molekularna ekologija imotske gaovice (delminichthys adspersus ...

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Anja PALANDAČIĆ

MOLEKULARNA EKOLOGIJA IMOTSKE GAOVICE (DELMINICHTHYS ADSPERSUS (HECKEL, 1843))

DOKTORSKA DISERTACIJA

MOLECULAR ECOLOGY OF IMOTSKA GAOVICA (DELMINICHTHYS ADSPERSUS (HECKEL, 1843))

DOCTORAL DISSERTATION

Ljubljana, 2012

Palandačić A. Molekularna ekologija imotske gaovice (Delminichthys adspersus (Heckel, 1843)) Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012

II

Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter po sklepu Senata Biotehniške fakultete in

sklepa seje Komisije za doktorski študij z dne 9.9. 2010 (po pooblastilu Senata UL z dne

20.1.2009) je bilo potrjeno, da kandidatka izpolnjuje pogoje za neposreden prehod na

doktorski študij bioloških in biotehniških znanosti ter opravljanje doktorata znanosti s

področja genetike. Za mentorja je bil imenovan višji znanstveni sodelavec dr. Aleš Snoj.

Poleg Oddelka za zootehniko Biotehniške fakultete je bil del razsikave izveden na inštitutu

Zoologische Institut, Universität Basel (Basel, Schweiz) s pomočjo štipendije Ad Future in

Javnega sklada za kadre in štipendije.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik: Dr. Peter Trontelj

Član: Dr. Elena Varljen Bužan

Član: Dr. Aleš Snoj

Datum zagovora: 6.4.2012

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Anja Palandačić

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd DK UDK 575:597.2/.5(043.3)=163.3 KG molekularna ekologija/molekularna evolucija/filogenetika/populacijska

genetika/mikromreže/ribe/gaovice(Cyprinidae)/imotska gaovica(Delminichthys adspersus)

KK AGRIS L20/8100 AV PALANDAČIĆ, Anja, univ. dipl. biol. SA SNOJ, Aleš KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Podiplomski študij bioloških in

biotehniških znanosti, področje genetike LI 2012 IN MOLEKULARNA EKOLOGIJA IMOTSKE GAOVICE (DELMINICHTHYS

ADSPERSUS (HECKEL, 1843)) TD Doktorska disertacija OP XIII, 74 str., 5 pregl., 12 sl., 146 vir. IJ sl JI sl/en AI

Namen raziskave je bil razširiti znanje o slabo raziskani skupini rib z imenom »gaovice« (Leuscisinae, Cyprinidae), ki naseljujejo centralni del južnega Dinarskega krasa in periodično kolonizirajo jame. Raziskava je potekala v treh sklopih, v okviru katerih smo postavili hipoteze: (1) Z dodatnimi jedrnimi geni (rodopsin, ERGF2B in ITS1) potrditi hipotezo, postavljeno na osnovi mitohondrijskega citokroma b in nedoločene jedrne regije Cyp_unFLP, ki predvideva uvrstitvev vrst imotska, popvska in jadovska gaovica ter krbavski pijor (D. adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis, D. krbavensis) v svoj rod (Delminichthys). (2) Vrsta imotska gaovica (Delminichthys adspersus) predstavlja eno samo nediferencirano populacijo, kar je posledica podzemne migracije in (3) Pri vrsti imotska gaovica se v času podzemnega življenja izražanje genov spremeni. V prvem sklopu smo določili nukleotidno zaporedje trem delnim zapisom za rodopsin, ERGF2B in ITS1 pri vseh bivših predstavnikih rodu Phoxinellus (med katerimi so tudi štiri zgoraj omenjene vrste), jim določili evolucijski model ter z različnimi metodami (največje verjetje, NJ) izračunali filogenetska drevesa. V drugem sklopu smo na 8 mikrosatelitnih lokusih genotipizirali 544 osebkov vrste imotska gaovica iz 18 vzorčnih mest, ki nimajo nadzemnih vodnih povezav, so povezana preko občasnih potokov, ali pa so del istega vodnega telesa. Nato smo z metodami, ki temeljijo na F-statistiki, Bayesovem principu oziroma koalescenci določili populacijsko strukturo in jo primerjali z znanimi hidrološkimi podatki. V tretjem sklopu smo z mikromrežami analizirali razliko v izražanju genov v jetrih skupine rib vrste imotska gaovica, ki so preživele ene mesec v popolni temi, s skupino rib z normalno 12 urno foto-periodo. Potrdili smo prvo hipotezo, da je rod Delminichthys monofiletski in sestavljen iz štirih vrst. Populacijska struktura imotske gaovice je razkrila vsaj tri podskupine, ki pa so med sabo povezane po podzemnih vodnih poteh. V tretjem sklopu smo odkrili 28 diferencialno izraženih genov.


IV

KEY WORDS DOCUMENTATION DN Dd DC UDK 575:597.2/.5(043.3)=163.3 CX molecular ecology/molecular evolution/phylogenetics/population

genetics/microarrays/fish/gaovice (Cyprinidae)/imotska gaovica (Delminichthys adspersus)

CC AGRIS L20/8100 AU PALANDAČIĆ, Anja AA SNOJ, Aleš PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Postgraduate Study of

Biological and Biotechnical Sciences, Field: Genetics PY 2012 TI MOLECULAR ECOLOGY OF IMOTSKA GAOVICA (DELMINICHTHYS

ADSPERSUS (HECKEL, 1843)) DT Doctoral Dissertation NO XIII, 74 p., 5 tab., 12 fig., 146 ref. LA sl AL sl/en AB

The object of the research was a group of poorly studied fish with vernacular name »gaovice« (Leuscisinae, Cyprinidae), which inhabit central Dinaric karst and periodically colonize caves. The research was divided in three parts and for each a hypothesis was constructed: (1) Delminichthys adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis and D. krbavensis form one, monophyletic genus also on the basisi of three nuclear DNA regions, (2) The species D. adspersus forms one panmictic population, sustained with subterranean gene flow, and (3) During the underground phase, gene expression in the species D. adspersus changes. In the first part, phylogenetic position and taxonomic status of former Phoxinellus taxa (including four previously mentioned species) was investigated on the basis of partial sequences of rhodopsin, EGRF2B and ITS1 and phylogenetic methods such as neighbor-joining and maximum likelihood. In the second part, 544 specimen of D: adspersus from 18 locations were genotyped for 8 microsatellite loci. The locations were either completely isolated, linked via temporal streams or a part of same water body. We determined population structure with methods based on F-statistic, Bayesian and coalescence and compared it with known hydrological data. In the third part we used microarrays to determine differentially express genes in liver of fish (D. adspersus), which spend one month in complete darkness, in comparison to the group with normal 12 hour photo-period. We confirmed that four species Delminichthys adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis and D. krbavensis form monophyletic genus Delminichthys. The population structure of D: adspersus revealed at least three groups with gene flow occurring between them. Finally, we found 28 differentially expressed genes with the microarray analysis.

KAZALO VSEBINE str.

Ključna dokumentacijska informacija (KDI) ...................................................... III

Key Words Documentation (KWD) ................................................................... IV

Kazalo vsebine ..................................................................................................... V

Kazalo preglednic .............................................................................................. VII

Kazalo slik........................................................................................................ VIII

Kazalo prilog ....................................................................................................... IX

Okrajšave in simboli ............................................................................................ X

Slovarček ............................................................................................................ XII

1 UVOD .................................................................................................................... 1

1.1 NAMEN DELA 2

1.2 RAZISKOVALNE HIPOTEZE 3

2 PREGLED OBJAV ............................................................................................... 5

2.1 KRAS 5

2.1.1 Sledenje vodnih povezav v krasu 5

2.1.2 Ekološke razmere v tokovih ponikalnic 6

2.1.3 Prilagoditev organizmov na podzemlje 7

2.1.4 Podzemeljska vodna favna Dinarskega krasa 8

2.2 GAOVICE (LEUSCISINAE, CYPRINIDAE) 9

2.2.1 Imotska gaovica (Delminichthys adspersus) 10

2.3 FILOGENETIKA IN POPULACIJSKA GENETIKA 11

2.3.1 Mitohondrijska DNA (mtDNA) 14

2.3.2 Jedrna DNA 15

2.3.3 Mikrosateliti 16

2.4 MIKROMREŽE 18

3 MATERIAL IN METODE .................................................................................. 20

3.1 OPIS VZORČNIH MEST 20

3.2 VZORČENJE IN IZOLACIJA DNA 24

3.3 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR), DOLOČANJE

NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA IN GENOTIPIZACIJA 24

3.4 FILOGENETSKA ANALIZA VRST RODU PHOXINELLUS 26


VI

3.4.1 Jedrni geni 26

3.5 ANALIZA POPULACIJSKE STRUKTURE IMOTSKE GAOVICE 27

3.5.1 Mitohondrijska DNA 27


3.6 ANALIZA DIFERENCIALNEGA IZRAŽANJA GENOV Z

MIKROMREŽAMI 31

3.6.1 Postavitev poskusa 31

3.6.2 Analiza mikromrež 32

4 REZULTATI ........................................................................................................ 33

4.1 RAZREŠEVANJE TAKSONOMSKIH NEJASNOSTI V SKUPINI

GAOVICE 33

4.2 POPULACIJSKA STRUkTURA IMOTSKE GAOVICE 35

4.2.1 Mitohondrijska DNA 35


4.3 RAZLIKA V IZRAŽANJU GENOV (POSKUS Z MIKROMREŽAMI) 48

5 RAZPRAVA ........................................................................................................ 50

5.1 RAZREŠEVANJE TAKSONOMSKIH NEJASNOSTI V SKUPINI

GAOVICE 50

5.2 POPULACIJSKO GENETSKA STRUKTURA IMOTSKE GAOVICE

IN PRETOK GENOV MED GEOGRAFSKO LOČENIMI

POPULACIJAMI 52

5.3 SPECIFIČEN METABOLIZEM VEZAN NA DOLGOTRAJNO

ŽIVLJENJE V PODZEMLJU 58

6 SKLEPI ................................................................................................................ 60

7 POVZETEK (SUMMARY) ................................................................................. 61

7.1 POVZETEK 61

7.2 SUMMARY 62

8 VIRI ...................................................................................................................... 63

ZAHVALA

PRILOGE

KAZALO PREGLEDNIC

str. Preglednica 1: Preučevane vrste iz bivšega rodu Phoxinellus in referenčni

predstavniki 20

Preglednica 2: Vzorčna mesta imotske gaovice (Delminichthys adspersus) 21

Preglednica 3: Začetni oligonukleotidi uporabljeni v analizi populacijske

strukture imotske gaovice z mikrosateliti 26

Preglednica 4: Populacijski parametri imotske gaovice 39

Preglednica 5: Seznam vseh zaporedji na mikromreži s spremenjenim

izražanjem pri primerjavi rib, ki so bile en mesec v temi, in

rib z normalno 12 urno foto periodo 49


VIII

KAZALO SLIK

str.

Slika 1: Imotska gaovica (Delminichthys adspersus) 10

Slika 2: Preučevani areal imotske gaovice 22

Slika 3: Rdeče jezero (Crveno jezero) 23

Slika 4: Filogenetsko drevo bivšega rodu Phoxinellus ter referenčnih vrst Telestes

souffia in Squalius cephalus 35

Slika 5: Nekoreninjena genealogija haplotipov izrisana na podlagi citokroma b 36

Slika 6: Analiza demografske ekspanzije 38

Slika 7: Populacijsko drevo (Populations) 41

Slika 8: Graf FCA (Genetix) 42

Slika 9: Grafi posterirne verjetnosti (LnP (D); STRUCTURE) 43

Slika 10: Populacijska struktura (STRUCTURE, BAPS) 44

Slika 11: Hierarhična analiza populacijske (STRUCTURE) 45

Slika 12: Vzorec migracij ocenjen (IMa2, Geneclass2) 47

KAZALO PRILOG

Priloga A: Seznam haplotipov citokroma b (mtDNA) po vzorčnih mestih

Priloga B: Paroma primerjane genetske razdalje med vzorčnimi mesti na osnovi

mitohondrijske DNA

Priloga C: Paroma primerjane genetske razdalje med vzorčnimi mesti na osnovi

osmih mikrosatelitnih lokusov (paroma primerjani FST)

Priloga D: Paroma primerjane genetske razdalje med vzorčnimi mesti na osnovi

osmih mikrosatelitnih lokusov (paroma primerjani RST)

Priloga E: Rezultati anlize z modelom izolacija-z-migracijo, izračunani s

programom IMa2


X

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

AIC angl. Akaike information criterion (slo. Akaiketov informacijski kriterij)

AMOVA angl. Analysis of molecular variance (slo. Anliza molekularne variance)

ATP adenozin trifosfat

AWTY angl. Are We There Yet (slo. ali smo že tam)

BIC angl. Bayes information criterion (slo. Bayesov informacijski kriterij)

bp bazni par

cDNA komplementarna DNA

Cyp_unFLP nedoločena jedrna sekvenca

DNA deoksiribonukleinska kislina

EGR2B angl. Early Growth Response Factor 2b (slo. faktor odziva v zgodnji fazi

rasti)

ETS angl. External Transcribed Spacers (slo. zunanji prepisujoči se

distančnik)

F81 Felsensteinov (1981) model nukleotidne substitucije

FCA angl. factorial correspondence analysis (slo. faktorska korespondenčna

analiza)

FIS koeficient parjenja v sorodstvu

FST fiksacijski indeks, temelji na identiteti alelov

G stopnje variacije med nukleotidnimi mesti (angl. rate variation among

site)

GTR splošni časovno reverzibilni model nukleotidne substitucije

HEXP angl. expected heterozygosity (slo. pričakovana heterozigotnost)

HKY Hasegawa Kishino Yano model nukleotidne substitucije

HOBS angl. observed heterozygosity (slo. opažena heterozigotnost)

HW Hardy in Weinberg

IAM angl. Infinite Alleles Model (slo. model neskončno alelov)

