Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as...
Transcript of Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as...
![Page 1: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/1.jpg)
Možnosti laboratórnej
diagnostiky liekových alergií.
AdLa s.r.o., Prešov
Analyticko - diagnostické laboratórium a ambulancie, Prešov
MUDr. E. Gerlašinská, RNDr. Ľ. Muller
![Page 2: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/2.jpg)
Alergická reakcia:
• Pojem alergia zaviedol v r. 1906
C.P. Pirquet
• Vzniká u senzibilizovaného jedinca po opakovanom stretnutí s antigénom (alergénom )
![Page 3: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/3.jpg)
Lieková alergia
• asi 10% všetkých prípadov akútnych alergických reakcií
• sprostredkované IgE
• non IgE
![Page 4: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/4.jpg)
Typy hypersenzitívnych
reakcií
Typ I Včasná ( aktivácia mastocytov )
anafylaktický šok, angioedém, astma, urtikária
Typ II (IgG alebo IgM )Cytotoxická sprostredkovaná protilátkami
anémia, trombocytopénia, neutropénia
Typ III Imunokomplexovánephritída, arthritíta, sérová choroba
Typ IV Bunkami sprostredkovanáSJS/TEN , DRESS Syndróm
![Page 5: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/5.jpg)
Alergické reakcie na lieky:
• Bezprostredné reakcia
(v priebehu prvej hodiny po poslednom podaní lieku)
• Oneskorené reakcie
(po viac ako 1 hodine)
![Page 6: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/6.jpg)
Nomenklatúra pre alergické
ochorenia
• Bezprostredné reakcie < 1 hod / IgE
urtikáriaangioedémrinitídabronchospazmusanafylaktický šok
• Oneskorené reakcie > 1 hod / non-IgE
makulopapulárny exantémoneskorená urtikária/angioedémfixný exantémexfoliatívne dermatitídy akútna generalizovaná exantematózna dermatitída (AGEP)liekové reakcie s eozinofíliou a so systémovými syndrómami(DRESS/DIHS)Stevenson-Johnsonov syndróm toxická epidermálna nekrolýza (TEN)
![Page 7: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/7.jpg)
Patogénne mechanizmy:
• Patogénne mechanizmy typu I
(sprostredkované IgE)
• Patogénne mechanizmy typu IV
(sprostredkované bunkami)
IgEYYYY
Ag
![Page 8: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/8.jpg)
Európska sieť pre liekovú alergiu (European Network for Drug Allergy, ENDA)
Navrhla všeobecné odporúčania pre diagnostiku takýchto reakcií:
1. klinická anamnéza (veľmi dôkladná, špeciálny dotazník)
2. výber diagnostických vyšetrení (podľa typu reakcie)
![Page 9: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/9.jpg)
Laboratórne testy používané
pri diagnostike liekovej alergie
• 1. Humorálne: majú v praxi prevahu
- stanovenie špecifického IgE
- tryptáza a histamín
• 2. Bunkové testy
![Page 10: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/10.jpg)
Bezprostredná reakcia:
• In vitro:
- vyšetrenie špecifických
IgE
- Test aktivácie bazofilov
prietokovou cytometriou
(BAT)
• In vivo:
- kožné testy
- liekové provokačné
testy
![Page 11: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/11.jpg)
Stanovenie špecifických IgE
v sére:
- enzymaticky viazaná imunosorpčná analýza (ELISA)
- fluorescenčná enzýmové imunoanalýza (FEIA)
- luminuscenčná imunoanalýza (LEIA)
- kožné testy a stanovenie špec. IgE nie sú úplne rovnocenné
- in vitro testy - menej citlivé ( vysoká špecificita, nízka senzitivita)
![Page 12: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/12.jpg)
Metódy stanovenia špecifických IgE
Naviazanie alergénov na pevnú fázu: •UniCAP ® PHARMACIA •QuantiScan ® INNOGENETICS •EUROLINE EUROIMMUN AG •CMG-Immunodot SANOFI Diagnostic•RISA DYNEX •AlaBLOT ® DPC •Allergen Disc Allergopharma•ALLERCOAT EAST SANOFI Diagnostic•RIDASCREEN ® R-Biopharm GmbH•ADVIA Centaur ® BAYER DIAGNOSTIC •ALLERgen Personal Lab ALLERGY BioChem ImmunoSystems Inc.
