20 décembre1993

CONTRAT C.E.E.,Université Nationale de Côte d'Ivoire,

1. 1. R. S. O. A. et 0 R S TOM

------------------_._.-

N° TSO 2A·0116-CI (CD)

RAPPORT D'EXECUTION

POUR LA PERIODE DU 01.07.92 AU 31.08.93

par

Jean DUBERN

avec la pmticipation de:L. GIVORD

C. GOUDOU-URBINOG.KONATE

B. MALAURIEJ.-B. QUIOT

------~-------------------'---~- ---.

•

,"

,.

RAPPORT D'EXECUTION N°2

PERIODE DU 01.07.92 au 31.08.93

.. ..

INTRODUCTION..

par

Jean DUBERN

Ce document rapporte les travaux et résultats obtenus par l'ORSTOM et ses

associés dans le cadre du projet «Amélioration et Valorisation de l'Igname», objet du

contrat international nO'fSO 2A-Ol16-CI (CD), entre la CEE, l'Université Nationale de Côte

d'Ivoire (U.N.C.L, Faculté des Sciences) et l'Institut International de Recherches,Scientifiques pour le Développement à Adiopodoumé (IJ.R.S.D.A.). Ce contrat, signé le

06.02.1989, modifié par avenants, substitue l'ORSTOM à l'I.I.R.S.D.A. et reporte la date

d'échéance au 01 septembre 1993.

Les travaux rapportés dans ce document ont été menés en association par

divers laboratoires.

Au Laboratoire des Ressources Génétiques et d'Amélioration des Plantes

Tropicales (L.R.G.A.P.T., ORSTOM Montpellier) ont été menées, d'une' part un

programme de sanitation de plantes in vitro, comportant des études de régénération de

plantes saines par culture de méristèmes, associant ou non la thermothérapie et / ou la

chimio-thérapie, et des études de multiplication par microbouturage aboutissant à la

constitution d'une vitro thèque, d'autre part, un programme d'amélioration de l'Igname

par la voie des protoplastes (B. MALAURIE).

Le Laboratoire de Phytovirologie des Régions Chaudes (L.P.R.C.! CIRAD­

ORSTOM Montpellier) a mené l'étude d'une souche standard du virus de la Mosaïque de

•

l'Igname permettant la production d'anticorps polyclonaux, la comparaison de cette souche

avec des virus du même groupe (Potyvirus), l'étude de différents isolats de virus de la

Mosaïque de l'Igname (YMV), la caractérisation d'anticorps monoclonaux produits conu'e la

souche standard, la mise au point d'un kit de diagnostic du YMV et l'indexation de la

collection de viu'oplants d'Igname du L.R.G.A.P.T. (Mme C. GOUDOU-URBINO, J.

DUBERN).

Au Burkina Faso et, pour partie, au Laboratoire de Virologie de la Station de

Kamboinsé (IN.E.R.A., Ouagadougou), des études d'épidémiologie et de distribution

. géograplùque du YMV ont été menées, pelmettant de mieux appréhender l'impoltance de la

Mosaïque de l'Igname, de repérer les régions inféodées à cette maladie et celles où elle

semble absente, permettant la collecte de nombreux isolats et ainsi l'étude de la diversité

biologique du YMV ( Mme C GOUDOU-URBINO, G. KONATE),

Au Laboratoire d'Immunochimie (I.B.M.C./ C.N.R.S. Strasbourg) des

anticorps monoclonaux spécifiques du virus de la Mosaïque de l'Igname ont été produits et

analysés (Mme L. GIYORD).

Au Laboratoire de Virologie (I.N.R.A. Montpellier) des études en immuno­

électrophorèse de la protéine de capside d'YMV ont été débutées permettant et la

caractélisation d'isolats d'YMV en provenance des Antilles et de Guyane.

Le rappolt actuel présente la seconde tranche des travaux réalisés:

Chapiu'e 1 - Régénération, Production, Multiplication et Sanitation de vitroplants d'Igname.

(B. MALAURIE, L.R.G.A.P.T./ORSTOM Montpellier)

Chapitre II - Indexation de la collection de vitroplants d'Igname du L.R.G.A.P.T.!

ORSTOM (J. DUBERN, B. MALAURIE, L.P.R.C. et L.R.G.A.P.T./

ORSTOM Montpellier)

Chapitre III - Production d'anticorps monoclonaux anti-virus de la Mosaïque de l'Igname.

(L. GIVORD, I.B.M.C./C.N.R.S. Strasbourg)

Chapitre IV - Caractérisation d'isolats du virus de la Mosaïque de l'Igname au Burkina Faso

(C GOUDOU-URBINO, L. GIVORD, G. KONATE et 1. DUBERN,

IN.E.R.A., Station de Kamboinsé, Ouagadougou)

Chapitre V - Distribution géographique du virus de la Mosaïque de l'Igname au Burkina

Faso.(C GOUDOU-URBINO, G. KONATE, J.-B. QUIOT et J. DUBERN,

IN.E.R.A., Station de Kamboinsé, Ouagadougou)

Chapitre VI - Présence du virus de la Mosaïque de l'Igname sur l'Igname en Guyane et aux

Caraibes. (1.-B. QUIOT, LN.R.A., Montpellier»

2

1 - REGENERATION, PRODUCTION, MULTIPLICATION ETSANITATION DE VITROPLANTS D'IGNAME(B. l\1ALAURIE)(L.R.G.A.P.T. Centre ORSTOM , BP 5045,34032 Montpellier France)

Description des recherches liées au contrat CEE TS2A-0116-Cl(CD)

. 1- Sanitation des plantes in vitro1-1 Régénération de plantes saines par la culture de méristèmes, avec ou sans association

de la thetmothérapie.1-2 Multiplication et production de plantes saines par micro-bouturage.1-3 Constitution d'une vitrothèque (garantie de conservation, et banque de gènes).1-4 Expérimentation par inoculation aItificielle de virus sur des plantes saines multipliées PaI'

microbouturage.

2- Amélioration de l'Igname par la voie des protoplastes2-1Tentatives de rég~nérationde plantes à paItir de protoplastes.

1- Sanitation des plantes in vitro

1-1 Régénération de plantes saines par culture de méristèmes, avec ou sansassociation de la thermothérapie et de la chimiothérapie

8 clones appartenant à 5 espèces ont été utilisés pour étudier les potentialités de

régénération des méristèmes isolés. Différents facteurs ont été étudiés : niveau de

prélèvement entre le noeud d'Oligine et l'apex, la taille des mélistèmes, le type de flaconnage

(boite de Péui ou tubes), le type de support (agar, agarose ou agar + agarose) et le milieu de

culture avec un gradient croissant d'ANA et de BAP. Ces 8 clones issus de méristèmes se

sont développés en plantes entières après des temps plus ou moins longs (60 à 400 jours).

Espèces

Dioscorea alataDioscorea bulbiferaDioscorea bulbiferaComplexe D. cayellensis -D. rotwldataComplexe D. cayenensis -D. rotundataComplexe D. cayenensis -D. rotwldataComplexe D. cayellensis -D. rotwldataDioscorea dumetorumDioscorea praehellsilis

Clones

AoridoNouméa imboroFOlme sauvageKoubaGbanganSp-douceGrosse cailleFOlme comestibleSauvage

3

Numéros

0A21NC02EA18IB05OA12OA18PB04EA20EA08

Etatphytosanitaire

SainSainSainVirosé*Virosé**Virosé*Virosé*SainVirosé****

•

Deux cultivars virosés ont été utilisés dans différents essais afin de trouver les

conditions optimum pour l'obtention de plante saine dépourvue de YMV. Aux milieux

précédents, testés sur les 8 clones, l'effet de l'apport de GA3 a été étudié. La culture de

méristèmes, associée ou non à la thermothérapie (63 jours à 37 oC) et la chimiothérapie

[agent antiviral, Ribavirin ou Virazole, nucléoside (l-I3-D-Ribofuranosyl-1,2,4,-triazole-3­

carboxamide)], a été menée parallèllement à des essais chimio-thermothérapiques sur

microboutures.

L'obtention de plante indemne de virus de l'Igname a été obtenue sur deux

clones du complexe D. cayenensis-D. rotundata (PB04 et IBOS), aprés cultme de méristèmes

et sur un clone de D. praehensilis (EA08), aprés un traitement chimio-thermothérapique sur

microboutures uninodales.

Références:

Malaurie B., Tardieu F. and J.-c. Thouvenel. 1988. Improving Yam (Dioscorea spp.), using biotechno­logy. 1) Rapid production of diesease free germplasm. Symposium of the InternationalSociety for Root Crops. Bangkok, 30/10-5/11/1988. Abstracts. pp. 51.

Malaurie B., O. Pungu. J. Dubern and J-c. Thouvenel. 1992. Determination of the best conditions for theregeneration of microplants and the elimination of YMV from exciscd meristems of yamnodal cUllings (Dioscorea spp.). Association of Applied Biologists. Plant Virology in theTropics. University of York. 9-10 April 1992.

Malaurie B., O. Pungu and J.-c. Thouvenel. Search for optimal factors in production of rootedplanUets from excised meristems and shoot tips of yam nodal cuttings (Disocorea spp).(soumis à publication)

Malaurie B., O. Pungu and M.-F. Trouslot. Meristem-tip culture from two clones of DioscoreaCGye1/ellsis-D.rollllldala complex and D. praehellsilis. Influence of media on morpholo­gical development. (soumis à publication)

Malaurie B., J.-c. Thouvenel and O. Pungu. Meristem-tip culture from two clones <Of Dioscoreacaye1/ellsis-D. rollllllfala complex and D. praehellsilis. Influence of meristem-tip size andlocation on morphological development. (soumis à publication)

Malaurie B., and J.-C. Thouvenel. Influence de la température et d'un agent antiviral (Virazole), surl'obtention de plantes indemnes de virus de la Mosaïque l'Igname (YMV) à partir demicroboutures nodales virosécs de D. praehellsilis. (en préparation)

Malaurie B., J. Dubem and J.-c. ThouveneI. Influence de la température ct de la chimiothérapie. a<;sociéesou non, sur l'obtention de plantes indemnes de virus de la Mosaïque de l'Igname (YMV), àpartir de méristèmes isolés de deux clones virosés de D. praehellsilis et du complexe D.cayellellsis-D. rOIWldata cv. Kouba. (en préparartion)

4

1-2 Multiplication et production de plantes saines par microbouturage

Ce volet conceme la multiplication de cultivars préalablement débaITassés du

YMV en vu d'une étude de réinfestation en plein champ, et cOlTespondant au point 2-3 du

programme incombant au L.P.R.C..

Deux cultivars dépourvus de YMV ont été sélectionnnés pour une telle étude

("Florido" et "Grosse Caille"). Une multiplication de ces clones pour la production de

microtubercules a été effectuée (ie sevrage de vitroplants sur le telTain est hasaI'deux et

demanderait une surveillance et un entretien journalier); le trop petit nombre de tubercules

obtenus, pour ces clones, et les difficultés de mise en place et de suivi de i'essai au Burkina

Faso n'a pas pennis de mener à bien ce prograrrune.

1-3 Constitution d'une vitrothèque (garantie de conservation, et banque degènes)

1-3-1 Constitution et entretien d'une vitrothèque

Une viu'othèque, sous la forme de microboutures nodales, a été établie dès

1985. Elle comptait en Juin 1990, 300 introductions, qui, aprés perte de 44 numéros,

rassemblait 256 numéros maintenus par microbouturages. Ces 300 introductions

appartenaient à 14 espèces, dont 9 espèces sauvages et 5 espèces cultivées. Cette vitrothèque

représente un "germplasm" fort diversifié regroupant du matériel de provenances trés

diverses (Côte d'Ivoire, Bénin, Brésil, Burkina Faso, Cameroun, Guinée, Guadeloupe,

Martinique, Nigéria, Nouvelle-Calédonie, Polynésie, Porto-Rico). Les espèces représentées

sont: Dios,corea abyssillica, D.a/ata, D. bu/bifera, D. burkilliana, complexe D. cayeneJlsis-D.

rotuJldata, D .dumetorum, D. escu/enta, D. hirtiflora, D.mangenotialla, D. minutiflora, D.

praeheJlsilis, D. shimperialla, D. togoensis, hybrides interspecifiques du complexe D.

cayeJlensis-D. rotuJldata, c.v. Krengle * D. praehensilis .

L'établissement d'une telle vitrothèque a été rendu indispensable pour avoir à

'. disposition toute l'année un matériel végétal axénique, génétiquement diversifié, pour le

développement des différentes opérations de recherche.

La grande diversité du matériel et le fait que l'Igname appartient au groupe des

plantes Monocotylédones posent un certain nombre de problèmes. Plusieurs milieux de

microbouturage ont été nécessaires pOlU" co~vrir la diversité du matériel de la vitrothèque.

5

1-3-2 Duplication et transfert d'une vitrothèque

Suite à l'arrêt, par l'üRSTüM, des programmes menés au sem de

l'LLR.S.D.A., en Côte d'Ivoire, une multiplication en u'ois exemplaires de la vitrothèque a

été réalisée; ces exemplaires ont été distribués dans trois endroits différents afin de garantir

une meilleure sauvegarde du matériel végétal : au Laboratoire de Biotechnologie de

l'LLR.S.D.A., au Laboratoire de la F.A.S.T. (Faculté d'Abidjan des Sciences et des

Techniques), et au L.R.G.A.P.T. (Laboratoire des Ressources Génétiques et d'Amélioration

des Plantes Tropicales) du Centre üRSTüM de Montpellier.

Le transfert des vitroplants de la collection d'Igname, de la Côte d'Ivoire au

LRGAPT, a occasionné une perte de 14 % des clones dupliqués (35 / 256). La disu'ibution

des clones par espèces est la suivante: Dioscorea abyssinica (3), D. a/ata (88), D. bu/bifera

(8), complexe D. cayenensis-D. rotundata (71), D. dumetorum (2), D. esculenta (9), D.

hirtiflora (1), D. mallgenotiana (14), D. praehensilis (2), D. shi/1lperiana (1), D. togoellsis

(7), hybrides interspecifiques du complexe D. cayenensis-D. rOlUl/data cv. krengle *, D.

praehensilis (14).

L'ensemble des clones maintenus sur un milieu unique à 21°C, dans un

premier temps, afin de limiter la fréquence des repiquages, a été replacé à 27°C, tenant

compte des potentialités de survie hétérogènes des clones placés à une basse température.

Le tableau 1 résume la situation de la collection des vitroplants d'Igname,

observée au 01.09.93; ce tableau met en évidence la pelte de 5 accessions de D. a/ata, et de

Il accessions du complexe D. cayellellsis-D. rotundata. Cependant, de nouvelles

introductions ont permis, d'une part d'enrichir les espèces suivantes: D. escu/enta (origine

Nouvelle Calédonie), D. abyssillica (origine Bénin) et D. praehensilis (origine Cameroun et

Bénin), respectivement, de 2, 2 et 27 accessions, d'autre part d'acquérir 2 nouvelles

espèces (origine Nouvelle Calédonie), jusqu'alors inconnues dans la vitro thèque: D.

pentaphylla et D. transversa (1 accession pour chacune).

Références:

Malaurie, B. and F. Tardieu. 1988. Improving yam (Dioscorea spp.), using biotechnology. 3) Compara­tive study of growth and in vitro tuberization from different cultivars belonging to animportant in vitro germplasm. Symposium of the International Society for Root Crops.Bangkok, 30/10-5/11/1988. Abslract Book, pp. 51.

Malaurie, B., O. Pungu, R. Dumont and M.-F. Trouslol. 1993. The creation of an in vitro gelmplasmcollection of yam (Dioscorea spp.) for the genetic resources preservation. Euphytica.65:113-122.

6

Table 1 Collection de vitroplants d'Igname du LRGAPT

Espèces en collection...-.-_ .. _- --._--- ---- _.-----------._------._. __ ._--- __ .-

31

14217

14

204

Nombre d'accessions83

860

29

Total

Espèces cultivées en Afrique de l'OuestD. alata * (1)D. bulbiferaD. cayenensis-D. rotulldata (complexe) * (2)D. dumetorumD. esculenta

Espèces sauvagesD. abyssinicaD. hirtifloraD. mangenotianaD. praehensilisD. schimperianaD. togoensis

Hybtide interspécifiqueD. cayenensis-rofllndata x D. praehensilis

Espèces en cours d'introduction

Espèces cultivées en Afrique de l'OuestD. esculenta

Espèces sauvagesD. abyssillicaD. pentaphyllaD. praehensilisD. transvasa

Nombre d'accessions2

21

271

Groupes de diversité des 2 principales espèces de la collection

Groupes de diversité* (1) D. alata

Bété bétéNzaIndétenninés

* (2) D. cayenensis- D. rotundataBaniakpaCocoassiéFrouGnanKangbaKpokpokpokpoKponanKrengléLokpaSopéréYaobadouIndételminés

Nombre d'accessions

39377

11116125222

36

7

1-3-3 Etude phytosanitaire pour l'indexation de la vitrothèque par latechnique immunosérologique ELISA

Indexation au 12/10/92

L'ensemble des "Introductions", présentes dans la vitrothèque, a subi un

conu'ôle phytosanitaire systématique par ELISA ( Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay).

Ce contrôle a été effectué à la mise en culture, sur des vitroplants en culture aseptique et au

moment du sevrage; il a été utilisé pour diagnostiquer la présence du Yam Mosaic Virus

(YMV), selon la technique décrite par Clark & Adams (1977), et modifiée par Thouvene1 &

Fauquet (1977). A l'aide de cette méthode, le virus de la Mosaïque de l'Igname, virus

filamenteux de 750 nm du groupe des potyvirus, peut être détecté avec une valeur

significative jusqu'à une dilution de 10-3. Des résultats reproductibles ont été obtenus à partir

des vitroplants avec des échantillons de 20 à 200 mg.

Des tests en routine ont utilisé les dilutions standard de la et 100, dans un,

tampon phosphate d'extraction (PBS), à pH 7,4, contenant 0,05 % de Tween 20, 2 % de

Po1yvinyl-PYITolidone (PVP) et de 0,2 % d'ovalbumine.

Cette technique a permis de se rendre compte de l'état phytosanitaire de la

vitrothèque. La présence du YMV a été constatée sur 60 % des clones testés appartenant au

complexe D. cayenensis-D. rotundara (57/95), 5 % des clones testés de D. a/ata (4/87). Seul

un clone de D. praehensilis, parmi les Il autres espèces testées, a présenté une infection par

le YMV. Le tableau (2) ci-dessous donne la répaltition des clones testés par espèces.

Table 2 Répartition des clones testés par espèces.

Nbre de DA DAb DB Dllurk DeR DD DE DH DMa DMi DP DS DT Hyb Totalclones

.Sains 83 3 8 1 38 3 9 0 7 0 0 1 7 14 174

Virosés 4 0 0 0 57 0 0 0 0 0 1 0 0 0 62

Testés 87 3 8 1 95 3 9 0 7 0 1 1 7 14 236

Légende: DA= D. a/ala: DAb.= D. abyssillica; DB= D. bu/bifem; DBurk.= D. burkilliana;DCR=complexc D. cayenellsis-D. rotw/data; DD=D. dume/orum; DE=D. escu/enta;

DH=D. hirtiflora; DMa= D. mangel/olialla; DMi=D. minuliflora; DP= D. praehellsilis;DS=D. shimperialla; DT=D. togoensis; Hyb.= Hybrides inlerspécifiques.

8

Table 3 : Etat phytosanitaire des divers groupesdu complexe ouest-africain D. cayenensis-D. rotundata

de la collection de germplasmes d'igname

Groupes(l) 1ntrod uctions Clones Clones Clonessains infectés non testés

Afoubessou a a a aBaniak.-pa 2 1 1 a

• Cocoassié 2 1 1 0Frou 3 0 0 2Gnan 1 0 1 aKangba 8 3 4 1Kpokpokpo 6 3 2 1Kponan 2 1 1 aKrandoufou a a a aK.renglé 13 6 5 2Kroukroupa 1 0 1 aLok-pa 4 1 1 2Nandokaha <" 1 0 1 0Sammancou 0 0 0 0Sopéré 1 1 a aSoussou 1 a a 1Vivan 1 1 a aWaraga 1 0 0 1Yaobadou 2 2 a 0Zrézrou 1 0 1 aNon identifié 67 18 34 14

Total 117 38 53 24

(1) Groupes décrits dans Hamon et al. (1986)

Table 4 : Etat phytosanitaire de divers groupesdu complexe ouest-africain D. cayenensis-D. rotundata

de la collection de germplasmes d'Igname, observés en Côte d'Ivoire

Groupes(l) Introductions

N'za (chair powpre) 25Bété Bélé (chair blanche) 28

. Non identifié 56

Total 109

9

Clones Clones Clonessains infectés non testés

22 1 2lé 1 549 a 7

93 2 14

Indexation et sanitation en cours de réalisation et envisagées

Une nouvelle indexation des clones a actuellement débuté; elle met en jeux

simultanément trois méthodes de contrôle: (1) l'inoculation mécanique sur divers espèces

de plantes sensibles (Nicotiana benthamiana, Nicotiana megalosypho/l, Nicotiana eleve/andii

Datura stramonium et Chenopodium amaranticolor, (2) le contrôle immunologique par tests

ELISA, double sandwich direct, à l'aide de divers sérums, (3) le contrôle par observation en

microscopie électronique (méthodes leaf-DIP et ISEM).

Le contrôle par immunologie a été redéfini pour tenir compte des données

actuelles de la littérature et des disponibilités en anticorps. Les vitroplants sont testés

simultanément vis à vis du virus de la Mosaïque de l'Igname (YMV) (nouveau sérum

polyclonal), le virus Y de la Pomme de teITe (PVY), le virus de la Mosaïque du Concombre

(CMV), le virus X de la Pomme de terre (PVX). Le chapitre suivant présente les résultats

des travaux réalisés dans ce domaine.

Référence.L

Malaurie, Il. et J-c. Thouvenel -1988- Production de plants d'Igname. dépourvus de viroses. par culture deméristèmes. 2° Salon International de la Coopération ct de l'Aide au Développement(SICAD). 7-11/12/1988, Montpellier.

Thouvenel J.-c. et Il. Malaurie. L'utilisation de la technique ELISA pour le contrôle de l'étatphytosanitaire d'une collection de microboutures d'Igname (Dioscorea ;;pp.) maintenues invitro (en préparation).

1-4 Expérimentation par inoculation artificielle de virus sur des plantes

saines multipliées par microbouturage

Le modèle in vitro peut présenter un certain intérêt, notament, pour effectuer

un meilleur contrôle de la multiplication du virus dans la plante, et pour connaître en fonction

du temps sa répartition dans la plante.

Des essais préliminaires d'inoculation ill vitro, de solution virale filtrée, à

différents niveaux de vitroplants sains, n'a pas parmis de mettre ultérieurement le virus en

évidence par les différentes techniques d'indexation. Ces problèmes de difficultés

rencontrées dans la mise en évidence de virus se rencontrent, de façon moins percutante,

dans les contrôles réalisés sur certains vitrç>plants. La trop forte dilution du virus dans la

plante en serait une des raisons.

10

2~ Amélioration de l'Igname par la voie des protoplastes.Tentatives de régénération de plantes à partir de protoplastes

Des vitroplants de plusieurs cultivars appartenant à 7 espèces ont été utilisés

pour l'obtention de protoplastes de mésophylle de feuilles en utilisant des enzymes de

macération lysant la paroi pectocellulosique (Cellulase Onozuka R-lO, 0,3 %; Driselase,

0,08 %; Macérozyme, 0,05 %; Pectolyase Y-23, 0,02 %) et 0,66 M de Mannitol.

Le rendement moyen varie de 2.10 7 à 15.10 7 protoplastes par gramme de

feuilles avec une variabilité de 60 à 75 %. Une méthode de purification par cenu-ifugation

utilisant un gradiant discontinu (Ficoll / Mannitol ou Sucrose / Mannitol) permet d'obtenir

plus de 85 % de protoplastes viables.