IGS angl. Internal Genetic Spacer (slo. notranji genetski distančnik)

ITS angl. Internal Transcribed Spacer (slo. notranji prepisujoči se distančnik)

IUCN angl. International Union for Conservation of Nature (slo. Svetovna zveza

za varstvo narave)

LSU angl. nuclear Large Subunit (slo. jedrna velika podenota ribosoma)

MCMC angl. Markov Chain Monte Carlo (slo. Markova veriga Monte Carlo)

ML angl. Maximum Likelihood (slo. največje verjetje)

MP angl. Maximum Parsimony (slo. metoda varčnosti)

mtDNA mitohondrijska DNA

NA povprečno število alelov na lokus

NADH angl. nicotinamide adenine dinucleotide (slo. nikotinamid adenin

dinukleotid )

NJ angl. Neighbour-Joining (slo. sosedsko združevanje)

NTS angl. Non-Transcribed Spacer (slo. ne-prepisujoči se distančnik)

PCR angl. Polymerase Chain Reaction (slo. verižna reakcija s polimerazo )

RAG1 angl. Recombination Activating Gene (slo. gen, ki aktivira rekombinacijo)

RNA ribonukleinska kislina

rRNA ribosomska RNA

RST fiksacijski indeks, temelji na številu ponovitev osnovnega motiva na

posameznem alelu

SMM angl. Stepwise Mutational Model (slo. model postopnega mutiranja)

SNP angl. Single Nucleotid Polymorphism (slo. točkovni polimorfizem)

SSU angl. nuclear Small Subunit (slo. jedrna mala podenota ribosoma)

Taq Termophilus aquaticus (bakterijska vrsta)

TPM triparametrični model nukleotidne substitucije

TrN Tamurin in Neiev model nukleotidne substitucije

tRNA prenašalna RNA

TVM transverzijski model nukleotidne substitucije

uf angl. unequal frequencies (slo. neenake frekvence)

UPGMA angl. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (slo. metoda

neponderirane aritmetične sredine)

VNTR angl. variable number tandem repeats (slo. tandemske ponovitve

osnovnega motiva dolgega različno število baznih parov)


XII

SLOVARČEK Bayesov princip/metoda metoda/princip v statistiki in verjetnosti, ki vrednoti

hipoteze na podlagi posteriorne verjetnosti

centromera regija DNA, kjer sta kromatidi kromosoma v najbližjem

kontaktu

efektivna velikost populacije dejansko število posameznikov, ki se razmnožujejo;

pomembno za naključni genski drs

ekson kodirajoči del gena

evkromatin razvit kromatin

fluorokrom fluorescentna molekula

heterokromatin nerazvit, skondenziran kromatin

intron nekodirajoči del gena

metoda varčnosti metoda, ki na podlagi vzorcev stanj znakov izbere tisto

hipotezo sorodstvenih odnosov, ki zahteva najmanj

sprememb stanj znakov

metoda največjega verjetja metoda, ki izbere hipotezo sorodstvenih odnosov, ki ima

največje verjetje v okviru izbranega evolucijskega

modela

monofiletsi tisti, ki ima(jo) skupnega prednika

naključni genski drs spremembe v frekvenci alelov iz generacije v

generacijo, ki so posledica naključnih dogodkov, kot je

naključen izbor gamet za zigoto

Predkambrij najstarejše in najdaljše geološko obdobje, začelo se je

pred 4,5 milijarde leti

polifiletski tisti, ki nima(jo) skupnega prednika

troglobiont vrste ali populacije, ki so normalno vezane na podzemni

habitat

evtroglofil v osnovi površinska vrsta, ki pa lahko oblikuje trajno

podzemno populacijo

subtroglofil vrsta, ki trajno ali začasno poseljuje podzemni habitat,

ampak je vezana na površe z vsaj eno življenjsko

aktivnostjo (dnevno, sezonsko, med življenjsko

zgodovino)

trogloksen vrsta, ki se v podzemlju pojavlja le sporadično

telomera ponovitve nizov nukleotidov na koncih kromosomov

troglomorfoza spremembe in prilagoditve povezane z življenjem v

podzemlju

zunanja skupina najbližji sorodnik skupini vrst, ki jo preučujemo (angl.

outgroup)


1

1 UVOD

Kras je izraz za vrsto pokrajine, kjer so se zaradi raztapljanja kamnin razvile posebne

površinske in podzemeljske kraške oblike. Za običajno apnenčasto ali dolomitno pokrajino

je značilna močna povezanost med površinsko in talno vodo (Gams, 2003). Eno izmed

najbolj preučevanih ter preučenih kraških območji na svetu je Dinarski kras, ki sega od

Italije do Albanije in je poznan po visoki stopnji biodiverzitete in endemizma (Sket in sod.,

2004). Najbolj znani endemit tega področja je edina evropska podzemna dvoživka močeril

(Proteus anguinus), poleg njega pa tu najdemo še številne druge endemite, kot so

ceponožni rak Bryocamptus zschokkei, jamski trdoživ Velkovrhia enigmatica, dinarska

voluharica Dinaromys bogdanovi ter druge podzemne in nadzemne vrste, med katerimi je

tudi slabo raziskana skupina rib iz družine krapovcev (Cyprinidae) s poljudnim imenom

»gaovice« (Sket, 2004a).

Gaovice naseljujejo izvirna območja vodotokov kraških polj v centralnem in južnem delu

Dinarskega krasa (Mrakovčić in sod., 2006). Na območju Hrvaške in Bosne in

Hercegovine živi predvidoma deset endemičnih vrst prvotno uvrščenih v rod Phoxinellus,

ki pa se je kasneje izkazal za polifiletskega. Tako so bile vrste Phoxinellus ghetaldii, Ph.

adspersus, Ph. jadovensis in Ph. krbavensis na osnovi dela mitohondrijske in jedrne DNA

uvrščene v nov rod Delminichthys, medtem ko so bile Ph. metohiensis, Ph. croaticus, Ph.

fontinalis premeščene v že obstoječi rod Telestes. Tri vrste, Ph. alepidotus, Ph.

pseudalepidotus in Ph. dalmaticus, pa so ostale v rodu Phoxinellus (Freyhof in sod., 2006).

Ne glede na taksonomsko uvrstitev pa je vsem trem vrstam skupna prilagoditev na

življenje v ponikalniškem habitatu. Skupaj s presihajočo vodo se v sušnih mesecih

umaknejo v podzemlje, kjer lahko preživijo tudi več mesecev, nato pa ob ponovnem

porastu kraških voda izplavajo iz izvirov in požiralnikov. Pri tem se ribe v obe smeri selijo

aktivno, ne le pasivno z vodnim tokom (Mrakovčić in sod., 2006). Ena od posledic

življenja v začasnih kraških izvirih, ki so raztreseni ob robovih kraških polj, pa je

razdrobljen areal, ki je še posebno izrazit pri vrsti imotska gaovica Delminichthys

adspersus (Zupančič, 2008).


2

Areal imotske gaovice je majhen (r = 30 km) in se razteza od mesta Imotski (Hrvaška) na

severzahodu do Grud (BiH) na severovzhodu in Ploč (Hrvaška) na jugu, ter obsega izvire

rek Vrljika (Hrvaška), Tihaljina (BiH) in Matica (Hrvaška), ki so pogosto medsebojno

površinsko izolirani (Zupančič, 2008). Najbolj očiten primer izolacije je tipska lokacija D.

adspersus (Heckel 1843) Rdeče jezero (Crveno jezero), ki je kraško brezno s

permanentnim jezerom, katerega vodni nivo je od 250 do 300 metrov pod robom (Bonacci,

2006). Poleg informacij o razširjenosti imotske gaovice (Zupančič, 2008), njenega

filogenetskega položaja (Freyhof in sod., 2006) in morfološke opredelitve (Franičević in

Tičina, 2003) je o biologiji in ekologiji imotske gaovice malo znanega in večina

geografsko ločenih populacij še ni bila raziskana ne z morfološkega ne z molekularnega

vidika. Vrsta je na seznam IUCN (angl. International Union for Conservation of Nature)

uvrščena kot ranljiva, ogrožena pa je predvsem zaradi omejene razširjenosti, uničevanja

kraških območji ter občasnega prekomernega izlova.

1.1 NAMEN DELA

Namen doktorske disertacije je razširiti znanje o slabo raziskani skupini rib z imenom

»gaovice«, ki naseljujejo centralni del južnega Dinarskega krasa in periodično kolonizirajo

jame. Raziskovalno delo smo v ta namen razdelili v tri sklope: (1) razreševanje

taksonomskih nejasnosti v skupini gaovice, (2) populacijsko genetska struktura imotske

gaovice in pretok genov med določenimi populacijami ter (3) specifičen metabolizem

vezan na dolgotrajno življenje v podzemlju.

V prvem sklopu raziskovalnega dela (Razreševanje taksonomskih nejasnosti v skupini

gaovice) je bil naš namen ovrednotili dosedanje študije, ki so že poskušale razrešiti

taksonomijo skupine gaovice. Freyhof in sodelavci (2006) so postavili hipotezo o

sorodstvenih odnosih med desetimi vrstami gaovic na osnovi mitohondrijske DNA ter na

osnovi nepoznane jedrne sekvence, za katero ni znano, ali je pod vplivom selekcijskega

pritiska, zato smo to hipotezo preverili še na osnovi novih odsekov jedrne DNA (deli

genov za rodopsin, EGR2B (angl. Early Growth Response Factor 2B) in ITS1 (angl.

Internal Transcribed Region)). Naš glavni namen je bil predvsem ugotoviti, ali je bila

ustanovitev novega rod Delminichthys smiselna, če je le-ta monofiletski ter ali ga

sestavljajo štiri predlagane vrste. Poleg tega nas je zanimal tudi položaj ostalih šestih vrst


3

gaovic in kolikšna je podpora za njihovo razdelitev med dva rodova, Phoxinellus in

Telestes.

Ker je kraški sistem poznan po nepredvidljivih podzemnih in nadzemnih vodnih

povezavah, je bil naš namen v drugem sklopu raziskovalnega dela (Populacijsko genetska

struktura imotske gaovice in pretok genov med določenimi populacijami) ugotoviti, ali

med populacijami iste vrste, med katerimi ni površinskih vodnih povezav, prihaja do

genetskega pretoka oziroma migracij rib. V ta namen smo izbrali vrsto imotska gaovica (D.

adspersus), ki ima največji in hkrati najbolj razdrobljen areal. Z vzorčenjem in

molekularno analizo izoliranih populacij smo želeli ugotoviti populacijsko strukturo vrste

ter morebitno prisotnost genetsko izoliranih populacij, ki bi lahko predstavljale potencialen

vir evolucijsko pomembnih enot ali celo kandidatov za nove vrste.

V tretjem sklopu (Specifičen metabolizem vezan na dolgotrajno življenje v podzemlju) je

bil naš namen razširiti znanje o biologiji imotske gaovice, predvsem pa ugotoviti, kaj se

dogaja z metabolizmom ribe v času bivanja pod zemljo. Ker nobena izmed vrst v katerikoli

fazi ne kaže vidnih prilagoditev na podzemlje, smo poskušali s pomočjo tehnologije

mikromrež ugotoviti, ali v podzemni fazi pride do sprememb metabolizma ribe ter kakšne

so te spremembe.

1.2 RAZISKOVALNE HIPOTEZE

V okviru raziskave bomo potrdili ali ovrgli naslednje hipoteze:

1. Z dodatnimi jedrnimi geni (rodopsin, ERGF2B in ITS1) bomo potrdili hipotezo,

postavljeno na osnovi mitohondrijskega citokroma b in nedoločene jedrne regije

Cyp_unFLP, ki predvideva uvrstitvev vrst imotska, popvska in jadovska gaovica ter

krbavski pijor (D. adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis, D. krbavensis) v svoj rod

(Delminichthys).

2. Vrsta imotska gaovica (Delminichthys adspersus) predstavlja eno panmiktično

populacijo. Osebki med različnimi lokacijami migrirajo tako po nadzemnih kot tudi

podzemnih vodnih povezavah.


4

3. Pri vrsti imotska gaovica se v času življenja pod zemljo izražanje genov spremeni.


5

2 PREGLED OBJAV

2.1 KRAS

Kras je izraz za vrsto pokrajine, kjer so se zaradi raztapljanja kamnin razvile posebne

površinske in podzemeljske kraške oblike. Površinske so žlebiči oz. škrape, vrtače,

vdornice, polja ter občasna in stalna jezera, podzemeljske pa jame in brezna. Značilen je

kompleksen nadzemni in podzemni vodni sistem in močna povezanost med površinsko in

talno vodo. Kras se najpogosteje razvije v sedimentnih kameninah (apnencih, dolomitih,

sulfatih, haloidih, kremenovih peščenjakih), lahko pa tudi v metamorfnih (marmorjih,

kvarcitih) ali magmatskih (karbonatnih) kameninah ali s taljenjem v ledu. Postopek, pri

katerem se v apnencu topita CaCO3 ali MgCO3, netopni silikati in oksidi pa ostajajo kot

zemlja (jerovica oz. terra rossa), se imenuje zakraševanje ali karstifikacija. Zakraševanje

poteka v več fazah (predkraška, zgodnje kraška, zrela kraška, smrt krasa) in traja dokler se

ne raztopijo vse topne snovi in ostane le netopna podlaga. Samo ime »kras« prihaja iz

lastnega imena za pokrajino, ki se razteza med Tržaškim zalivom in Vipavsko dolino ter

Soško dolino in Brkini, in se je razširilo na stvarno ime za to posebno vrsto pokrajine.