Naviazanie alergénov na kvapalnú fázu:IMMULITE® 2000 DPC AlaSTAT ®DPC
![Page 13: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/13.jpg)
Špecifické IgE
- dôležité alergologické vyšetrenie doplňujúce kožné testy (výhodné - ak nie je možné realizovať kožné testy)
- prítomnosť špecifických protilátok triedy IgE proti určitému alergénu – dispozícia k alergickej reakcii I. typu
- citlivé imunochemické metódy - schopné zachytiť veľmi malémnožstvo špecif. IgE
- rôznorodé metódy detekcie - koncentrácia špec. IgE v sére sa udáva v štandardizovaných triedach RAST (RadioAllergySorbent Test)
- trieda I (najnižšia) – trieda VI (najvyššia)
![Page 14: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/14.jpg)
Obmedzenia pri vyšetrení
špec. IgE:
- vyšetrenie je prínosom len, ak predpokladáme alergickú reakciu I. typu
- negatívny výsledok šIgE nevylučuje významnú alergickú reakciu,
veľká časť poliekových reakcií nie je sprostredkovaná IgE
- aj v prípade IgE mediovanej liekovej alergie nemusia dostupné lab. testy
dokázať reakciu na niektoré minoritné alergény
- bezprostredne po ťažkej alergickej reakcii (anafylaxii) - nie je možné
šIgE v krvi dokázať, je potrebné vyšetrenie o niekoľko týždňov odložiť.
- veľmi vysoké hodnoty celkového IgE v sére – falošne pozit. výsledky
šIgE (nešpecifická väzba IgE v teste).(MUDr. S. Honzová, Interní Med. 2009, 11(4), 168-170)
![Page 15: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/15.jpg)
Tryptáza
• Mediátorom alergickej reakcie uvoľnovaným
zo žírnych buniek v tkanivách po expozícii alergénu.
• Výhodou oproti iným mediátorom (histamín):
- nie je uvoľnovaná z bb. PK (vylúčené ovplyvnenie výsledku jej uvoľnením
in vitro), má aj dlhší poločas rozpadu in vivo.
• Zvýšené hladiny:
- od niekoľko málo minút po anafylaktickej reakcii
- maximum – v intervale 15 minút – 3 hodiny po reakcii.
• Zvýšené hladiny pretrvávajú obvykle niekoľko hodín.
• Stanovenie tryptázy má význam pri dg. anafylaktickej reakcie
(lieky, potraviny, blanokrídly hmyz).
• Zvýšená hladina sa vyskytuje aj pri mastocytóze
![Page 16: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/16.jpg)
Syndróm histamínovej
intolerancie
- nerovnováha medzi odbúravaním histamínu pomocou
enzýmu diaminooxidázy (DAO)
- DAO – enzým ľudského tela, ktorý kontinuálne tvoria
bunky črevnej sliznice a je čiastočne vylučovaný do čreva
- 3% populácie na Slovensku, cca 25-30% pacientov
v alergologických ambulanciách
- pacienti s typickým alergickým klinickým obrazom
a častou negativitou všetkých dostupných vykonaných
alergologických vyšetrení
![Page 17: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/17.jpg)
Prečo bunkové testy?
- Vyšetrenie špecifických IgE : len cirkulujúce IgE protilátky
- Väčšina IgE protilátok je naviazaná: tkanivá, žírne bunky,
bazofily
- Vznik techník, ktorých cieľom je priblížiť sa viac situáciám,
ktoré sa odohrávajú v priebehu alergického ochorenia
- Testy, ktoré detegujú pochody spojené s aktiváciou bazofilov
periférnej krvi a uvoľnenie mediátorov alergickej reakcie
www.internimedicina.cz | 2009; 11(4) | Interní medicína pro praxi
![Page 18: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/18.jpg)
Bunkové testy
• Test aktivácie bazofilov ( BAT)
• Eseje s T-lymfocytmi (LTT, LAT)
![Page 19: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/19.jpg)
Princíplaboratórnych bunkových testov:
Špecifická stimulácia krvných buniek
alergénom a následné hodnotenie pochodov
spojených s ich aktiváciou, ev. degranuláciou.