Les espèces et cultivars d'Igname, et le stade physiologique et morphologique

des feuilles sont les paramètres qui affectent le plus intensément les rendements.

La pression osmotique maintenue à 0,66 M par addition de mannitol, un

apport de glucose comme source de carbone et de glutamine (l00 mgil) comme unique

source d'azote, ont pelmis de constater une augmentation de la viabilité des protoplastes et

une diminution de leur difficulté à régénérer la paroi pectocellulosique

40 à 55 % de cellules étaient vivantes aprés 10 jours de culture et 30 % de

celles-ci ont produit des "bourgeonnements" ou des "pelotes de laine".

Différents macro- et oligo-éléments, vitamines et régulateurs de croissance ont

été utilisés sans pour autant observer de réelles divisions.

RU'érel/ce:

Tardieu, F. and B. Malaurie -1988- Improving yam (Dioscorea spp.), using biotechnology. 2) Isolationand culture of protoplaslS from different species. Symposium of the International Societyfor Root Crops. Bangkok, 3Q/1O-5/11/1988. Abstracl Book, 70-71.

1 1

II - INDEXATION DE LA COLLECTION DE VITROPLANTSD'IGNAME DU L.R.G.A.P.T.lORSTOM(J. DUBERN et. B. MALA URIE)

(L.P.R.C./C.I.R.A.D.-ORSTOM, CIRAD BP 5035 34032 Montpellier France)(L.R.G.A.P.T., Centre ORSTOM , BP 5045,34032 Montpellier France)

. II - 1 Matériels et Méthodes

La constitution d'une collection de clones et la multiplication de cette

collection exigent l'évaluation de son état sanitaire. En ce qui concerne l'Igname et la

collection réunie au L.R.G.A.P.T., il a semblé indispensable de prendre en compte les

données de la littérature mentionnant la prévalence probable du virus de la Mosaïque de

l'Igname (YMV) mais aussi la présence du virus de la Mosaïque du Concombre (CMV).(Migliori et al. 1978), du virus X de la Pomme de teITe (PVX) (Lawson et al. 1971), de

virus de groupe des potyvirus (PVY) (Leseman) différents de l'YMV.

Un autre virus de type rhabdovirus, responsable de la Maladie des Taches

Brunes (Mohamed 1976) est encore cité dans la littérature; cependant nous ne disposions

pour cette étude ni du virus ni de moyen de détection.

Tenant compte des données de la littérature et des u'avaux menés, par ailleurs

au L.P.R.C., nous avons tenu à effectuer simultanément une détection vis à vis du virus de

la Maladie Bronzée de la Tomate (Tomato Spotted Wilt Virus, tospovirus), virus à u'ès forte

biodiversité et très polyphage mais non encore répertorié dans l'Igname.

Dans le but d'effectuer une détection la plus fiable possible, nous avons

décidé d'appliquer simultanément trois techniques de détection: une détection en

immunologie, une détection par inoculation mécanique à quelques plantes hôtes spécifiques

des virus à détecter, une analyse en microcopie élecu·onique.

..Pour effectuer les détections immunologiques, nous avons donc produit au

L.P.R.C. un kit de diagnostic d'anticorps polyclonaux anti-YMV: immunoglobulines

purifiées et immuno-globulines purifiées conjuguées à la phosphatase, la technique choisie

'. étant la technique ELISA double sandwich direct (isolat de virus ivoirien YMV-12, isolé de

la collection du L.R.G.A.P.T., multiplié sur Nicotiana benthamiana, purifié et injecté à des

lapins). L'utilisation des anticorps monoclonaux, produits dans le cadre de ce projet et

actuellement disponibles, a été écartée ne permettant un spectre de détection plus large que

nos anticorps polyclonaux. ,

Les autres kits de diagnostic ànti-CMV, anti-PVY, anti-PVX, anti-TSWV ont

été achetés (SANOFI, France).

12

Indexation des yitrODlants d'Igname de la collecti@

dy L.R,G.A,P,T.lûRSTûM

N° clones Espèces Cultivars Origine Etat sanitau-e Traitementsà l'origine Riba T(°C)

KP 04 SI Hybride krengle-praehensilis - Côle d'Ivoire sain + 27

KP 0452 Hybride k:rcngle-prnehensilis - Côle d'Ivoire sain + 27

KP 04 S3.1 Hybride krengle-praehensilis - Côle d'Ivoire sain + 27

KP 04 53.2 Hybride krengle-praehensilis - Côle d'Ivoire sain + 27

lB 40 D. cayenensis-D. rolundata XMBOT Côle d'Ivoire malade

lB 43 D. cayenensis-D. rolundala Kpambli Côle d'Ivoire -

lB 60 D. cayenensis-D. rOlundala Akendolokou Côle d'Ivoire sain

lB 75 D. cayenensis-D. rolundala NF! Cameroun sain

lB 05 RI D. cayenensis-D. rOlundala Kouba Côle d'Ivoire malade - 27

lB 05 R2 D. cayenensis-D. rOlundala Kouba Côle d'Ivoire malade - 27

lB 05 R3 D. cayenensis-D. rolundala Kouba Côle d'Ivoire malade - 27

lB 05 R6 D. cayenensis-D. rOlundala Kouba Côle d'Ivoire malade - 27

lB 05 Rll D. cayencnsis-D. rOlundala Kouba Côle d'Ivoire malade - 27

lB 05 RI2 D. cayencnsis-D. rolundala Kouba Côle d'Ivoire malade - 27

lB 05 RI9 D. cayenensis-D. rOlundala Kouba Côle d'Ivoire malade - 27

lB 05 51 D. caycnensis-D. rolundala Kouba Côle d'Ivoire malade + 27

lB 05 S3 D. cayenensis-D. rolundala Kouba Côle d'Ivoire malade + 27

lB 05 S8 D. cayenensis-D. rOlundata Kouba Côte d'Ivoire malade + 27

lB 05 SI2 D. cayenensis-D. rolundala Kouba Côle d'Ivoire malade + 27

lB 05 S13 D. cayenensis-D. rolundala Kouba Côle d'Ivoire malade + 27

lB 05 S 14 D. cayenensis-D. rolundala Kouba Côle d'Ivoire malade + 27

lB 05 SIS D. cayenensis-D. rOlundal'\. Kouba Côte d'Ivoire malade + 27

lB 05 T3 D. cayenensis-D. rOlundala Kouba Côle d'Ivoire malade - 37

Indexation de la collection de vitroplanls du L.R.G.A.P.T./OR5TOM, aprés trailement soit par la Ribavirine,soit par la chaleur (2]0 ou 3]0).

L~gendes: Riba =RibavirineT(°C) =température de cuilure en oC

5 =clones lB 05 trailés par la Ribavirine et trailés à 27°CX =clones EA 08 traités par la Ribavirine et traités à 27°CW =clones EA 08 non traités par la Ribavirine et trailés à 27°CR =clones lB 05 non traités par la Ribavirine et trailés à 27°CT =clones lB 05 non traités par.: la Ribavirine et trailés à 3]OC

\

13

Indexation des yit[oplants d'Igname de la collection

du L.R.G.A.P.T.lORSTOM

N° clones Espèces Cultivars Origine Etat sanitaire Traitement,:>à l'origine Riba T(oq

EA08 W2 D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade - 27

EA08 W3 D. praehensilis - Côle d'Ivoire malade - 27

EA08 W4 D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade - 27

EAOS WS D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade - 27

EA08W8 D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade - 27

EA08 W9 D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade - 27

EA OS Xl D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade + 27

EA 08 XS D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade + 27

EA08 X8 D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade + 27•

EA 08 X9 D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade + 27

EA 08 XIO D. praehensilis - Côle d'Ivoire malade + 27

EA 08 XU D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade + 27

EA08 Xl2 D. praehensilis - Côle d'Ivoire malade + 27

EA 08 X13 D. praehensilis - Côle d'Ivoire malade + 27

EA 08 X14 D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade + 27

EA OS XI8 D. praehensilis - Côte d'Ivoire malade + 27

EA08 X19 D. praehensilis - Côle d'Ivoire malade + 27

NCOS D. alala DEU Nlle Calédonie -NC 10 D. aIula Fidji/Gohapin Nlle Calédonie -

OA 1 (1) D. alala Namassou blanc Côte d'Ivoire sain

OA 1 (2) D. aJala Namassou blanc Côle d'Ivoire sain

OA 17 .D. cayenensis-D. rotundata Kpan Côle d'Ivoire malade

OASS D. cayenensis-D. rolundala Kounougbe Côle d'Ivoire sain

PR 01 D. alata .. Florido Porto Rico -

Indexation de la collection de vitropIants du L.R.G.A.P.T./ORSTOM. aprés traitement soit par la Ribavirine,soit par la chaleur (27° ou 37°).

Légendes: Riba =RibavirineT(°C) =lempérature de culture en oC

S =clones lB OS trailés par la Ribavirine el trailés à 27°CX =clones EA 08 traités par la Ribavirine et traités à 27°CW =clones EA 08 non traités par la Ribavirine et traités à 27°CR =clones lB OS non traités par la Ribavirine et traités à 27°CT =clones lB OS non traités par la Ribavirine et trailés à 37°C

1 4

•

Pour la détection par inoculation mécanique, des fragments de vitroplants ont

été broyés dans une solution tampon habituelle d'inoculation mécanique (tampon K2HP04

0, lM, cystéine HCl 0,01 M, charbon actif 0.5%, bentonite 0,25%. H20, pH 7,5) et frottés

sur les feuilles, préalablement saupoudrées de carborindum, de plants de Nicotialla

benthamiana, Datura stramonium et Chenopodium amaranticolor.

Pour la détection en microscopie, la technique de "trapping" a été retenue,

-technique d'immuno-électromicroscopie pennettant d'accrocher sur des grilles préalablement

couvertes avec des immunoglobulines les protéines virales homologues (immunoglobuline

30 mn, rincer, ajouter extrait clarifié à tester 1h à 3rC,rincer, colorer avec acétate

d'uranyle).

Le diagnostic a été appliqué aux vitroplants d'Igname de la collection du

L.R.G.A.P.T. et à la ,collection de clones d'Igname du L.P.R.C., clones rapportés du

Burkina Faso, de Guyane et de Guadeloupe.

L'interprétation des résultats doit êU'e effectuée avec une exu-ême prudence,

l'objectif de cette indexation étant d'identifier des clones sains, c'est-à-dire donnant des

réponses négatives aux analyses effectuées. Dans les différents types d'analyse effectués,

un résultat estimé positif est effectivement positif; un résultat estimé négatif n'est réellement

négatif que dans la mesure où la preuve positive n'a pas été apportée: tout résultat négatif est

donc une présomption d'absence de virus, jamais une certitude absolue, malgré l'utilisation

comparative de témoins négatifs absolus (plantes saines) et de témoins positifs_

Par ailleurs, la biodiversité des agents pathogènes, insuffisamment estimée

dans la plupart des cas, doit êu-e prise en compte (voir études immunologiques avec les

anticorps monoclonaux pour YMV).

II - 2 Résultats

Résultats des transmissions mécaniques

Seuls les extraits des vitroplants OAI (D.alata, cv Namassou blanc, Côte

d'Ivoire), lB 05 8S (D. cayenensis-D. rotundata, cv Kouba, Côte d'Ivoire), lB 05 813

(D. cayenensis-D. rotundata, cV Kouba, Côte d'Ivoire) , EA OS X9 et EA OS XI0 (D.

praehensilis, Côte d'Ivoire), EA OS WS (D. praehensilis, Côte d'Ivoire) , lB 05 R2 (D.

cayellensïs-D. rotulldata, cv Kouba, Côte d'Ivoire) et EA OS W3 (D. praehensilis, Côte

d'Ivoire) provoquent l'apparition de SY111ptômes sur Nicotiana benthamiana et sur

Chenopodium amaralllicolor. Les symtômes observés sont faibles; aucune mosaïque

15

typique et aucune mosaïque déformante ne sont observées.

Les plants de Nicotial/a bel/thamiana ont été analysés en immunologie ELISA

(sél1lms anti-YMY, antî-PYX, antî-CMY, anti-PYY et anti-TSWY).

Résultats des contrôles en microscopie électronique

Des particules flexueuses ont été observées dans les exu'aits du viu'oplant lB

05 Rl, panicules dont les dimensions (500-600 nm de longueur et 12-13 nm de diamètre)

• sont typiques du groupe des PYX.

Résultats des contrôles immunologiques en ELISA

Le vilUs de la Mosaïque de l'Igname (YMY) a été détecté (kit YMY/L.P.R.c.)

dans un vitroplant, üA 17 ,Dioscorea cayel/el/sis-D. rotulldata cv. Kpan, Oligina.ire de Côte

d'Ivoire, réputé malade à l'origine, et n'ayant subi aucun traitement.

Ce virus a également été détecté (présence probable, mais à confirmer) dans 5

viu'oplants, EA 08 W3, EA 08 W8, EA 08 X9 (N.b.), KP 04 Sl, IB 75. Les trois premiers,

en provenance de Côte d'Ivoire, appartiennent à l'espèce D. praehel/silis et sont réputés

malades à l'Oligine; seul le troisième a été traité à la Ribaviline. Le quau'ième est un hybride

D. praehellsilis / lcrengle, en provenance de Côte d'Ivoire, réputé sain à l'origine et traité à la

Ribavirine. Le cinquième vitroplant, du complexe D. cayel/ellsis-D. l'olUl/data, en

provenance du Cameroun, réputé sain, n'a reçu aucun traitement.

Dans 4 autres vitroplants, DA 1.1(N.b.), EA 08 X9, EA 08 Xli, lB 05 R2,

l'absence du virus demande à être confitmée. Le premier, de l'espèce D.afata, en provenance

de Côte d'Ivoire, réputé sain, n'a reçu aucun traitement. Le second et le troisième, de

l'espèce D. praehel/silis, réputés malades, ont été traités à la Ribavirine, Le quatrième, du

complexe D. cayel/el/sis-D. l'otundata, réputé malade, n'a reçu aucun traitement.

Le VlllJS X de la Pomme de terre (pYX) a été détecté dans un vitroplant, IB 05

Rl, du complexe D. cayenellsis-D. l'otUlzdata, en provenance de Côte d'Ivoire et non traité à~

la Ribavirine, Cette détection, négative quand effectuée directement sur le vitroplant, a été

obtenue aprés transmission mécanique à Nicotiana benthamialla; elle a été confirmée par

observation au microscope électronique.

Le vil1ls de la Mosaïque du Concombre (CMY) a peut êU'e été détecté dans un

vitroplant, lB 05 Rll, du complexe D. cayenensis-D. rotUlzdata, en provenance de Côte

d'Ivoire, réputé malade et non traité à la Ribavirine; cette détection est douteuse et demande

confirmation.

Le virus de la Maladie Bron?-ée de la Tomate (TSWY) et le virus Y de la

Pomme de terre (PYY) n'ont pas été détectés.

16

Indexation des vjtroplants d'Igname de la collectiondu L.R,G,A,P,T.lORSTOM

N° clones anti-YMV anti-PVY anti-PVX anti-CMV anti-TSW

KP 0451 0.000 0,012 0,000

KP 0452 0,111 0,026 0,014

KP 04 53.1 0,000 0,002 0,004

KP 04 53.2 0,000 0,024 0,008

• lB 40 0,055 0,012 0,019

lB 43 0,025 0,005 0,013

IB60 0,040 0,000 0,006

lB 75 0,097 0,008 0,011

lB 05 RI 0,014 0,005 0,015

lB 05 R2 0,041 0,QI8 0,017

lB 05 R2 (N.b.) 0',080 0,000 0,379 0,011 0,074

lB 05 R3 0,030 0,005 0,008

lB 05 R6 0,036 0,009 0,009

lB 05 Rl1 0,021 0,016 0,007

lB 05 R12 0,026 0,016 0,045

IB 05 Rl9 0,025 0,017 0,005

lB 05 51 0,050 0,012 0,010

lB 05 53 0,042 0,026 0,012

lB 05 S8 0,000 0,023 0,009

lB 05 58 (N.b.) 0,061 0,018 0,023 0,000 0,091

lB 05 512 0,000 0,013 O,QIO

lB 05 Sl3 0,016 0,014 0,017

lB 05 513 (N.b.) 0,057 0,006 0,025 0,015 0,059

lB 05 514 0,029 0,QI5 0,013

IB05515 0,056 0,008 0,029

IB 05 T3 0,020 0,010 0,007

PR 01 0,023 O,QIO 0,008

Témoin sain 0,058 0,015 0,021 0,015 0,130

YMV 0,487

PMV (PVY) 0,129

PVX 0,507

CMV 0,094

T5WV 2,500

Le seuil de discrimination positif est fixé à deux fois la valeur moyenne des témoins sains et supérieur à 0,100.Le seuil de discrimination négatif est fixé à la valeur moyenne des témoins négatifs. Entre ces deux valeurs lesrésultats sont estimés douteux et doivent être contrôlés (douteux négatif en dessous de la valeur médiane entre cesdeux seuils el douteux positif au dessus de cette valeur médiane).

l 7

Indexation des yitroulants d'Ilmame de la collectiondu L.R,G,A,P,T.lORSTOM

N° clones anti-YMV anti-PVY anti-PVX anti-CMV anti-TSWV

EA08 W2 0,034 0,014 0,015

EA08W3 0,000 0,006 0,008

EA 08 W3 (N.b.) 0,111 0,012 0,013 0.009 0,092

EA08 W4 0,025 0,013 0,016

EA08W5 0,020 0,016 0.009

EA08W8 0,088 0,008 0,015

EA 08 W8 (N.b.) 0,055 0,005 0,016 0,017 0,093

EA 08 W9 0,015 0,005 0,015

EA08 XI 0,019 0,000 0,004

EA 08 X5 0,025 0,007 0,004

EA 08 X8 0,031 0,003 0,010

EA08 X9 0,075 0,022 0.014

EA 08 X9 (N.b.) 0,100 0,ûl5 0,021 0,000 0,086

EA 08 XIO 0,058 0,011 0,018

EA 08 X10 (N.b.) 0,043 0,004 0,006 0,000 0,091

EA08 XlI 0,075 0,007 0,012

EA 08 X12 0,017 0,012 0,006

EA 08 XI3 0,036 0.006 0,004

EA 08 X14 0,030 0.020 0.012

EA 08 XI8 0,030 0,014 0,013

EA08 X19 0,018 0,003 0,015

NC05 0,010 0,021 0,008

NC 10 0,000 0,001 0,000

OA 1.1 0,000 0,009 0,006

OA 1.1 (N.b.) 0,072 0,005 0,052 0,002 0,143"

OA 17 0,160 0,010 0,006

OA55 0,026 0,000 0,016

Témoin sain 0,058 0,015 0,021 0.015 0,130

YMV-12 0,487

PMV(PVY) 0,129

PVX 0,507

CMV 0,227

TSWV 2,500

Le seuil de discrimination positif est fixé à deux fois'Ia valeur moyenne des témoins sains et supérieur à 0,100.Le seuil de discrimination négatif est fixé à la valeur moyenne des témoins négatifs. Entre ces cieux valeurs lesrésultats sont estimés douteux et doivent être contrôlés (douteux négatif cn dessous de la valeur médiane entre cesdeux seuils et douteux positif au dessus de celle valeur médiane).

1 8

Indexation des yitroplants d'Igname de la collectiondu L,R,G,A,P,T./ORSTOM

N° clones

KP 04 SI

KP 04 S2

KP 04 S3.1

KP 04 S3.2

1B40

IB43

IB60

lB 75

IB 05 RI

IB 05 R2

IB 05 R2 (N.b.)

lB 05 R3

lB 05 R6

IB 05 Rll

IB 05 R12

lB 05 R19

lB 05 SI

lB 05 S3

IB 05 S8

. IB 05 S8 (N.b.)

lB 05 S12

IB 05 SI3

IB 05 SI3 (N.b.)

lB 05 S14

lB 05 S15

lB 05 T3

PR 01

Témoin sainYMV~MV (pVY)PVXCMVTSWV

anti-YMY

+?

+ ?

. ?

+

anti-PYY

+

anti-PYX

+

+

anti-CMY

. ?

+

anti-TSW

+

Le seuil de discrimination positif (+) est fixé à deux fois la valeur moyenne des témoins sains et supérieur à0,100. Le seuil de discrimination négatif (-) est fixé à la valeur moyenne des témoins négatifs. Entre ces deuxvaleurs les résultats sont estimés douteux et doivent ê.tre contrôlés: douteux négatif (. ?) en dessous de la valeurmédiane cntre ces deux seuils et douteux positif (+ ?) :lu dessus de celle valeur médiane).lB 05 S 13 (N.b.) : Nicotialla belllhamialla inoculé avec un extrait du vitroplant lB 05 S 13

1 9

Indexation des yitroDlants d'Igname de la collectiQIldu L.R.G,A,P,T.lOR8TOM

N° clones anti-YMY anti-PYY antÎ-PYX antÎ-CMY anti-TSWY

EAOS W2

EAOS W3

EA OS W3 (N.b.) + ?

EAOS W4

'EAOS W5

EAOS WS + ')

EA OS WS (N.b.)

EAOS W9

EA 08 Xl

EA OS X5

EA OS XS

EA OS X9 0 ?

EA OS X9 (N.b.) + ?

EA OS XlO

EA OS XIO (N.b.)

EA 08 XlI - ?

EA OS X12

EA OS X13

EA OS X14

EA OS XIS

EA 08 X19

NC05

NC 10

OA 1.1

OA 1.1 (N.b.) • ?

OA 17 +

OA55

Témoin sainYMV-12PM\'(PVY)PVXCMVTSWV

++

++

+

Le seuil de discrimination positif (+) est fixé à deux fois la valeur moyenne des témoins sains et supérieur à0.100. Le seuil de discrimination négaùf (0) est fixé à la valeur moyenne des témoins négatifs. Entre ces deuxvaleurs les résullats sont estimés douteux et doivent êl{e contrôlés: douteux négaùf (- ?) en dessous de la valeurmédiane entre ces deux seuils et douteux positif (+ ?) au dessus de cette valeur médiane).lB 05 S13 (N.b.) : Nicotialla bellthamialla inoculé avec un extrait du vitroplant lB 05 S13

20

Résultats des traitements effectués sur les vitroplants

Traitement par la chaleur

Un seul vitroplant (lB 05 T3) a subi un traitement par la chaleur à 37 oC (pas

de Ribavirine); la présence d'aucun virus n'a pu être détectée.

, Traitement par la Ribavirine

Deux clones issus des vitroplants lB 05 et EA OS ont été traités pour partie à

la Ribavirine: 7 clones d'IB 05 ont été traités et 7 clones sont restés non traités; Il clones

d'EA 08 ont été traités et 6 sont restés non u'aités.

Aucun des clones d'lB 05 traités ne semble infecté par un VilllS; à l'encontre,

l'un des clones non traités (sur 7), lB 05 R2, est infecté par PYX (contrôle positif) et peut­

être par YMY (probabilité négative) et un autre, lB 05 R 12 est peut-être infecté par

CMV(probabilité négative).(

Cependant, 3 des clônes d'EA OS traités (sur Il) ne peuvent être ce11ifiés sans

virus (probabilité positive d'infection par YMV pour EA 08 X9), alors que 2 clones non

traités (sur 6) semblent infectés par YMV (probabilité positive d'infection pour EA 08 W3 et

EAOS WS).

Pris globalement les résultats, présentés dans le tableau ci-aprés, sont les

suivants: 3 clones sur 18 sont estimés non sains aprés traitement soit 17 %, alors que 4 sur

13 le sont sans u'aitement, soit 31 %.

Clones Nb de clones traités Nb de clones non traitésinfectés sams infectés sains

lB 05 a 7 2 5

EA08 3 S 2 4

TOTAL 3 15 4 9

% 17 83 31 69

2 1

Discussion

Ainsi qu'il a été précisé dans le chapitre "11-1 Matériel et Méthodes", les

résultats obtenus en immunologie doivent toujours être interprétés avec une extrême

prudence; cela signifie précisément que les résultats avancés ne sont pas critiquables mais

que les conclusions qui sont tirées de ces résultats doivent être par contre avancées avec une

grande ligueur.