Kraška ozemlja se nahajajo povsod po svetu, največja so na Kitajskem in v Avstraliji. V

Evropi je kras zelo raznolik in ne zajema samo apnenčastih tvorb, popolnoma brez

kraškega ozemlja pa so le Finska, Danska in Nizozemska (Gams, 2003). Dinarski kras

zavzema del Italije, južni polovici Slovenije in Hrvaške, celo Črno Goro, zahodno Srbijo

ter Albanijo do Helenidov in vključuje tudi večino jadranskih otokov, potopljene jame pod

morjem ter visoke gorske grebene, ki tečejo paralelno z obalo v smeri severozahod-

jugovzhod. Posebna značilnost Dinarskega krasa so kraška polja: velike, zaprte depresije

brez površinskega pritoka ali odtoka, ki periodično poplavljajo. Na začetku polja voda

privre iz podzemlja, teče po površju ter na drugem koncu zopet ponikne. Ponikalnice so

tako tudi ene od pomembnih ekoloških niš na Dinarskem krasu (Gams, 2003; Kranjc,

2004; Sket, 2004b).

2.1.1 Sledenje vodnih povezav v krasu

Zaradi zapletenega vodnega sistema krasa je za ugotavljanje podzemnih povezav najbolj

uveljavljena tehnika sledenje s pomočjo soli, barve ali sprememb v temperaturi in količini


6

vode. Sledilni testi veljajo za najbolj zanesljiv in učinkovit način zbiranja informacij o

nedostopnih in neraziskanih podzemnih delih kraškega sistema (Field, 1999; Goldscheider

in sod., 2008). V kombinaciji z drugimi geološkimi in hidrološkimi tehnikami pa

predstavljajo tudi najmočnejšo metodo za določevanje skrajnih mej razvodji v krasu

(Goldscheider, 2005), kar je izjemnega pomena za vse vede, ki se ukvarjajo s preučevanje

kraških področji (geologija, hidrologija, kemija, fizika, vodno upravljanje, biologija in

limnologija; Käs, 1998). Obstaja več vrst kriterijev, po katerih se sledilni testi delijo. Ford

in Williams (2007) jih delita na kvantitativne in kvalitativne ali glede na učinkovino, ki se

uporablja, na delce, impulze umetne označevalce in naravne označevalce, ki jih naprej

delita na mikroorganizme, ione in raztopine ter okoljske izotope. Smart in Worthington

(2004) razvrščata sledilce kot fizikalne, kemične, izotopične in biološke, pri čemer

biološke definirata kot organizme, ki so v vodi prisotni po naključju (npr. koliformne

bakterije). Pipan in Culver (2007) sta predstavila idejo o sistematični uporabi bioloških

sledilcev kot dopolnilo dosedanjim hidrološkim metodam. Biološki sledilci so naravno

prisotni v vodi, zato ni potrebe po uporabi za okolje potencialno škodljive barve ali soli,

poleg kvantitativnih meritev pa dajejo tudi kvalitativne informacije o tipu vodne povezave

in njeni primernosti za disperzijo organizmov.

2.1.2 Ekološke razmere v tokovih ponikalnic

Ponikalnice so stalni ali občasni vodotoki, ki se formirajo na površju in tečejo v podzemlje.

Obstajata dve vrsti ponikalnic, perienalne in intermitentme. Perenialne ponikalnice imajo

na površini popolnoma osnovano floro in favno, zato je tudi njihov podzemni del

razmeroma bogat s hranili. Podzemne življenjske združbe so poleg obligatnih podzemnih

organizmov (troglobiontov) sestavljene še iz površinskih organizmov, ki jih v podzemlje

naključno odnese tok (troglokseni), organizmov, katerih del življenjskega cikla je vezan na

podzemlje (subtroglofili) in organizmov, ki lahko tvorijo popolnoma troglomorfne

populacije (evtroglofili). Klimatski parametri v perenialnih ponikalnicah vsaj delno dnevno

in letno nihajo, kar pa je odvisno od oddaljenosti od ponora, vodne mase in toka. Z

oddaljenostjo od ponora se spreminjajo tudi količina in kvaliteta hrane, prodiranje svetlobe

in količina nitratov, ki se zaradi odsotnosti zelenih rastlin ne absorbirajo in se kopičijo po

toku navzdol. Zaradi spreminjanja vseh parametrov v odvisnosti od oddaljenosti od ponora

lahko podzemeljski del toka razdelimo v več »podhabitatov«, ki se odražajo tudi v razlikah


7

lokalne favne. Intermitentne ponikalnice nimajo osnovane flore in favne, vendar

podzemeljske vire hrane občasno obogatijo kopenski organizmi, ki jih tok odnese v

podzemlje. Združbe so sestavljen predvsem iz vodnih troglobiontov, klimatski parametri

pa so praktično identični kot pri perenialnih ponikalnicah. Delno se ohranijo dnevno/nočni

in sezonski ritmi, ki pa se z določeno oddaljenostjo od ponora porušijo. Poleg oddaljenosti

je glavni parameter, ki narekuje temperaturo, vsebnost hranil, kisika in nitratov, količina

vode oziroma njen pretok (Sket, 2004b).

Na ekološke razmere v ponikalnicah vplivajo tudi antropogeni dejavniki oziroma

onesnaževanje. Kraška pokrajina je navadno revna z uporabno vodo, saj v sušnih obdobjih

površinski deli tokov presahnejo, podzemeljske zaloge pa so omejene in težje dostopne. Če

v tem času pride do izliva odpadne vode ali drugega vira onesnaževanja, se v obstoječih

razdrobljenih in omejenih vodnih telesih strupene snovi pojavijo v izjemno visokih

koncentracijah ter povzročijo uničenje flore in favne, ki se zaradi izoliranosti ponovno

razvijeta mnogo kasneje. V kolikor do onesnaženja pride v času visokega vodostaja, se

zaradi prepletenosti vodnega sistema onesnažila sicer razredčijo, hkrati pa se tudi razširijo

na obsežno področje. Zaradi številnih povezav, ki jih ne poznamo v celoti, je tudi

nemogoče oceniti, do kam vse je kontaminirana voda segla. Drugačni abiotski in biotski

dejavniki (morfologija struge, odsotnost zelenih rastlin...) podzemeljskih tokov zmanjšajo

njihove samoočiščevalne sposobnosti in otežijo predvidevanja, koliko onesnaževanja bodo

prenesli brez nepovratnih negativnih posledic. Oceno vpliva onesnaževanja ovira tudi

slabo poznavanje fizioloških značilnosti ter življa in združb v ponikalnicah (Sket in

Velkovrh, 1980).

2.1.3 Prilagoditev organizmov na podzemlje

Podzemni organizmi izkazujejo različne znake (troglomorfoze), ki so posledica življenja v

podzemlju. Najpogostejši troglomorfozi sta pomanjkanje pigmenta in redukcija očesnega

aparata, poleg teh pa obstajajo še številne druge morfološke (podaljševanje izrastkov),

fiziološke (upočasnitev metabolizma), vedenjske (fotofobija) in ekološke (zgodnji razvoj

oziroma neotenija) prilagoditve na razmere v podzemlju. Okoljske razmere v podzemlju so

relativno konstante, zato so podzemni organizmi neodporni na hitre spremembe okoljskih

dejavnikov. Poleg tega so populacije običajno majhne in geografsko izolirane, zato so še


8

toliko bolj dovzetne za lokalna ali splošna izumrtja (Culver, 1982; Culver in sod., 1995;

Romero in Pulson, 2001; Trajano, 2001).

Leta 2001 sta Romero in Pulson zbrala seznam več kot 86 vrst jamskih rib iz 18 družin,

med tem ko je bilo leta 2003 opisanih že več kot 125 vrst (Proudlove, 2006). Glede na

visoko stopnjo odkrivanja novih vrst pa se predvideva, da bo številka do leta 2050 narasla

na 250 jamskih ribjih vrst (Proudlove, 2006). Redke od družin so sestavljene iz izključno

jamskih vrst in tudi znotraj posameznih vrst pogosto najdemo popolnoma troglobiontske

populacije, nadzemne populacije ter vse vmesne stopnje, ki se medsebojno lahko parijo

(Romero in Pulson, 2001). Najbolj raziskane jamske ribe so iz mehiškega rodu Astyanax in

amblyopsidi iz Severne Amerike (Trajano, 2001). Prav tako kot pri drugih organizmih so

podzemne ribe najpogosteje brez pigmenta, medtem ko je njihov očesni aparat in z njim

povezano živčevje na različnih stopnjah redukcije. Poleg tega so fotofobične, imele pa naj

bi tudi spremenjeno obliko in strukturo ribjega mehurja ter zreducirano število oziroma

kompleksnost lusk. Avtorji omenjajo še upočasnjeno metabolno stopnjo in odsotnost

formiranja jat (Romero in Pulson, 2001).

Pri gaovicah ni opaziti morfoloških sprememb, ki bi kazale na posledice njihovega bivanja

v podzemlju, razen zmanjšanega števila lusk, ki ga Freyhof in sodelavci (2006) navajajo

kot možno prvo stopnjo prilagoditve na podzemne razmere. Ob padcu vodostaja se aktivno

začnejo premikati v podzemne dele tokov, kar bi lahko šteli kot vedenjsko prilagoditev na

specifične razmere v občasnih kraških izvirih (Mrakovčić in sod., 2006; osebna opažanja).

Druge morfološke, ekološke, fiziološke ali vedenjske prilagoditve niso opisane.

2.1.4 Podzemeljska vodna favna Dinarskega krasa

Podzemeljska vodna favna Dinarskega krasa je najbolj bogato zastopana z raki, od katerih

je največ ceponožcev in postranic. Zelo veliko pa je tudi polžev, kar je glede na druga

kraška območja precej nenavadno. Vredna omembe sta zagotovo tudi edina vodna

troglobiontska školjka (Congeria kusceri) in ožigalkar (Velkovrhia enigmatica) ter seveda

močeril (Proteus anguinus), ki je edini vodni troglobiontski vretenčar. V centralnem delu

južnega dela Dinarskega krasa so prisotne številne endemične ribe iz družine krapovcev, ki

periodično kolonizirajo jame (Sket in sod., 2004; Sket, 2004a).


9

2.2 GAOVICE (LEUSCISINAE, CYPRINIDAE)

Gaovice so majhni, do 12 cm veliki endemiti iz družine krapovcev (Cyprinidae) in

poddružine Leuciscinae, ki živijo v kraških vodah jugozahodnega Balkana (Mrakovčić in

sod., 2006). Do leta 2006 so bile vse vrste uvrščene v rod Phoxinellus, ki pa se je izkazal

za polifiletskega. Freyhof in sodelavci (2006) so vrste Phoxinellus ghetaldii, Ph.

adspersus, Ph. jadovensis in Ph. krbavensis na osnovi mitohondrijskga citokroma b in dela

nedoločene jedrne DNA, ki so ga poimenovali Cyp_unFLP, uvrstili v nov rod

Delminichthys, medtem ko so Ph. metohiensis, Ph. croaticus, Ph. fontinalis premestili v že

obstoječi rod Telestes, tri vrste, Ph. alepidotus, Ph. pseudalepidotus in Ph. dalmaticus, pa

so ostale v rodu Phoxinellus. Vseh deset opisanih vrst se nahaja na Rdečem seznamu

ogroženih vrst IUCN. Medtem ko imajo Delminichthys adsperus, D. ghetaldii, Phoxinellus

dalmaticus in Telestes metohiensis status ranljive vrste, sta Ph. alepidotus in T. croaticus

ogroženi, D. jadovensis, D. krbavensis, Ph. dalmaticus in T. fontinalis pa kritično ogrožene

(Mrakovčić in sod., 2006).

Morfološko je desetim vrstam skupno vretenasto in bočno sploščeno telo pokrito z

majhnimi luskami, ki ponekod manjkajo, in žrelni zobje, ki so v eni vrsti. Vse so

bentopelagične in litofilne, saj ikre odlagajo na trdi substrat oziroma kamnito podlago.

Drstijo se spomladi ozirom zgodaj poleti. Prehrana ni podrobno raziskana, zato se

predvideva, da se prehranjujejo z nevretenčarji. Gaovice so prilagojene na življenje v

ponikalniškem habitatu in se v času nizkega vodostaja skupaj s presihajočo vodo umikajo v

podzemlje, kjer preživijo tudi več mesecev (Mrakovčić in sod., 2006).

Vrste D. krbavensis in Ph. fontinalis ter D. jadovensis in Ph. dalmaticus živijo paroma v

simpatriji, druge pa so medsebojno alopatrične (Mrakovčić in sod., 2006). Predvideva se,

da so vse vrste evolucijsko zelo stare in da izhajajo iz obdobja srednjega miocena (13

milijonov let). So ene izmed geografsko najbolj izoliranih vrst ciprinidov v Evropi in

zahodni Aziji (Freyhof in sod., 2006). Za vse je značilen fragmentiran habitat, ki je še

posebej očiten pri imotski gaovici (Delminichthys adspersus) (Zupančič, 2008).


10

2.2.1 Imotska gaovica (Delminichthys adspersus)

Imotska gaovica (Slika 1) ima vretenasto in bočno sploščeno telo ter podaljšano glavo s

terminalnimi usti. Bočna proga je prekinjena in se najpogosteje zaključi na repnem

nastavku. Hrbet in boki so pokriti s številnimi temnimi pikami nepravilne oblike, ki se

lahko zlijejo v večje packe. D. adspersus je litofilna vrsta, ki se drsti v juniju in juliju.

Samcem v času drsti po glavi in prsnih plavutih zrastejo bradavice. Hrani se z vodnimi

nevretenčarji, predvsem z rakci in ličinkami vodnih žuželk. Naseljuje kraške reke, jezera,

izvire, pa tudi zamočvirjene predele, pri temperaturi vode med 5 in 20 stopinj. Ob

neugodnih razmerah, ko vode presušijo, se umakne v podzemlje (Mrakovčić in sod., 2006).

Poleg osnovnih informacij (zgoraj navedeno), filogenetskega položaja (Freyhof in sod.,

2006, Franičević in Tičina, 2003) in morfološke opredelitve vrste (Bogutskaya in

Zupančič, 2003) je o biologiji in ekologiji imotske gaovice malo znanega in večina

geografsko ločenih populacij še ni bila raziskana niti z morfološkega niti z molekularnega

vidika.

