukan untuk fungsi spermatozoa. Disamping itu H202 dapat berdifusi melintasi membran ke dalam sel dan menghambat aktivitas beberapa enzim seperti Glukose-6Phosphat Dehydrogenase (G6PD). Enzim ini mengontrol aliran glukosa melalui hexosa monopospat shunt, yang selanjutnya mengontrol tersedianya Nicotinamida Adenin Dinucleotida Phosphat (N ADPH) intrasellular yang digunakan sebagai sumber elektron untuk pembakaran yang menghasilkan ROS oleh sistem enzim NADPH oksidase. Penghambatan G6PD mengakibatkan menurunnya NADPH dan secara bersamaan terjadi akumulasi glutation teroksidasi dan glutation tereduksi. Hal ini dapat menurunkan antioksidan dan pospolipid membran

terperoksidasi. (Agarwal et _aI., 2003). Kesimpulan dari penelitian ini adalah spermatozoa yang tercemar Escherichia coli mempunyai kadar ROS lebih tinggi dari normospermia yang bedampak pada penurunan motilitas spermatozoa. KEPUSTAKAAN Agarwal A., Saleh RA., Bedaiwy MA., 2003,

Role of Reactive Oxygen Species in The Pathophysiology of Human Reproduction, Fertility and Sterility , 79: 829-843.

Alvarez JG., Sharma RK., Ollero M., Saleh RA., Lopez MC., Thomas AJ., Evenson DP., Agarwal A., 2002, Increased DNA Damage in Sperm from Leukocytospermic Semen Samples as Determinated by the sperm chromatine Structure Assay, Fertility and Sterility, 78:319-329.

Auroux MR., Jacquest L., Mathieu D., Aurer J ., 1991, Is The Sperm Bacterial Ratio a Determining Factor in Impairment of Sperm Motility; An In Vitro Study in man With Escherichia coli, International Journal of Andrology, 14: 264-270.

Azenabor AA., Mahony JB., 2000, Generation of Reactive Oxygen Species and formation and membrane lipid peroxides in cells infected with Chlamydia trachomatis, International Journal of Infected Disease 4 (1) : 46-50.

Bartoove BD., Osbontil MC., Maayan E., Chad and Y Nitsan, 1991, Virulence Characteristics of Male Genital tract Escherichia coli Isolated from semen of suspected Infertil Men, Andrologia, 23: 387394.

Chan PJ., Su BC., Tredway DR. ,Whitney EA., Pang SC., Corselli J., Jacobson JD., 1994, White Blood Cells in Semen Affect Hyperactivation but not Sperm Membrane ‘Integity in The Head and Tail Regions, Fertility and Sterility, 61 : 986-989.

Diemer T., Weidner W., Michelmann HW., Schiver HG., Rovan E., and Mayer F., 1996, Influence of Escherichia coli on motility parameters of human spermatozoa in vitro, International Jornal of Ahdrology, 19 : 271-277.

Diemer T, Huwe P, Michehnann HW., Mayer F., Cshifer HG., Weidner W.,2000, Escherichia coli-induced Iterations of Human Spermatozoa. An Electron microscbpy analysis, International Journal of Andrology, 23: 178186

Fraczek M., Sanocka D., and Kurpisz M., 2004, Interaction between Leucocytes and Human Spermatozoa Influencing Reactive Oxygen Intermediates Release, International Journal. of Andrology, 27: 69-75.

Huwe P , Diemer T:, Ludwig M., Liu J., Schiefer HG., Weidner W, 1998, Influence of different urophatogenic microorganism on human sperm motility parameters in an in vitro experiment, Andrologia, 30 Supp.l : 5559

Halliwell B. and Gutteridge JMC., 1999, Free Radicals in Biology and Medicine, 3 rdEd, Oxford University Press, page 32.

Khanna J., Van Look PFA, Griffin PD., 1992, A Key to brihter future, Geneva, Word Health Organization.

Koksal IT., Usta M., Orhan I., Abbasoglu S., Kadioglu, 2003, Potential Role of Reactive Oxygen Species on Testicular pathology Associated With Infertility, Asian Journal of Andrology, 5: 95-99.

Michemann HW.,1998, Influence of Bacteria and Leucocyte on The Out Come In Vitro Fertilization (IVF) or Intracytoplasmic Sperm Injection ( ICSI), Andrologia, 30 Supplemen 1: 99-101.

Monga, M., Robert 1A., 1994, Spermaglutination by Bacteria: Receptor-Speciiic Interaction, Journal ofAndrology, 15: 151-156.

Ochsendorf,FR., 1998, Infection and Reactive Oxygen Species, Andrologia,30, Supplement 1 : 81-86.

Pott JM., Sharma R., Pasqualotto F, Nelson D, Hall G., Agarwal A, 2000, Association of ureaplasma urealitycum with abnormal Reactive Oxygen Species levels and absence of leukocytospermia, Journal of Urology, 163 (6) : 1775-8

Paulson ,JD., dan polaskoki, KL., 1977, isolation of a spermatozoal immobilization Factor from Escherichia coli Filtrates, Fertility and Sterility, 28:182-185.

Rajasekaran, M., Hellstrom,W J ., Naz,R.K., and Sikka SC., 1995, Oxidative Stress and Interleukins in Seminal Plasma During Leucocytospermia, Fertility. and Sterility : 64,166-171.

Sikka,SC.,1996, Oxidative Stress and Role Antioxidants in Normal and Abnorma. Sperm Function, Bioscience 1-78-86: 1-13.

Sikka SC., Champion HC., Bivalacqua TJ. Estrada LS., Wang, R., Rajasekaran M., Agarwal BT., and Hellstrom WJG., 2001 , International Journal q" Andrology, 24:136-141.

Sukcharoen N.,Keith ,J.,Irvine DS., Aitken R.I., 1995, Predicting The Fertilizing Potential of Human sperm Suspention in Vitro : Importance of Sperm Morphology and Leucocyte Contamination, Fertility and Sterility. 63: 1293-1300.

Suleiman SA.,Ali M., Zaki ZMS, El Malik. EMA., and Nasr MA., 1996, Lipid Peroxidation and Human Sperm Motility : protective role of Vitamin E, Journal of Andrology 17: 5, 530-537.

Sukarjati, Lunardhi H, Hinting A., 2002, Pengaruh Spesies Bakteri dan ratio spermatozoa/ Bakteri terhadap Vitalitas spermatozoa Manusia secara In vitro, Berkala Penelitian Hayati,8: 21-25.

Sukarjati, Lunardhi H, 2001, Pengaruh Spesies Bakteri dan ratio spermatozoa/ Bakten' terhadap Motilitas spermatozoa Manusia secara In vitro, ,Berkala Penelitian Hayati, 7: 41 -46.

Wolff, H., Panhans, A., Stolz, W., Mauree, M., 1993, Adherence of Escherichia coli to Sperm : A Mannose mediated phenomenon leading to agglutination of sperm and Escherichia coli, Fertility and Sterility, 6O : 154-158.

Wolff,H., Politch, JA., Martinez A., Haimovici F, Hill, JA., Anderson DJ., 1990, Leukocytospemnia is Associated with poor Semen Quality, Fertility and Sterility, 53:52.8 -536

Word Health Organization ,. 1999, WHO Laboratory Manual for Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction, 3rd ed., Cambridge University Press, Cambridge

.