Tous les résultats signalés positifs sont liés effectivement il. des échantillons

infectés par un virus; tous les résultats négatifs sont liés à des échantillons qui sont ou bien

non-infectés <1> ou bien infectés par une souche de virus non-détectée pour diverses

raisons (concenu'ation en virus trop faible <2> , propriétés immunologiques différentes

<3», la probabilité la plus fOlte étant le premier cas.

Le troisième cas <2> est illustré lors de la détection du PVX dans l'échantillon

lB 05 R2: pas de dét~ction positive dans le viu'oplant mais détection postive (et contrôle

positif) dans Nicotiana benthamiaJ/a inoculé avec un exu'ait du viu·oplant. Cela signifie que

la concenU'ation en virus était trop faible pour être détectée directement dans le vitroplant

(pour des raisons toujours imaginables: liées au vitroplant : âge, température de

croissance.... , ou liées au virus ... ). Cela signifie également que la technique

immunologique choisie poulTait manquer de sensibilité. Pour cette raison, il a été décidé

d'adapter cette technique, tenant compte des résultats des travaux d'immunologie exposés ci­

aprés (chapiu'e IV): technique ELISA double sandwich direct, faisant appel en première

couche aux anticorps polyclonaux et en seconde couche aux anticorps monoclonaux

conjugués.

Les travaux de sanitation conduisent à des résultats prometteurs; il est

envisagé de compléter ces travaux afin de vérifier l'effet positif de la température, agissant

seule ou en association avec un u'aitement chimique.

Référence

Malaurie B., J. Dubern and L·C. ThouveneI. Influence de la température et de la chimiothérapie, associéesou non, sur l'obtention de plantes indemnes de virus de la Mosaïque de l'Igname (YMV), àpartir de méristèmes isolés de deux clones virosés de D. prachclIsiiis et du complexe D.cayellellsis·D. rotwldala cv. Kouba. (en préparartion)

22

Conclusion

YMV détecté (+) dans üA 17,

présence probable (+ ?) dans EA 08 W3, EA 08 W8, EA 08 X9, TB 75, KP 04 52

présence improbable (- ?) dans OA 1.1, EA 08 X9, EA 08 XlI, lB 05 R2

. PVX détecté (+) dans lB OS R2

CMV présence improbable (. ?) dans lB 05 R12

T5WV non détecté (.)

Traitement à 37°C positif mais un seul clone testé.<

Traitement par Ribavirine relativement positif

mais nombre de clones étudiés faibles:

clones estimés non sains: 17 % aprés traitement contre 31 % sans traitement.

23

III - PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-YMV(L. GIYORD)(Laboratoire d'Immunochimie, LB.M.C., 15 rue Descartes, 67084 Strasbourg France)

Les hybridomes issus des fusions réalisées dans les conditions décrites dans

le rapport précédent, contre le virus de la Mosaïque de l'Igname (YMY), ont été reproduits

dans des souris. Nous avons pu récolter des volumes de liquides d'ascites variables selon

les anticorps monoclonaux (AcMc) de 0,5 ml à plusieurs millilitres. Nous disposons, à

l'heure actuelle, de 26 sous-clones appal1enant à 5 familles de clones.

Leurs titres homologues maximum s'échelonnent de 10-3 (groupe 5) à 10-9

(groupe 11); les titres de la plupart des autres anticorps monoclonaux (dans les liquidesr

d'ascites) sont de l'ordre de 10-5 à 10-7•

Nous rappelons que ces anticorps monoclonaux ont été sous-clonés

successivement 2 fois, ce qui permet d'assurer avec plus de certitude, que nous avons

effectivement des anticorps monoclonaux issus d'un seul hybridome. D'après les analyses

de caractélisation que nous avons faites sur tous les sous-clones, notamment à panir de leur

réactivité vis-à-vis de trois antigènes purifiés (L.P.R.C. / ORSTOM), à savoir le virus YMY

natif, l'YMY traité à la trypsine et la protéine fde l'YMY, les sous-clones d'une même

famille réagissent de manière identique. Ceci est un résulat supplémentaire permettant

d'assurer que nous avons bien sélectionné des anticorps monoclonaux.

L'étude de la réactivité de ces différents anticorps monoclonaux, vis-à-vis

d'isolats de l'YMV, a été débutée avec des échantillons rapportés du Burkina Faso par C.

GOUDOU-URBINO; les premiers résultats ont permis de sélectionner dès à présent des

anticorps monolonaux qui permettent de reconnaître les isolats d'après leur origine

géographique. Il est évident que la,recherche doit être poursuivie, en particuJiier, en collectant

un nombre beaucoup plus important d'isolats, répartis dans des régions plus disséminées.

Les résultats finaux conduiront à la mise au point d'un kit de détection.

En résumé, nous avons obtenu plusieurs anticorps monoclonaux de

spécificités différentes, permettant de reconnaître tous les isolats actuellement en notre

possession (ceux d'origine africaine, mais aussi d'origine antillaise). Les quantités

disponibles de liquides d'ascites, utilisables sans purification, sont suffisantes pour

envisager un diagnostic à grande échelle.

24

IV - CARACTERISATION D'ISOLATS DE VIRUS DE LAMOSAÏQUE DE L'IGNAME DU BURKINA FASO

(C.GOUDOU-URBINO, L. GIVORD, G. KONATE et .1. DUBERN)

(L.P.R.C./C.I.R.A.D.-ORSTOM, CIRAD, BP 5035, 34032 Montpellier France)(Laboratoire d'Immunochimie, LB.M.C., 15 rue Descartes, 67084 Strasbourg France)(IN.E.R.A., Centre de recherche de Kamboinsé, 01 BP 476 Ouagadougou, Burkina Faso)

29 anticorps monoclonaux ont été produits par L. GIVORD (ORSTOM­

.C.N.R.S.) à l'I.B.M.C. (Strasbourg). 23 de ces monoclonaux se sont révélés détecter la

souche de référence YMV-12, souche ivoirienne ayant pelmis la production de ces anticorps.

L'ensemble des anticorps a été testé contre 15 isolats provenant du Burkina

Faso (8), du Cameroun (2), de la Guadeloupe (3), de la Guyane (1) et du Nigéria (1). La

technique ELISA en double sandwich indirect polyclonal-monoclonal (DAS) a été utilisée.

Les résultats sont rappoltés dans les tableaux 1, 2, 3, 4 et S.

1 - ETUDES DES ANTICORPS MONOCLONAUX

Les anticorps monoclonaux fournis par l'I.B.M.C. ont été testés contre le

virus qui a permis de les produire et contre un témoin sain. Le Tableau 1 rapporte les

données observées.

Les résultats peuvent être ainsi résumés:

1) En ELISA-ACP (simple sandwich), les monoclonaux suivants ne réagissent pas avec le

virus témoin : 511, 512, 713, 714, 742, 743, 744, 911, 151, 1534,

232. Les monoclonaux suivants donnent des réponses faibles avec le virus témoin: 711,

712, 741.

En ELISA-DAS (double sandwich), les monoclonaux suivants ne donnent pas de

réponses positives avec le témoin virosé: 512, 713, 911, 1534, 232.

Les monoclonaux suivants donn~nt des réponses u'ès faibles avec le témoin virosé: 511,

151.

2) Les monoclonaux 711, 712, 714, 741, 742, 743, 744 ne réagissent pas en

ACP mais donnent de bons résultats en DAS.

Pour la suite, seuls 23 anticorps monoclonaux sur les 29 disponibles seront

utilisés après élimination des 6 monoclonaux suivant:

511, 512, 713, 911, 1534, 232.

25

TABLEAU 1: Densités optiques résultant de la réaction <ELISA-DAS) des anticorpsmOQoclonaux contre un Témoin Sain (TS) et un Témoin Yirosé (TY) à différentes dilutions

TV 1/5 TV 1/10 TV 1/20 TS 1/10 TS 1/20

3.3.1 818 780 1115 16 17

3.3.2 715 731 1050 22 25

3.5.1 690 12

3.5.2 800 Il

3.5.3 825 963 1016 13 13

3.6.1 820 987 960 16 17

3.7.1 765 749 1105 12 13

3.7.2 880 955 1120 16 17

5.1.1 107 47

5.1.2 20 27 31 29 31

7.1.1 1040 28

7.1.2 1830 38

7.1.3 75 49

7.1.4 1371 18

7.4.1 780 40

7.4.2 880 54

7.4.3 860 5

7.4.4 1100 4

9.1.1 36 31 27 29 31

11.1.1 926 1230 1525 36 38

11.1.2 1115 1335 1540 45 49

1.5.1 280 11

15.2.1 959 30

15.2.2 1430 43

15.3.1 1013 36

15.3.2 1100 20

15.3.4 80 70

15.5.1 687 40

2.3.2 28 19 30 21 30

TV 1/5; 1/10; 1/20 =Témoin virosé dilué au·1/5. 1/10 el 1/20TS 1/10; 1/20 =Témoin sain dilué au 1/10 el au 1/20

2 - ETUDES DES ISOLATS DU BURKINA FASO

Les résultats de cette étude sont mpportés dans les tableaux 2 et 3.

Ces résultats montrent une grande diversité biologique des isolats de YMV. Les anticorps

monoclonaux permettent de différentier les isolats du Burkina Faso provenant de la région

Centre et de ceux de la région Sud-Ouest:\

- 5 anticorps monoclonaux ne détectent que 'les isolats de la région Centre;

- 8 anticorps monoclonaux ne détectent que les isolats de la région Sud Ouest;

- 10 anticorps monoclonaux détectent certains isolats dans les deux régions.

26

TABLEAU 2: Réactioos des anticorps monoclonaux en ELISA-DASavec les isolats du Burkina Faso

TS TV12 BF48 BF51 BF54 BF56 BF60 SOC SOAI SOA2 lITA3.3.1 5 263 17 47 20 318 23 341 122 105 39

31 284 57 39 473.3.2 26 261 16 137 71 259 74 271 178 176 75

3.5.1 12 482 97 550 512 32 736 110 135 45 522 693 196 579 385 240 145 47

3.5.2 13 560 97 560 533 27 735 125 106 22 474 800 196 475 421 390 16 7

3.5.3 2 261 13 69 16 320 23 349 127 121 15

3.6.1 48 226 39 87 81 216 81 188 93 152 109

3.7.1 21 561 12 105 42 628 51 763 203 266 79

3.7.2 2 282( 14 48 17 343 19 307 115 138 68

7.1.1 29 1051 120 275 258 45 335 42 46 22 686 680 131 53 24 22

7.1.2 20 1345 235 109 47 219 36 42 41 35 13037 830 140 48 25 28 46 41

7.1.4 16 650 19 35 19 21 16 20 16 21 153 615 31 23

7.4.1 45 190 296 289 250 277 292 49 48 62 1825 785 119 61 21 12

7.4.2 34 932 155 272 323 58 393 30 39 107 4861 785 209 60 30 41 98 52

7.4.3 15 121 175 96 29 202 19 15 13 16 1514 903 213 68 13 17 15 19

7.4.4 10 980 190 81 29 31 23 12 Il 12 254 1075 128 72 10 13 2 15

11.1.1 16 546 97 102 41 537 49 643 245 240 96·56 121 65 79 1236 974 761 736

11.1.2 22 548 71 183 88 679 82 748 307 227 6248 220 ~ 98 71

15.2.1 26 720 30 41 30 30 39 401 730 240 12513 309 11 Il 800 722 197 123

15.2.2 43 1515 43 7 10 42 27 1163 1110 636 30117 751 21 21 341 395 130 80

15.3.1 40 660 40 345 674 220 11715 870 25 58 55 31 60 845 981 1116 560

15.3.3 18 1097 21 31 38 22 48 960 1.085 1230 67521 960 881 745

15.5.1 5 690 9 8 11 10 17 263 275 100 433 996 2 1005 300 250 205 27

1.5.1 61 280 90 91 ~3 91 91 90 94 90 85\

(en gras et Italique, test avec le virus purifié)

27

TABLEAIJ 3: Interprétation des réactions des anticorps monoclonauxen ELISA-DAS avec les isolats du Burkina Faso

+ =Réponse pOSll1ve : D.O> 2 X TS et 100; - =réponse négatJve: < 2 X TS;+/- = réponse positive douteuse (entre 2 X TS et \00) ; <+> = réponse positive avec le virus purifié

~

TVl2 BF48 llF51 BF54 BF56 BF60 SOC SOAI SOA2 lITA

3.3.1 + - - - + - + + + -3.3.2 + - + +/- + +/- + + + +/-3.5.1 + + + + -<+> + + + - -3.5.2 + + + + -<+> + + + - -3.5.3 + - +/- - + - + + + -3.6.1 + - +/- +/- + +/- + +/- + +3.7.1 + - + - + - + + + +/-3.7.2 + - - - + - + + + +/-7.1.1 + + + + - + - - - -7.1.2 + + + - + - - - - +7.1.4 + - - - - - - - - -,

7.4.1 + + + + + + - - - +7.4.2 + + + + - + - - +/- -7.4.3 + + +/- - + - - - - +7.4.4 + + +/- - +/- - - - - -11.1.1 + +/- +/- - + - + + + +/-11.1.2 + +/- + +/- + +/- + + + +/-15.2.1 + - - - - - + + + +15.2.2 + - - - - - + + + +15.3.1 + - - - - - + + + +15.3.3 + - - - - - + + + +15.5.1 + - - - -<+> - + + + -1.5.1 :+ - - - - - - - - -

..

Les isolats 54 et 60 réagissent de la même façon vis à vis de tous les

anticorps monoclonaux; il en est de même des isolats SOC et SOA 1.

Un essai de classement peut être réalisé selon le tableau 4. Par ailleurs, en

combinant les anticorps, il est possible de reconnaître tous les isolats:

7.4.1 + 3.3.1 (ou 3.3.2, ou 3.5.3, ou 3.7.1, ou 3.7.2, ou 11.1.1, ou 11.1.2, ou 15.2.1,

(ou 15.2.2, ou 15.3.1, ou 15.3.3)

3.5.1 + 3.6.13.5.2 + 3.6.2

28

Classement des isolatsd'YMV

du llurkina Faso

SOAI SOCSOA2IITAB:f.54 TIF60 UF48 UrS1

J 3.3.13.3.2~

3.5.33.7.1

«<7.1.27.4.17.4.3~

11.1.111.L27.1.2

3.5.17.4.33.5.27.4.4 »» ,3.6.1»>11.1.17.4.2-

15.5.13.3.23.5.3»> -~

3.6.1

13.6.1»13.7.17.1.27.4.37.4.411.1.2

1r 1TIFSG

.3.1

.5.1 »»»>

.5.2

.7.2

.1.1

.4.2

15.2.115.2.2»»»»»i5.3.115.3.3

l'V"0

TABLEAU' 4-:21 anticorps monoclonaux permettent de classer les souches de YMV,collectées au Burkina Faso, en 2 groupes principaux et 4 sous-groupes.

3 - ETUDES DES ISOLATS DE GUADELOUPE, GUYANE ET CAMEROUN.Les résultats sont rapportés et analysés dans les tableaux 5 et 6.

TAllLEAJI 5: Densjtés optiQues résultant de la réactioD (ELISA·DAS) des anticorpsmonoclonaux contre les jsolats de Guyane. Guadeloupe et Camer!ll1.lL.

TS TV12 CAM2 AIA CAM1 DIVIN TRIFD GUYNE

331 2 1534 175 700 1104 1148 1555 16222 533 246 619 871 1055 1225 1582

332 4 487 100 417 966 1144 1412 168224 1597 101 553 1290 1176 '1642 1564

. 351 2 581 169 535 1284 1381 1383 175820 1536 167 648 1265 1197 1622 1692

352 1 1 602 188 591 944 1227 1305 16801 7 1 61 1 222 648 1203 1136 1682 1753

353 5 636 239 542 1024 1143 1448 16279 1573 281 674 1197 1243 1740 1703

361 3 584 128 512 1093 1395 1100 15561 6 1403 185 666 1125 11 81 1636 1568

371 6 '664 287 627 1080 1268 1441 17251 8 1603 297 756 1340 1241 1640 1694

372 6 584 227 672 1284 1381 1383 175820 1536 255 659 1265 1197 1662 1692

71 1 8 834 133 725 54 63 105 441 7 1747 147 823 86 69 85 59

71 2 5 764 1 1 1 728 109 39 82 5132 1636 11 0 834 86 69 74 31

714 6 760 1 9 490 1 9 38 25 4823 1835 1 0 580 41 42 25 50

741 1 0 932 107 814 95 72 88 2522 1587 106 863 100 28 52 21

742 1 2 848 108 726 69 92 66 2923 813 143 840 69 54 64 31

743 1 6 894 90 705 108 62 21 1 678 1432 93 822 66 49 28 33

744 6 860 100 770 58 26 31 3238 1863 90 890 33 28 33 37

1 1 1 1 28 .155 100 56 128 173 528 24854 518 76 77 158 184 527 246

1 1 1 2 1 4 328 1 71 350 643 731 812 87825 892 165 320 704 735 793 845

1521 1 2 631 288 664 30 1164 1 5 16533 1598 335 698 46 1137 1 8 1563

1522 1 0 789 488 805 166 995 51 161346 1531 529 822 176 1089 35 1769

1531 32 452 109 376 134 984 30 167335 1671 129 432 136 1051 41 1774

1533 26 774 439 757 147 131 1 44 175124 1828 453 828 1 1 3 1262 33 1786

1551 2 740 406 }49 169 972 1 7 164022 1492 421 827 144 1106 5 1740

1 5 1 80 83 138 214 146 295 255 2541 91 237 147 202 148 209 289 231

30

TAllLEAll 6: Interprétation des résultats de la réaction ŒLISA-DAS) des anticorpsmonoclonaux contre les isolats de Guyane. Guadeloupe et Cameroun.

TV12 Cam2 AIA Cam1 Divin Tri fd Guyne

3.3.1 + + + + + + +

3.3.2 + + + + + + +

.3.5.1 + + + + + + +

3.5.2 + + + + + + +.3.5.3 + + + + + + +

3.6.1 + + + + + + +

3.7.1 + + + + + + +

3.7.2 + + + + + + +

7.1 .1 + + + - - ? -

7.1. 2 + t+ + ? - - -

7.1.4 + - + - - - -

7.4.1 + ? + - - - .

7.4.2 + + + - - - -7.4.3 + ? + - - - .

7.4.4 + ? + - - - -

11 .1 .1 + ? - ? ? + +

11.1.2 + + + + + + +

15.2.1 + + + - + - +

15.2.2 + + + + + - +

15.3.1 + + + + + - +

15.3.3 + + + + + - +

15.5.1 + + + + + - +

1 .5.1 + . - - -. - -

Ces isolats sont tous reconnus par les anticorps 3.3.1, 3.3.2, 3.5.1, 3.5.2, 3.5.3,

3.6.1,3.7.1,3.7.2 et 11.1.2

4'.- ETUDES DE QUELQUES POTY VIRUS AFRICAINS

5 potyvirus africains sérologiquement reliés, d'après la littérature, au Yam

Mosaic Virus (Peanut Mottle Virus, Pepper VeinaI Mottle Virus, Sugar Cane Mosaic Virus,

Grounut Eyespot Virus, Datura Shoestring Virus) ont été testés avec un mélange de 3

monoclonaux pennettant de détecter l'ensembl,e des isolats dont nous disposons.\

Les résultats indiquent que tous les échantillons testés sont séro-négatifs vis à

vis du mélange d'anticorps monoclonaux utilisé.

3 1

Ces travaux ont été présentés au <Premier Seminaire du Réseau Ignames en Afrique>, qui

s'est tenu du 26 au 28 octobre 1993 à Cotonou, Bénin.

CONCLUSION

L'utilisation des anticorps monoclonaux permet de préciser la diversité

biologique des divers isolats testés, et de distinguer les isolats selon leur provenance

géographique.

Ces anticorps ont permis de distinguer clairement YMV d'autres

potyvirus d'origine africaine.

Le mélange des anticorps 3.5.1+ 3.6.1 (ou 3.5.2 et 3.6.2 ) permet

une reconnaisance de tous les isolats étudiés et, ainsi, d'envisager la production et la

divulgation d'un kit de diagnostic anti·YMV (double sandwich direct, associant

polyclonal anti YMV-12 et l'un de ces couples d'anticorps monoclonaux).

Références

Goudou-Urbino C.• G. Konate, 1.-B. Quiot, L. Givord et 1. Dubern. Etudeimmunologique du virus de la MosaYque de l'Igname. First Seminar of Yam Network inAfriea, OCI. 26-28.10.1993. Cotonou Bénin. (conmlUllicalioll)

Goudou-Urbino C., G. Konate, J.-B. Quiot, L. Givord et J. Dubern. ImmunologicalStudies of Yam Mosaie Virus. Phylopathology (en préparation)

32

V- DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DU VIRUS DE LAMOSAÏQUE DE L'IGNAME AU BURKINA FASO(C.GOUDOU-URBINO, G. KONATE, J.-B. QUIOT et ,1. DUBERN)

(IN.E.R.A., Centre de Kamboinsé, 01 BP 476 Ouagadougou 01, Burkina Faso)(I.N.R.A., ENSA, Place Viala, 34060 Montpellier France)(L.P.R.C./CIRAD-ORSTOM, CIRAD, BP 5035, 34032 Montpellier France)

1 - Introduction

L'Igname, (Dioscorea spp, Dioscoreacées) est l'une des principales cultures

vivrières des régions tropicales où elle représente 12% de l'alimentation de base. La

production mondiale s'élève à 25 millions de tonnes (F.A.O. 1985) dont 95% en Aflique de

l'Ouest. Cette culture est sensible à une maladie virale provoquée par le Vims de la Mosal"que

de l'Igname (Yam Mosaïc Virus, YMV). La maladie s'exprime par l'apparition de

symptômes de type "green vein banding", ou de cloques sur les feuilles, et parlois d'un

nanisme de la plante. Elle provoque des peltes de rendement de l'ordre de 15 à 25 % chez les

principales espèces cultivées (D. cayel/ensis-rotlll/data .. D. a/ota .. D. trifida). Le virus est

disséminé soit en culture par des pucerons vecteurs selon le mode non persistant, soit au

moment de la plantation par l'utilisation de tubercules-semences virosés. Il s'agit d'un virus

filamenteux appartenant au groupe des Potyvirus, et dont un isolat de Côte d'Ivoire a été

caractérisé par THOUVENEL et FAUQUET (1979). La répaltition géographique du YMV

semble s'étendre à toutes les régions productrices d'Igname (Nigéria, Côte d'Ivoire, Togo,

Cameroun, Caraïbes, Pacifique) .

L'importance de cette culture justifie le fait qu'elle soit depuis quelques

années l'objet de thèmes de recherches prioritaires à l'ORSTOM (amélioration génétique), à

l'LN.R.A. mais également dans divers instituts internationaux tels l'I.I.T.A. (International

Institute of Tropical Agriculture) et l'I.I.R.S.D.A. (Institut International de Recherche

Scientifique pour le DéveloppemeqJ: en Afrique).

Actuellement, il n'existe aucune méthode de lutte contre cette virose. Le choix

raisonné d'une méthode de lutte nécessite l'acquisition de connaissances sur la prévalence de

la maladie dans les régions à protéger afin de savoir si son importance justifie la mise en

place d'une protection sanitaire. D'autre part, une évaluation de la diversité biologique et

sérologique du virus permettrait de mieux choisir les outils de détection nécessaires au

contrôle de la maladie.

La disponibilité en anticorps polyclonaux an ti-YMV préparés à partir de

souches ivoiriennes du virus et, plus réceÎnment, en anticorps monoclonaux préparés

également à partir d'une souche ivoirienne, a permis de débuter une étude de détection

33

sérologique du virus de la Mosaïque de l'Igname au Burkina Faso, ainsi qu"une étude de sa

diversité biologique.