Slika 1: Imotska gaovica (Delminichthys adspersus; fotografija: Arne Hodalič, Palandačić in sod., 2012b) Figure 1: Imotska gaovica (Delminichthys adspersus, photography by Arne Hodalič, Palandačić et al., 2012b)

Na Rdečem seznamu ogroženih vrst IUCN-a (1996) je uvrščena med občutljive vrste.

Mednarodno je zaščitena z Bernsko konvencijo in z Evropsko direktivo o zaščiti habitatov.


11

Glavni vzroki za ogroženost so zmanjševanje in uničevanje kraških območji zaradi

agrikulturnega onesnaževanja in regulacije vodotokov ter občasen prekomeren izlov za

potrebe lokalnega prebivalstva, ki ribe uporablja v prehrani (Mrakovčić in sod., 2006).

2.3 FILOGENETIKA IN POPULACIJSKA GENETIKA

Filogenija je zgodovina razvoja določene skupine organizmov oziroma genov in njihovih

prednikov, s filogenetiko pa razvoj določene skupine rekonstruiramo. Cilja filogenetskih

študij sta dva: rekonstrukcija pravilnih sorodstvenih odnosov med organizmi in ocena časa

od cepitve med skupinami (divergenca). Organizmi so v skupine razvrščeni glede na

stopnjo sorodnosti (npr., kraljestva, redovi, družine, rodovi, vrste, populacije). Za

ponazoritev sorodnosti se uporabljajo filogenetska drevesa, ki so včasih temeljila na

morfoloških lastnostih, danes pa so vse bolj v uporabi molekularne metode, ki podobnost

med skupinami določijo na osnovi nukleotidnih zaporedji DNA. Filogenetsko drevo je

sestavljeno iz vej in vozlišč. Notranja vozlišča pomenijo prednika oziroma predniško

stanje, zunanja vozlišča pa preučevane skupine. Veje povezujejo vozlišča in običajno

predstavljajo oddaljenost med skupinami (količino sprememb). Koreninjeno drevo poleg

odnosov med skupinami prikazuje tudi zaporedje odcepljanja skupin (evolucijsko pot),

korenina pa predstavlja skupnega prednika vseh vključenih skupin, medtem ko

nekoreninjeno drevo predstavlja samo odnose med skupinami. Drevo se ukorenini s

pomočjo zunanje skupine (angl. outgroup), za katero obstajajo zunanje informacije (npr.

paleontološki podatki), da se je odcepila prej kot katera od preučevanih skupin in se ne bo

uvrstila med preučevane skupine (Li in Graur, 1991).

Metode za izris filogenetskih dreves se delijo na distančne metode in metode na osnovi

znakov. Distančne metode nukleotidna zaporedja (ali morfološke znake) pretvorijo v

distančno matriko, v kateri razdalje predstavljajo število razlik med preučevanimi

skupinami. V primeru nukleotidnih zaporedji določijo število različnih nukleotidov, ki jih

preračunajo v distanco med skupinama (Li in Graur, 1991). Med najpogosteje

uporabljenimi metodami za rekonstrukcijo filogenetskih dreves iz podatkov o razdaljah je

metoda NJ (sosedsko združevanje oz. angl. Neighbour Joining), ki temelji na principu

združevanja parov v operacijske taksonomske enote tako, da je celotna dolžina vej na

koncu združevanja enot minimalna. Začne z zvezdastim drevesom in ko najde prvi


12

(najbližji) par, ga združi v operacijsko enoto ter nadaljuje iskanje dokler ne razreši vseh

medsebojnih odnosov na drevesu (Saitou in Nei, 1987). NJ dopušča različne stopnje

sprememb na posameznih vejah. Metode na osnovi znakov v nukleotidnem zaporedju

primerjajo stanje znakov na določeni poziciji, v primeru nukleotidnih zaporedji je to

primerjava med zaporedji v vertikalnem stolpcu poravnave. Metode na osnovi znakov, ki

se največ uporabljajo, so metoda varčnosti (Parsimony), največjega verjetja (ML, angl.

Maximum Likelihood) in varianta ML, podprta z Bayesovo statistiko (angl. Bayesian).

Metoda varčnosti (Fitch, 1971) najprej v poravnavi najde informativna mesta, ki dajejo

prednost določenemu drevesu pred drugimi, kot najbolj verjetno drevo pa določi tisto, do

katerega pride z najmanjšim številom sprememb med temi mesti (najbolj varčno drevo). Z

metodo največjega verjetja (Felsenstein, 1981) ocenimo verjetnost hipoteze o evolucijski

zgodovini, ki jo v našem primeru predstavlja filogenetsko drevo. Izračunamo kolikšna je

verjetnost, da bi ob danem drevesu in izbranem modelu dobili obstoječi rezultat oziroma,

pri določenem modelu in obstoječih podatkih, med vsemi možnimi drevesi izračuna tisto z

največjim verjetjem. Podporo drevesu zagotovi s samovzorčenjem, tako da ovrednoti

število ponovitev, pri katerem je bila ponujena določena rešitev filogenetskega odnosa.

ML, ki temelji na Bayesovi statistiki (Yang in Rannala, 1997), najboljše drevo izriše z

algoritmom MCMC (angl. Markov Chain Monte Carlo), tako da algoritem v vsakem

koraku predlaga novo drevo, ki ga izbere z naključno premestitvijo vej na trenutnem

drevesu. Primerja ga s prejšnjo rešitvijo in v primeru, da bolj ustreza vhodnim podatkom,

rešitev sprejme. Iskanje traja, dokler se stanje spreminja na boljše oziroma dokler se ne

ustali - konvergira. Kolikokrat je bilo določeno drevo »obiskano«, pa je dober približek

njegove posteriorne verjetnosti.

Za izris filogenetskih dreves, ki temeljijo na nukleotidnih zaporedjih, je ključen izbor

primernega evolucijskega modela, ki najbolje opiše, kako hitro in na kakšen način se v

določenem zaporedju kopičijo substitucije. Kateri model je najprimernejši, se oceni iz

analiziranih nukleotidnih sekvenc. Eno-parametrični model (Jukes – Cantorjev model)

predvideva, da so vse spremembe (substitucije) enako verjetne, medtem ko dvo-

parametrični model (Kimura) predpostavlja razliko med tranzicijami in transverzijami.

Najkompleksnejši je generaliziran časovno reverzibilni model (GTR, angl. General Time

Reversible), ki predvideva šest različnih stopenj za kodonska mesta, razlikuje med


13

tranzicijam in transverzijami ter upošteva še številne druge spremenljivke (Li in Graur,

1991).

Populacijska genetika preučuje genetsko sestavo in procese v bioloških populacijah, na

katere vplivajo štiri evolucijske sile: selekcija, naključni genski drs, mutacije in migracije.

Ukvarja se s populacijsko strukturo v času in poskuša razložiti pojave kot so adaptacija in

speciacija. Temelj populacijske genetike so abstraktni matematični modeli, ki opisujejo

dinamiko frekvenc genov in alelov. Teoretični modeli poskušajo posneti vzorce genetske

variacije, ki se jih nato primerja z realnimi podatki, zbranimi na vzorčnem številu

organizmov. Bazo populacijske genetike in sorodne kvantitativne genetike so postavili S.

Wright, J.B.S. Haldane in R.A. Fisher, ki so integrirali principe Mendelske genetike z

Darwinovo naravno selekcijo in s tem postavili temelje za neo-darwinizem ter ključno

vlogo populacijske genetike v moderni evolucijski sintezi. Medtem ko sta bila Fisher in

Haldane prepričana, da je naravna selekcija tista, ki ima najpomembnejši vpliv na genetsko

kompozicijo populacije, je Wright kot enko pomembna štel tudi vpliv naključja (naključni

genski drs) in migracije (Fisher, 1918 cit. po Okasha, 2008; Haldane cit. po Okasha, 2008;

1932, Wright cit. po Okasha, 2008; 1931; Kimura in Ohta, 1971 cit. po Okasha, 2008;

Hartl, 1980 cit. po Okasha, 2008; Allendorf in sod., 1987).

Najenosnovnejši teorem populacijske genetike je Hardy-Weinbergov teorem, ki sta ga

ločeno odkrila G.H. Hardy in W. Weinberg leta 1908, in predvideva, da so v idealizirani

populaciji frekvence alelov in genotipov v ravnotežju, kar pomeni, da se ohranjajo iz

generacije v generacijo. Odnos med frekvenco alelov in genotipov opisujeta enačbi p2 +

2pq + q2= 1 in p + q = 1, pri čemer sta p in q frekvenci alelov. V kolikor je prisotnih več

alelov, se enačba razširi. Hardy-Weinbergov zakon omogoča modeliranje evolucijskih

sprememb, saj lahko iz relativnih frekvenc alelov ob predpostavki, da je populacija v HW

ravnotežju, izračunamo distribucijo celotne frekvence genotipov. Kljub temu da je v

realnih populacijah le redko zadoščeno zgoraj navedenim pogojem, je opisan princip (v

približku) osnovno orodje populacijske genetike. Preko odstopanja od HW ravnotežja je

možno prepoznati številne procese, kot so izolacija med populacijami, parjenje v

sorodstvu, ozka grla in selekcija (Weinberg, 1908 cit. po Okasha, 2008; Crow, 1999 cit. po

Okasha, 2008).


14

V populacijski genetiki se uporabljajo deterministične in stohastične metode.

Deterministične predpostavljajo neskončno velikost populacije ter zanemarjajo

spreminjanje genskih frekvenc, zato populacijsko dinamiko opisujejo s srednjimi genskimi

frekvencami. Sem spadajo metode osnovane na F-statistiki (Wright, 1978; Slatkin, 1994), s

katerimi računamo fiksacijske koeficiente ter koeficiente parjenja v sorodstvu. Stohastične

metode opisujejo verjetnostni proces v populacijah končne velikosti in, za razliko od

metod F-statistike, ki računajo povprečje lokusov, podatke iz vseh lokusov vključijo v en

verjetnostni model ter jih analizirajo z MCMC analizo (Pritchard, 2000; Corander, 2003).

Leta 1982 je Kingman v populacijsko genetiko vpeljal koalescentno teorijo, ki sledi

prednikom vzorca, ne modelira pa spremembe v frekvenci alelov v populaciji kot celoti.

Gre za obraten pristop, ki poteka od sedanjosti k preteklost in omogoča uporabo manjšega

števila vzorcev, določanje časa od ločitve dveh populacij, oceno velikosti populacij ter

migracije med njimi (Beerli in Felsenstein, 1999; Beaumont, 1999; Kuhner in sod., 2000;

Hey in Nielsen, 2004; Beerli, 2006).

Za razreševanje nekega vprašanja iz področja filogenetike ali populacijske genetike je

ključen izbor primernega odseka DNA, ki mora biti v skladu s kategorično ravnjo, na

kateri so preučevani taksoni. Za primerjavo bližnje sorodnih skupin (sorodne vrste,

populacije iste vrste) so primerni odseki DNA, v katerih se spremembe kopičijo hitreje,

medtem ko se za razreševanje globokih filogenij uporabljajo bolj ohranjeni odseki, v

katerih se spremembe kopičijo počasneje. V splošnem se najpogosteje uporabljajo odseki

mitohondrijske DNA, od jedrnih zaporedji pa odseki ribosomske DNA, točkovni

polimorfizmi in mikrosateliti (Hwang in Kim, 1999).

2.3.1 Mitohondrijska DNA (mtDNA)

Mitohondrijska DNA se za ugotavljanje strukture populacij in odnosov med bližnje

sorodnimi vrstami uporablja zaradi visoke stopnje mutacij, enostavne organizacije,

dedovanja po materini strani in odsotnosti rekombinacije (Avise, 2000). V celici je prisotna

v več kopijah, kar olajša njeno izolacijo (Hwang in Kim, 1999). Zaradi haploidnosti in

dedovanja po materini strani, se nove variante v primerjavi z jederno DNA hitreje fiksirajo.

Tudi hitrost substitucij v mtDNA je višja kot pri jedrnih genih, kar je posledica višje

metabolne stopnje in večjega števila prostih radikalov v mitohondriju, pogostejše delitve


15

mtDNA in slabših popravljalnih mehanizmov ter manjšega selekcijskega pritiska nekaterih

regij (npr. kontrolne regije). Zaradi pojavljanja in fiksacije novih variant se mtDNA

uporablja za sledenje novejše evolucijske zgodovine: genskega pretoka med populacijami,

kolonizacije ter efekta ozkega grla. Od konkretnih odsekov se za populacijske študije

najpogosteje uporablja hipervariabilna kontrolna regija. Deli mtDNA pa so uporabni tudi

za študije oddaljenih taksonomskih linij, npr. ohranjeno zaporedje genov, ki nakazuje

starodavni vzorec evolucije živali. Za ugotavljanje sorodnosti med družinami ali redkimi

rodovi se uporablja 16S rDNA (Hwang in Kim, 1999).

Velika variabilnost mtDNA včasih otežuje konstrukcijo univerzalnih začetnih

oligonukleotidov za pomnoževanje specifičnih regij pri širokem krogu organizmov. Zato

so v filogenetske študije vključeni večinoma samo geni za 12S in 16S rDNA, citokrom b,

NADH dehidrogenazo in citokrom oksidazo, ki so med najbolj ohranjenimi in je

modeliranje začetnih oligonukleotidov za njihovo pomnoževanje lažje. Mitohondrijski geni

(citokrom oksidaza) se uporabljajo tudi v t.i. DNA barcoding-u, ki je uporaba kratkih

odsekov DNA za namen identifikacije organizmov (Kress in sod., 2005). Tudi v

filogenetskih in populacijskih študijah rib se najpogosteje uporabljajo odseki ali deli

odsekov za citokrom b, citokrom oksidaza, NADH dehidrogenaza in kontrolne regije

(Nesbo in sod., 1999; Robalo in sod., 2007; Perdices in sod., 2008).