![Page 20: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/20.jpg)
Bunkové testy I.typ
hypersenzitívnej reakcie:
1. stanovenie histamínu alebo leukotriénov
( CAST test )
2. bazofildegranulačný test ( BHR )
3. expresia CD63 na bazofiloch metódou
prietokovej cytometrie ( BAT, FlowCAST )
![Page 21: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/21.jpg)
CAST (Cellular allergen stimulation test)
)
• analýza mediátorov, ktoré sa uvoľňujú pri procese
degranulácie bazofilov:
- sulfidoleukotriény ( LTC4,, LTD4 , LTE4 )
- ev. histamín
• nie je to rutinná metóda
• nevýhodou je nutnosť izolácie bb. na hustotnom
gradiente ( nešpecifická stimulácia bazofilov )
![Page 22: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/22.jpg)
Bazofilový degranulačný test ( BHR,Basophil histamine release ):
• stanovuje sa ich pasívnou senzibilizáciou alergénom
• väzba alergénu na receptory FcεRI indukuje uvoľnenie intracelulárneho depozitu histamínu a tvorbu ďalších mediátorov
• degranuláciu bazofilov charakterizuje strata afinity senzibilizovaných bazofilov k bázickým farbivám
• posúdenie procesu je možné vyhodnotiť metódou svetelnej mikroskopie
![Page 23: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/23.jpg)
BAT
• Spoľahlivá a citlivá metóda pre dg. IgE sprostredkovanej alergie
• Je prínosom aj u reakcií, ktoré nie sú sprostredkované IgE (Ebo
aj. 2006)
• Prináša výhody oproti kožným testom a vyšetreniu špec. IgE
![Page 24: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/24.jpg)
BAT – bazofilaktivačný test
• patrí medzi „ funkčné testy“
• Cieľ: - priblížiť sa čo najviac podmienkam in vivo
- sledovať priamo efekt reakcie alergénu
na cieľové bunky
![Page 25: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/25.jpg)
BAT
• Vyvinutý ako doplnkový test
• Prelom – objav znaku CD63 (znak bazofilovej aktivácie)
• r. 1994 Sainte – Laudy a kol. popísal BAT
![Page 26: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/26.jpg)
Bazofily
- Predstavujú primárne efektorové bunky v IgE sprostredkovanej
alergickej odpovedi I. typu
- Na svojej membráne exprimujú vysokoafinitný receptor IgE
( FcεRI )
- Nízkoafinitné receptory IgE ( FcεRII ) sa nenašli
- Multifunkčné solubilné mediátory a vazoaktívne látky
v cytoplazmatických granulách
![Page 27: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/27.jpg)
Imunofenotyp bazofilov:
- CD123, CD203c, CCR3, CD11a, CD11b,
CD13, CD35, CD37, CD40, CD121b, CD9,
CD29, CD33, CD44, CD45, CD54, CD97...
- po stimulácii špecifickým alergénom nastáva
de novo expresia CD63
![Page 28: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/28.jpg)
Bazofilaktivačný test ( BAT, BASO Ex, FlowCAST ):
• indukovaná degranulácia bazofilov sa špecificky kvantifikuje metódou prietokovej cytometrie
• bazofily sú značené: anti - CD123FITC anti - CD203c anti - CCR3
a anti - CD63PE
• na základe emitovanej fluorescencie sa kvantitatívnevyjadrí počet aktivovaných bazofilov CD63+ z celkového počtu bazofilov
![Page 29: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/29.jpg)
BAT(Test aktivácie bazofilov)
funkčný test – sleduje sa aktivácia bazofilov in vitro po expozícii alergénom
plná nezrazená krv pacienta sa inkubuje s vyšetrovaným alergénom(v rôznych riedeniach)
do testu je zaradená neg. a poz. kontrola
alergén sa viaže cez špecif. IgE na FcRI receptor, dôjde k premosteniu receptorov a aktivácii bazofilov, degranulácii, uvoľneniu histamínu a iných mediátorov
na povrchu bazofilov se exprimujú aktivačné znaky CD63 a CD203c
meranie pomocou prietokovej cytometrie
![Page 30: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/30.jpg)
Negatívna kontrola
- inkubácia bez alergénu
(pufer)
- hodnota by nemala by prekročiť 5% pre
všetky typy alergénov
Pozitívna kontrola
Stimulácia bazofilov dvomi nešpecifickými stimulmi:
1. protilátka anti – IgE
2. peptid N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)
Vyšetrenie je možné hodnotiť len vtedy, ak
hodnota aspoň jednej kontroly je vyššia ako 10%.
![Page 31: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/31.jpg)
Prehľad vyšetrovaných
liekových alergénov:
• ATB: beta-laktámové, makrolidy, tetracyklíny,
chinolóny, trimetoprim, sulfamethoxazol
• Analgetiká, antipyretiká
• Anestetiká
• Myorelaxanciá
• Iódové kontrastné látky
![Page 32: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/32.jpg)
Alergény:
• Nesmú byť cytotoxické (bez aditív a konzervačných látok -fenol, glycerol, azid sodný, mertiolát)
• Nesmú vykazovať nešpecifickú stimuláciu (lektíny, endotoxíny)
• Používame štandardizované alergény
![Page 33: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/33.jpg)
Správne načasovanie testu
• 6 týždňov – 12 mesiacov po akútnej príhode
• Falošne negatívny výsledok:- znížená refrakternosť buniek po nedávnejalergickej reakcii
- znížený počet IgE(Ebo aj. 2008)
![Page 34: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/34.jpg)
Spôsob odberu:
- plná krv odobratá do heparínu
- na jeden alergén 50 ul krvi (1ml – 18 skúmaviek)
- krv je potrebné analyzovať do 24 hod.
