Northern Blot Fix

8/17/2019 Northern Blot Fix

1/22


2/22


3/22

Northern Blot adalah suatu teknik untukmendapatkan informasi mengenai identitas,ukuran dan kelimpahan RNA.

secara umum teknik ini mirip denganSouthern Blot

Yang membedakan adalah sampel yang

digunakan, yaitu RNA.

Pengertian


4/22

Tujuan


5/22

eknik ini digunakan untuk melihatekspresi !transkripsi" suatu mRNA

!gen" pada organ atau #aringantertentu, seperti daun, bunga, bi#i,batang, dan lain sebagainya.


6/22

Prinsip Dasar


7/22


8/22

Tata Pelaksanaan


9/22

Isolasi RNA (total atau poli (A) RNA)

Generasi Probe

Denaturasi an elektro!oresis gel agarosa

Trans!er ke support soli an i"obilisasiPre#$brii%ation an #ibriisasi engan

probe

Pen&u&ian

DeteksiPengupasan an reprobing (opsional)


10/22


11/22

Isolasi RNA

%apat dilakukan dengan cara:

&isis membran Seluler

$enghambatan akti'itas ribonuklease

%eproteinasiReco'ery intact RNA


12/22

Isolasi Poli (A)dalam beberapa kasus, langkah terpisah untuk

isolasi mRNA dari RNA total dapat dimasukkandengan poly !A" selection, hal ini meningkatkansensiti'itas.

(solasi mRNA dari total RNA menggunakan poli)Aprosedur seleksi *, yang melibatkan kolom oligo),atau beads primed oligo), untuk mengikat ekorpoli)A * mRNA.

RNA diekstraksi spesies, apakah RNA total ataupoli)A * yang dipilih, kemudian dipisahkan

berdasarkan ukuran molekul dengan elektroforesisagarosa)gel


13/22


14/22

Denaturasi enganelektro!oresis agaros

0ormaldehida biasa digunakan secaratradisional sebagai denaturan, meskipunsistem glyo+al memiliki beberapa

keunggulan dibandingkan formaldehida.


15/22

Trans!er ke support soli ani"obilisasi

RNA ditransfer ke membran nilon bermuatan positif dan

kemudian bergerak selama hibridisasi berikutnya.

etode berteknologi rendah terbaik untuk transfer agarosaadalah dengan elusi, pasif sedikit basa, ke ba1ah.

$rosedur ini, dibandingkan dengan mentransfer ke atas, #auh lebih cepat dan karena itu menghasilkan band)bandlebih ketat dan sinyal yang lebih. Atau, cara transfer yangtersedia secara komersial aktif !electroblotter, semidryelectroblotter, 'akum tinta, tinta tekanan, dll" dapatdigunakan.

Setelah RNA ditransfer, membran harus segera disiapkanuntuk 2rosslink RNA. 3al ini dapat dilakukan oleh sinarultra'iolet !metode yang disukai" atau dengan dipanggang.


16/22

Pre#$briisasi an Hibriisasiengan Probe

$rehybridisasi atau memblokir, diperlukansebelum menyelidiki hibridisasi untukmencegah probe dari lapisan

membran. Blocking yang baik diperlukanuntuk meminimalkan masalah background.


17/22

Hibriisasi Probes3ibridisasi asam nukleat mensyaratkan bah1a probe ini

melengkapi semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target.

Secara umum, ukuran minimum untuk probe untuk memastikanspesi4sitas adalah sekitar dua puluh lima basa,memberikan bah1a ada kecocokan lengkap antara urutan probe

dan urutan dari mRNA target,Ada dua bentuk utama probe hibridisasi, pendekatan tradisional

yang menggunakan %NA komplementer !c%NA". Atau, anti)senseoligonukleotida !umumnya56)76 basa" dapat dirancang dari data urutan dan disintesis.

8ligonukleotida, seperti c%NA, adalah molekul %NA yang tetapi9riboprobes9 basa RNA nya dapat digunakan.

Riboprobes dapat meningkatkan sensiti'itas dibandingkan denganprobe %NA, tetapi mereka kurang stabil dalam arti men#adi subyekdengan kerusakan oleh RNases.


18/22

Pen&u&ianSetelah hibridisasi, unhibridisasi probe

dihilangkan dengan mencuci denganbuer. encuci strigensi rendah !misalnya,dengan ;- SS2 atau SS$


19/22

Deteksi >ika probe radiolabeled selesai digunakan, blot

dapat dibungkus dalam bungkus plastik agartidak kering dan kemudian segeramenggunakan 4lm untuk autoradiogra4.

>ika menggunakan probe nonisotopic, blotharus diperlakukan dengan reagen deteksinonisotopic sebelum terkena 4lm.


20/22

Deteksi%eteksi dicapai baik dengan radioakti'itas

atau dengan non)radioaktif.

%engan radioakti'itas, probe ditandai dengan5;$ !atau 55$".

%engan non)radioakti', deteksi dilakukandengan pe1arnaan. Salah satunya denganteknik chemiluminescence, deteksi #ugamungkin didasarkan pada ?uoresensi, tapi inimemerlukan substansial in'estasi dalaminstrumentasi khusus.


21/22

$erbedaan antar eknik


22/22

erimakasih

Northern Blot Fix

Documents

Transcript of Northern Blot Fix