2.3.2 Jedrna DNA

Jedrna DNA se uporablja za širok spekter filogenetskih in populacijskih analiz. Kodirajoče

regije, ki so bolj ohranjene, se uporabljajo za študijo sorodnosti med osnovnimi skupinami

organizmov, kot so redovi in družine, nekodirajoče pa za razreševanje sorodnosti med

rodovi, vrstami in populacijami. Najpogosteje uporabljana jedrna DNA je ribosomska

DNA, ki kodira rRNA in je pri evkariontih v jedru prisotna v več kopijah. Sestavljena je iz

zapisov za tri gene: za jedrno malo podenoto (SSU-18S), jedrno veliko podenoto (LSU-

28S) in za 5,8S ribosomsko DNA. Kodirajoča zaporedja so med seboj ločena z ne-

kodirajočimi regijami (angl. spacers). SSU in LSU sta ločena z medgensko ne-kodirajočo

regijo (angl. Internal Genetic Spacer; IGS). IGS sestavljata dve zunanji prepisujoči

nekodirajoči regiji (ETS) in ne-prepisujoča nekodirajoča regija (NTS). 5,8S rDNA leži

med dvema notranjima prepisujočima nekodirajočima regijama (angl. Internal Transcribed


16

Spacer, ITS1 in ITS2). SSU rDNA je ena najbolj ohranjenih regij v DNA. Uporabili so jo

za rekonstrukcijo globokih filogenetskih razvejitev, ki vključujejo kraljestva, debla,

razrede in redove ter za rekonstrukcijo filogenetskih dogodkov iz predkambrija. Tudi 5,8S

rDNA je zelo ohranjena, vendar je premajhna (okoli 150bp) in ne vsebuje dovolj

filogenetske informacije, zato se večinoma ne uporablja. LSU rDNA je velika in precej

bolj variabilna kot SSU rDNA. Uporablja se za določanje odnosov med bolj sorodnimi

skupinami, kot so redovi in družine. Regij IGS in ITS sta močno variabilni in se

uporabljata za razreševanje nejasnosti med nižjimi kategoričnimi stopnjami: rodovi,

vrstami in populacijami. Ker so daljše, so IGS regije bolj uporabne od ITS regij (Hwang in

Kim, 1999).

Za filogenetske in populacijske analize se pogosto uporabljajo točkovni polimorfizmi

(angl. single nucleotid polymorphisms; SNP), ki predstavljajo večino razlik v DNA med

dvema posameznikoma iste vrste (približno 0, 1%). Ljudje naj bi imeli okoli 3 milijone

točkovnih polimorfizmov, ki so razporejeni bolj ali manj naključno po genomu na vsakih

300 do 1000 baznih parov in se nahajajo v kodirajočih, nekodirajočih ali medgenskih

odsekih DNA (Vignal in sod., 2002). Za populacijsko genetske študije se pogosto

uporabljajo tandemske ponovitve (angl. variable number tandem repeats, VNTR-ji), ki jo

sestavlja različno število ponovitev osnovnega motiva, katerega dolžina je od dva do nekaj

tisoč baznih parov. Osnovni motiv minisatelitov je dolg med 9 in 100 baznih parov,

najpogostejša dolžina pa je okoli 30 baznih parov. Minisateliti so po genomu razporejeni

precej enakomerno, najdemo jih tako v ev- kot tudi v heterokromatinu, največ pa jih je v

bližini telomernih regij (Goldstein in Schlötterer, 1999). Osnovni motiv mikrosatelitov je

dolg med ena in šest baznimi pari, ki se od petkrat do stokrat ponovi. Enakomerno so

razporejeni po celem genomu, vendar so manj pogosti v centromerni in telomerni regiji

(Goldstein in Schlötterer, 1999).

2.3.3 Mikrosateliti

Najpogostejši osnovni motiv mikrosatelitov je dolg dva, tri oziroma štiri bazne pare. Za

mikrosatelite je značilna visoka variabilnost v številu ponovitev osnovnega motiva oziroma

velik dolžinski polimorfizem, ki je posledica pogostih mutacij (10-3 do 10-5 mutacij na

lokus na generacijo) značilnih za mikrosatelitno DNA. Najvišjo stopnjo mutacij imajo


17

dinukleotidni mikrosateliti, sledijo tri- in tetranukleotidi. Pogoste mutacije so posledica

večjega števila napak pri podvojevanju, saj polimerazni kompleks zaradi velikega števila

ponovitev lahko zdrsne (angl. DNA slippage), pri čemer nastane zanka, ki običajno

povzroči podaljšanje dolžine mikrosatelita. Stopnja zdrsa je odvisna od narave

ponavljajočega motiva ter od njegove dolžine. S citozinom in gvaninom bogati in krajši

mikrosateliti imajo nižjo stopnjo zdrsov. Mutacije so večinoma v prid podaljševanja

mikrosatelitov, rast pa je počasnejša pri mikrosatelitih z daljšim osnovnim motivom.

Stopnja mutacij je alelno specifična, zato nastajajo na različnih lokusih različni aleli

(Goldstein in Schlötterer, 1999).

Osnovna mutacijska modela, ki opisujeta evolucijo mikrosatelitov sta IAM (model

neskončno alelov) in SMM (model postopnega mutiranja). Model IAM predvideva, da

vsaka mutacija povzroči nastanek novega alela v populaciji. Model ne upošteva povratnih

mutacij ter homoplazije. Nasprotno drugi model za enako verjetno šteje povečevanje ali

pomanjševanje mikrosatelita. Razširjen SMM model dopušča spremembo za več osnovnih

enot. Vendar so mutacije mikrosatelitov preveč kompleksen proces, da bi jih razložili s

katerim od teh dveh modelov. Nobeden namreč ne upošteva lokusno specifičnih

mutacijskih procesov. Novejši mutacijski modeli upoštevajo tudi robna zaporedja, ki so

veliko bolj variabilna med vrstami kot znotraj vrst (Goldstein in Schlötterer, 1999).

Negativna lastnost mikrosatelitov v populacijskih študijah je možnost njihove

konvergentne evolucije oz. pojava homoplazij. Če predpostavimo, da mutacije z enako

verjetnostjo povzročijo tako zmanjšanje kot povečanje števila osnovnega motiva, je velika

verjetnost povratnih mutacij. To je ena od možnosti, ki pogojuje, da imajo določeni

mikrosateliti enako število istih osnovnih enot, vendar niso istega porekla. Če ne

upoštevamo možnosti homoplazij, potem lahko podcenimo pravo divergenco med

preučevanima populacijama. Druga negativna lastnost uporabe mikrosatelitov je nastanek

amplifikacijskih repov (angl. stutter bands), ki so posledica napak pri prepisovanju v

verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker in vitro ni popravljalnih mehanizmov, med

podvojevanjm nastanejo številni krajši produkti, ki se razlikujejo za dolžino osnovnega

motiva. Problem predstavljajo tudi mutacije v robnem zaporedju, ki predstavljajo vezna

mesta za začetne oligonukleotide, kamor se le-ti zato v verižni reakciji s polimerazo (PCR)


18

ne morejo vezati, posledica pa je odsotnost produkta. Dobimo t.i. ničelni alel, vidimo le

drug homologni produkt in preučevani osebek nepravilno prepoznamo kot homozigota,

ocena heterozigotnosti pa je glede na Hardy-Weinbergovo ravnotežje prenizka. Ničelni

aleli so pogosti, zato je potrebno upoštevati njihov vpliv v populacijski študiji (Goldstein in

Schlötterer, 1999).

Pozitivne lastnosti uporabe mikrosatelitov v populacijskih raziskavah so visoka stopnja

genetske variabilnosti in heterozigotnosti, nevtralna evolucija, kodominantnost in

enostavno mendelsko dedovanje. Ker so mikrosateliti visoko polimorfni, lahko med sabo

ločujemo zelo sorodne populacije na ozkem geografskem območju (Goldstein in

Schlötterer, 1999).

2.4 MIKROMREŽE

Tehnologija DNA mikromrež omogoča sočasno preučevanje več tisoč genskih prepisov.

DNA mikromreže so na podlago (npr. kemično obdelano steklo) pritrjene skupine tisočih

cDNA ali DNA molekul z znanimi nukleotidnimi zaporedji, ki predstavljajo matrico za

hibridizacijo s fluorescentno označenima poskusnim in kontrolnim vzorcem.

Hibridizacijski signal na določenem mestu matrice izraža identiteto nukleotidnega

zaporedja, velikost signala pa je merilo za količino izraženega genskega produkta.

Pripravljena mikromreža se hibridizira s preiskovanim vzorcem in/ali kontrolnim vzorcem,

ki je lahko iz celic izolirana in v cDNA prepisana RNA ali celična DNA, označena s

fluorokromom. Rezultat je računalniška slika, kjer je jakost hibridizacijskega signala

ponazorjena z intenziteto slikovnih pik. Sledi obdelava rezultatov s statističnimi in

korelacijskimi programi, ki izluščijo seznam statistično signifikantno različno izraženih

genov (Juvan in Rozman, 2006).

Mikromreže se razlikujejo po izdelavi. Obstajajo mikromreže s krajšimi oligonukleotidi

(20 do 50 nt), ki so sintetizirani na matrici in situ. To metodo je razvilo in patentiralo

podjetje Affymetrix. Posamezne sonde so med sabo oddaljene nekaj nanometrov, vsak gen

pa je zastopan s preko 10 kratkimi oligonukleotidi. To so t.i. mikromreže visoke gostote, ki

so bolj specifične, vendar tudi dražje od druge možnosti, mikromrež nizke gostote, na

katere se nanese že prej sintetizirane oligonukleotide ali produkte verižne reakcije. Ti so


19

lahko daljši (do 500 baznih parov), sonde pa so oddaljene nekaj mikrometrov (Juvan in

Rozman, 2006).

Do pred kratkim so se mikromreže uporabljale za nekaj modelnih organizmov, za katere so

bila dostopna zaporedja celega genoma. Z napredkom tehnologije pa so sedaj omogočene

tudi raziskave drugih, ne-modelnih organizmov, ki so zaradi svoje posebne fiziologije ali

življenjskega prostora pomemben vir novih podatkov v znanosti (Juvan in Rozman, 2006).

Problem, ki se pojavlja pri uporabi mikromrež na ribjih vrstah, je pomanjkanje poznavanja

genoma in majhno število genov s poznanim nukleotidnim zaporedjem. Zato se

najpogostejše raziskave s pomočjo mikromrež izvajajo na modelnih organizmih zebrici

(Danio rerio) in napihovalki (Fugu rubripes) ter pri komercialno pomembnih ribah iz

družin salmonidov in ciprinidov. Za preučevanje nepoznanih organizmov je možna

uporaba mikromrež sorodnih organizmov, le hibridizacijski signal je na splošno manjši

(Reynders in sod., 2006).


20

3 MATERIAL IN METODE

3.1 OPIS VZORČNIH MEST

Kratki opisi vzorčnih mest trinajstih vrst uporabljenih v prvem sklopu raziskav

(Razreševanje taksonomskih nejasnosti rodu Phoxinellus) so navedeni v Preglednici 1.

Preglednica 1: Preučevane vrste iz bivšega rodu Phoxinellus in referenčni predstavniki, njihova prejšnja in sedanja klasifikacija ter opis vzorčnih mest (Palandačić in sod., 2010) Table 1: The studied taxa (previously belonging to Phoxinellus), their former and new classification and the list of sampling locations (Palandačić et al., 2010) Vrsta Rod Vzorčna mesta Prejšnje

poimenovanje Novo poimenovanje

Delminichthys adspersus

Phoxinellus Delminichthys Reka Vrljika, Imotsko polje, Hrvaška (CRO)

Delminichthys ghetaldii

Phoxinellus Delminichthys Ljubomirski potok, Popovo polje, Bosna in Hercegovina (BiH)

Delminichthys jadovensis

Phoxinellus Delminichthys Reka Jadova, Ličko polje, Hrvaška (CRO)

Delminichthys krbavensis

Phoxinellus Delminichthys Izvir Vukova pećina, Krbavsko polje, Hrvaška (CRO)

Phoxinellus pseudalepidotus

Phoxinellus Phoxinellus Mostarsko blato, Bosna in Hercegovina (BiH)

Phoxinellus alepidotus Phoxinellus Phoxinellus Reka Korana, Bosna in Hercegovina (BiH)

Phoxinellus dalmaticus

Phoxinellus Phoxinellus Reka Čikola, Povodje reke Krke, Hrvaška (CRO)

Telestes metohiensis Phoxinellus Telestes Reka Mušnica, Gatačko polje, Bosna in Hercegovina (BiH)

Telestes croaticus Phoxinellus Telestes Reka Jadova, Ličko polje, Hrvaška (CRO)

Telestes fontinalis Phoxinellus Telestes Izvir Vukova pećina, Krbavsko polje, Hrvaška (CRO)

Pelasgus prespensis Pseudophoxinus Pelasgus Prespansko jezero, Albanija Telestes souffia Telestes Telestes Reka Kamnica, Slovenija (SLO) Squalius cephalus Leuciscus Squalius Reka Cerkniščica, Slovenija (SLO) Chondrostoma nasus Chondrostoma Chondrostoma Reka Vipava (prinesena), Slovenija

(SLO)

Osemnajst vzročnih mest imotske gaovice smo izbrali tako, da smo pokrili večji del

njenega areala (Slika 2, Preglednica 2).