Cette étude a été réalisée au Burkina Faso, pays situé à la frontière nord de

plusieurs pays producteurs d'Igname dans lesquels l'YMY a été identifié. L'extension de

cette culture depuis quelques années, son intensification envisagée en relation avec

l'explosion démographique dans ce continent, les échanges fréquents de matériel effectués

.entre pays voisins dans cette zone, justifient un travail de prospection et de détection de la

maladie.

2 - MATERIEL ET METHODES

2.1 Prospections

Elles ont été effectuées en septembre 1991 et en juillet 1992 (la culture de

l'Igname débute en ~ai et se termine en novembre) dans trois régions de culture

traditionnelle d'Igname au Burkina Faso (voir carte ci-jointe). Les régions Sud-Ouest et

Sud produisent à elles deux 75% de la production nationale d'Igname, soit 42 000 tonnes.

La région Centre a été choisie parce qu'elle est excenu'ée par rappolt aux autres zones de

culture d'Igname et que la variété principalement cultivée (D. cayellensis, dite Igname de

Pilimpikou) n'est pas représentée ailleurs dans le pays.

Le travail a consisté à rechercher la présence de symptômes de mosaïque sur

les feuilles. De nombreux échantillons ont été ramenés au laboratoire pour y subir une étude

de diagnostic sérologique (ELISA).

Des comptages de plantes présentant des symptômes caractéristiques de

mosaïque ont été effectués dans plusieurs parcelles en 1992; les résultats sont donnés par

parcelle pour plusieurs lots de 100 plantes (par exemple, 29/1000 signifie que sur 10 X 100

plantes, il a,été u'ouvé au total 29 plantes présentant des symptômes de mosaïque ou des

cloques).

2.2 - Etude sérologique

La technique ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), utilisée en

double sandwich direct, a été appliquée au matériel végétal récolté au cours des prospections

1991 et 1992 (feuilles conservées à -20°C). Ce matériel comporte des plantes (dénommées

collection 1991) récoltées en 1991 dans différentes zones de production et cultivées en serre

à la Station de recherche de l'IN.E.R.A., à Kamboinsé, (feuilles issues de la germination

des tubercules), et des fragments de tubercules (dénommés collection 1992). Un anticorps

polyclonal anti-YMY (THOUYENEL et FAUQUET, 1980) est utilisé pour ces tests de

détection.

34

Par la suite, dans le but d'étudier la diversité des isolats, de.s tests ELISA ont

été effectués sur 8 isolat'> du Burkina Faso en utilisant 23 anticorps monoclonaux (GIVORD,

non publié). La technique du double sandwih indirect a été utilisée.

Le matériel végétal est broyé et dilué 1/1 0 (g/ml). Le seuil de discrimination

choisi pour déterminer les échantillons positifs est fixé à 3 fois la valeur moyenne de la

densité optique obtenue pour les témoins sains.

. 2.3 - Etude de la gamme d'hôte

L'inoculation mécanique de l'ensemble des isolats de la collection 1991 a été

effectuée à partir de feuilles de N. benthamiana infectées (selon méthode décrite

précédemment) sur différentes plantes hôtes : N. benthamiana, .N. glutinosa, N.

megalosiphon N. rustica, N. sylvestris, N. tabacum cv Samsun, N. tabacum cv Samsun

NN, N. tabacum cv Xanthi NN, Petunia hybrida, Datura stramonium, Chenopodium

amaranticolor , Chenopodium quinoa, Gomphrena globosa. Les symptômes ont été notés

dès leur apparition et une détection par test ELISA a été effectuée pour confirmer les1

observations.

Afin de confirmer les diagnostics obtenus par le test ELISA, une inoculation

mécanique des 8 isolats a été réalisée sur des plantes de Nicotiana benthamiana,

particulièrement sensibles à ce virus (symtômes de mosaïque devant apparaître environ 7

jours après l'inoculation mécanique). La méthode utilisée est la suivante: chaque isolat est

inoculé sur 6 plantes de N. benthamiana à partir d'un broyat de feuille d'Igname; le broyage

est effectué dans une solution de phosphate de sodium 0,03M, à pH 8,3, additionnée de

0,2% de diéthyl-dithiocarbamate de sodium. Les plantes inoculées sont placées en conditions

contrôlées (300 e, 75% H.R.) et observées à partir du 6ème jour après l'inoculation.

2.4 - Observations au microscope électronique

La méthode "leaf dip" a été utilisée; après coloration à l'acétate d'uranyle

(2%), les. extraits bruts de N. benthamiana infectés ont été observés à l'aide d'un

microscope électronique léol lEM-IOO ex II.

3 - DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DE LA MALADIE

En septembre 1991, les plantes étaient à un stade de développement très

avancé (floraison); au cours des prospections effectuées, il n'a pas été observé de

symptômes caractéristiques de la Mosaïque de l'Igname; des prélèvements de feuilles ont

cependant été effectués afin de rechercher au laboratoire la présence du virus malgré cette

absence de symptôme (Tableau 1).

35

*13oromo

*Békuy

TOGOBENIN

1000 mm

NIGER

os

*Pobé

*Léo

GHANA

Région CENTRE 1*Arbollé

1 N A F*KamOOinsé*Ouagadougou

*Koudougou

Région

*Ouahigouya

*DédougouU R ICB

*13000

MAL!

ZONES DE PROSPEGTION DE LA MOSAÏQUE DE L'IGNAME

AU BURKINA FASO

36

..

TA BLEAlI 1 ; RI~SULTAT DES OBSERVATIONS EFFECTUÉESLORS DE LA PROSPECTION DE 1991

REGIONS CARACTERISTIQUES DE ESPECES SYMPTOMESLA REGION CULTIVEES OBSERVES

SUD-OUEST -localisation: frontière avec la Côte d'Ivoire D. cayenensis cloques sur jeunes(grand pays producteur et échanges) feuilles

Il champsvisités - précipitations: 1000 mm/an D. alala marbrures et stries. jaunes

- production: Il 000 t d'Igname.soit 25 % de la production nationale D. bulbifera nécroses

- les variétés des espèces deD. cayenensis et D. alata dominent

SUD - localisation: frontière avec le GhanaD. cayenellsis cloques sur jeunes

- précipitations: 1100 mm/an feuilles5 champs

visités - production: 20500 t d'Igname. enroulement dessoit 50 % de la production nationale feuilles

- D. cayenensis domine sur les autres D. alala marbrures surespèces feuilles agées

CENTRE - localisation: nord de Ouagadougouet isolement car à au moins 200 km D. cayenellsis IP nécroses surde toute zone de culture d'igname feuilles agées

4 champs cloquesvisités - précipitation: 700 mm/an 1

- culture d' igname possible grâce au D. cayenellsis SO J pas de symptômesol hydromorphe à pseudogley 1

~i

- production: environ 30 t d'Igname D. a/ala (rare) pas de symtôme

- la variété locale D. cayenellsis (IP)représente 95 % des Ignames cultivées

Sous le terme D. cayenellsis. S0l1t regroupées toutes les variétés de cette espèce. cultivées dansla zone de prospection. Dans la région Centre. la variété locale dite "Igname de Pilimpikou"(IP) est distinguée des autres variétés de la même espèce habituellement cultivées dans le Sud­Ouest (Sa).

Une deuxième prospection a été effectuée en juillet 1992, plus précocement au

cours de la saison des pluies. Après un début tardif de la saison des pluies en 1992, les

plantes étaient au premier stade de leur développement. De nombreux symptômes typiques

de la Mosaïque de l'Igname ("Green Vein Banding" =GVB, mosaïque, nanisme) ont été

observés dans les trois régions prospectées:

- sur la totalité des plantes de la variété IP dans la Région Centre, mais pas sur les autres

variétés présentes dans cette zone (D. cayenensis SO, D. a/ara),

37

- sur de nombreuses plantes dans le Sud Ouest (D. cayenellSÏS sa, D. afala).

- sur quelques plantes de la Région Sud.

Le tableau 2 résume ces observations ainsi que les comp~ages des plantes

présentant des symptômes typiques de la Mosaïque de l'Igname.

TABLEAU 2 ; RESULTAT DES OBSERVATIONS EFFECTUEES,LORS DE LA PROSPECTION EN 1992

.REGIONS ESPECES ESPECES PLANTES PRESENTANT

CULTIVEES OBSERVES DES SYMPTOMES

SUD·OUESTD. a/ota chlorose pa:; de comptage

Banfora, Bobo-Dioulasso D cayellellsis chlorose pas de comptage

D. a/ota G YB, mosaïque champ 1 29/1000=3%Mangodara D. cayellellsis GY B. nanisme champ 1 30/800 =3,7%,

D. bu/bifera pas de sYl11tôme

Gaoua. Balié D. a/ata panachure pas de comptage

D. cayellellsis nécroses

SUDD. a/ata marbrure pas de comptage

LEO D. cayellellsis G Y B t mosaïque champ 1 6/1000champ 2 28/1000champ 3 2/1000

CENTRED. a/ota (rare) pas de symplôme pas de complage

Arbolle D. cayellellsis IP GYB 100%

D. cayellensis SO pas de symplôme pas de comptage

CONCLUSION 1

La première prospection tardive n'a pas permis d'observer des symptômes

caractéristiques de la Mosaïque de l'Igname. Cependant, l'année suivante, des symptô~es

ont été observés dans les trois zones de culture visitées, notamment dans la Région Centre

'. sur l'Igname de Pilimpikou. Les comptages effectués en 1992 dans les différentes régions

semblent indiquer une infection particulièrement importante dans la Région Centre en

comparaison de celle qui a été constatée dans les deux autres régions.

Afin de disposer, à 1'IN.E.R.A.-Kamboinsé, de plantes virosées provenant

des différentes zones de culture d'Igname du Burkina Faso, une collection a été constituée en

choisissant au hasard des tubercules dans les champs, ou sur les marchés, à la fin de la

saison de culture en 1991 et 1992.

38

4 - LE DIAGNOSTIC SEROLOGIQUE

4.1 - Détection avec un anticorps polyclonal

Un témoin positif (échantillon lyophilisé de N. benthamianG infecté par une

souche ivoirienne de YMV) est utilisé comme référence au cours de noU'e test. Le témoin

négatif est un extrait de feuilles de N.benthamiana ou de feuilles d'Igname selon la nature

des extraits testés.

Les résultats des tests effectués sont présentés dans les tableaux 3, 4, 5,6.

TAULEAJJ 3 ; DÉTECTION (ELISA) DANS LES ECHANTILLONS.PRELEVES AU COURS DE LA PROSPECTION EN 1991

REGIONS NOMBRE DE NOMBRE DE PLANTIS %DEPLAN1ESPLAN1ES TES1EES SEROPOSITIVES SEROPOSITIVES

,

SUD-OUEST 102 36 35%

SUD 164 25 15%

CENTRE 72 63 87%

Il n'a pas été fait de distinctions selon les espèces en 1991.

TABLEAU 4 ; DÉTECTION EN ELISA DANS LES ECHANTILLONSPRELEVES AU COURS DE LA PROSPECTION EN 1992

REGlONS ESPECES NOMBRE DE NOMBRE DE PLAmES % DEPLANTESPLANTIS TES1EES SEROPOSITIVES SEROPOSITIVES

SUD-OUEST D. cayellellsis 176 22 12,5%Banfora D. a/ata 181 18 10%

.Gaoua D. caye/le/lsis 46 0 0

D. a/ata 40 0 0

SUD D. cayalle/lesis 215 0 0

Léo D. a/ata 68 0 0

CENTRE D. cayc/le/lsis IP 131 109 85%

ArbolIé D. cayencnsis SO 26 0 0

D. a/ata 2 0 0

39

L'ensemble de ces résultats montre que, dans les trois régions prospectées, il

existe sur Igname un virus sérologiquement relié au YMY. D'après les résultats des tests

effectués sur les échantillons prélevés lors des prospections (tableaux 5 et 6), la Région

Centre apparaît la plus infectée par YMY : 87% d'échantillons virosés en 1991, et 85% en

1992 ; la Région Sud-Ouest supporte un taux d'infection encore important: 35% en 1991 et

12% en 1992; quant à la Région Sud elle reste relativement peu infectée: 15% en 1991 et

0% en 1992.

Les résultats des tests ELISA obtenus pour les collections 1991 et 1992 sont

en accord avec ceux effectués sur les échantillons prélevés au cours des prospections dans

les régions Sud-Ouest et Cenu·e. Cependant, il n'a jamais été u'ouvé dans la région Sud

d'échantillon positif parmi les échantillons prélevés en 1992 ni panni les tubercules de nos 2

collections. Ces résultats contradictoires doivent donc être confirmés par de nouvelles

prospections et l'étudé d'un plus grand nombre d'échantillons.

TABLEAU 5 ; DETECTION (ELISA) DANS LES PLANTES ISSUESDES TUBERCULES COLLECTES EN 1921 EN CHAMPS OU SUR LES MARCHES

REGION ESPECE NOMBRE DE NOMBRE DE PLANTESPLANTES TESTEES SEROPOSITIVES

D. cayellellsis 16 1

SUD-OUEST D. a/ala 8 2D. bu/bifera 6 0

SUD D. cayellensis 22 0D. a/ala 5 0

CENTRE D. cayellensjs IP 22 22

Ces premiers résultats ont permis de sélectionner 8 échantillons virosés

.provenant de deux zones de production (5 échantillons de la région Centre, 3 échantillons de

la région Sud Ouest), échantillons qui ont été utilisés par la suite pour l'étude de la gamme

d'hôtes, par transmission mécanique, et pour l'étude de la diversité biologique du virus.

40

TABLEAU 6 ; DETECTION (ELISA) DANS LES TUBERCULES

COLLECTES EN 1992 DANS LES CHAMPS OU SUR LES MARCHES

REGION ESPECE NOMBRE DE NOMBRE DETUBERCULES TESTES TUBERCULESSEROPOSnnFS

SUD-OUEST D. cayel/ellsis 15 0D. a/ala 15 0

SUD D. cayel/ellsis 46 0D. a/ala 30 0

CENTRE D. cayellellsis IP 49 49D. cayellellsis SO 20 0D. a/ala 2 0

4.2 - Détection à l'aide d'anticorps monoclonaux

23 anticorps monoclonaux ont été testés sur les 8 isolats de notre collection; les résultats

paltiels actuellement obtenus montrent que:

- 5 anticorps monoclonaux ne détectent que les isolats de la région Centre,

- 8 anticorps monoclonaux ne détectent que les isolats du Sud-Ouest,

- 10 anticorps monoclonaux détectent des échantillons dans les deux zones.

CONCLUSION 2

La technique ELISA réalisée avec un anticorps polyc1onal anti-YMV (souche

de Côte d'Ivoire) a permis de détecter le virus présent dans les plantes d'Igname des régions

Centre et Sud-Ouest du Burkina Faso. Une situation particulière semble exister dans la

région Centre, isolée de toute auU'e culture d'Ignalne, où une variété spécifiquement cultivée'"semble très infestée.

5 • ETUDE DE LA GAMME D'HÔTES

Des inoculations sur N. bellthamialla ont d'abord été effectuées à parÙf des

différents isolats de virus présents sur Igname au niveau de la collection. Toutes les plantes

qui ont été déterminées séro-positives présentent des symptômes de mosaïque.

L'inoculation mécanique des ex~aits de l'ensemble des plantes de la collection

1991 sur différentes plantes hôtes a donné les résultats suivants :

4 l

- N. eleve/andii, N. mega/osipholl, présentent des symptômes de mosaïque et donnent des

réactions sérologiquement positives contre le YMV;

- Les autres plantes inoculées se sont révélées séro-négatives .

La présence de particules filamenteuses a été confirmée par des oservations en microscopie

électronique.

, CONCLUSION 3

Les différents isolats que nous avons rassemblés sont capables d'infecter N.

bellthamialla N. eleve/alIdii, et N. mega/osiphon. Par contre il n'a pas été possible de les

inoculer sur d'autre plantes hôtes.

6 - DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE

L'étude sérologique a permis de détecter un virus sérologiquement relié au

YMV au Burkina Faso, dans les régions Sud-Ouest et Centre. La gamme d'hôtes de ce virus

a été identifiée comme étant restreinte à N. bellthamialla, N. eleve/alldü, N. mega/osiphon ,

en accord avec les travaux de THOUVENEL (1979), et de THOTTAPILLy (1981).

L'étude de la répaltition géographique indique que le vil1ls est présent dans le

Sud-Ouest dans 10 à 15% des plantes d'Igname cultivées. Ces observations sont

comparables à celles de THOUVENEL et al. (1989) effectuées dans le Nord de la Côte

d'Ivoire.

La présence du Virus dans la région Sud reste à confirmer et nécessite de

nouvelles prospections. Le diagnostic du virus dans les tubercules doit être confinné par des

tests sérologiques sur les plantes issues de ces tubercules. Le test actuellement utilisé n'a pas

été optimisé pour ce matériel. Des travaux doivent être poursuivis dans ce sens pour

pennettre une indexation rapide des tubercules-semences.

Le résultat le plus intéressant de cette étude est celui lié à la situation qui

prévaut dans la Région Centre, éloignée des autres zones de culture d'Igname, région où le

pourcentage de plants atteints avoisine 100 %. Ce taux exceptionnel peut être relié aux

techniques agricoles utilisées, à l'absence d'introduction de variétés nouvelles, mais aussi

très probablement à la spécificité de la variété cultivée dans cette région (Igname de

Pilimpikou). Une étude de DUMONT et HAMON (1986) a montré que cette variété de D.

cayellensis se rapproche par ses caractères morphologiques du complexe savanicole D.

abyssillica / D. /ecardii / D. sagittifolia .. L'isolement de cette zone de culture, le peu

d'échanges existant entre celle-ci et les autres zones de culture de l'Igname, et le fort

pourcentage de plantes contaminées en fo~t une zone à caractéristiques écologiques

particulières.

42

Un autre résultat non négligeable est lié à l'utilisation des anticorps

monoclonaux: une grande diversité géographique semble exister parmi les isolats collectés

dans les régions Sud-Ouest et Centre. Ces résultats sont d'autant plus intéressants que de

nombreux potyvirus ont été trouvés sur l'Igname sans avoir été suffisamment été décrits: le

Dioscorea Green Banding Mosaïc Virus (DGMV) au Togo (RECKHAUS et NIENHAUS,

1981), le Yam Virus (YVN) au Nigéria (TERRY, 1978), un potyvirus sérologiquement

proche du YMV de Côte d'Ivoire dans les Antilles françaises (GOUDOU-SINHA, 1990 ;

. Anonyme, 1993). PORTH et al. rappOltent qu'il existe une relation sérologique fOlte enU"e

le DGMV et le YVN mais qu'elle est plus faible avec le YMV identifié en Côte d'Ivoire.

L'ensemble de ces résultats indique qu'il pOUlTait exister une forte diversité

géographique du Yam Mosaïc Virus. Il serait donc intéressant d'effectuer une caractélisation

de tous les potyvüus cités en Afrique et aux Antilles en utilisant les anticorps monoclonaux

dont nous disposons. En outre, il paraît nécessaire de contrôler, sur un plus grand nombre

d'isolats en provenance,de différentes régions du monde productrices d'Igname (Amélique

Centrale, Asie), l'importance de cette diversité géographique du YMV. Par la suite, au plan

pratique, ces travaux permetu'ont la caractérisation d'un maximum d'isolats dans le monde

puis, la mise au point d'un test de détection de routine et, but ultime, le choix de la méthode

de lutte la plus appropriée à la Mosaïque de l'Igname et aux conditions de culture de

l'Igname.

Ces résultats, encore préliminaires, pelmettent en outre d'initier de nouvelles

études. En effet, il y aurait lieu d'étudier, de manière soutenue, les autres sites connus (Mali,

Bénin), identiques au plan pédologie à la région d'Arbollé (Région Cenu"e) et cultivés avec

des variétés identiques ou proches de l'Igname de Pilimpikou, sites susceptibles d'être des

sites-réselvoirs importants de la maladie.

. Ces résultats ont été présentés à la Société d'Ecophysiologie, au cours de la

séance tenue le 14 mai 1993 à l'Ecole Normale Supérieure, rue d'Ulm, à Palis.

RÉSu/1É

DISTRIBUTION GÉOGRAPHIQUE

DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DE LI IGNAME AU BURKINA FASO

L'Igname, principale culture vivrière en Afrique de l'Ouest est sensible à une maladie provoquée parle virus de la Mosaïque de l'Igname (Yam MosaYc Virus, YMV, potyvirus). Afin de prévenir une extension dela maladie par des échanges de matériel végétal, une étude de la répartition géographique du YMV a étéeffectuée au Burkina Faso dans trois zones de culture. Les résultats des prospections et de l'étude sérologiquemontrent que le virus est présent dans la Région Sud-Ouest (10 à 15% de plantes infectées) et dans la RégionCentre (environ 100% des plantes). La situation écolo'gique de la Région Centre semble très intéressante carla variété principalement cultivée, Igname de Pilimpikou, n'est pas représentée ailleurs dans le pays. De plus,la détection effectuée avec des anticorps monoclonaux a mis en évidence une diversité géographique du YMV.Suite à ce résultat, des perspectives de recherches sont envisagées pour la caractérisation des différents

43

potyvirus précédemment trouvés sur Igname ainsi que pour la mise au point d'un test de détection de routinepermettant de caractériser le maximum d'isolats de YMV dans le monde.MOTS CLES : IGNAME VIRUS AFRIQUE DISTRIBUTION DIVERSITE

ABSTRACT

Geographical distribution of Yam Mosaic Virus in Burkina FasoThe yam, one of the most important crops in the West Africa, is infected by a disease caused by

Yam Mosaic Virus (YMV, potyvirus). In order to prevent YMV extention by free trade, the geographic. distribution of the virus was studied in three regions of Burkina Faso. The results of prospections and

serological studies showed that the virus was present in the South-Western Region (10 to 15 % of infectedplants) and in the Central Region (almost 100 %). The ecological status of the Central Region was spe.cialyinteresting because of the cultivatcd variety (Pilimpikou's yam), only present in this region and nowhere else.Moreover, a geographical diversity of YMV was observed by using monoclonal anlibodies. New projeclSwere proposed for characterizing the different potyviruses observed on yam in the world and for perfecting aroutine tes!.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ANONYME, 1993 - L'Igname et ses contraintes parasitaires à la Martinique: résultats de l'enquête réalisée en1991. Rapport ORSTOM mars 1993, 24 pp.DUMONT. R. et HAMON. P. - 1986 - Une forme originale parmi les Dioscoréacées culrjvées en Afrique del'Ouest: l'Igname de Pilimpikou. Rapport IDESSA 1986.F.A.O. - 1985 - Annuaire des productions.GOUDOU-SINHA, C. - 1990 - Etude épidémiologique multilocale de la contamination virale de troisespèces d'Igname par le Yam Mosaïc Virus à la Guadeloupe. R<lpport de DIAT, ESAT-CNEARC, 49pp.MIGLIORI, A. el CADHILAC, B. - 1976 - Contribution à l'étude de la maladie du virus de l'Igname D.1rifldaen Guadeloupe. Ann. Phytopath. 8, 73-78.PORTH, A., LESEMANN, D.E. et VETTEN, H.J. - 1987 - Caraclerization of potyviruses isolates fromWest african Yams (Dioscorea spp.). J. Phytopath. 120, 166-183.RECKHAUS, P. et NIENHAUS, F. - 1981 - Etiology of virus disease of White Yam (Di.'Jscorea ro(ulldata)in Togo. Z. Pflkrankh. PflSchutz 88, 492-509.TERRY. E.R. - 1977 - Incidence, symptomatology, and transmission of Yam virus in Nigeria. l'roc. 4thSymp. Int. Soc. Trop. Root Crops, Cali, Colombia, 1976, 170-173.THOTTAPILLY, G. - 1981 - Annual Report of lITA, p. 70.THOUVENEL. L-C., BORG-OLIVIER, O. et DUMONT, R. - 1989 - Epidemiology of Yam Mosaïc Virus.Importance of aphid transmission. 4th International Plant Virus Epidemiology Workshop,Montpellier, France, 3-8 Sept 1989.THOUVENEL, J.-c. et FAUQUET, C. - 1979 - Yam Mosaïc, a new potyvirus infecting DioscoreacayeneJIsis in Ivory Coast. Ann.appl.8ioI.93 (3), 279-283.THOUVENEL, L-C. et FAUQUET, C. - 1980 - Utilisation de la technique ELISA dans le diagnostic de laMosaïque de l'Igname. 2ème Conférence Internationale sur l'Impact des Maladies à Virus surle Développement des Pays Africains et du Moyen-Orient. Nairobi, 2-6 décembre 1981.THOUVENEL, L-C. el FAUQUET, C. - 1986 - Yam Mosaïc Virus. AAB Descriptions of PlantViruses. N° 314.

