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Méthodes d'évaluation de l'efficacité des antibiotiques

en biofilm

Françoise Van Bambeke, PharmD, PhD

Pharmacologie cellulaire et moléculaireLouvain Drug Research Institute

Université catholique de Louvain, Brussels, Belgium

<www.facm.ucl.ac.be>

27/11/2014 Antibiotiques et biofilms

2

Antibiotiques et biofilms en pratique clinique

échecs thérapeutiques pas rares …27/11/2014 Antibiotiques et biofilms

3

Modèles statiques in vitro

pegs plaques multi-puits


4

Activité antibiotique: cultures planctoniques vs. biofilms

Macià et al, Clin Microbiol Infect. 2014 Apr 26


5

Modèles statiques: “Calgary Biofilm Device”

Détermination de la “Minimal Biofilm Eradication Concentration”

(MBEC)

Ceri et al, J. Clin. Microbiol. 1999; 37:1771-6; Herrmann et al, J Infect Dis. 2010;202:1585-9227/11/2014 Antibiotiques et biofilms

6

Activité antibiotique: cultures planctoniques vs. biofilms

Takei et al, J Infect Chemother (2013) 19:504–9

MIC

MBCMBEC

MIC MBC

MBEC

ampicilline et lévofloxacine vs. H. influenzae (< liquide de l’oreille moyenne)


7

Modèles statiques: plaques à 96 puits en polystyrène

colorantsappropriés pour évaluer

la biomasseou la charge bactérienne


8

Mesure de la biomasse / viabilité dans le biofilm

crystal violet

biomasse

Christensen et al, Infect. Immun. 1982; 37:318–26


Mesure de la biomasse / viabilité dans le biofilm

crystal violet

resazurin

resorufine

activité métabolique

fluoresceine diacetate

fluoresceine

Gram(+) Gram(-)

Christensen et al, Infect. Immun. 1982; 37:318–26

Tote et al, 2008; Lett. Appl. Microbiol. 46:249–254 Wanandy et al, J Microbiol Methods 2005;60:21-30

biomasse

9

10

Distinction entre effets statique et cidal

Comptage des UFC

Hardrson et al, Nature Protocols 2010; 5:1236-54 27/11/2014 Antibiotiques et biofilms

11

Distinction entre effets statique et cidal

S. pneumoniae

Libération de NADH

NADH oxidase(NOX)

NADH oxidase

NADH NAD+

Hardrson et al, Nature Protocols 2010; 5:1236-54 Yu et al, Microbiology. 2001;147(Pt 2):431-8

Comptage des UFC


12

Comptage des UFC vs. fluorescence de RF

relation between fluorescenceand bacterial inoculum for S. aureus

2 3 4

6

7

8

9

10

11

-2.5

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

30 min. incubation

log resorufin fluorescence

log

CFU

/ml log O

D620 nm

Van den Driessche et al, J.Micr. Meth. 2014; 98:31–4Bauer, Siala et al, Antimicrob Ag Chemother. 2013;57:2726-37;

an exemple pour S. aureus

UFC & signal RF proportionnels Sensibilité ~ temps d’incubation


13

NADH oxidase vs. fluorescence de RF

Vandevelde et al, ECCMID 2014; eP288

bactéries mortes bactéries vivantes restantes

un exemple pour S. pneumoniae

-7.5 -5.0 -2.5 0.0 2.5 5.00

20

40

60

80

100

120

CLRMXF

log10 concentration (X MIC)

Res

oruf

in fl

uore

scen

ce(%

con

trol

val

ue)

-7.5 -5.0 -2.5 0.0 2.5 5.00

20

40

60

80

100

120

CLRMXF

log10 concentration (X MIC)

NA

DH

abs

orba

nce

(% c

ontr

ol v

alue

)

clarithromycin (bacteristatic) vs moxifloxacin (bactericidal)


16/09/2014 antibiotic activity in biofilms 14

Etudes PK/PD : quelques exemples

PK/PDeffet vs temps

Temps

Effe

t

0

1

0

Pharmacodynamiqueconc. vs effet

10-3Conc. (log)

Effe

t

Pharmacocinétiqueconc. vs temps

Con

c.

Temps0 250.0

0.4

15

Modèle pharmacodynamique en bref

an exemple avec un biofilm jeune de S. aureus

vancomycin

CT0

20

40

60

80

100

120

RFCV

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0log10 concentration (X MIC)

% c

ontr

ol v

alue

Emax« efficacité maximale »

Bauer, Siala et al, Antimicrob Ag Chemother. 2013;57:2726-37

C25-50-75« puissance

relative »


16

Biofilms de S. pneumoniae: influence de la maturité

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 40

20

40

60

80

100

120

day 2day 11

Log10 concentration (X MIC)