21

Preglednica 2: Vzorčna mesta imotske gaovice (Delminichthys adspersus) s pripadajočimi zemljepisnimi širinami (E) in dolžinami (N), nadmorsko višino (A) in okrajšavami. Navedeno je število vzorcev iz posameznega vzorčnega mesta (No.) ter število vzorcev (NoC), pri katerih je bilo določeno nukleotidno zaporedje citokroma b (mtDNA). V zadnjem stolpcu je navedena razdelitev v skupine glede na površinsko izoliranost in genetsko strukturo (GDS; Palandačić in sod., 2012a). Table 2: Summary of sampling locations for Delminichthys adspersus with respective latitude (E), longitude (N), elevation (A) and abbreviations, with number of specimens per sampling location (No), number analyzed for mtDNA analysis (NoC) and group assignment based on genetic structure and geographic proximity reported (Palandačić et al., 2012a).

Vzorčno mesto Okrajšava No NoC E in N A (m) “GDS”

Reka Rastočka Matica, izvir

Studena MAT 10 0 / prbl. 30

južni izvir porečje

Tihaljine

Reka Vrgoračka Matica, izvir

Banja, Vrgorac BVRG 27 20

N 43 13 07.03E 017 23 14.29

65

Potok Draga, vas Radušići

DRA 16 15 N 43 13 15.7 E 017 30 41.5

76

Potok Nezdravica, vas Tihaljina

NEZ 46 21 N 43 18 58.45E 017 23 20.29

161 Nezdravica

Jezerine pJEZ 53 19 N 43 27 25.77E 017 10 20.93

269

izviri Vrljike

porečje Vrljike

Grbavac GRB 34 18 N 43 27 06.22E 017 10 36.67

275

Stari vodovod STR 19 16 N 43 26 52.41E 017 10 34.1

274

Vrata, Prološko Blato

PRBL 29 23 N 43 27 30.59E 017 06 44.01

281 Prološko

Blato Grančice, Glavina

Donja GRAN 24 21

N 43 26 15.48E 017 13 3.82

268

izviri v Imotskem

Medvidovića Draga

MED 17 17 N 43 26 18.41E 017 13 41.64

268

Rebić REB 23 21 N 43 26 05.2 E 017 14 26.4

258

Izvir Jažva, Glavina Donja

GLD 37 20 N 43 26 36.76E 017 11 42.93

274

Udovice, Vinjanji Donji

UDV 28 21 N 43 25 39.2

E 017 15 15.36261

Vinajnji Donji, vodnjak

BVID 25 19 N 43 26 05.32E 017 14 26.4

264

Vinjani Donji VID 40 19 N 43 26 11.35E 017 14 20.33

264

Grudsko Vrijelo GRV 24 15 N 43 23 22.45E 017 22 04.78

263 izviri v Grudah

Jamine, Grude JAM 40 15 N 43 22 29.35E 017 23 23.77

273

Rdeče jezero (Crveno jezero)

CRV 33 37 N 43 27 14.84E 017 11 54.93

452 Rdeče jezero

Med nakaterimi vzorčnimi mesti ni površinskih vodnih povezav, medtem ko so druga

povezana preko občasnih potokov in umetnih kanalov, ali pa so v času poplav celo del

istega vodnega telesa.


22

Slika 2: Preučevani areal imotske gaovice je del Dinarskega krasa, ki se nahaja na Balkanskem polotoku, in sega od jugovzhodne Hrvaške do južne Bosne in Hercegovine. Osemnajst vzorčnih mest obsega tipsko lokacijo Rdeče jezero ter reke Vrljike, Tihaljine, Rastočke in Vrgoračke Matice in njihove pritoke. Podrobnejši opis je v Materialih in metodah (Opis vzorčnih mest), okrajšave so v Preglednici 1 (Palandačić in sod., 2012a). Figure 2: The study area is part of the Dinaric karst of the Balkan Peninsula, ranging from the southeastern Croatia to southern Bosnia-Herzegovina. Eighteen sampling locations include type locality Rdeče jezero, and direct and indirect springs of the Vrljika, Tihaljina and Matica river systems, which cover most of the distribution area of D. adspersus. See text for a detailed description, and Table 1 for abbreviations of sampling locations (Palandačić et al., 2012a).

Rdeče jezero (Slika 3), ki je 500 metrov globoko brezno z vodno gladino 250 do 300

metrov pod robom, nima nobene površinske povezave s katerim koli vzorčnim mestom ali

drugim nadzemnim vodnim virom (Garašić 2001, Bonacci 2006). Medsebojno površinsko

izolirani sta tudi porečji Vrljike in Tihaljine, ki ju spaja umeten podzemni kanal, ki ob ca.

100-metrskem višinskem padcu usmerja vodo iz ponornega dela Vrljike v HE centralo Peć

Mlini na izviru Tihaljine, ter ponikalnica Vrgoračka Matica, ki izvira in ponikne na

Vrgoračkem polju (Kanaet 1959, Džeba 2010). V študijo smo vključili tudi mesta, ki so

povezana preko presihajočih potokov in umetnih kanalov, vendar je migracija rib po teh


23

poteh zaradi pogoste presušitve malo verjetna. Migracijo poleg tega ovirajo tudi velika

razdalja, previsoka temperatura vode v poletnih mesecih, razlike v elevaciji ter

izpostavljenost plenilcem. Ta vzorčna mesta so Prološko Blato, izviri Vrljike in izviri

Grude v porečju Vrljike (Džeba 2010), ter reke Nezdravica, Draga in Rastočka Matica v

porečju Tihaljine (Kanaet 1959). Vzorčili smo tudi izvire v mestu Imotski z okolico, ki jih

z izjemo Glavine Donje in Udovic povezujejo potoki, zaradi bližine pa se voda iz izvirov

premeša tudi v času poplav.

Slika 3: Rdeče jezero (Crveno jezero; fotografija: Arne Hodalič, Palandačić in sod., 2012) Figure 3: Red lake (photography by: Arne Hodalič, Paladnačić et al., 2012) Glede na medsebojno izolacijo in geografijo smo vzorčna mesta razdelili v naslednje

geografsko določene skupine (GDS): Prološko Blato, izviri Vrljike, izviri v mestu Imotski

in okolici, izviri v Grudah, Rdeče jezero, Nezdravica in južni izviri (Draga in obe Matici)

(Preglednica 1).


24

3.2 VZORČENJE IN IZOLACIJA DNA

Za prvi sklop raziskav razreševanja taksonomskih nejasnosti smo vzorčili 13 vrst

(Preglednica 1), vključno z vsemi bivšimi vrstami iz rodu Phoxinellus ter s predstavniki

rodu Telestes, Pelasgus (staro ime Pseudophoxinus), Chodrostoma in Squalius.

V študijo populacijske strukture imotske gaovice smo vključili 544 osebkov, ki so bili

večinoma vzorčeni med letoma 2007 in 2010, z izjemo vzorcev iz Vrgoračke Matice, ki so

bili nabrani leta 1999 (osebna zbirka P. Zupančič). Zaradi starosti in morda tudi

neprimernega shranjevanja (nezadostna količina alkohola), nam mitohondrijske DNA iz te

skupine vzorcev ni uspelo pomnožiti. Uspelo pa je pomnoževanje sedmih mikrosatelitnih

lokusov, ki smo jih zaradi pomembnosti lokacije vključili v analizo. Vzorčni set iz

Rdečega jezera je bil sestavljen iz petih vzorcev ujetih leta 2007 in 32 iz leta 2010.

Ribe so bile ujete z električnim agregatom, mrežami ali vršami. Odvzet jim je bil približno

25 mm2 velik delček plavuti, po vzorčenju so bile ribe vrnjene na mesto ulova.

Celokupno DNA smo izolirali z izsoljevanjem (Miller in sod., 1988).

Za analizo diferencialnega izražanja genov z mikromrežami smo uporabili osem primerkov

imotske gaovice iz vzorčnega mesta Jezerine (pJEZ, Slika 2).

3.3 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO (PCR), DOLOČANJE NUKLEOTIDNEGA ZAPOREDJA IN GENOTIPIZACIJA

Odsek gena za rodopsin in EGR2B (angl. Early Growth Response 2B) smo pomnožili v

verižni reakciji s polimerazo z začetnimi oligonukleotidi RH_28F, RH_233F in RH_1039R

za rodopsin ter E2B_278F, E2B_287F, E2B_1108R in E2B_1117R za EGR2B (Chen in

sod., 2008). Regijo ITS1 smo pomnožili z začetnimi oligonukleotidi ITS1F (Wyatt in sod.,

2006), ITS2R (Hamilton in Tyler, 2007) ali z ITS3R (AGTGTCGATGATCAATGTGT),

ki smo ga oblikovali na osnovi rDNA nukleotidnih zaporedji vrst Scardinius

erythrophthalmus, Rutilus rutilus in Abramis brama iz Genske banke z zaporednimi

številkami AM183338, AM183339 ter AM183341.


25

Dvajset mikrolitrska mešanica za reakcijo je vsebovala 50 ng vzorčne DNA, 0.5 μM

vsakega začetnega oligonukleotida, 0.2 mM vsakega nukleotida (dNTP), 1.5 mM MgCl2,

1mM pufra za reakcijo ter 1 U Taq polimeraze (Fermentas). Pogoji reakcije so bili: 4

minute začetne denaturacije pri 95 °C, ki ji je sledilo 35 ciklov 40 sekundne denaturacije

pri 95 °C, 40 sekundnega naleganja začetnih nukleotidov pri 55 °C ter 90 sekund

podaljševanja pri 72 °C (za ITS1 45 s). Na koncu je sledilo še sedemminutno končno

podaljševanje pri 72 °C. Vse reakcije so bile izvedene v namiznem mikroprocesorsko

vodenem termostatu GeneAmp®PCRSystem2720 (AB Applied Biosystems).

Delni zapis gena za citokrom b je bil pomnožen iz približno dvajsetih naključno izbranih

primerkov imotske gaovice (n = 15–37; Preglednica 2) iz vsakega vzorčnega mesta, razen

Vrgoračke Matice, z začetnimi oligonukleotidi Glu-F in Thr-R (Zardoya in Doadrio, 1998)

in enako 20-mikrolitrsko reakcijsko mešanico kot je opisana za EGR2B in ITS1. Pogoji

reakcije so bili: 1 minuta začetne denaturacije pri 94 °C, ki ji je sledilo 35 ciklov 30

sekundne denaturacije pri 94 °C, 30 sekundnega naleganja začetnih nukleotidov pri 55 °C

ter 60 sekund podaljševanja pri 72 °C. Na koncu je sledilo še triminutno končno

podaljševanje pri 72 °C. Vse reakcije so bile izvedene v namiznem cikličnem

pomnoževalniku GeneAmp®PCRSystem2720 (AB Applied Biosystems).

Čiščenje in določitev nukleotidnega zaporedja pomnoženih DNA fragmentov je bilo

opravljeno v Macrogen Inc (Koreja).

Pomnoževanje izbranih mikrosatelitnih lokusov (Preglednica 3) smo izvedli s

fluorescentno označenimi začetnimi oligunukleotidi v 10 μl reakcijskih mešanicah s 50 ng

vzorčne DNA, 0.5 μM vsakega začetnega oligonukleotida, 0.2 mM vsakega nukleotida

(dNTP), 1.0 mM MgCl2, 1mM pufra za reakcijo ter 1 U Taq polimeraze (Fermentas) po t.i.

»touchdown« protokolu (Hamilton in Taylor, 2007). »Touchdown« protokol pomeni

postopno zniževanje temperature naleganja začetnih oligonukleotidov vsakih nekaj ciklov

pomnoževanja, s čimer se izogibamo pomnoževanju nespecifičnih nukleotidnih zaporedji.

Del fluorescentno označene pomnožene DNA (1.5 μl) smo zmešali s formamidom in

dolžinskim standardom GENESCAN-LIZ 500 (Applied Biosystems) in genotipizirali na

avtomatskem kapilarnem določevalniku nukleotidnih zaporedji (sekvenatorju) ABI-3130 s


26

programom GeneScan Analysis Software 3.7. Podatke smo obdelali s programom

GeneMapper 4.0 (ABI), v katerem označimo razpon velikosti za določen alel mikrosatelita

(npr. od 177 do 178 bp), saj je dolžina istega alela mikrosatelita pogosto različna za nekaj

desetink (npr. 171.6, 171.8, 172.0). Ker pa je pri avtomatskem odčitavanju mikrosatelitov

lahko dolžina napačno poenostavljena (npr. 171 in 172, čeprav je osnovni motiv dolg 2

bp), smo podatke še ročno pregledali, nato pa izvozili dejanske, decimalne vrednosti dolžin

mikrosatelitov ter jih poenotili s programom TANDEM 1.07 (Matschiner in Salzburger,

2009). Program določi dolžino osnovnega motiva ter decimalne vrednosti pravilno poenoti

tako, da je vsaka naslednja dolžina večja za dolžino osnovnega motiva.