Référence

Goudou-Urbino c., G. Konate, J.-B. Quiot et J. Dubern. Distribution géographique du virus de laMosaïque de l'Igname au Burkina Faso. Société d'Ecophysiologie, séance du 14 ami 1993, EcoleNormale Supérieur. rue d'Ulm, Paris France. COinmunication.

Goudou-Urbino c., G. Konate, J.-B. Quiot el J. Dubem. Geographical distribution and biodiversily ofyam mosaic virus. Tropical Science, en préparation.

44

VI - PRESENCE DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DE L'IGNAMESUR L'IGNAME EN GUYANE ET AUX CARAÎBES.(.I.-B. QUIOI )

(LN.R.A. , ENSA, place Viala 34060 Montpellier France)

Les résultats des u'avaux effectués par l'équipe dirigée par J.-B. QUIOT sont

exposés ci-aprés; ils ont été l'objet de deux communications au Congrés de la Caribbean

. Food Crop Society, tenu en juillet 1993 à la Martinique.

1 - Mise en évidence de la présence du Virus de la Mosaïque de l'Igname surIgname (Dioscorea trifida) en Guyane.

Divers isolats en provenance de Guyane ont été étudiés à Montpellier.

Certains isolats, induisant des symptômes de mosaïque classique sur Dioscorea trijïda, ont

été testés en ELISA conU'e un antisérum spécifique du Virus de la Mosaïque du Concombre

(CMV) et contre un antisérum polyclonal spécifique du Virus de la Mosaïque de l'Igname

(YMV, isolat ivoirien); un isolat inoculé avec succés à Nicotialla benthamiana et répondant

négativement en ELISA avec le sérum ami-CMV et positivement avec le sérum anti-YMV a

été l'objet d'une étude particulière,

La transmission à l'aide de divers genres de pucerons a été précisée: Myzus

persicae, Aphis gosypii, Aphis spiraecola, Macrosipho/l euphorblae, Rhopalosipholl padl;

tous ont pennis la transmission (mode non persistant) mais avec une efficacité vélliable selon

les genres.

Des essais de transmission mécanique à divers hôtes ont été tentés sans

succés hormis vers Nicotia/la benthamialla et Dioscorea alata.

Une étude de microscopie optique permet d'observer des inclusions

cytoplasmiques céll'actéristiques de la présence des potyvirus.

Utilisant la technique d'''electro-immunoblot assay", les protéines de capsides

des divers isolats ont été analysées avec deux sérums anti-YMV (souche ivoliienne et souche

guadeloupéenne). Cette étude a permis de rapprocher la souche de Guyane étudiée d'une

souche ivoirienne et d'une souche guadeloupéenne, mais de la différencier dautres souches

"en provenance de Guadeloupe et du Cameroun.

Ces résultats confirment des résultats préliminaires et pelmettent d'affirmer la

présence d'YMV en Guyane sur Dioscorea trijïda. Ils pelmettent d'envisager une diversité

45

au sein du Yam Mosaic Virus, caractéristique qui est étudiée, par ailleurs, à l'aide

d'anticorps monoclonaux et qui sera l'objet d'une étude précise à l'aide de la "polymerase

chain reaction".

Cette diversité alliée à un potentiel théorique important de dissémination par

vecteur conduit à envisager avec une extrême prudence les échanges intematinaux.

"2 - Etude épidémiologique du Virus de la Mosaïque de l'Igname enGuadeloupe dans l'objectif d'établir une stratégie de contrôle de la maladie.

Dans l'objectif d'évaluer l'extension du virus de la Mosa'ique de l'Igname

(YMV), des plants garantis sans virus de Dioscorea cayenensis-D. rolundata et de Dioscorea

trifida ont été plantés dans deux sites différents en Guadeloupe. La progression de la maladie

a été suivie sur les de~x espèces, durant toute la saison de culture, par des observations

vlluelles et par des analyses immunologiques en ELISA.

A la fin de la saison de culture, des infections ont été notées sur les deux

espèces, mais le pourcentage de plants infectés s'est révélé beaucoup plus impol1ant dans le

site de culture traditionnel que dans celui où la culture est rarement effectuée.

Une étude de la fréquence de la maladie sur les trois principales espèces

d'Igname cultivées en Guadeloupe indique que, dans le cas d'une forte pression de la

maladie, l'espèce D. a/ala est moins infectée que les deux autres.

Sur la base de ces résultats, il semble donc possible d'envisager une sélection

sanitaire dans l'objectif de limiter la prévalence du YMV en Guadeloupe.

Références

BOEGLIN M., G. LABONNE, L. DEGRAS, L. QUIOT-DOUINE et J.-B. QUIOT. Mise en évi­dence de la présence du Virus de la Mos<üque de l'Igname sur Igname (Dioscorea trifida)en Guyane. Caribbean Food Crop Society, Congrés juillet 1993, Martinique.

GOUDOU-URBINO C., L. DEGRAS et J.-B. QUIOT. Epidemiological sLudy of yarn mosaic virus inGuadeloupe (FWI) to formulale disease-control strategies. Caribbean Food Crop Society,Congrés juillet 1993, Martinique.

46

Communication au Congrés de la Caribbean Food Crop Society, Martinique. juillet 1993

Mise en évidence de la présence du Virus de la Mosaïque de l'Igname Sllr Igname(Dioscorea trifida) en Guyane.

M. BOEGLlN, G. LABONNE*, L. DEGRAS**, L. QUIOT-DOUINE, J.B. QUIOT

INRA Pa thologie Végétale ENSA place Viala 34 060 tvlontpellier Cedex 1. "'INRA Zoologie ENSA PLACE Viala 34060 Montpellier Cedex 1"':TNRA Amélioration des plélntes, DomCline Duclos 97 170 Petit Bourg FWI

Introduction:

Les investigCltïons déja réalisées su r J'igname (Dioscorco sp.) ont montré que cetteespèce pouvait être naturellement infectée par plusieurs types de phytovirus.

Le type de virus le plus souvent rencontré sur igname appartient ~ la famille despotyvirus et provoque des symptômes de mosaïque chromatique plus ou moinsmarquée sur le feuillage d'une plClnle infectée. l'agent pathogène se présente sous laforme de pClrticu les flexueuses de 750 nrn environ transmissibles pélr inocu lationmécanique et par pucerons sous le mode non persistant. 11 ressort d'études réalisées encôte d'Ivoire que l'infection pélr des virus de ce type génère chez l'igname des pertes derendement de l' ord re de 15 à 20 % (rhou venel 1989).

De tels virus ont été isolés J partir de plusieurs espèces d'igname dans différentspClyS du monde et ont été décrits p<lrfois sous des nO/11S différents (Virus de laMosClïque de l'Ign<lme, Yam j\·10saic Virus, Dioscoreo green b<lnding virus, Dioscorcatrifida virus ... ) les données êt<lnl en général insuffis<lnles pour connailre leur nive<1ude relation el établir s'il s'élgil d'iso!<lls idenliques d'un même virus ou de souches ouvirus différents. C'esl le '{,\ln Î\10SClic Virus (YMV) qui Cl été le plus étudié et quiconstitue actuellement le potyvirus de référence (fhouvenel et Fauguet 198).

Il félut pourtant signaler le GIS pMticulier du "Dioscorea a/Mo ring mottle virus"isolé au Togo pour lequel les éluteurs sont pélrvenus à montrer que ce potyvirus étaitdifférent du Yam i\1osaic Virus et qu'il était il rapprocher du virus de la mosClique de laBetterave (Beet Mosaic Virus).

Les progres réalisés dans les techniques de caractérisation du genôme et desprotéines des potyvirus peuvent permettre d'accéder plus facilement à uneconnaissance rapide de la diversité géographique de ce type de virus et ont redonné del'intérèt à la collection d'isolats provenélnt de différents lieux pour établir les risC'Juesd'introduction et d'acclimatation d' Clgents pilthogènes ou de nouveaux pathotypes.

Le but de cette note est de signaler la présence en Guyane d'un virussérologiquement relié au Virus de lil Mosélïque de J'Igname en Guyane et de présenterquelques caractèristiques de cet isolat.

Résultats:

L'isolélt de virus qui il été plus pilrticulièrement étudié provient d'un lot de 6échantillons de feuilles présentélnt des symptômes qui élvait été collecté en Guyanefrançaise en 1991.

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Ces éch<tlltillolls présent(lient soit des symptômes de mos(lique classique, soit desdessins en arète cl e poisson répClftis le long des nervures princip(lles.

La recherche de virus p<lr test ELISA a montré qu'aucun de ces échantillons neré<lgissait avec un antiserum spécifi'lue du Virus de la Mosaique du Concombre,tandis que trois d'entr-eux réagissaient positivement avec un antiserum préparé parJ.c. Thouvenel et al. contre un isolat du YMY collecté en Côte d'Ivoire.

Deux des échantillons négatifs au test ELISA présentaient des symptômes demosaique très marqués. Il n'a pas été possible d'en tirer un iso1at de virus parinoculation mécanique sur une gamme d'hôtes sensibles au CMY et comprenantNicolimzn labacl/I/l xanthi, Clicl/1uis sa/ivl/s, Cl/cllIl1is 17Il'lo et Citlï/llflS lallatl/s.

l:'échantillon N° 6 a été inoculé avec succés à NicoiiaJla bellilzamiana. C'est cetisolat qui a été plus particuliérement étudié aprés avoir vérifié qu'il réagissait toujourspositi\~ement en ELISA avec un antiserum YMY et négativement avec un antiserumCMY.

Transmission par vecteur:

L'isolat N°6 a été transmis de N. bCIlt/w1IliaJla à N. bC'llf/wl11iaïzn par plusieursespèces de pucerons en utilisant des lots de 20 individus ayant été maintenus 6minutes sur la plante source puis une nuit sur la plante à inoculer. Le succés destransmissions a été vérifié'en testant en ELISA, aprés incubation, les plantes inoculéesLes résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci dessous:

espèce: Myzl/s Aphis Ajl/li::. Macro::.iphol/ Rhopalosiphollpers/cal' gossypll spim('(o/Il ellp/lOrbil1e padi

Plantsinfectés

/ 3/60 29/60 7/60 2/60 1/60inoculés

Ces essais montrent que l'isolat de Guyane N°6 a la cé1p<1cité d'être disséminé parplusieurs espèces de pucerons, sur le mode non persistant, et que ceritaines espèces, enparticulier A. gossypii, se révèlent être des vecteurs significativement plus efficientsque d'autres.

Inoculation sur hôtes différentiels.

Des inoculations mécaniques de plantes ont été réalisées en utilisant commesource de virus des NicoiiaJla beITI/IIl1IlÏi7ll1l infectés de f<1çon systémique par l'isolatN°6. Des feuilles avec symptômes ont été broyées au 1/5 d<1ns une solution saline deP04HNa2, 0,03M renfermant 0,2% de di-ethyl-di-thiocarballlùte de sodium et l'extrait a

été frotté sur de jeunes feuilles de plantes sensibles en présence d'un abrasif(carborundum).

Le virus infecte facilement N. fJelliha111ialla dont les feuilles infestées présententun symptôme de "vein banding" caractéristique (photo n01). Ce symptôme (nervuresbordées de vert foncé) parait caractéristi'lue de l'isolat N°6 et n'a pas été observé avecles autres isolats de YMY étudiés.

L'isolat a été aussi transmis par inocl,1lation mécanique de N" belli/zamialla àDioscorea alaia par contre aucune infectio'n n'a été obtenue sur Peil1llia hybrida,Datura stmlllOllill1ll, AlIIaralli/lllS calldaills 011 Brassica llapllS .

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Observations en microscopie optique:

Des observation réalisée sur des lambeaux d'épidermes de N. bmtllntll inllninfectés qui ont été colorés selon la technique de Christie et Ed wardson montrent laprésence dans les cellules infectées d'inclusions cytoplasmiques caractéristiques de laprésence d'un potyvirus.

Comparaison de protéines capsides en EJBA:

La technique d'EISA (electro-immunoblot assay) a été utilisée pour comparer lesdistances de migrations de protéines capsides de différents isolats de YMV

La technique est appliquée à des extraits bruts de plantes infectées: son principeutilise l'électrophorèse en gel SDS polyacrylamide pour séparer par leur vitesse demigration les protéines virales des protéines de lél plante. Une seconde électrophorèseperpendiculaire à la première permet de transférer ces protéines sur une membrane denitrocellulose. La révélation de la protéine virale recherchée se fait par le moyend'une réaction immuno-enzymatique à l'aide d'un antiseru 111 spécifique conjugué ilun enzyme catalysant une réaction colorée insol uble.

Plusieurs essais d'EBlA ont été réalisés en mettélnt en présence des isolats de YtvlYde diverses origines ainsi que deux antiseruJ11 polyclonaux préparés contre un isolativoirien et un isolat guadeloupéen de Ytv!\'. Des résultélts élnéllogues ont été obtenusavec les deux antiserum, ce qui montre que ces deux ilntiserum contiennent desanticorps qui réagissent avec des épitopes présents sur toutes les protéines capsides desisolats étudiés. Par contre, on constate que les isolats de Yi"!\! peuvent se différencierpar leurs mobilités éléctrophorétiques. L'isolat N°6 présente une mobilitéélectrophorétique identique à celle de l'isolat Côte d'Ivoire et probablement pasdifférente de celle de certains isolats gUildeloupéens. pi)r contre" il se différencienettement des mobilités électrophorètiques présentées par d'autres isolatsguadeloupéens (photo 2) ou par des isolats provenant du Cameroun(photo 3).

Conclusion:

On peut tirer de ce travail les conclusions suivantes:

1°) L'isolat N°6 contient un virus transmissible par pucerons sur le mode nonpersistant et par inoculation mécanique qui induit, dans les cellules infectées, desinclusions cytoplasmiques caractéristiques de la présence d'un poty virus. Cet isolatréagit positivement en ELISA et en EBI A avec des antiseru ln préparés contre dessouches de YMV provenant de Guadeloupe et de Côte d'Ivoire.

Ces résultas permettent d'affirmer qu'il existent en Guyane sur D. trifida unpotyvirus relié sérologiquem'ent au Yam Mosaic Virus. On complète ainsi lesobservations réalisées en 1980 par Marchoux et al. qui avaient observé en microscopieélectronique des particules virales flexueuses dans un extrait de D. trifidn provenantde Guyane.

2°) L'isolat étudié présente des caractéristiques particulières (symptomatologie surN. bmthnmitllln, mobilité électrophorétique) qui permettent de le différencier desautres isolats de YMY en cours d'étude au laboratoire. Des étudi.'~s complémentairessont encore nécessaires pour connaitre le niveau de diversité présent au sein du YamMosaic Virus en particulier en faisant appel il des techniques complémentaires tel que

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l'utilisation d'anticorps monoclonaux ou de la "polymerase chain reaction" (PCR).

3°) Les essais de transmissibilité de l'isolat N°6 par certaines espèces de puceronsmontrent que cet isolat a conservé une capacité de dissémination par vecteur bienqu'il infecte une espèce à multiplication végétative qui lui fournit un second modede dissémination. Des expériences complémentaires restent à réaliser pour vérifier sila transmissibilité par pucerons de Dioscorea à Dioscorea se révèle aussi efficace quecelle observée de N. bellthamil11la à N. bel1thal1liallt1.

4Cl ) La diversité géographique observée entre les isolats de YMY et leur potentielthéorique de dissémination par vecteur doivent conduire à une extrème prudencedans les échanges internationaux de matériel sensible.

50

EPIDEMIOLOGICAL STUDY OF YAM MOSAIC VIRUS INGUADELOUPE (FWI) TO FORMULATE DISEASE-CONTROL

STRATEGIES

C.GOUDOU-URBINO (1), L.DEGRAS (2), et J.B.QUIOT (3)

Abstract

In order to evaluate the spreading of Yam Mosaic Virus (YMV,potyvirus), virus-free plants of Dioscorea cayenensis­rotundata and D. trifida were used for establishingexperimental plots in two different locations in Guadeloupe.

The progress of vJ.rus disease in the two species wasfollowed during the crop season by repeated visualobservations which were later confirmed by ELISA tests.

At the end of the crop season infections were observed inthe two species"but, the percentage of infected plants washigher in the location where yam is traditionaly grown thanin the location where yam is rarely gro~~.

A study of disease frequency in the three principal speciesof yam grown in Cuadeloupe has shown that in a locationwhere inoculum pressure is high, D. alata was less infectedcompared to the two other species.

On the basis of the results, it seems possible to undertakea sanitary selection in orderto limitate the prevalence ofYMV in Guadeloupe.

(1) LPRC/ORSTOM BP 5045 34032 ~ontpellier cedex(2) INRA Antilles-Guyanne. Laboratoire de cultures vivrJ.eres

BP 1232; 97184 Pointe à pitre Cedex Guadeloupe(3) INRA Place Viala Biologie et Pathologie végétale

34060 Montpellier cedex 1

5 1

CONCLUSION

Le programme «Amélioration et ValOlisation de l'Igname» financé par la

CEE a permis de développer trois groupes d'actions: des actions de recherche, des actions de

• fOlmation et des actions de coopération scientifique

Les actions de recherche ont été centrées sur:

- la connaissance de la culture in vitro de l'Igname dans l'objectif d'obtenir une

multiplication aisée de l'Igname par production de vitroplants,

- la sanitation de ces vitroplants, par culture de méristème et thelIDothérapie associée ou non

à la chimiothérapie, r

- la mise au point d'un kit de diagnostic permettant de déceler aisément le virus de la

Mosaïque de l'Igname (technique ELISA double sandwich direct, faisant intervenir anticorps

polyclonaux et anticorps monoclonaux,

- la connaissance propre du virus (biodiversité) nécessaire à cette mise au point,

- la connaissance propre de cette maladie au Burkina Faso, pays dans lequel une étude

distribution géographique a été menée, une étude de diversité biologique du virus, et dans

lequel a débuté une étude épidémiologique,

- la connaissance propre de cette maladie en Guadeloupe et Guyane.

Ces différentes actions ont été menées à terme pour la plupart ou sont en cours

(épidémiologie, biodiversité),

- la connaissance des autres maladies virales de l'Igname: un virus sérologiquement relié au

PVX a ainsi pu être identifié dans les vitroplants d'Igname en provenance de Côte d'Ivoire.

Certaines actions sont alTivées à terme: mise au point du kit de diagnostic

anti-YMV, étude de la biodivers'ité, distribution géographique au Burkina Faso, culture des

vitroplants et sanitation; elles peuvent (et parfois doivent l'être) être poursuivies pour

préciser les résultats et améliorer les technologies proposées (sanitation ou dianostic).

Ces travaux sont concrétisés par 14 publications (acceptées, soumises, en

'. préparation, communications) dont la liste est jointe ci-aprés: 5 communkations, 1 publica­

tion acceptée, 3 publications soumises, 5 publications en préparation.

En ouU·e un contrat (avec SANOFI) devrait pennetu'e de valoriser la mise au

point du kit de diagnostic ami-YMV et permettre sa divulgation.

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Les actions de fOimation ont été progranunées dès le début de réalisation de ce

projet:

- formation doctorale (2 ans) de Mme Cica GOUDOU-SINHA dont le sujet de thèse est

«Ecologie et épidémiologie du Virus de la Mosaïque de l'Igname dans le Sud du Burkina­

Faso; application au raisonnement d'une méthode de lutte et à l'étude de la diversité d'un

potyvirus.» et dont le travail aura été effectué pour moitié au L.P,R.C./Montpellier

(France) et pour moitié à l'IN.E.R.A./Kamboinsé (Burkina Faso).

- fonnation universitaire, stage de licence de Mlle Karine LACOrrE (2,5 mois).

Ce programme a également pennis de développer une action de coopération

scientifique avec Dr Gnissa KONATE de l'IN.E.R.A. au Burkina Faso. Cette action était

prioritaire dans l'éventualité de produire un kit de diagnostic anti-YMV; cette étude

nécessitait en effet de disposer d'isolats variés d'YMV. Les résultats obtenus sont importants

puisque nous dispoSOflS actuellement d'une collection de souches de virus du Burkina Faso;

en outre la disuibution géographique de la Mosaïque au Burkina Faso a été précisée.

Ce programme a, de plus, permis de poser les bases de nouveaux projets, en

cours d'étude dont les objectifs sont la sélection et la création, puis la multiplication de

matériel indemne de virus. Les actions envisagées sont les suivantes:

- connaissance du YMV, et des autres virus infectant l'Igname, en Amérique Centrale et en

Amérique du Sud, en Asie du Sud-Est (Chine et Indonésie), et en Océanie.

- épidémiologie du YMV au Burkina Faso et Côte d'Ivoire,

- étude de diagnostic des virus de l'Igname en Côte d'Ivoire et en Guadeloupe

- étude moléculaire du YMV, en collaboration avec C. FAUQUET (I.L.T.A.B./S.C.R.I.P.,

La Jolla, USA) et PL LEPOIVRE (Université des Sciences Agronomques, Gembloux,

Belgique),

- transformation génétique de !'jicotiana benthamiana , en vue de résistance au YMV

(stratégie de la coat protein) (C. FAUQUET/ I.L.T.A.B.) et contrôle des résistants au

L.P.R.C.,

- transformation génétique de l'Igname en vue de résistance au YMV (Pl'. S. MANTELL,

.Wye College, Unive Londres, G.B.),

- contrôle de la résistance (sélection, sanitation, transformation génétique) en Guadeloupe et

en Côte d'Ivoire (ou Burkina Faso) dans des sites pré-étudiés.

Jean DUBERN

53

TRAVAUX

Travaux réalisés dans le cadre du programme CEE n"TSD 2A-OI16-CI (CD), publiés, soumis àpublication, en préparation ct communications

1 - Boeglin M., G. Labonne, L. Degras, L. Qlliot-Douinc ct J.-B. Quiot. Mise en évidencede la présence du Virus de la Mosaïque de l'Igname sur Igname (Dioscorea rrifida) en Guyane.Caribbean Food Crop Society, Congrés juillel 1993, Martinique. (communication)

2 - Goudou-Urbino C., L. Degras et J.-B. Quiot. Epidemiological study of yam mosaic virus inGuadeloupe (FWI) to formulate disease-control strategies. Caribbean Food Crop Society, Congrésjuillet 1993, Martinique.(communication)

3 Goudou-Urbino C.~ G. Konate~ .L-B. Quiot~ L. Givord et J. Dubern. Etudeimmunologique du virus de la Mosaïque de l'Igname. First Seminar of Yam Nelwork in Africa, Oct.26-28.10.1993, Cotonou Bénin. (communicatioll)

4 • Goudou-Urbino C .. G. Konate~ J.-B. Quiot, L. Givord et J. Duberll. ImmunologicalStudies of Yam Mosaic Virus. Phytopalhology (en prépara/ioll)

5 - Goudou-Urbino, C., G. Konate, J.-B. Quiot et J. Dubern. DistribUilion géographique duvirus de la Mosaïque de l'lgname au Burkina Faso. Société d'Ecophysiologie, séance du 14 ami 1993.Ecole Normale Supérieur, rue d'Ulm. Paris France. (conullullicarioll).

6 - Goudou-Urbino C., G. Konate, J.-B. Quiot et J. Dubern. Geographical distribution andbiodiversity of yam mosaic virus. Tropical Science, (ell préparation.)