% c

ontr

ol v

alue

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 40

20

40

60

80

100

120


metabolic activity biomass

Vandevelde et al, Antimicrob Ag Chemother. 2014; 58:1348-58

Emax avec la maturité

moxifloxacine


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Biofilms de S. pneumoniae: influence de la maturité

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 40

20

40

60

80

100

120

day 2day 11


% c

ontr

ol v

alue

-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 40

20

40

60

80

100

120


metabolic activity biomass

Vandevelde et al, Antimicrob Ag Chemother. 2014; 58:1348-58

Puissance relative avec maturité

moxifloxacine


18

Biofilms de P. aeruginosa: influence du milieu


Basseres et al, ICAAC 2014

Puissance relative réduite dans ASM

beef infusion solids, casein hydrolysate,

starch

mucin, DNA, DTPA,

casaminoacids, NaCl, KCl, tris base, egg yolk

emulsion.



Biofilms de P. aeruginosa: influence du milieu

Basseres et al, ICAAC 2014

Interaction avec les constituants du milieu

antibiotiqueCMI (mg/L)

contrôle + mucine + ADN + jaune d’oeuf

CIP 0.06 0.06 0.5 4

CST 1 16 1 1

AMK 1 1 64 64

CAZ 1 64 1 4

MEM 0.5 0.5 0.5 > 64

20

Paramètres PK/PD dans les biofilms

cathéter, os, peau, valve cardiaque,…

nutriments &

oxygène

pharmacocinétique

diffusibilité ~ matrice biodisponibilité dans le biofilm accès aux bactéries efflux hors des bactéries

pharmacodynamique

réponse bactérienne(activité métabolique) expression d’activité antibiotique(environnement local [O2, pH, ..])


21

Modèles dynamiques in vitro

remplacement unidirectionnel

de fluide

apportpermanent

de fluide

conditionsconstantes


22

Modèles dynamiques: bioréacteurs

Réacteur du CDC:• mélange constant expériences de cinétique avec changement de la composition du milieu

• forces de cisaillement élevées


23

Activité antibiotique en mimant l’exposition chez l’homme

Parra-Ruiz et al, J Antimicrob Chemother 2012; 67:2682–5

Cultures planctoniques Biofilm (CDC reactor)

S. aureus

LZDDAP

LZD+

DAP

LZDDAP

LZD+

DAP

Dosages simulés: DAP (10 mg/kg 1x/jour) / LZD (600 mg 2X/jour)

Réacteur du CDC

Combination plus utile sur les biofilms que les cultures planctoniques


24


Goeres et al, Nature Protocols 2009; 4: 783-8

Réacteur à perfusion (drip flow reactor) :• changement progressif et unidirectionnel du milieu• faibles forces de cisaillement


25

Sélection de populations résistantes

Macià et al, Antimicrob. Ag. Chemother. 2013; 55:5230–7

Réacteur à perfusion P. aeruginosa

Amplification des mutants pendant le traitement antibiotiqueet accumulation de mécanismes de résistance

PAO1 hypermutator

Concentrations fixes en ciprofloxacine (MPC)


26


Lüdecke et al, PLoS One 2014; 9(1):e84837

Fermenteur à profondeur (non)-constante:• conditions constantes• faibles forces de cisaillement• ~ biofilms sur implants


27

Selection of resistant populations

Hill et al, J. Antimicrob. Chemother. 2010; 65:1195-206

Fermenteur à profondeur (non)-constante

Activité faible à des concentrations cliniques

Concentrations fixes en function du temps; biofilm multi-espèces (souches isolées de blessures humaine)


28

Conclusions

nombreuses méthodes pour évaluer la biomasse / la survie bactérienne

pas de consensus reel sur les meilleures options

nombreux modèles de biofilms in vitro

comparison entre études difficile

modèle le plus pertinent ?

Smith et al, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2013 ; 32:1327–3227/11/2014 Antibiotiques et biofilms

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Conclusions


pas de consensus réel sur les meilleures options




activité antibiotique sur biofilms <<< bactéries planctoniques

peu ou pas d’effet sur la matrice

determination des paramètres PK: diffusion / biodisponibilité

determination des paramètres PD: expression d’activité / réponse bactérienne



Conclusions


pas de consensus réel sur les meilleures options




activité antibiotique sur biofilms <<< bactéries planctoniques

peu ou pas d’effet sur la matrice

determination des paramètres PK: diffusion / biodisponibilité

determination des paramètres PD: expression d’activité / réponse bactérienne

combination avec des agents modifiant la matrice / l’état métabolique des bactéries ?

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Nouvelles stratégies …

Kostakioti et al. Cold Spring Harb Perspect Med 2013;3:a01030627/11/2014 Antibiotiques et biofilms

27/11/2014 Antibiotiques et biofilms 32

Combination avec des polycations

Siala et al, Antimicrob. Ag. Chemother. 2014; 58:6385-6398

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Remerciements

Julia Bauer Yvan Diaz IglesiasWafi Siala Nathalie Vandevelde Eugénie Basseres

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