Preglednica 3: Začetni oligonukleotidi uporabljeni v analizi populacijske strukture imotske gaovice z mikrosateliti (ime, razpon velikosti, osnovni motiv, nukleotidno zaporedje, barvna značka, referenca). Tabel 3: Primers used for microsatellite analysis (name, size range, core motif, primer sequence, fluorescent dye, reference). IME Razpon

velikosti (bp) Osnovni motiv

Nukleotidno zaporedje začetnega oligonukleotida

Barvna značka

Reference

Ca1 110–230 (150–180)

(CA)24 F: AAGACGATGCTGGATGTTTAC R: CTATAGCTTATCCCGGCAGTA

FAM Dimsoski et al. (2000)

Ca3 190–350 (200–300)

(TAGA)14 F: GGACAGTGAGGGACGCAGAC R: TCTAGCCCCCAAATTTTACGG

VIC - | | -

CypG3 200–380 (200–300)

(CAGA)2 (TAGA)11

F: AGTAGGTTTCCCAGCATCATTGT R: GACTGGACGCCTCTACTTTCATA

NED Baerwald & May (2004)

CypG5 160–300 (150–300)

(TAGA)12 F: AGTTGATGCCTGTTTTGTTTGTAT R: AGTTGTGTCAGGGTCTGTAGAA

PET - | | -

CypG27 210–310 (250–300)

(TAGA)8 F: AAG GTA TTC TCC AGC ATT TAT R: GAG CCA CCT GGA GAC ATT ACT

FAM - | | -

CypG24 150–160 (150–200)

(CAGA)19 F:CTGCCGCATCAGAGATAAACACTTR: TGGCGGTAAGGGTAGACCAC

FAM - | | -

Rru4 160–200 (200)

(CA)15 F: TAAGCAGTGACCAGAATCCA R: CAAAGCCTCAAAAGCACAA

PET - | | -

Lsou34 230–280 (280–290)

(GT)15 F: CCAGACAGGGTGATGATTCC R: GTAGCGACGTTCAGGTCTCG

NED Muenzel et al. (2007)

3.4 FILOGENETSKA ANALIZA VRST RODU PHOXINELLUS

3.4.1 Jedrni geni

Pridobljena delna nukleotidna zaporedja rodopsina, EGR2B in ITS1 smo poravnali s

programom Muscle (Edgar, 2004), ki je vključen v program Seaview 4.2.3. Nato smo

odrezali slabo določene konce zaporedji in določili evolucijski model, ki najbolje opiše

potek substitucij v izbranih zaporedjih (test modela DNA substitucij) s programom

jModelTest 0.1 (Guindon in Gascuel, 2003; Posada, 2008). Testirali smo vsako regijo

ločeno kot tudi vse tri regije skupaj. Za izbiro modela smo uporabili dva kriterija: Bayesov


27

informacijski kriterij (BIC; Schwarz, 1978) in Akaiketov informacijski kriterij (AIC;

Akaike, 1974). Sledil je izris filogenetskih dreves na podlagi različnih kombinacij

zaporedji (npr. samo ITS1, vse tri regije skupaj…) z metodami: (i) največjega verjetja

(ML) vključeno v program GARLI 1.0 (Zwickl, 2006), (ii) Bayesova metoda vključena v

program MrBayes 3.1.2 (Ronquist in Huelsenbeck, 2003) in (iii) NJ vključeno v program

Seaview. V programu GARLI smo podporo filogenetskemu drevesu zagotovili s

samovzorčenjem z 2000 ponovitvami. Da smo lahko vsaki od združenih regij določili svoj

model evolucije, smo uporabili program GARLI-PART 0.97 (500 ponovitev za podporo s

samovzorčenjem). Program MrBayes je tekel 500,000 generacij, dokler številka za

standardno deviacijo ločenih frekvenc ni padla pod 0.01, kot svetuje priročnik programa.

Ali se je analiza ustalila (konvergirala), smo grafično preverili tudi s programom AWTY

(angl. Are We There Yet, Wilgenbusch in sod., 2004). Drevo z metodo sosedskega

združevanja je bilo izračunano z 10,000 ponovitvami.

3.5 ANALIZA POPULACIJSKE STRUKTURE IMOTSKE GAOVICE

3.5.1 Mitohondrijska DNA

Pridobljena (delna) nukleotidna zaporedja za citokrom b smo pregledali in poravnali v

programu MEGA 5.0 (Tamura in sod., 2011). Nato smo v programu jModeltest z BIC

kriterijem določili model, ki najbolje opiše potek substitucij v zbranih zaporedjih (TrN;

Tamura in Nei, 1993) ter poravnavo »zrušili« (angl. collapse), kar pomeni, da smo ohranili

le po en unikaten haplotip in informacijo, pri katerih vzorci ga najdemo. Sledil je izris

filogenetskega drevesa s programom PAUP (Swofford, 2003), na podlagi katerega smo

naredili genealogijo haplotipov. S pomočjo programa Arlequin 3.11 (Excoffier, 2007) smo

izračunali nukleotidno diverziteto (Nei, 1987) zaporedji.

Stopnjo raznolikost med vzorčnimi mesti smo določili s paroma primerjanimi genetskimi

razdaljami na podlagi Φ-statistike (paroma primerjani ΦST-ji; Wright, 1978) ter z analizo

molekularne variance (angl. analysis of molecular variance, AMOVA), ki smo jih

izračunali v programu Arlequin. Signifikantnost analiz je bila testirana s 16,000

permutacijami originalnega seta podatkov. P-vrednosti smo modificirali z Bonferronijevo

korekcijo (Rice, 1989; Cabin in Mitchell, 2000).


28

Demografska zgodovina populacije (ekspanzije ali ozka grla) je bila testirana na nivoju

vrste s ti. »mismatch« analizo (Li, 1977), za katero smo uporabili vsa določena zaporedja

citokroma b. Dobljeno distribucijo paroma primerjanih distanc smo primerjali z modelom

hitre populacijske ekspanzije s pomočjo generaliziranega nelinearnega postopka

najmanjšega kvadrata (Schneider in Excoffier, 1999), ki je vključen v program Arlequin.

Statistična signifikantnost ustreznosti modela je bila ocenjena z vsoto kvadriranih deviacij

in Harpendingovim indeksom (angl. raggedness index; 10,000 ponovitev).

3.5.2 Mikrosateliti

Rezultate dobljene z genotipizacijo smo testirali s programom Micro-Checker (Van

Oosterhout in sod., 2004), da bi odkrili ničelne alele, zdrse polimeraze (angl. stuttering) in

izpad alelov. Ker program deluje na osnovi Hardy-Weinbergovega ravnotežja in bi lahko

podstrukture napačno interpretiral kot enega od zgoraj naštetih pojavov, smo testirali vsako

od geografsko določenih skupin posebej.

Genetsko raznolikost vrste, povprečno število alelov ter pričakovano in opaženo

heterozigotnost smo ocenili s programom Arlequin (100,000 MCMC generacij in 10,000

dememorizacijskih korakov (Nei, 1987)). Informacijo o populacijski strukturi in parjenju v

sorodstvu smo pridobili s pomočjo izračuna Wrightovega koeficienta FIS (Wright, 1978) po

metodi Weira in Cockerhama (1984) v programu Fstat 2.9.3.2 (Goudet, 2001), ki ima že

vključeno Bonferronijevo korekcijo.

S primerjavo koeficientov RST (temelji na številu ponovitev mikrosatelitnega motiva) in

FST (temelji na identiteti alelov) smo ugotavljali, ali so mutacije bistveno doprinesle k

genetski diferenciaciji med skupinami. Iz tega lahko tudi sklepamo, da večji kot je razpon

števila ponovitev, več časa je minilo, od kar so se populacije medsebojno ločile (Hardy in

sod., 2003). RST in FST smo primerjali s programom SPAGEDI 1.3 (Hardy in Vekemans,

2002; 20,000 permutacij), ki izračuna, ali je vrednost opaženega RST signifikantno različna

od vrednosti RST izračunane po permutacijah alelnih velikosti znotraj populacij.

Stopnjo genetske raznolikosti med pari vzorčnih mest (paroma primerjani FST-ji) smo

izračunali v programu Arlequin (1000 permutacij, 5 % manjkajočih podatkov) in programu


29

RST-CALC (paroma primerjani RST-ji; 1000 ponovitev; Goodman, 1997). Na osnovi

opaženih razlik smo izvedli tudi analizo molekularne variance s programom Arlequin, s

katero smo ugotovili, kako je varianca razporejena med skupinami, med populacijami

znotraj skupin ter znotraj populacij.

Z metodo skupnih alelnih razdalj (angl. shared allele distances; Chakraborty in Jin, 1993)

smo v programu Populations 1.2.30 (Langella, 1999) izračunali populacijsko drevo.

Podporo drevesu smo zagotovili s samovzorčnejem s 100 ponovitvami.

Genetsko podobnost oziroma variabilnost med vzorci smo grafično predstavili v

tridimenzionalnem prostoru s faktorielno korespondenčno analizo (FCA; angl. Factorial

Correspondence Analysis) s programom Genetix 4.05.2 (Belkhir in sod., 2004).

Od metod za določanje podskupin, ki temeljijo na Bayesovem principu, smo uporabili

STRUCTURE 2.3.1 (Pritchard in sod., 2000; Falush in sod., 2003; Falush in sod., 2007;

Hubisz in sod., 2009) in BAPS 5.3 (Corander in sod., 2003; Corander in Marttinen, 2006;

Corander in sod., 2006; Corander in sod., 2008). V STRUCTURE smo za analizo uporabili

model mešanja (angl. admixture model) in korelirane alelne frekvence med populacijami

(angl. correlated allele frequencies). MCMC veriga je tekla 1500,000 generacij, po tem ko

smo začetnih 100,000 generacij zavrgli. Število klastrov (K) je bilo določeno med ena in

sedem. Za vsako vrednost K smo naredili 20 ponovitev. Da smo zagotovili konvergenco

MCMC verige, smo celotno analizo trikrat ponovili. Rezultate smo nato analizirali še z

metodo po Evannu (Evanno in sod., 2005), ki določa najverjetnejšo vrednost K. S

programom STRUCTURE smo izvedli tudi hierarhično analizo (Vähä in sod., 2007), v

kateri postopno izločamo iz analize najbolj diferencirano skupino. Poleg tega vsako

izločeno skupino analiziramo, da bi odkrili morebitno skrito pod-strukturiranost. Pri tem

pristopu smo po 50,000 zavrženih generacijah MCMC verigo pustili teči še dodatnih

150,000 generacij, testirane K vrednosti pa smo izbrali glede na posamezen primer. V

programu BAPS smo minimalno velikost populacije nastavili na 10 osebkov. Za oceno

koeficienta mešanja (angl. admixture coeficient) smo uporabili 100,000 ponovitev ter za

število referenčnih osebkov iz vsake populacije določili 200, za število ponovitev za oceno

koeficienta mešanja za referenčne osebke pa smo določili 10.


30

Ker metode vključene v STRUCTURE in BAPS delujejo na osnovi več-lokusnih

genotipov, katerih lokusi so med seboj neodvisni, je bilo potrebno neodvisnost izbranih

mikrosatelitnih lokusov preveriti z uporabo vezavnega neravnovesja (angl. linkage

disequlibrium; Slatkin, 1994; Slatkin in Excoffier, 1996). Test smo opravili v programu

Arlequin s 16,000 permutacijami in štirimi začetnimi pogoji ter p-vrednosti prilagodili z

Bonferronijevo korekcijo.

Ali je v posameznih geografsko določenih skupinah oziroma v podatkovnem setu kot celoti

prišlo do ozkih grl, smo testirali s programom Bottleneck 1.2.02 (Piry in sod., 1999), ki

primerja opaženo heterozigotnost in heterozigotnost izračunano glede na število alelov

(Cornuet in Luikart, 1996). Ker mikrosateliti redko mutirajo strogo po SMM modelu (angl.

Stepwise Mutation Model; Ellegren, 2004), smo analizo izvedli z dvostopenjskim

mutacijskim modelom, pri katerem smo določili, da se v desetih odstotkih mutacij dolžina

mikrosatelita spremeni za več kot eno ponovitev osnovnega motiva in z desetodstotno

varianco. Po navodilih avtorjev smo uporabili Wilcoxonov test, ki je najprimernejši, kadar

imamo manj kot 20 lokusov.

Da bi določili količino in smer genskega toka med skupinami, smo uporabili model

izolacije-z-migracijo (angl. isolation-with-migration model; IM), kot je vključen v program

IMa2 (Hey in Nielsen, 2007). Vzorčna mesta so bila v skupine združena glede na

geografske lastnosti ter paroma primerjane FST-je. Iz vsake skupine smo v analizo vključili

set naključno izbranih 36 osebkov in kjer je bilo možno (dovolj veliko število osebkov),

analizo vzporedno izvedli še z dodatnim neodvisnim setom iz iste skupine. S tem smo

želeli testirati, ali z različnimi seti vzorcev iz istih vzorčnih mest dobimo enake rezultate,

torej ali je prišlo do ustalitve MCMC verige (konvergence). Analiza je bila izvedena na

kombiniranem setu podatkov, sestavljenem iz mikrosatelitne in mitohondrijske DNA. Za

mikrosatelitne lokuse smo uporabili model SMM, za del zapisa za citokrom b pa model

HKY. Za prilagoditev pričakovane efektivne velikosti populacije smo uporabili skale

dedovanja (angl. inheritance scalars): 0.25 za mtDNA ter 1 za mikrosatelite. Razponi

parametrov za nespremenljive vhodne podatke (angl. uniform priors) so bili določeni s

poskusnimi testi ter nato določeni na t ϵ (0, 2] in Θ1, Θ2, ΘA ϵ (0, 500]. Kot vhoden

podatek za izračun migracijskih stopenj smo uporabili eksponentne distribucije s srednjo


31

vrednostjo 2. Geometrična shema segrevanja (angl. heating scheme) parametrov in njihov

efekt na stopnje zamenjav sta bila preučena v preliminarnih testih in nato določena na ha =

0.97 in hb = 0.80. Za vsako par primerjanih skupin smo izvedli pet neodvisnih ponovitev

in pustili teči MCMC verigo v M-načinu po prvotno zavrženih 500,000 generacijah še 3,5

milijonov generacij. Pet neodvisnih ponovitev je bilo nato združenih v L-načinu in

testiranih z enakimi parametri.

Ker program IMa2 oceni celokupno migracijo od časa ločitve populacij do sedanjosti, iz

rezultatov pa ni razvidno, kdaj je do migracije prišlo, smo s programom Geneclass2 (Piry

in sod., 2004) ocenili, koliko osebkov se je domnevno preselilo v zadnji generacij. V ta

namen smo uporabili metodo, ki jo je razvil Paetkau in sod. (2004) in omogoča oceno

migrantov v zadnji generaciji (angl. genetic assignment method for direct real-time

estimation of first generation migrants). Za izračun števila domnevnih migrantov smo

uporabili metodo na osnovi frekvenc (Paetkau in sod., 1995). Za število manjkajočih alelov

smo uporabili frekvenco 0.01 ter možnost Lhome (verjetnost, da izberemo genotip osebka iz

populacije, v kateri je bil tudi vzorčen), ker je možno, da nismo vzorčili vseh populacij, ki

so prispevale migrante v podatkovni set. Verjetnostni izračun je bil izveden z MCMC

algoritmom ponovnega vzorčenja in 10,000 simuliranimi osebki ter napako prve vrste (α)

0.05 kot predlaga avtor, kadar uporabljamo Lhome.