7 - Malaurie B., O. Pungu~ J. Dubern and J-c. ThouveneI. 1992. Determination of the bestconditions for the regeneratioll of microplants and the eliminalion of YMV from excised meristems ofyam nodal Cllltings (Dioscorea spp.). Association of Applied Biologists. Plant Virology in thel'ropics. University of York. 9-10 April 1992.

8 - Malaurie B.~ O. Pungu and J.-C. Thouvenel. Search for optimal factors in production ofrooted planllets from excised meristems and shoot tips of yam nodal cutlings (Disocorea spp).(soumis à publicarioll)

9 - Malaurie B., O. Pungu ~md M.-F. Trouslot. Meristem-tip culture from two clones of Dioscoreacayenensis-D. rotundara complex and D. praehellsilis. Influence of media on morphologicaI

development. (soumis à publication)

10 - Malaurie B., J.-C. Thouvenel and O. Pungu. Meristem-tip culture from two clones ofDioscorea cayenensis-D. rorundora complex and D. praehensilis. Influence of meristem-tip size andlocation 011 morphologicaI devclopmcnt. (soumis à publicatioll)

11 - Malaurie B., and J.-C. Thouvenel. Influence de la température ct d'un agent antiviral (Virazole),sur l'obtention de plantes indemnes de virus de la Mosaïque l'Igname (YMV) il partir de microbouturesnodales virosées de D. praehensilis. (en préparation)

12 - Malaurie B., J. Dubern and J.-C. Thouvencl. Influence de la température ct de lachimiothérapie, associées ou non, sur J'obtention de plalltes indemnes de virus de la Mosaïque del'Igname (YMV), à partir de méristèmes isolés de deux clones virosés de D. praehellsilis cl ducomplexe D. cayellellsis-D. rOlUl/data cv. Kouba. (en prépararrioll)

13 - Malaul'ie, B., O. Pungu, R. Dumont and M.-F. Trollslot. 1993. The creation of an invitro germplasm collection of yam (Dioscorea spp.) for the genetic rcsources preservation. Euphytica.65: 113-122.

14 - Thouvenel J.-C. et B. Malaurie. L'utilisation de la technique ELISA pour le contrôle de l'étatphytosanitaire d'une collection de microbouturcs d'Igname (Dioscorea spp.} maintenues in vitro (ellpréparaJÎolI).

54

ANNEXES

CEE TSD 2A- 0116-CI (CD)

1 - Rapport financier

2 - Publications et communications

AMELIORATION ET VALORISATION DE L'IGNAME

*******************

Contrat n° TSD 2A-Ol16-CI (CD)

************

RELEVE DES DEPENSES POUR LA PERIODE

DU 01.07.92 AU 31.08.93

RECAPITULATIF

(francs français)

PERSONNEL (dont frais d'allocation 94 000*) 1 328 000

DEPLACEMENTS * 4 150

UTILISATION DE MATERIEL DURABLE 122 500

MATERIEL NON-DURABLE * 146 898

FRAIS DE LABORATOIRE DE KAMBOINSE * 23 700

TOTAL ...................................................................... 1 625 248 FF

PARTICIPATION DE LA CEE (lignes marquées par *) 268 748 FF

(Deux cent soixante huit mille sept cent quarante huit france français)

Soit 33 % de 1 625 248 FF

L.P.R.C. CIRAD-ORSTOM

Montpellier le 20.12.1993

Jean DUBERN

RELEVE DES DEPENSES POUR LA PERIODE DU 01/07/1992 AU 31/08/93

Personnel

Nom Institut Localisation Catégorie Dw-é Coût(estimation)

J. DUBERN ORSTOM MOlltpellier Chercheur 12 mois 4340000

L. GIVORD ORSTOM Strasbourg Chercheur 2 mois 108000

B. MALAURIE ORSTOM Montpellier Cherchew' 14 mois 506000

J. ARIEl ORSTOM Montpellier Technicien 3 mois 78000

J.-B. QUIOT I.N.R.A. Montpellier Chercheur 2 mois 108000

C. GOUDOU-URBINO ORSTOM Montpellier/ Allocataire 14 mois 94000 *Ouagadougou

TOTAL 1 328 000 FF<

Les valeurs avancées SOIll des esLimalions ell foncLion des barèmes de l'Institut (note D.G. du 22.06.93)

* Seule cette allocaLion est effectivement comptabilisée dans les frais à la charge du Conu'at CEE

RELEVE DES DEPENSES POUR LA PERIODE DU 01/07/92 AU 31/08/93

DEPLACEMENTS

COMMANDE DESIGNATION DATE FOVRNISSEUR FACTVRE MONTANT CHERCHEUR

19928283 Angers 13/07/92 26/03/92 MERIDIONALE V. 37022 1 077,00 B. MALAURIE

19932345 Mission Burkina 03/02/93 2345 3600,00 C.GOUOOU-

URBINO2346 Mission Burkina 03/02/93 2346 550,00 C.GOVOOU-

URBINO

TOTAL 4 150,00 F F1

RELEVE DES DEPENSES POUR LA PERIODE DU 01/07/92 AU 31/08/93

Utilisation de Matériel Durable

Dénomination Valeur % AmOltissement % Utilisation Montant

Centrifugeuses 400 000 15 la 6 000

Serres / chambres 600 000 15 50 45 000climatiques

Microscope électro. 1 200 000 15 5 9 000

Appareils Labo 2500 000 25 10 62500

,TOTAL 122 500

RELEVE DES DEPENSES POUR LA PERIODE DU 01/07/1992 AU 31/08/93

Matériel Non Durable

COMMANDE DESIGNATION DA1E FOURNISSEUR FACTIJRE MONTANf CHERCHEUR

199223431 Photocopies 21/07/92 Tiroplan 07/1942 336A2 DUBERN23433 Photographies 30/07/92 Photov ision 1871 445,19 DUBER.N22870 Produits chimiques 18/08/92 Merck Laboratoires 38134319 4 505,00 MALAURIE24584' Abonnement 29/09/92 Europériodiqnes 019-431 5 697,46 MALAURIE24585 Abonncment 29/09/92 Lavoisier Abonllem. 21112478 2 485,25 tvlALAURlE24881 . Photopgraphies 29/10/92 Photov ision 2035 204,46 DVDERN24882 Matériel informatique 05/11/92 JWP Information Syst A901027 1 700,84 MALAURIE

FI01.04 Affranchissements 06/1 1/92 ORSrOM 17 118,21 DUBERN24886 Photographies 10/11/92 Photovisiotl 2023 526,30 DUBERN24887 Animaux 16/11/92 INRA Régiss Recètes 24/13606 255,92 DUBERN24888 Alimentation Lapins 16.11.92 UAR Usine Aliment. 211362 471,00 DUBERJ'I24889 Papèterie Lapins 16/11/92 IfFA CREDO 205870 410,96 DUBERN24890 Matériel Labo 17/11/92 Bioblock Scientific 31970 1 476,24 DUBERN

24891 Matériel Labo 17/11/92 OS! 200610 1 143,00 DUBERN24892 Produits Chimiques 23/11/92 Baeckeroot Labo 19139 1 075,40 DUBERN24992 Matériel Informatique 23/11/92 Sélection informaI. 238556 2 500,00 MALAURlE24897 Pièces centrifugeuse 26/11/92 Beckman Instruments 312895 981,00 DUBERN24997 Frais transport 26/11/92 Danzas S.A. 242932 2 047,35 MALAURlE24998 Matériel Labo 26/11/92 Labover 71793 553.35 MALAURIE24999 Produits chimiques 27/11/92 Sigma Chimie S.A. 355234 1 830,70 MALAURlE24899 Produits chimiques 30/11/92 Midi Sécurité 1153 605,00 DUBERN24900 Produits entretien 04/12/92 Beckman instruments 313422 2 824,00 DUBERN25226 Matériel Labo 11/12/92 Labo Tecnia 64594 1 500,00 DUBERN

1052-93 Frais Lransport 31/12/92 Chronopost 82842 193,13 DUBERN1993

23693 Produits serres 05/02/93 NlMAGRI 931392 84,00 MALAURlE25244 Matériel Labo 23/02/93 S.A. TECHALU J 93065 6 280,00 GIVORD26540 Ramettes papier 03/03/93 Laurans Henri 5510 199,50 MALAURlE23692 Produits serres 04/03/93 NIMAGRI 931391 2 852,40 MALAURlE

25223 Matériel Labo 04/03/93 OSI 227040/237080 10 429,80 MALAURIE/244441

26383 Matériel Labo 04/03/93 ELVETEC 53849/59332/ 8 349,00 MALAURIE62249/63788

26386 Produits Labo 04/03/93 OSI 227038/232512 3 523,00 MALAURIE25020 Produits chimiques 08/03/93 Sigma Chimie S.A. 376988 82,10

l1MALAURIE

25224 Matériel Labo 05/03/93 OSI 228392 3 689,911: MALAURIE

25225 Matériel Labo 05/03/93 ELYEl,EC 53394 254,001' MALAURlE

26387 Produits Labo 05/03/93 OSI 227039/233613 7 890,00 MALAURlE/257296

26388 Produits Labo 05/03/93 OSI 226545 103,00 MALAURlE

25018 Matériel centrifugeuse 08/03/93 Poly-Labo Bloek 979580 5 352,90 MALAURIE

25019 Produits chimiques 08/03/93 Baeckeroot Labo 20219 1 138,86 MALAURlE

26389 Transports 09/03/93 DANZAS S.A. 1003258 166,67 MALAURlE

26391 Produits labo 11/03/93 Baeckeroot 20295 2 642, 52 MALAURlE

26392 Matériel Labo 11/03/93 PRODIS 93/F13842 760,45 MALAURIE

27001 Bte Rang.Oplinett 16/03/93 Poly Labo Block 982350 1862,98 MALAURIE

Report 89 547,27

· RELEVE DES DEPENSES POUR LA PERIODE DU 01/07/1992 AU 31/08/93

Matériel Non Durable (suite)

COMMANDE DESIGNA110N DA'ΠFOURNISSEUR FACTIJRE MONTANT CHERCHEUR

report 89 547,27

27002 Produits Labo 9033 16/03/93 Merck Laboratoires 38187516 112,00 MALAURIE27003 Matériel Labo 17/03/93 Poly Labo Block 982305 1538,73 MALAURIE27004 Matériel Labp 17/03/93 BioRad 84122 577,00 MALAURIE27005 • Produits Labo 17/03/93 Siggma Chimie S.A. 379593 986,90 MALAURIE26393 Matériel Labo 18/03/93 Bioblock Scientific 57540 2 191,'14 MALAURIE26390 Matériel Labo 18/03/93 Poly-Labo Block 982232 390, i, 1 MALAURIE

27006 Produits Labo 22/03/93 Sigma Chimie S.A. 380296 1 133,20 MALAURlE27007 Mat. et Prod. Labo 22/03/93 De1villc José 93352 1 662,00 MALAURlE27008 Flat embedoling 22/03/93 Sté René Janning 18494.RJ 341,50 tvIALAURlE26540 Régulation Télécopies 23/03/93 Gaspard 245400 840,27 MALAURLE26541 Relect. Anglais Adv. 25103/93 Marsh David 77.93 1 015,00 MALAURIE26405 Feutre permanent 25103/93 METI-IORGA 92280 196,30 MALAURIE26394 Produits Labo 25103/93 Poly-Labo Block 985301 193,ï2 MALAURlE25021 Produits chimiques 26/03/93 Amersham France 892999 1 122,00 MALAURlE26544 Ramettes papier 29/03/93 Laurans Henri 5677 199,50 MALAURlE26545 Mat. divers 30103/93 Salery Ets 23096 1 309,88 MALAURIE

2084/93 Entretien lingerie 31/03/93 Régie Linge 303769 4449,08 MALAURlE26395 Tampon RF 69366044 31/03/93 EESSELTE MEfO 275036 201,30 MALAURIE26396 Feutre Mackie noir 31/03/93 WE..L 27898 288.00 MALAURlE26406 Travaux Photo 01/04/93 Photo Vision 2299 1947,88 DUBERN26407 Travaux Photo 0\.04.93 Photo Vision 2299/2323 2105,55 DUBERN26546 Fournitures Labo 01/04/93 Gaspard 350378 1 568,08 MALAURrE25023 Produits chimiques 02/04/93 Perkin Elmer IV/0033813 3 444,CO MALAURIE

26397 Etuve série E 28 L 02/04/93 A.MILABO 1260 3 673,00 MALAURlE27010 Matériel Labo 04/04/93 Bioblock Scientific 62475 387,00 MALAURlE27011 Produits Labo 04/04/93 Sigma Chimie S.A. 383872 700,00 MALAURlE

25024 Produits entretien 05/04/93 OSI 233078 379,44 MALAURIE

27012 Matériel Labo 07/04/93 OSI 234302/24368 1 100,40 MALAURIE

2080 Azote liquide 08/04/93 V.S.TL H813 1 764,00 MALAURIE

26408 Tirages photos 15/04/93 IPP-INSTAN PROD. en cours 540,00 MALAURlE

27015 Produits Labo 19/04/93 Castorama 766 402,82 MALAURIE

27017 Matériel Labo 20104/93 Bioblock Scientific 68808174954 873,52 MALAURIE

27476 Produits Labo 20104/93 Amersham France 896372 2 066,40 MALAURIE

26399 Produits Labo 22/04/93 l'RaDIS F15534 500,64 MALAURTE

26400 Fourniture Labo 22/04/93 OSI>' 237700/240756 2 511,25 MALAUR1E

27477 Fourniture Labo 22/04/93 Poly Labo Block 993691 3 529,94 MALAURlE

27479 Produits Labo 22/04/93 Amersham France 896399 2 50,00 MALAURTE

27527 Fournitures admin. 22/04/93 Bonnio1 Ets. 4198 320,86 MALAURIE

27526 Papier imprimante 23/04/93 Laurans Henri 5840 199,50 MALAURIE

27528 Dépan. annoire pos. 28/04/93 Hurthemel 93005 810,00 MALAURIE

27018 Produits Labo 29/04/93 Merck Laboratoires 38202454 642,20 tvlALAURlE

26409 Travaux plloto 06/05/93 Photo Vision en cours 52,00 MALAURIE

2104/93 Lampes Phytoreflect 12/05/93 C.N.R.S. ML.JO.93.006 8 250,00 MALAURIE

23697 Etagère Everiplan 19/05/93 Castorama 903 475,55 MALAURIE

23698 Transport d'Everiplan 19/05/93 Castorama 907 109,61 MALAURlE

TOTAL 146 898,64 FI'

TRAVAUX

Travaux réalisés dans le cadre du programme CEE nOTSD 2A-OI16-CI (CD), publiés, soumis àpublication. en préparation et communications

Bdeglin M., G. Labonne, L. Degras, L. Quiot-Douine et J.-B. Quiot. Mise en évidence de

la présence du Virus de la Mosaïque de l'Igname sur Igname (Dioscorea trifida) en

Guyane. Caribbean Food Crop Society, Congrés juillet 1993, Martinique.

(communication)

Goudou-Urbino c., L. Degras et J.-B. Quiot. Epidemiological study of yam mosaic virus in

Guadeloupe (FWI) to formulate disease-control strategies. Caribbean Food Crop

Society, Congrés juillet 1993, Martinique.(communication)

Goudou-Urbino C., G. Konate, J.-B. Quiot, L. Givord et J. Dubem. Etude

immunologique du virus de la Mosaïque de l'Igname. First Seminal' of Yam Network in

Africa, Oct. 26-28.10.1993, Cotonou Bénin. (communication)

Goudou-Urbino c., G. Konate, J.-B. Quiot, L. Givord et J. Dubem. Immunological

Studies of Yam Mosaic Virus. Phytopathology (en préparation)

GOlldou-Urbino c., G. Konate, J.-B. QlIiot et J. Dubem. Distribution géographique du

virus de la Mosaïque de l'Igname au Burkina Faso. Société d'Ecophysiologie, séance du

14 ami 1993, Ecole Normale Supérieur, rue d'Ulm, Par'is France. (communication).

Goudou-Urbino C., G. Konate, J.-B. Quiot et J. Dubern. Geographical distribution and

biodiversity of yam mosaic vi;us. Tropical Science, (en préparation.)

Malaurie B., O. Pungu, J. Dubem and J-C. Thouvenel. 1992. Determination of the best

conditions for the regeneration of microplants and the elimination of YMV from

excised meristems of yam nodal cuttings (Dioscorea spp.). Association of Applied

Biologists. Plant Virology in the Tropics. University of York. 9-10 April 1992.

Malaurie B., O. Pungu and J.-c. Thouvenel. Search for optimal factors in production of

rooted plantlets from excised meristems and shoot tips of yam nodal cuttings

(Disocorea spp). (soumis à publication)

Malaurie H., O. Pungu and M.-f. Trouslot. Meristem-tip culture from two clones of

Dioscorea cayenensis-D. rotundata complex and D. praehensilis. Influence of

media on morphological development. (soumis à publication)

Malaurie H., J.-C. Thouvenel and O. Pungu. Meristem-tip culture from two clones of

Dioscorea cayenensis-D. rotundata complex and D. praehensihs. Influence of

meristem-tip size and location on morphological development. (soumis à publication)

Malaurie H., and J.-c. Thouvenel. Influence de la température et d'un agent antiviral

(Yirazole), sur l'obtention de plantes indemnes de virus de la Mosaïque l'Igname

(YMY) à partir de microboutures nodales virosées de D. praehensilis. (en préparation)

Malaurie H., J. Dubern and J.-C. Thouvenel. Influence de la température et de la

chimiothérapie, associées ou non, sur l'obtention de plantes indemnes de virus de la

Mosaïque de l'Igname (YMV), à partir de méristèmes isolés de deux clones virosés de

D. praehensilis et du complexe D. cayenensis-D. rotundata cv. Kouba. (e fi

préparartion)

Malaurie, H., O. Pungu, R. Dumont and M.-f. Trouslot. 1993. The creatJon of an in vitro

germplasm collection of yam (Dioscorea spp.) for the genetic resources preservation.

Euphytica. 65: 113-122.

Thouvenel J.-C. et B. Malaurie. t'utilisation de la technique ELISA pour le contrôle de

l'état phytosanitaire d'une collection de microboutures d'Igname (Dioscorea spp.)

maintenues in vitro (en préparation).

E/lphylica 65: 113-122, 1993.CO 1993 Kl/llvu Academie Pllblisllers, Prinlet! in Ihe Nelherlands.

The creation of an in vitro germplasm collection of yam (Dioscorea spp.). for génetic resources preservation

B. Malnurie', O. Pungu2, R. Dumone & M·F. Trouslot4

1Laboratoire cles· Resso/lrces Géllétiq/les et d'Amélioratioll des Plalltes Tropicales - Celltre ORSTOM ­BP.5D45-F. 34032 - Montpellier Cedex l, France;] Laboratoire cie Biotechnologie IfR5DA, B? V 51, Al)ie/­jan 0/, Côte-d'fl,'oire;JCelltre Vivrier, Réseau 'plalltes cltllbcrcllles'IDESSAIIRAT, BP635, Bouaké Dl, Côte­d'/I:oire; i Laboratoire cie Biotechnologie - Centre ORSTOM - BP.5045 - F. 34032 - MOlltpellier Cedex J,France

RcccÎ\'cd 15 May 1992: ncccplcd 20 Novcmbcr 1992

Key lVorcls: active in vitro genebanks, Dioscorea spp., genetic resourccs preservation, in vitro gerrnplnsmcollection, in vitro tubcrization, yam

Summnry

A genetic reSOUrces preservation progralll Icd to an in vitro gcrmplasm collection of yarn (Dioscorea spp.),obtained by nodal cutting and maintnined under slow growth conditions \Vith «Knop, 1865) in George &.Shcrrington, 1984) modified medium. The collection comprises accessions of 14 species from Arrica and Asia,includingedible varieties from the hurnid intertropical areas, viz 10 wild species (D. abyssiniea, D. bl/lblfera, D.lmrkilliana, D. dlllJlctomlll, D.llirtiflora, D. mallgellotiant1, D. min/ltiflora, D. praehcmilis, D. sellimperalia, D.togoemis) ,5edible 'specics' (D. alala, D. bulvifera, D. caycnel/sis-D. rotul/dara complex, D. dllllletortll1l and D.escitlel/ra) and 1 interspccific hybrid (D. cayencnsis-D. rotune/ata complcx, cv. Kreng1cx D. praehcl/silis).Three factors that may influence the success in transfer from the ill vivo to the in vitro conditions have beenstudied. These are: the type of introducted material (nodal cutting fragments, seeds and exchanged micro­plants), the introduction date and the genotype. Some significnnt differences in sucecss \Vere due to the type ofintroduced material, whereas the introductiGn date had no effect. On the other hand, some species showcd agrenter success in the transfer from the in vivo to the in vitro conditions than others. The three tuberizationtypes (basal tuberization, aerial tuberization and 'boulagc' (tuberization without vegetative development)phenomena)), according to species, are discussed.

". Introduction

The genus Dioscorea comprises nearly 600 species(Knuth,1924; Coursey, 1967) distributed ail over thehurnid intertropical zone (Bailey, 1960). Ynrn do­mestication would have occurred independently inAsin, in Afriea and in America (Burkill, 1939; Che­valicr,1946; Alexander & Coursey, 1969). Toclay. 40to 50 spccics arc cultivated, or me collcctcd fromthe wild (Martin & Degras, 1978). In West Africa,

there are 5 cultivated spccies, D. alata L., D. caye­Ilellsis Lamk.-D. rolLtndala Poir. complex, D. escl/­lellta (Lour.) Burkill, D. dl1merort/111 (Knuth) Pax,D. bllllJifera L. Nevertheless, wild yams (D. prae­Itellsilis Benth., D. mangenotiana J. Miège, D. abys­sinica Hoehst. ex Kunth, D. hiriiflora Benth., D.mi-

" nlltiflora Engl.) can still forrn an important compo­nent of the human diet (Miègc,1952; Hamon, 1987).Part of the bio-diversity has bccn coltcctcd for thebreeding programs and is cu:;rently preserved in

114

field genebanks (Miège, 1952; Hamon, 1987). Sig­nificant risks of genelic erosion <Ife linked to Ihiskind of preservation. These risks <Ire In<linly due 10disease.s such as anthracnose and yam mosaic(Haque & Manlell, 1980; Toribio ct aL, 1980; Thou­vene! & Fallqllet, 1982; Nolteghem, 1985), nema­Iodes (Kermarrec el aL, 1980; Bridge, 1982), insecls(Sauphanor & Raln<ld<lss, 1985) <lnd rodenls. 1'0Ihese risks, are added high maintenance cosls, dueto a high labour requircment, 370 up 10 423 man­days per ha (Onwueme, 1982; Rankine & Ferguson,1974 sl<lled in Degras, 1986), necessary for mOllnd­m<lking, weeding ancl sl<lcking. The st<lcking, whichis the most expensive process, is an essential oper­ation due to the vcry high vegelative growth of thelian<ls, 111<It may re<lch 30m in Icnglh wilh more Ih<ln1000 !caves (Trouslot, 1985).

As recommended by lITA (IlTA <lnnual report,1981; Ng & Hahn, 1985; Ng & Ng, 1990) <lnd byIBPGR (Hanson, 1986), in vitro preservalion oflhese colleclions <lvoids Ihese problems. However,this process requires maximum surviv<ll rates, slowgrowlh 10 limit sub-culluring, <lnd should be <lppli­cable to <II! genotypes. In !leI' bibl:ogr<lphic reviewon yam collection preservation, I-filnson (1986)pointed out th<lt currently 100 few species arc main­lained under aseptic condilions <lnd that the longterm maintenance of Ihese cultures, without a lossoftheir geneticstability, is uncertain. Thercfore, shesuggested 10 sub-cullure Ihe clones every Iwo yearsand to use growth rel<lfdants as additives to the cul­ture medium. For example, O.2M of mannitol hasbeen used for the in vitro shoot tips of D. rOfl,mdata

(Henshaw, 1982).On Ihe Côte d'Ivoire, the use of in vitro preserva­

tion was considered as early on as 1985. In this pa­per, the diversily of materiaI introducecl inlo the invitro germplasm collection, and the problems en­counle'red are diseussed (the lalter include the de­gree of inoculation succcss, callus induction diffi­culties, 'boulage' <lnd tuberization).