![Page 35: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/35.jpg)
Príprava pacienta
• Vysadiť lieky:
- antihistaminiká
- kortikosteroidy najmenej na 24 hodín pred odberom
![Page 36: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/36.jpg)
Výsledok
• 60 minút
![Page 37: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/37.jpg)
Stimulačný index ( SI ):
- lieky vykazujú nižšie % aktivácie bazofilov ako ostatné alergény
- senzitivita je nižšia a hodnotenie náročnejšie
- stanovenie stimulačného indexu (SI):
pomer % zastúpenia bazofilov vykazujúcich expresiu CD63 postimulácii liekom k % zastúpeniu bazofilov rovnakého druhu pred stimuláciou:
% CD63+ bazofilov po stimulácii liekom% nestimulovaných bazofilov
• Výsledok je pozitívny pri hodnote SI = 2,0 a viac
![Page 38: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/38.jpg)
Non - responderi
• Pacienti, ktorí nereagujú na pozitívnu stimuláciu anti-IgE (6,1%), fMLP (4,9%)
• Nie sú vhodní na stanovenie alergie metódou BAT
• Tyrozín kináza syk a lyn (IgE sprostredkovaná degranuláciabazofilov) - asociované s neodpovedavosťou. U pacientov zistená neprítomnosť tyrozín kinázy syk a znížené množstvo tyrozínkinázy lyn.
(Ebo ai. 2006)
![Page 39: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/39.jpg)
Uplatnenie BAT
• Pri stanovení problematických alergénov:
- jed blanokrídleho hmyzu
- potravinové alergény
- latex
- lieky
(Ebo aj. 2009, Wolanczyk Medrala aj. 2009, De Weck aj. 2008, Eberlein- Konig aj. 2006)
- meranie zmien odpovede na alergén v priebehu špecifickej
imunoterapie (Mikkelsen aj. 2010)
![Page 40: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/40.jpg)
Flow CAST (BAT) a lieky:
• Senzitivita 80-90%
• Špecificita 93% -100%
(EBO,D.G., C.H. BRIDTS a et al., 2008 )
![Page 41: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/41.jpg)
Indikácia vyšetrenia BAT:
• Ak nie je možné realizovať:
- kožný test
- vyšetrenie špec. IgE
• Výsledky sa navzájom nezhodujú
• Výsledky neodpovedajú klinickej anamnéze pacienta
• Môže nahradiť rizikové vyšetrenia in vivo, hlavne testy expozičné
![Page 42: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/42.jpg)
BAT
• BAT je vhodnou metódou pre zistenie
špecifickej precitlivelosti I. typu
• BAT má vyššiu senzitivitu ako vyšetrenie sIgE
a veľmi vysokú špecificitu
• BAT má vyššiu senzitivitu i špecificitu ako CAST
Optimálny čas diagnostiky 1 - 6 mesiacov po klinickej reakcii.
![Page 43: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/43.jpg)
Rutinné použitie BAT:
- zvyšuje senzitivitu diagnostického procesu
- znižuje potrebu prevádzania liekovýchprovokačných testov
![Page 44: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/44.jpg)
Oneskorené LHR
- sprostredkované T- lymfocytmi
- tzv. hapténová hypotéza: liek ako haptén(ireverzibilná väzba na proteíny – antigén)
- alternatívna hypotéza p-i: koncept farmakologickejinterakcie priamo s imun. receptormi ( TCR alebo HLAmolekula) a aktivácia T-lymfocytov alterácioupeptidového žliabku MHC
![Page 45: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/45.jpg)
Oneskorená reakcia:
• In vivo: In vitro:
- intradermálny test - test transformácie alebo
s oneskoreným odčítaním aktivácie lymfocytov (LTT)
- epikutánne testy
- liekové provokačné
testy
![Page 46: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/46.jpg)
LTT-lymfocytotransformačný
test
• Sledovanie syntézy DNA na označenie mitoticky
aktívnych buniek: 3H thymidin
• Nevýhody:1. použitie rádioaktívnych izotopov
2. riziková práca s toxickými odpadmi
![Page 47: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/47.jpg)
Activation in vitro – LTTVaried concentrations of pure drug, incubate at 37ºC with 5% CO2
6 days
Add 3H thymidine
Harvest cells and count radioactivity, results: cpm or stimulation index (SI = drug stimulated cpm/unstimulated cpm)
PBMC
Cells
II- Quantify Response
T cell
PBMC
![Page 48: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/48.jpg)
LTT(lymfocytotransformačný test)
- prítomnosť určitých liekovo-špecifických klonov
T- lymfocytov
- Senzitivita 56-78% , špecificita 85-93%
![Page 49: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/49.jpg)
Načasovanie LTT
stanovuje odpoveď pamäťových T- lymfocytov
môže bytˇpozitívny po dobu mnohých rokov (10-20 rokov), ale aj strata reaktivity po 3-4 rokoch
nie je možné predpovedať, či bude u pacienta reaktivita na liek pretrvávať alebo nie
test vykonávať po 4 - 8 týždňoch od reakcie
vzorku heparinizovanej krvi doručiť čo najskôr (pracujeme so živými bunkami)
![Page 50: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/50.jpg)
Metóda LAT (Lymphocyte Activation Test)
Lymfocytoaktivačný test (LAT) –vyvinutý ako alternatíva
LTT.