In vitro preservation conditions

Basic conditions

The c1ifferent organs and/or group of organs used 10initiate the in vitro cultures belollg to 3 types: unin­oual cuttings rrom stem fragments (82,3°1<,), seedsl'rom collecting missions (13%) and in vitro plan­tlets [rol11 intcr-Înstitule exchanges of plant matcri­aIl (4.7%).

The stem fragments and seeds (Ife both sterilizedby soaking in 1% mercuric chloride solution(I-IgCl 2) [or 1103 minutes. Sterilization is achicvedin prescnce of an absorptive agent (Tween 20). Af­ter 4 to 5 washes with stcrilc water, Ihe nodal cut­tings mc inoculated inlo test tubes, filled with 10 1015 ml agar medium, in a laminar air !low cabinet.Test tubes (24111111 diametcr; 15cm high) arc c10sedby a polycarbon<lte cap and sC<licd with an exten­sible transparent fill11.

/11 vitro cultures arc maintained at a lemperaturcof 28° C± 2° C under a 16 h or 12 h per 24 hours pho­loperiod. Light flux of about 120~L E m-2.sec-1 is pro­vided by equal numbers of Groiux and Coolwhitefluorescent tubes. Each clone, represented by 14replicates, is sub-cullured every 6 to 12 months de­pending Ihe clone in question. Subculturing is car­ried out so as to maintain, for cach clone, a numbero[ physiologieal development stages.

The basal culture medium cOf:tains Knop's mod­ified mineraI nutricnts, Murashige's and Skoog's(1962) modified vitamins, 3% sucrose and 0.8%agar, 0.2% aelivated charcoal and 200mg.r' gluta­min (Table 1). This medium is used [or in vitro main­Icnanee under minimal growth conditions. This me­dium is adequate for the introduction o[ most of Iheclones (86%). For the di[fieult cases, a so-called 'in­troduction' medium was necessary. Herc, the acti­v<lted eharco<ll and glutamin arc replnced by a bal­ance of plant growth regulators NAA!I3AP (1 mg.l- I

1 ln addition to the plant materialtaken from the Cole d'Ivoirefield collections since 1985, some plant Illatcrial 'importations',for ill vitro introductions, have occurred oetween 1986 and 1990

'. \Vith the usual phytosanitary recornmencialions for foreign male­'rial received in the fonn of lubers: 1l3ra;~il (1987-89), Cameroun(1986-89--90), Guadeloupe (1986), New Calcdonia (1986-S9),Martinique <Jnd Polynesia (1988), Puerto Rico (1986)].

115

Obscrved valucs

Comparison Nodnl cUllings/5ccds

'1 nsurricicnl theorctical snl1lplc si?c «3).

4092

24678

5 for Ille Icvel 0.01 <p <0.02

1361

11/ vitro Nodal 5ccdsplanllcls 1 cUllings

df= 1

Introduction numhc.r% succcss

Factors influcncing SIlCCCSS

Table 2. InOucncc of the lype of malcrinl introducctl on inoc­ul:llion succcss

Threc factors may influence the success of the pas­sage from the ill vivo to the ascptic culture condi­tion: the type of explant material (uninodal cuttingof stem fragment, seeds and exchanged micro­plants), introduction date and the genotype.

In the first case, differences in success rates wasfound duc to the type of introduced material; seedsshow the highest rate ofsuccess (92%) which issig­nificantly different from uninodaJ cutting stem frag­ments (78%). Introduction in the form of in vitroplant!cts gave 61 % succcss, but populations \Veretoo smallto aJiow a statistical comparison (Table 2).

Next, the period over which plant materia! can beintroduced il/ vitro through nodal cuttings is de­pendent lIpon the yam cultiv8tion cycle for the tu­ber crop harvest, at the end of December to the be­ginning of January. The dorm<1ncy period, wllich isvery variable from one clone to another, forced in­oculations to be staggered jl1t~me, between Febrll­ary and July. Neverthelcss, it 'vas round th:lt intro­duction date has no effect 011 in vi/ra inoculationsucccss.

Lastly. the percentage of inoculation success va­ries [rom one species to an otller. D. aIn/a showedthe highest success level (84%) which differed sig­nificantly from the D. cnycnl!nsis-D. ra/III/data com­plex (59%). D. I!scIIlm/(( displayed 80% success, butinsufficient population sizes did not allo\V a statisti­cal comparison. With D. rogocnsis Knuth and D. dll-

low gro\\'lh

2GGC mcdium

M:lCrOnUlricnls mg'I" mM

Ca (1'103)2.41-120 1000 4.2(NI-I4) S04 250 1.9Mg504 250 1.07 H20 Km P04 250 1.8KCI 250 3.4

Micronulricnls mg·I" IIM

1-131303 1 16Mn 504, 1-120 0.7.'i5 4.5Zn 504, 71-120 1 3.5Cu 504. 51-120 0.Q3 0.1AICI3 0.03 0.2Ni Cl2, 61-120 0.03 w 0.1Fc 504, 71-120 2"/.S 100Na2 EDTA. 21-120 37.25 100

Organic compounds mg'I-' mM

Glycin 2 44.4MyoiqosilOI 100 550Nicoliriic acid 5 40.6Pyridoxin HCl 0.5 2.5Thiamin HCL' 0.5 1.5

13iolin 0.05 0.2Folic ncid 0.5 1.1Glulnmin 200 1370

Suc rose (g'\-') 30

AClivntcd charcoal (g'I") 2

7i/ble J. low growlh mcdium composition

and 0.2mg.I-', respectively). After induction, thedifficult dones are sub-cultured onto the basal cul­ture medium. A certain number of studies rder tothe)n vi/ra micropropagation ofyam nodal cuttingsand/or to tuberization phenomcnon observations,with or without growth regulators (Uduebo, 1971;Mantell et al., 1978; Amolin, 1980; Cortes Monlloret al.. 1982; Forsyth & Van Staden, 1982; Espiand,1983; Ammirato, 1984; Forsyth & Van Staden, 1984;Fautret et al., 1985; Lacointe & Zinsou, 1937; Ng,1988; DaIouman, 1989; Mantell & Hugo, 1989, Jean& Cappadocia, 1991). .

116

melomm, with a smaller population size, the rate ofsuccess was respectively 7 of the 10 ônd 2 of the 3introduced clones (1~1blc 3). 1'0 sum up, only oneattempt at inoculation was required for 244 clonesof the 299 introduced. However, s'ol11e of the clonesrequired 2 to 3 attempts at inoculation over severalycars, bcfore they could be maintained in vicro bysub-culture. In ôddition, after 5 years of in vitro mi­cropropagation, the clones of D. alnia displayed asignificant difference in their in vilro survival (84 %)compared to clones of the D. cnyenensis-D. rOfWl­

dnra complex (71 %) (Table 3). These latter were al­so more slow to adapt to in vi/ra culture conditions:nodal culling bud(s) were often choked by the pro­liferation and bursting of tissues. Their initiation re­quired callus induclion, followed by sub-culturingonto the maintenance medium.

Tubcrization

Types of luberiZOlion

ln vilro tuberization was observed l'or 9 species outof a total of 14 introduced into the in vilro germ­plasm collection and also for the interspecific hy­brids (Malaurie & Tardieu, 1988). This occurs, de­pending on the clones, between 2 <lnd 12 months,<lfter il sub-culture. Three types o[ tuberiz<ltionwere observed:- basal tuberization or [ornl(ltiofJ, al the lcvel o[

the original nod<ll bud,of a tuber or a microtuberin the agar medium. This phenomenon \Vas ob­served in 9 spccies and the 12 interspecific hybridclones (Fig. 1);

- acrial tuberiziltion or aerial m\croluber(s) for­mation on the vegetative part, at the Icvel of theaxillary buds (next to the leaf axil). This secondtype of tuberization was observed for ail butthrce (D. hirriflora, D. I1Inl1gClloiù!JW and D.schil11pernlltl Hochsl. ex Kunth) of the species

Table 3. Number oC clones. by species. cnpnble or not 10 be inlrOlJlIced nmJ mnintnincd il/ vi/ra

Species Toini number of clones fntroduclioninlrodueed

Clone introduclionsuceess'

Mninlennnc~

Number of clonesmninlnincd il/ vi/ro"

D. (lIma

D. b/llbifernD. carel/el/sis-D. rOlllllda/a complexD. esc/llel//aD. IIlllllgeno/ial/aD. /ogoe/lSistnlerspecifie hybridsD. nUllle/orlllll

D. !liT/if/oraD. prncllClIsi/isD. sc!linrpl.'rlIllo

109S

11710]4

1016

3131

Xl globaldf

17.77

1

4.114

1

'Specics not annlY7.cd by a Slnlistical eomparlson for ill vi/To introduction nnd nlninlCnnnce.lSpecies examined by statiSlienl compnrison."Values followed by differenl Icllcrs ;lre significilnlly differenl for 0.02 <p <0.05. nrtcr comparison Wilh lhc Xl Pcarson lesl.'Villues followed by differenllellers nre signifieanlly differenl ror p <0.001. arter eompnrison with lhe Xl Penrsflnlcsl.~Insllfficienllheorelical sample size «3).

117

which developed in vitro basal microtuber (Fig.1);tuberization resembling 'boulage' (Madec inCourduroux, 1967) which results in the forma­tion of a microtuber without dcvclopmcnt of aleafy stem. This third type of tubcrization wasobserved on a number of clones bclonging to 3species: D. n/lIta (la clones over 712

; D. bu/bifera(1 clone ovcr 8); D. cayenensis-D. rOllllzdatn com­plex (19 clones out of 1052

).

o 20 40 GO1 -.-,--.---(

60 100 120

TuberiZlIlioll abi/ily

The five specics most represented in the collection(D. aIMa, D. 1)({llnfera, D. caycncnsis-D. rOrlll1r!M{/compJex, D. JI1angclloriana, D. logocnsis and the in­tcrspecific bybrids) \Vere compared for their abilityto produce tubers under the dcscribcd tissue cul­ture conditions (Fig. 1).

2 The clones inlroduced inlo the in vitro germplJsm collection. in1990, \Vcre nOI laken inlO accounl.

Fig. 1. Percenlagc or lubcrizalion (basal mierolUber-I3MT andaerial microlUber-AMT) or 'spccies' \Vith al Icasl S introduc­lions. The olher species (D. tlllllietomll/: D. hirtifloro; D. pme­

hellsilis and D. schill/patlnn) \Vilh \css lhan ~ introductions havenol bcen considercd on lhis hislograll1.

For aerial microtubcr formation, a significant dif­ference al the 1% Jevel \Vas obsefved betwecn D.alaln (56% of clones \Vith aerialmicrotubcr forma­tion) and the D. cayenensis-D. ra/lint/ara complex,

Tnhle 4. Number or ciones per species \Vilh aerial and basa]microlUbers

,Species

D. nlntaD. blilbifernD. cnyeflensis·D. rOlllfldntn complexD. eSCIIlefltaD. IIInllgcflotinllnD. logOCllsis

Inlerspecific hybridsD. dlllIIelOTlIIIID. lIirtiflornD. prnellcflSilisD. sclzilllpernfln

Tuberizalion

Tolal observee! clones Clones wilh acrial Cloncs \Vith basalmicrOlubers) micrOlubcrs'

71 40<2 66i~

S 81 81.\

105 19""~ 55j~

3 0 014 0 141.5

7 32-' 72-'

14 7'fh1 142.<

2 2' 2'1 0 11

1 l' l'1 0 l'

X~ global 28.78 32.401dC 2 l

'Species nol considered by a slalislical comparison ror in vitro luberiz<llion.lSpccies nnalyzed by sialislicai compnrison.)Values Collowcd by dirrcrenllellers arc signiricarJlly dirrcrent ror p= 0.01, arlcr eomparison 2 by 2 \Vilh lhe Ryan test.'Values follo .....ed by dirrerenllellers are signiricanlly dirrerenl ror p <0.001, Mler cOl11p:lrison \Vith the Xl Pearson test.)lnsufCicienllheorclical sample size «3).

11S

Fig. 2. Org:lOiz~tion ~n<.l illlport~ncc of lheir contributions to (hecrc:llion of ~ Y~1ll (DioJeorcr: spp.) in dlro gerlllpl:lslll collectionby nodal cutling. Ccnargen/Embrapa.13razil; CS RS. Orstol1l ~lld

lirsd~ (Inslitut 11lIern~tioll~1 de Recherche Scientifique pour leOé-'eloppemenl en Afrique). Rese~rch Centre of A<.Iiopodou.Illé. Cüle d'Ivoire; rast, Abidj:lll. Cüte d'Ivoire; Inra·Guade·loupe: USDA. :vl~y~gue7.I11slitute ofTropic~1 Agriculture. Puer­to Rico.

y.,,, clof\u 'rom dlrflrfDl Ott.nltatloll(

Numbcr of ""ones

1

14

1

1

;;;;;J 2S

-~20

S

17

1

~3

181

,1

•1

Q'2:Ill

lb-- ,& 1000

Fig. 3. Coulllrics of origin of the pl~nt m~teri~1 ~nd imporlanceof lheir contribulion to the conslilution of ~ yam (Dioseormspp.) il/ "ilro, genelic~lIyuiversificd.gerl11pJ~sm collection m~ill­

I:lineu in Ihe form of llou~1 cuttings.

PoJyoosi.1

NcwCllI"-"

P~PU3 NaN Guinoa

PhifippinosIndoraosia

Ir&a

C3moroon

N""J'CN.

B6nin

TO(IJ

OuMI'\8 flUa

C6lO41~te

SiOft" looooGunoa

EAzl

M.:irtiniqoo

Guodcloupo

Puono Rico. Trinid.i1d..

100co60

USDA

O'lSTCM

IRAT

INRA

lIRSOA

IDESSA

FAST

CSRS

'3œw-cel

0 20 40

D. rogoensis and the interspecific hybrids (18 to50% of clones \Vith aerial l11icroluber formation)(Table 4).

for basai tuber formation, only D. a/Ma and theD. cayellensis-D.rorlindaw complex, with sufficientpopulation sizes, \Vere compared. A very high sig­nificant difference was found with a high basal tu­berization percentage for clones D. a/ara (93%)compared to the D. cayenensis-D. rorllndnra com­plex (52%) (Table 4). These two types of tuberiza­tion, basal and aerial, can develop on the sa me mi­croplant.

Basal and aerial microtubers allow potential byhigher suceess rates upon transfer to the field (Ng,1988).

d'Ivoire\ Gu"deloupe~,Martinique". New Caledo­nia" French Poiynesin S

, or from collecling missionsor from an in vitro collection based in Brazil6 (Fig.2). Sorne of the in-field collections, had been en­riched in the past, by the transfer of tradition,,1clones from diverse geographical areas (Degras,1986?, Thcrefore, the clones introduced in vi/ra in­to our collection, came from a range oflS differentgeogrnphicnl regions (fig, 3). However, the coun­trics from which the traditional clones came werenot neccssarily those from which the particular spe­cies originated or in which it was cultiva ted (Table 5,(1)). For example, for the Asian species D. a/ala,only 17% of clones came from the diversity ecnlresof South-east Asia, as opposed to 78% originatingfrom South America and the C"ribbean.

Gcncfic divcrsity of the ill vitro collection

Origins afrhe il1rrodllced mareria/

The plant material came from differentlive collec­tions maintained in the fjeld located in Côte-

) F~sl/Ens~. Faslll3ouaké, Idessa/Cirad-lralll3ouaké, Orslom/lirsdalAdiopodoU01é.• Inra/Pelit-l3ourg.S Cirad/lral.h Cenargen/Embrapa.7 The tr~nsferof eert~in clones of3 'species' (D. a/ma, D. esell/el/­la and the D. eayenensis.D. rOlHndala complcx) present in the'M.I.T.A.' collection (Mayaguc7. lnsli;ule of Tropical Agricul­ture (Puerto Rico)] in the Orslom collection h~d been perform­ed by Martin in 1974.

IntcrspCCIfic r/iversity of tlic introdllccd matcria!

The interspccific divcrsily of tlle in vitro germplilsmcollection is imporl'Wl. Alllong Ihe 20 species ofDioscorca in Tropic,lI Wcst Africil (Miège, 1968), 13\Vere introduced ill vitro germplilsm collection, 3 ofwhich were edible ilnd widely cultiviltcd (D. a/aftl,D. caycl/cl1sis-D. rotul/d({itt complex, D. esculcl/t({),2 included edible forms ilS well as taxie wild Vil ric­tics (D. b/l/bifcm, D. r!/lmctoIïlJl1), 8 were wilcl (D.abyssil/ica, D. bl/rkit/ial/a J. Miège, D. li irt/jlo ra. D.IIwngel1o/ial/a, D. mill{{tiflom, D. pmellensi/is, D.scliimpemna, D. togocnsis). Moreover, 1 inlcrspec­ific hybrid (D. caycncnsis-D. rotl/nd{7(a complex, cv.Krenglcx D. pmellCllsilis) \VilS Cllso introduced (Fig.4). These 14 'species' ilre illl ilnnuil!s except for D.burleillialla ilnd D. mil/I/tijlora which CIre perennialsilnd D. I1wlIgcnoti(/l/{/ which is h<1lf-percIlnial. Only7 wild West-Africiln specicss are not yet included inthe in vitro gennplaslll collection.

, /J. /('('(m/ii De Will!, D. /icbrccilisiol/fi De Wild, D. prclIsJ'Îi l'ax.

D. qllorlillill//{I 1\. Rich. D..l'fIgili!o/io Pax. D. slIIl.I'ih"rClIsis PilX

ilnù D. .l'IIli/,,6Jo/io De Wilù.

119

lntmspccific r/iversity of tllc il/tror/lIccr/ l/1{7(cri({1

To this interspecific divcrsily lllilY be added a greatintr,lspecific varialion. Two 'species' (D. ({/{7(a andD. caycl/cnsis-D. rotl/nr/I//a complcx) arc represcnt­cd by over 100 different ilcccssions. Four other spe­cics (D. CSC/l/CI1{(1, D. bllllJ/fcm, D. /IIangcnolù/I/({, D./Ogocl/sis) and the interspecific Ilybrid Iwve be­tween 8 ilnd 16 ilccessions eilch. The other specieswllich arc representcd by bet \Veen 1 ilnd 4 shoulc\ beenlarged by nCW introductions so :lS [0 enhililceintraspecific v<1riability.

An important pereentage of the field collectionsof Côte d'Ivoire have been introduced into the invitro colleclion. In <Iddition, 53% (95 introducedclones). 52% (66) and 81 % (57), rcspeetively, of thein-field collections of k!CSSil ilnd ['<1st, bilscd inBouaké, together \Vith those from Orstom/lirsda,based in Acliopocloumé, ilre represented.

Moreovcr the groups established wilhin D. (/10/(/

(N'z<1 group, purp!e f1esh (25 accessions); Bété Bétégroup, white llesh (28 ileeessîoIls); not presentlyidenlified (56 ilceessions)) Iwye ill vi/ro reprcsenta­tives. Those introduced [rom Ihe D. caycllcnsis-D.

Tllhlc 5. Dislribulion of the Înlroullceù cloncs accoruing 10 rcgion of origin

DA" DE' 013' OCR'

---(1) (2) (1 ) (2) (2) (2)

Zone ,.\ New C~ledoni3 10 JO 2 2

Pacifie

Zone Il' Cameroon 2 13

Nigeria 2 2

Zone 111.1 I3razil 13 IJ 4._----._-Caribbe~n 34 12 9 4

Total 60 Ji) 10 4 2R

(1) Towl clones presenl inlhe il/ vilro germplam collection of which Ihe importation origin dcpcnùs on forcig:! collceling missions anùimporlation field collection transfer.

(2) Recenlly inLroduceù clones in Ihe in vilra germplasm collection whieh didn't appear previously in field collection of Ihe Côte d'Ivoire

and whose initial origin diùn'l belong to Côte d'Ivoire.

"South-East I\sia.

'West anù Central Afric<l,

~South Amcrica anu the Caribbean islands.

'01\, D. 011/10; 013, D. /}/ItbiJera; DE. D. c,I'cutcI/IO; OCR. D. ("yel/cmis-D. rOII/I/t/oll/ complcx.

I(JIJO

120

l=~~~~[!I"------lIJll6tspoçi(1C h)'b'\1s

0. to~ns,l. 10

O.scNm~filM

O. dume\ot'urn wi!d 10("'$

O. bulbiletll wlId fOftft$

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D. minu~f:ot»

~Œœ;m_~I~O.mlll19C"'O'r,,,,. ~

D./lirtiltoq

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D.•>Won:. JO111

O. c;JytMn$ÏJ'IOIIJ~'JID?

D. ,lI~"

IQ I()()

h'umocr o( clones

Fig. 4. Different edible and wild cultivated species. and wi!d toxic

spccics introduced into the yam (Dioscorr.n spp.) in vitro gcrm­

plasm colleclion mainlained by nodal cutting.

rot//ndata complex (Hamon ct al., 1986) representthe majorily (lï groups or 85%) (Table 6).. On the other hand, tI signiricant proportion of the

in vitro gcrmplasm collection comes from the intro­duction by in vitro methods of new varieties to Côted'Ivoire (Table 5, (2)); their membership of the es­tablished groups within the two most represented'species' will be possible by enzYll1atic cllaracteriza­tion llsingstarch gel electrophoresis with the in vitrogermplasm (unpublished results) tlnd morpholog­ical and enzymatic characterization a[(er the il1 vit­ro-in vivo transfer.

III vitro preservtltion security

In order to provide betler protection for the plantmaterial, Hanson (1986) recommended that a num­ber of replicates, tlt kast 5, be kept for etlch clone. Inour case, wc have limited the in vitro collection to aminimum of 12 test tubes per clone. A replicate ofthe in vitro collection, \Vith 2 replicates pel' clone isstored in another tissue culture room, which in­crease the safety of the collection.

This author also sllggested at least 2 replicates foran in vitro collection be kept in different geograph­iCtll areas (IEPGR, 1985). Currcntly, the yam in vil­

ro nodal cutting germplasm collection exists in trip-

Iicate, of wllich two are in the same gcogrtlphicalsite (Iirsda and Fast, in Côte d'Ivoire). The thirdreplicate has been transferred to France to the Ge­netic Resources and Tropical Plant Breeding Lab­oratory (LRGAPT) of the Orstom centre in Mont­pellier. These transfers of in vitro malcrial are usu­ally not p<lrticularly sensitive, \vith (1 Joss below 5%.The latter resulted in a loss of 14% of the dllplicateclones.

Conclusions ::Incl perspectives

We have shown that an 'active in vitro genebank'(IBPGR, 1985) was feasible in a gcnetic resourcespreservation program witil a yam nodal microcut­tings under minimal growth conditions. Wc suc­ceeded in the introduction and maintenance by mi­cropropagation of other spccies by nodal cutting(D. vurki//iano, D. /1/angcnotiana, D. /1/inl/tiflortl, D.prachensilis, D. Scflilllpcrana tlnd D. IOgocnsis),which, to our knowledge, are not mentioncd in theIiterature. The range of in vitro recovery and main­tenance problems observed cOllld be due to themonocotyledonous material, as described by Hu­nault (1979). The establishment of the collection ina humid tropical area did not crcate any major tech­nical problems and its transfer to distant geograph­ical ZOnes lead to the ioss of 14% of the tottll acces­sions. This loss is explained by a transfer of somenodal cuttings recently inoculated in vitro withoutany shoot development of the axillary buds, most ofthem belong to the D. caycnensis-D. rotulldata COI11­plcx and did not develop any !cafysllool. However,sorne of the species showed a higher aptitude to in

vivo-in vitro transfer.fil vitro germplasm collections have the advan­

tage of providing a collection of preserved l11aterialtaking up little space, under phytosanittlry condi­tions, after virus indexing, and Cree from fungi andbacteria. This enables the lransfer of plant materialwithout quarantine problems (Hanson, 1986). Thepreservation of genetic resources requires the es­tablishment of a minimal collection or 'core collec­tion' (Frankel & Brown, 1984) to be crcated in or­der to maintain a high lcvel of genetic diversity\Vith in a restricted numbcr of inJividuals. In Côte

d'Ivoire, the lasl yams added to the field collections\Vere selccted according to these recoml11endations(Hamon et aL, 1986).

The rcduccd number of sub··culturing operationsduc by the lise of dilutc medium, and the lack ofplant growth regulators in the medium allo\Ys so­maclonal variation to be reduced "nd so preservematcrial conformity (Aml11ir"to, 1984; Ducreux claL, 1986). 1/1 vitro methods, such as in vitro micro­propagation by nodal cutting, basal microtuber, ae­rial microluber, somalic embryos permit an easytransfer of material from one point of the globe toanother (Ng, 1988). Moreover, artcr virus indexa­tion, the use of meristem tip cultures should "ssist inthe production of virus-free "nd other p"thogen­free microplants (Salcil ct ,,1., 1990).

ln the future the use of cryopreservation, frommeristems, zygotie or soma tic embryos, should cn­"bic the consitution "nd mainten"nce of' base in vit­ro genebanks' (IBPGR, 1985). This type of prescr­v<ltion should protect specific clonai stocks and ;ll­lo\\' the long term maintenance of a large gencticdiversity.

Acknowlcdgelllen ts

This \York \Vas c<lrried out in the L<lboratory of Bio­teehnology in the ORSTOM, aftcrwards IIRSOA,Adiopodoumé researeh station, ne<lr to Abidjan, inCôte d'Ivoire, and, was assisted by a EEC support[STD2, TS2A-0116-CI. (CD)]. The <luthors wou IdIike to thank Professor Bakary Tio-Touré, reetor ofthe university of Abidjan, as the manager of theyam research program, in Côte d'Ivoire; Dr. J-c.Thouvcnel for the phytosanitary contraIs of the in­troduced material; Dr. M. Noirot and Dr. S. Hamonfor their advice and comments; Dr. J. Beeching [oreorrecting the English.

References

Alex:lnder. J. & D.G. Coursey. 1969. The origin of Y:lm culliv:l­

tion. In: P.J. Ucko & G.W. Dimblchy (Eds.). The domeSlic:l­tion and the exploitation of plants :lnd nnilll:lTs. Duckworlh.

London, pp.405-425.

121

AlllmiralO. P.V.. 19X4. Y;UllS. In: P.v. Alllmirato ct :lI. (Eds.).

I-f:lndhook of l'I:lnl CcII Cullllre. Vol. 3. Crop Species. Mac­

millan. New York. pp. 327-354.

Arnolin. R.. 191-iO. Cullun: il/ l'i/ro cl ;ulléliorntion de l'ign.ullc(Dio.rcorclI L.). L'Igname. Séminaire Intcrnational. l'ointe-il­Pitre. INRA. pp.255-26X.

13:lilcy. L.H.. 1960. Manunl of cullivatcd planls. Revised edn.

M:lemill:ln. New York.

Bridge. J.. 19R2. NémnLodcs of Y;\fl1s. In: J. Mit:gc 8: S. Lyonga

(Eds.). Yams-Ignnmes. C1nrendon Prcss. O,':ford. pp. 253-2M_l3urkill. I.H .. \939. Notes on the gCl1US Dioscorell in the Belgi:ln

Congo. 13ul\. .l:Jrd. 130t. Etat. I3ruxelles 15: 345-392.

Chevalier. A., 1946. Nouvelles recherches sur les ignames eulti·

vées. Rev. Int. 1301. App\. Agrie. Trop. 26 (279-XO): 26-31.

Cortes Monllor. A .. L.J. Liu 8:.. E. Arroyo. 19~2. An improvedmedium for tissue cullure of yam Dioscon'II sp. ill vilro in

Puerlo Rico. Phytop:lthology 72 (1): 171.

Courduroux. J.C.. 1967. Elude du mécanisme physiologique de

};ltubérisalion chez le lopin:llllbour (Ik/ill/llhlls IlIheroslI.r L.).

Ann. Sc. N:lt. Bot. R: 215-356.Coursey. D.G .. 1967. Y;lms. Longmnns, London. 2:\0 pp.D;llollman. R.. 1939. Evolution des sucres solubles m:ljeurs cl

des nctivités invertnse :lciuc d:lns les différents organes ;lUcours de la eroissnnce des vilroplallls d'/gn:lme (Dioscorc(/

1I/lIlfI L.). Recherche d'lm modèle de tubéris:llion ill l'ilfO.

DEA. f":lelllté des Sciences ct Techniques, Abidjan. 75pp.Degrus, L.,19S6. L'ign;lme, Teehn:ques Agricoles Cl Produclions

Tropicales. Ed. G.P. Mnisonnclive cl L:lrose & Agence de

Coopération Culturelle el Techniquc. 409pp.

Ducreux, G .. L. Rossignol & M. Rossignol. 19S6. La pomme dc

terre. Ln Recherche 17174: 19:,-203.

Espi:lnd. H.,19S3. Conséquences de b cullure ill virro sur l:l mor·

phogenèse de boutures nodaics de l'ign:lme (DioscorcfI a/(l/a

L. cv ·T:lhiti'). Thèse 3i~m' cycle. Paris XI. Ors:lY. NU 3460. SOpp.

Fautret. A .. l'. Dublin 8: P. Ch:lgv<lrdicff, 19S5. Callogenèse cl

néoformation chez deux espèces d'ignames comestibles. Dios­

corea a/ata ct D. Iri/ida. Communication VII Symp. ISTRC,

GU;ldeloupe.

Forsyth. C. & J. V:ln Sladen, 1932. An improved melhod of ill

vilro prop:lg:ltion of Dioscorcft hll/bifera. PI:lnt CcII Tiss. Org.

Cult. 1 (4): 275-·281.Forsyth. C. & J. Van SL:lden.1984. Tubcrization of Dioscorca bllt·

bitera stem nodes in culture. J. Plnnl Physiol. 115: 79-83.

Frankel. O.H. & A.B.D. nrown. !9S4. Currenl Piani Genelie Re­

sources. A erilical :lppraisal. In: Chopra. Joshi. Sharma & l3:ln·

sai (Eds.) Genelics News Fronticrs. vol. IV. 3-13.George, E.F. & P.D. Sherrington, 1984. Tissue Cullurc Media. In:

Plant Prop;lg:ltion by Tissue Culture. Handbook and Directo­

l'y of Commercial L:lboralorics. Exegetics Limited, Char. 6:

252-233.I-I:lmon. P.• S. Hamon & 13. Touré. 1986. Les ignames cultivées du

complexe Dioscorca Cflyellcnsis-rol/llltlata de Côte d'Ivoire.

Inventaire ct description des 'cultiv:lrs' tr:ldilionnels. F:lculté

des Sciences ct Techniques. Abidj:ln, R.C.J.·lntern:llion:l)

l3o:lrd for Plant Genetic Rcsourees, Rome. Ilaly. AGPG:

I13PG R/861153.

122

Hamon. P.. 1987. Structure. origine génétique des ignames eulti·vées du complexe Dioscorca cnYCllellSis·rotllllt!1I1a et domes·tication des ignames en Afrique de l'Ouesl. Th~se Univ. Paris

XI. Centre d·Orsay. 247pp.

I-fanson.1.. 1986. Methods of storing tropical rool crop germ­plasm with special rcference to yanl. FAO/IBPGR Plant Ge·nel. Resourees Newsls 64: 24-32.

I-Iaque. S.O. &. S.H. Mantell. 191'0. Slalus or the virus diseases of

yam (Dioscoren sp.) in the Cornmon Wealth Caribbean. In:

L·lgname. séminaire internalional. Poinle·:I·Pilre. L·INRA.Paris. pp. lOI-lOS.

l-lenshaw. G.G" 1%2. Tissue cullure Illethods and gerll1plasm

storage. In: A. Fujiwara (Ed.). l'iant Tissue Cullure. M,uuzen.

Tokyo. pp.7f,'J-792.

Hunault. G .. 1979. Recherche sur le comportement des frag.ments d'organes ct des tissus de Monocolylédones cultivées ill

vitl'O. III. Etude de cas de plusieurs Liliacées. Rev. Cylol. [lioi.

Veg. Bol. 2: 103-154.

II3PGR. 1%5. [II vitro advisory commiuee. Rcport of subeom·

millee on design. planting and operation of ill vitro Gene·banks. Internalional Board ror Plant Genetic Resourees.

Rome.

lITA. 1981. Annual report for 19:;0. lITA. Ibadan, Nigeria.

JC<IIl. M. & M. Cappadocia. 1991. [lIl'itro tuberization in Diosco·rea II/ilia L. '[lrazo fuene' and 'Florido' and D. lIiJyssillicaBoch. PianI CciI. ·lïss. Org. CU!1. 26: 147-152.

Kermarrec. A.. L. Degras & A. Anais. 1980. Le nématode de l'ig­

name SClltc![ollelll{/ brat!)'s dans la caraille: distribution Cl qua·

rantaine inlernationale. In: L'igname. séminaire international.

Pointe':I·Pitre, lès colloques de l'Inra. Paris. pp.7S-R4.

Knuth, R" 1924. DioscorCllccac. A. Englèr. D,IS l'f1anzenreich.IV·43. H7. /-Ieft. 1-397.

Laeointe. A. &. U. Zinsou. 1987. Croissance ct développement auchamp de l'igname (Dioscorea II/ara L.) à partir de plants pro·duits par culture ill vitro. Agronomie 7: 331-338.

M..lIaurie. I3. &. F. Tardieu. 1985.lmproving yam (Dioscorca spp.).

using I3iotechnology. 3) Comparitive study of growlh and in\'itro tuberization from different cullivars belonging to an im·

portant ill vitro germplasm. VIII' Intern. Soc. Trop. RootCrops Symp.. [langkok. Thailand. Abstraets book. pp.5I.

Mantell. S.H. & S.A. Hugo. 1989. Effect of photoperiod. mineraimcdium strength. inorganie ammonium. sucrose and eytoki·nin on rool. shoot and microlUber development in shoot cul­

tures of Dioscorcaillora L. and D.lm/bifcT(1 L. yams. Plant Cell

TIss. Org. Cult. 16: 23-37.

Mantell~.S.H.. S.O. Haque & AP. Whitehall. 1978. Clonai mul·tiplication of Dioscorea a/a[a L. and Dioscorea rO[/ln(/ata Poir.

yams by tissue culture. J. Hort. Sci. 53 (2): 95-98.

Martin. F. W. & L. Degras. 1978. Tropical yams and their poten­

tial. Part 6. Minor cultivated Dioscorea species. USDA agri­

cultural handbook n" 538. 23pp.

Miège, J.,1952. Contribution ~ l'étude syst':l11alique des Diosco·

rca Ouest africains. 1l1èse. P,uis. 266pp.

Miège,J .. I968. Dioscoreaeeae.ln: Flora of West Tropical Arriea.

Hutehinson. Dalziel.l-Iepper. Crown Age'!t London. 3, Part 1.191. pp.144-154.

Murashige. T. &. F. Skoog. 1962. A rcviseu medium ror r,lpid

growlh and llioassays with tobacco tissue cultures. Physiol.

Plant. 15: 473-497.Ng. S.Y. &. S.K. Hahn. 1985. Application ofti:;sue culture to tuber

erops at liTA. In: Biolechnology in international research. 1R·RI. Manila. pp.29-38.

Ng, S. V.c. & N.O. Ng. 1990. Redueed growlh storage or ge1"m­

plasm. 1n: J.H. Dodds.TIssue culture ror conservalion of plant

genetie resourses. Crool1l Helm Lld.. Kent. UK.Ng. S.Y.c.. 1988. [II vitro conservation and distribution of root

and luber crop gerl11pl:lslll.ln: N.O. Ng. P. Perrino. F. Allere &.

H. Zedan (Eds.). Crop Genetic Resources of Africa. Vol. Il.(2.3). pp. 95-106.

NOlleghem ..:.L..1985. RésultaIS d'essais de 1Utle contre le f1élris­

sement de l'igname 1%2-1984. Rapporl. analytique de syn·

th~se. Centre Vivrier. Institut des Savanes. I3ouaké. Côte d·I·

voire.40pp.

On",ueme. I.C.. 1982. A slrategy package for reducing the highlabour rcquirel11ents in yam production. In: J. Miège &. S.N.Longa (r:ds.). Vams, ignames. Clarendon Press, Oxford.

pp.335-344.

Rankine, L.B. & T.U. Ferguson.1974. l'am production in Jamai­

ca. 111: L. Degras (1986). L'ign:lme. Technique Agricoles ct

Productions Tropicales. Edit. Gy. Maisonneuve cl Larose &.

Agence de Coopération Culturelle Cl Technique.

Ryan. T.A .. J960. Signilïeance tests for multiple comparison of

proportions. vuiances and olher slatistÎc;s. Psychologieal bul­

lelin. 57: 318-328.

Saleil. v.. L. Degras &. R. Jonard. 19<)0. Ob',ention de plantes in­

demnes du virus de la mosaïque de l'ign:lme (VMV) par cul­ture ill vitro des apex ehczl'igname amédeaine Dioscoren triJi­cla L. Agronomie 10: 605-6IS.

Sauphanor. n. & A. Ibtnadass. 1985. Aspects enlomologiquesliés à la conservation des ignames. L'Agronomie Iropicale 40

(3): 261-270.

Thouvenel. J.c. & C. Fauquet. 1%2. Les viroses de J'igname enCôte d·Ivoire.ln: J. Miège & S. Lyonga (Eds.). Yams·lgnames.Cl:lrendon Press. Oxford. pp. 24S-252.

Toribio. A., S. Edwige & G. Jacqua.1980. Pathologie des ignamesen Guadeloupe. In: L'igname aujourd'hui et demain.

CRAAG. INRA. pp.40-45.

Trouslot. M.E. 1985. Analyse de la croiss:lnce ct morphogcn~se

de l'igname Dioscorl'I/ complexe D. cI/J'I'I/l'n.ris-D. mtll/li/l/lIl.Editions de l'Orstom. Colleclion Trav:lux Cl Documents n"

IR5.370pp.Uduebo. E.E.. 1971. Effect of external s~lpply of growth sub­

slanees on axilJary proliferation and del'elopmcnt in Diosco­rca bulbifefll. Ann. I30t. 35: 159-163.

EuphytU;a GG: 243, J993.© 1993 Kluwcr Aau1l:mic Publishas. Princcd ÏrI cl~ Nec1~rlands.

Corrigendum

The creation of an in vitro germplasm collection of yam (Dioscorea spp.) for

genetic resources preservation

B. Malaurie1• O. Pungu2, R. Dumont) and M-F. Trouslot4

1Laboracoire au Rt:Ssourca Cinltiqua d d'Amllioracion du Planca Trol'icala - Centre ORSTOM - lJP:.5045-F.34032 _MonlpeUier Cedex l, Fran.ce: ~boracoire de Bwcec1ulOlogie IIRSDA. BP V 5/, Abidjan al, Côce-d'/voire: Jûn.cre. Vivrier,Rlscau 'planccs à cubercuLes' IbESSNIRAT. BP 635, Bouaké 0/, Côce-d'Ivoire: 41.Aborocoirc de Biolcchnoiagie - ûnt~'

ORSTOM - BP:.5045-F.34032 - Montpellier Ceda J, France

EuphycU;a GS: 113-122. 1993.@1993 Kluwcr Acadanic Publishus. PrÙ11ed in clu: Nechcrlands.

Owing ta an errar in the proof-reading process Table 6 of L!'jis article has bee.n omitted. The, Table ispresented below.

TABLE 6Listing of the differcnt groupsinside (he west-African D.cayenensis-D. rocuru!nCa com­plex observed in (he yam invicro germplasm collection.

Groupsl Inlfoductions

Afoubessou 0

B:miakp:l 2

Coco:lS.~ié 2

Frou 3

Gnan 1

K:lngb:l 8

Kpokpokpo 6

Kponan 2

Kr":lIldoufou 0

Krenglé 1J

Kroulcroupa 1

Lokpa 4

Nandokah:l 1

S:lmm:lncou 0

'Sopéré

SOU~SOll

Vivan

Warag:l

Yaob:ldou

7..cél.roll

Not prc..<enlly

idenlified

1

1

2

'1

67Toul 117

1 the prc..<cnl diffcrenl group<

h:lvc becn de<cribed in

H:lmon cl al., (!9R6).

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Articles soumIS à publication

MALAURIE B., O. PUNGU and J.-C. THOUVENEL. Search for optimal factorsin production of rooted plantlets from excised meristems and shoot tips of yam nodalcuttings (Disocorea spp).

Summary : Eight clones belonging to 5 species of Dioscorea spp., coming from an invitro gem1plasm collection, in the form of cuttings (Malaurie et al., 1993), \Vere used formeristem and shoot tips assays. Five of these clones, after an usual phytosanitary controlby ELISA technique, before the meristem and shoot tips excision, were consideredinfected by the Yam Mosaic Virus (YMV). In order to determine the optimal growthmedia, several culture media were studied : rands phytohormonal balances andcombinations of growth regulators NAA (0.5 to 1.5 mg.l- 1) and BA (0.1 to 0.3 mg.l- 1).The basal medium was a Knop modified medium (Malaurie et al., 1993), with, as culturesupport, 0.8 % agar and/or 0.4 % agarose. Four excised meristem and shoot tips sizewere used : from 0.3 mm to 5 mm. For the excision meristem localisation, 4 levels wereconsidered : from the apex to the base of the microplants. The meristems \Vere culturedinto two vessel conditions : Petri dishes and test tubes. Medium effect, vesselconditionning system, meristem localisation and clones effects were observed under themeristem viability and their good development into microplants. Reoeneration intomicroplants from excised meristems and shoot tips have been realis:d on the eiohtsrudied clones. .::.

MALAURIE B., O. PUNGU and M.-F. TROUSLOT. Meristem-tip culture fromtwo clones of Dioscorea cayenensis-D. rotundata complex and D. praehensilis. Influence ofmedia on morphological development.

Summary : Two clones, from the D. cayenensis-D. rotundata complex and D.praehensilis species, coming from an in vitro germplasm collection (Malaurie et aL,1993a), were used for meristem-tips assays. These two clones, after phytosanitarycontrol by ELISA technique, before meristem-tips excision (Thouvenel & Malaurie,unpublished results), were considered infected by the Yam Mosaic Virus (YMV). Randsphytohonnonal balances and combinations of growth regulators NAA (0.5 to 1.5 mg.l­1), BAP (0.1 to 0.3 mg.l- 1) and GA3 (0 to 0.1 JlM.l-1) were used. The basal mediumwas a Knop's modified medium (Malaurie et al., 1993a), with, as culture support, 0.8 %agar and/or 0.4 % agarose. Meristem-tips of 0.5 tO 1 mm were used. Test tubes (24 mmdiameter; 15 cm high), filled with 25 ml of a double agar/agarose bed, were used for themeristem-tips culture. The impact of growth regulators on the meristem-tips viability andon their morphological development were studied up to 3, 8 and Il months. Differenceswere observed between clones on their responses to NAAfBAP and GA3 treatments.Regeneration into microplants from excised melistems tips have been realised on the twOsrudied clones.

Articles soumis à publication

MALAURIE B., J.-C. THOUVENEL and O. PUNGU. Meristem-tip culture fromtwo clones of Dioscorea cayenensis-D. rotundata complex and D. praehensilis. Influence ofmeristem-tip size and location on morphological development.

Surnmary : Two clones, from the D. cayenensis-D. rotundata complexand D.praehensilis species, coming from an in vitro germplasm collection, under nodal cuttings(Malaurie et al., 1993a), were used for meristem-tips assays. These two clones, afrerphytosanirary control by ELISA technique, before meristem-tips excision (Thouvenel &Malaurie, unpublished results), \Vere considered infected by the Yam Mosaic Virus(YMV). The basal medium \Vas a Knop modified medium (Malaurie et aL, 1993a) withthe addition of the two growth regulators NAA (1 mg.l- 1), BAP (0.2 mg.l- 1), and with,as culture support, 0.8 % agar and/or 0.4 % agarose. Two excised merisrem-tips size(0.3 mm < t ::; 0.5 mm; 0.5 mm < t < 1 mm) and two excised merisrem-tips (0.3 mm < t::; 0.5 mm) excision level, from apical or lateral buds, were used. Test tubes (24 mmdiameter; 15 cm high), filled with 25 ml of a double agar/agarose bed, were used for themeristem-tips culture. The impact of level and size excision on the meristems viability andon their morphological development were studied up to 3, 8 and 11 months. Regenerationinto microplants from excised merisrems tips have been realised on the two studiedclones.

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Articles en préparation

MALAURIEB.,aild J.-C. THüUVENEL. Influence de la température "et d'un agentantiviral (Virazole); sur l'obtentio.nde plantes indemnes de' virus de la Mosaïque l'Igname(YMV) à partir de microbo~ture~n()dales vir?sées de D. praehensilis. ,

. Résumé: pes miCroboutures nodales de h. p~aehensilis (EA08), virosées par la.. présence du virus de la mosaïque de l'ignarne, ont été utilisées'dans un e.ssaide sanitation

par chimie 'et/ou thermothérapie. Deux lots de n?icroboutures ont été considérées: 1) desmicroboutures virosées, mais issues de' culture de méristèmes; 2) des microbouturesvirosées mairùemies normal~menfpar subcultures. Les microboutures issus de ces deux.lots, cultivées sur le milieu de culture modifié de Knop (Malaurie et al., 1993), avec 0.8% d'agar, on~t été confrontées à une combinaison ge deux traitements tbenniqUes (27 0 Cet 37 0 C) et chirniothérapique à l'aide d'un agent antiviral; Ribavirin ou' Virazole,nucléoside (l-B-D-Ribofuranosyl-l ,2,4,-triazole-3-carboxamide), pendant 6~ jours.Trois concentrations en Ribavirin ont été utilisées (10, 20' et 50 mg. 1- 1). La lecture des

,. résultat a été ré<\lisée 120 jours après le début de l'essai. ,

MALA URIE B., J. DUBERN and J.-C. THüUVENEL. Influence de latempérature et de la chimiothérapie, associées ou non, sur l'obt~ntion de plantes indemnes devirus de la Mosaïque de l'Igname (YMV), à partir de méristèmes isolés de deux clonesvirosés de D. praehensili~ et du complexe D. cayenensis-D. rorundara CY. Kouba.

Résumé: Deux clones· appartenant au complexe D. cayenensis-D. rolUndata et àl'espèce D. 'praehensilis ont été utilisés dans un essai de sanitation par culture <;leméristèmes. Les méristèmes ont été maintenus pendant 25 jours à 27 oC, afin de leurassurer une meilleure reprise avant de leur faire subir le traitement de thermothèrapie. Lesméristèmes excisés ont été confrontés à une combinaison de deux traitements thermiques(27 ° Cet 37 ° C) et chimiothérapique à l'aide d'un- agent antiviral, Ri-.bavirin ou Virazole(l-I3-D-Ribofuranosyl-l ,2,4,-triazole-3-carboxamide). Les méristèmes isolés, de 0.3 à0.4 mm, ont été dépo~és surIe milieu de culture modifié de Knop (Malaurie et al., 1993)additioné de régulateur de croissance NAA (l mgJ-l) et BAP (0.2 mg.l- 1), contenant ounon 20 mg/l de Ribavirin, avec 0.4 % d'Ag,arose.Le traitement thennothérapique s'estmaintenu·pendant une période de 63 jours. A la fin de ce traitem'entles cuIturesont étéreplacées à 27 oC, La lècture des résultats a été réalisée 90 jours et le contrôle de la.présence du YMV, 120 jours-après le début de l'essai:' ' , ,

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