Stanovujeme percentuálne zastúpenie aktivovaných
T- lymfocytov meraním antigénu CD69 na prietokovom
cytometri po ich 48 hodinovej inkubácii s liekom pri 37˚C
s 5% CO2 .
Stimulačný index 2,0 ako cut-off umožňuje odlíšiť
medzi areaktívnymi a reaktívnymi T- lymfocytmi.
![Page 51: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/51.jpg)
Lymphocyte activation test
(LAT):
- test oneskorenej alergickej reakcie
- v lymfocytotransformačnom teste pri kultivácii
lymfocytov s alergénom reagujú tieto blastickou
transformáciou
- obdobou testu je LAT test – stanovenie aktivačnej
molekuly CD69 metódou prietokovej cytometrie
![Page 52: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/52.jpg)
I- Activation in vitro
Varied concentrations of pure drug, incubate at 37ºC with 5% CO2
PBMC
II- Quantify Response
PBMC PBMC
Evaluate T cells by flow cytometry
CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells
T cell
48 hours
Activation in vitro - LAT
![Page 53: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/53.jpg)
Laboratórne testy
sú výhodné - bezpečné pre pacienta
pri indikácii a interpretácii laboratórnych
testov je potrebné zohľadniť typ reakcie
a časový odstup medzi reakciou
a vyšetrením
![Page 54: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/54.jpg)
Výhody vs. nevýhody lab.
testov I.
Laboratórne metódy majú veľkú výhodu bezpečnosti
pre pacienta.
Nedostatkom - obmedzená dostupnosť metód, obmedzený
výber liekov pre niektoré metódy.
Dôvodov nízkej citlivosti in vitro testov je viac. Nie je vždy
možné podľa klinických prejavov spoľahlivo určiť
imunopatologický mechanizmus.
![Page 55: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/55.jpg)
II.
Problémom je aj dostupnosť príslušných epitopov lieku
potrebných pre väzbu protilátky s receptorom v teste
in vitro. Niektoré reakcie vyvoláva metabolit lieku, nie
originálna molekula.
Veľmi dôležitou podmienkou je aj správne načasovanie
testu.
Pri funkčných testoch môže interpretáciu znemožňovať
prítomný stav neodpovedavosti (non-responders).
Vyskytuje až u 10 % pacientov.
![Page 56: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/56.jpg)
Záver
- Patogenéza liekových hypersenzitivít je veľmi
zložitá – zložitá je aj ich diagnostika.
- Univerzálny diagnostický test zatiaľ neexistuje.
- Kombinácia niekoľkých vyšetrovacích metód zvyšuje senzitivitu a špecificitu diagnostického procesu.
- Potreba kombinácie klinického vyšetrenia,
in vivo testov s in vitro testami.
![Page 57: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/57.jpg)
Diagnostika
Nesprávna diagnóza založená iba na anamnéze LHR môženepriaznivo ovplyvniť individuálny výber liečby a môžepacienta poškodiť viac ako komplexný alergologickývyšetrovací postup.
Klinické nástroje na stanovenie konečnej diagnózy:
- dôkladná anamnéza, štandardizované kožné testy, spoľahlivé
in vitro testy a provokačné testy
Screening osôb bez predchádzajúcej liekovej alergickej reakciesa neodporúča.
![Page 58: Možnosti diagnostiky liekových alergií.€¦ · flow cytometry CD69 upregulation expressed as percent CD69 positive T cells T cell 48 hours Activation in vitro - LAT. Laboratórne](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022060807/608c1245686d27572a73fea2/html5/thumbnails/58.jpg)