3.6 ANALIZA DIFERENCIALNEGA IZRAŽANJA GENOV Z MIKROMREŽAMI

3.6.1 Postavitev poskusa

V tretjem sklopu raziskav smo izbrali 8 rib enake velikosti in teže. Ribe so tri mesece

preživele v skupnem akvariju. Nato smo jih razdelil v dve skupini ter jih dali v ločena

enako velika akvarija s temperaturo vode 15 °C. Obe skupini rib smo hranili z enako

količino akvarijske ribje hrane v lističih. V prvem akvariju smo z avtomatsko lučjo

vzdrževali normalno, 12 urno foto-periodo. Druga skupina je živela v neprestani temi, ki

smo jo zagotovili z večkratnim ovitjem akvarija z aluminijasto folijo. Po enem mesecu smo

ribe ob enih ponoči evtanazirali, jim odvzeli jetra in jih shranili v tekočino, ki blokira

delovanje encimov za razgradnjo RNA (RNAlaterTM, Ambion). Odvzem jeter smo opravili

ponoči, da bi se izognili razliki v izraženosti genov zaradi dnevno-nočnega ritma rib z 12


32

urno foto-periodo. Jetra smo nato na ledu poslali v analizo z mikromrežami v podjetje

EcoArray, Inc. (Gainesville, Florida).

3.6.2 Analiza mikromrež

Izolacijo RNA ter razliko v ekspresiji genov na mikromreži so opravili v podjetju

EcoArray Florida. Uporabljeni čipi so bili razviti v podjetju EcoArray in proizvedeni v

podjetju Agilent Technologies, Inc. Vsebujejo več kot 26,000 kratkih zaporedji (sond), ki

so bila pripravljena s pomočjo DNA knjižnic iz različnih organov (jeter, možganov, ledvic)

vrste črnoglavi pisanec (Pimepales promelas), ki pripada isti poddružini (Leuscisinae) kot

imotska gaovica.


33

4 REZULTATI

4.1 RAZREŠEVANJE TAKSONOMSKIH NEJASNOSTI V SKUPINI GAOVICE

Z določanjem nukleotidnega zaporedja smo pri trinajstih vrstah naštetih v Preglednici 1

dobili 700 baznih parov dolg fragment gena EGR2B, 687 baznih parov dolg fragment gena

za rodopsin in med 350 (Squalius cephalus) in 175 (Delminichthys krbavensis) baznih

parov dolge fragmente ITS1. Dolžine so se razlikovale predvsem zaradi številnih delecij in

insercij, zaradi katerih so bili deli ITS1 pri nekaterih vrstah neberljivi. Zato smo na koncu

uporabili 262 baznih parov dolgo poravnano zaporedje, pri čemer je bilo zaporedje vrste D.

krbavensis krajše. Pri podusti (Chondrostoma nasus) je bilo določanje nukleotidnega

zaporedja vseh treh izbranih regij neuspešno, zato smo jo izpustili iz nadaljnje analize.

Nukleotidna zaporedja so dostopna v Genski banki pod zaporednimi številkami HQ232304

do HQ232342.

Evolucijski modeli, ki glede na kriterij BIC najbolje opišejo razvoj izbranih fragmentov, so

F81 za EGR2B, HKY + G za rodopsin in TPM2uf + G za ITS1, medtem ko so bili glede na

AIC kriterij najustreznejši modeli TPM1uf za EGR2B, HKY za rodopsin in TVM + G za

ITS1. Kombinacijo vseh treh delnih zaporedji (EGR2B, rodopsin in ITS1; 1657 bp)

najbolje opišeta modela TPM2uf + G (BIC) in GTR + G (AIC).

Ne glede na uporabljeno metodo ali evolucijski model so na vseh filogenetskih drevesih

štirje predstavniki novo predlaganega rodu Delminichthys vedno tvorili eno, dobro podprto

skupino, kateri je sestrsko skupino predstavljala vrsta Pelasgus prespensis. Ostali topološki

odnosi so se spreminjali glede na to, katero kombinacijo regij in kateri program za izačun

drevesa smo uporabili. Največje razlike so bile med drevesom, ki je temeljil le na regiji

ITS1, in drevesom osnovanim na treh združenih zaporedjih. Na ITS1 drevesu vrste Ph.

dalmaticus, Ph. pseudalepidotus in Ph. alepidotus tvorijo eno dobro podprto skupino z

vrednostmi podpore s samovzorčenjem 75 (ML), 86 (NJ) in posteriorno verjetnostjo ena.

Na drevesu združenih zaporedji se vrste odcepljajo v padajočem zaporedju (Slika 4),

vendar je ta vzorec slabo podprt. Prav tako je razlika pri vrstah Telestes croaticus in T.

fontinalis, ki na ITS1 drevesu tvorita dobro podprto skupino, medtem ko je ista skupina na


34

drevesu iz združenih zaporedji zelo slabo podprta (28, -,46). Na drevesu iz združenih

zaporedji je bil dobro podprt sestrski odnos med združenima rodovoma Pelasgus -

Delminichthys in vrsto Ph. pseudalepidotus (Slika 4), medtem ko je bil položaj T.

metohiensis nejasen in slabo podprt. V Bayesovi metodi in odvisno od evolucijskega

modela je vrsta večinoma tvorila politomijo s T. croaticus and T. fontinalis, medtem ko je

pri metodi največjegaega verjetja predstavljala sestrsko skupino T. croaticus – T.

fontinalis. Z metodo sosedskega združevanja položaja T. metohiensis sploh ni bil mogoče

razrešiti. Tudi položaj T. souffia je bil nekonsistenten, a je bil pogosteje določen kot bližnji

sorodnik vrst rodu Phoxinellus, kot sorodnik vrst T. croaticus, T. fontinalis in T.

metohiensis, ki naj bi sodile v rod Telestes. Najbolj je bila sorodnost med vrstami

Phoxinellus in T. souffia očitna pri analizi z Bayesovo metodo, ki je bila podprta s

posteriorno verjetnostjo 0.97 (Slika 4). Razporeditev vrst znotraj rodu Delminichthys je

ostala nerazrešena, vzorec sorodnosti je bil odvisen od uporabljene metode in zaporedja.

Med odkritimi delecijami in insercijami v nukleotidnem zaporedju regije ITS1 je bila ena

od njih razločevalna. Opažena je bila le v zaporedjih vseh vrst iz rodu Delminichthys in

vrste Pelasgus prespensis. Deset baznih parov dolgo insercijo smo zato uporabili kot ločen

filogenetski znak, saj programi za izračun dreves insercij običajno ne upoštevajo.


35

Slika 4: Filogenetsko drevo bivšega rodu Phoxinellus ter referenčnih vrst Telestes souffia in Squalius cephalus izračunano z metodo največjega verjetja v programu GARLI, kjer je bil omogočen lasten evolucijski model za vsakega od združenih zaporedji (delno zaporedje rodopsina – HKY+G, EGR2B – F81, ITS1 - TPM2uf+G). Na vejah so napisane tudi vrednosti podpore (ML/PP/NJ). Poleg podpore izračunane z metodo ML, še pri izračunu z Bayesovo metodo (posteriorne verjetnosti, PP) in metodo NJ (podpora s samovzorčenjem; Palandačić in sod., 2010). Figure 4: Maximum likelihood (ML) tree of former Phoxinellus genus along with Telestes souffia and Squalius cephalus as reference taxa, performed in GARLI partitioned version and based on three nuclear DNA regions (partial gene sequences for Rhodopsin - HKY+G, Early Growth Response 2B - F81,and Internal Transcribed Region 1 - TPM2uf+G). ML bootstrap values, values for posterior probabilities in Bayesian analysis (PP) and Neighbour-Joining (NJ) bootstrap values are indicated on branches (ML/PP/NJ; Palandačić et al., 2010).

4.2 POPULACIJSKA STRUKTURA IMOTSKE GAOVICE

4.2.1 Mitohondrijska DNA

Z določanjem nukleotidnega zaporedja citokroma b pri 337 osebkih iz sedemnajstih

vzorčnih mest smo dobili 999 baznih parov dolgo poravnavo brez vrzeli. Zaporedja so


36

dostopna v Genski banki pod zaporednimi številkami JN101952-JN102110 in JQ315936-

JQ316113. Po »zrušenju« poravnave (»collapsing«) smo dobili 74 unikatnih haplotipov.

Izrisana genealogija haplotipov je imela zvezdasto obliko (Slika 5). Nobeno od vzorčnih

mest in nobena od geografsko določenih skupin ni tvorila ločene populacije. Haplotipi 1

(H1; 46% vseh vzorcev), 2 (H2; 19%) in 3 (H3; 7%) so bili najpogostejši in tudi

geografsko najbolj razširjeni, pri čemer se H2 in H3 od H1 razlikujeta v eni substituciji.

Tudi večina prostalih haplotipov se je od treh najpogostejših razlikovala le za eno

substitucijo. Večinoma so bili ti haplotipi prisotni le pri enem vzorcu oziroma pri vzorcih

iz enega vzorčnega mesta.

Slika 5: Nekoreninjena genealogija haplotipov izrisana na podlagi 337 delnih nukleotidnih zaporedji citokroma b (999 bp). Oznake se nanašajo na opažene haplotipe, ki jih tudi v tekstu imenujemo H1, H2, H3… Barve predstavljajo vzorčna mesta, velikost premera krogov pa število vzorcev, ki nosijo določen haplotip (Palandačić in sod., 2012a). Figure 5: Unrooted haplotype genealogy based on 337 cytochrome b gene sequences (999bp). Labels refer to observed haplotypes (in the text referred to as H1, H2, H3, etc.); colors denote sampling sites, and radii reflect the number of individuals per haplotype (Palandačić et al. 2012a).

Najbolj opazna lastnost genealogije je skoraj popolna odsotnost vzorcev s haplotipom H1 v

reki Vrljiki (en vzorec iz pJEZ), medtem ko pri vzorcih v Nezdravici nismo odkrili

nobenega vzorca s haplotipom H2. Tudi v južnih izvirih je prisoten le en vzorec s


37

haplotipom H2. Haplotip H3 je najpogostejši pri vzorcih iz izvirov Vrljike, imajo pa ga še

trije vzorci iz izvirov Imotskega, eden vzorec iz Grud in eden iz Prološkega Blata. Vzorci

iz Nezdravice so večinoma nosilci haplotipa H1 (81%) in H49 (14%). Podobno tudi v

Rdečemu jezeru najdemo največ vzorcev s haplotipom H1 (68%), čeprav jih je nekaj imelo

tudi H2 (8%), 24% osebkov pa je imelo unikatne haplotipe. Natančen seznam haplotipov

po vzorčnih mestih je v Prilogi A.

Povprečna nukleotidna raznolikost vseh lokusov je bila 0.001243 (+/- 0.000873).

Rezultati paroma primerjanih genetskih razdalj med vzorčnimi mesti so potrdili opažanja

na osnovi genealogije, saj so se najbolj razlikovali vzorci iz Nezdravice in vsa tri vzorčna

mesta izvirov Vrljike (p ≤ 0.001). Signifikantne razlike so bile še med vzorčnimi mesti

Nezdravica in Prološko Blato, Rdeče jezero ter Medvidovičeva Draga, medtem ko so bila

tri vzorčna mesta izvirov Vrljike poleg Nezdravice še signifikantno različna od Rdečega

jezera in Banje v Vrgorcu. Podrobni rezultati so predstavljeni v Prilogi B.

Za analizo molekularne variance (AMOVA) smo vzorčna mesta razdelili glede na paroma

primerjane genetske razdalje v tri skupine: (i) Nezdravica, (ii) izviri Vrljike, (iii) vsa ostala

vzorčna mesta. Varianca je bila največja znotraj populacij (89%; p ≤ 0.00069), medtem ko

je bila med skupinami 9% (p ≤ 0.00001). Razlika med populacijami znotraj skupin ni bila

signifikantna (2%; p ≤ 0.11436).

Pri analizi nenadne demografske ekspanzije (Slika 6; angl. mismatch analysis) smo pri

primerjavi porazdelitve paroma primerjanih razlik med haplotipi naših vzorcev odkrili

ujemnje z modelno, eno-modalno porazdelitvijo, vendar je bila hipoteza demografske

ekspanzije zavrnjena tako s testom vsote paroma primerjanih deviacij (p = 0.041), kot tudi

s signifikantnim Harpendingovim indeksom (p = 0.002), ki je nakazal na razpršenost okoli

hipotetične krivulje.


38

Slika 6: Analiza demografske ekspanzije (angl. mismatch analysis). Porazdelitev se je ujemala s hipotetično krivuljo, a je bila s statističnimi testi zavrnjena. Figure 6: Mismatch analysis. The hypothesis of sudden demographic exansion was rejected.

4.2.2 Mikrosateliti

Petsto štiriinštirideset osebkov D. adspersus iz 18 različni lokacij je bilo genotipizirano z

osmimi mikrosatelitnimi lokusi. Tisti vzorci, pri katerih je bilo določanje števila ponovitev

neuspešno pri treh ali več lokusih, so bili izključeni iz nadaljnje analize. Vse nadaljnje

postopke smo izvedli s podatkovnim setom, ki je vključeval 522 genotipiziranih osebkov.

Analiza s programom Micro-Checker ni razkrila ničelnih alelov pri nobeni izmed

geografsko določenih skupin, z izjemo skupine iz Rdečega jezera. Pri samostojni analizi

vzorcev iz leta 2007 in 2010, ničelni aleli niso bili več prisotni. Izpadov alelov ali zdrsov

polimeraze ni bilo pri nobeni skupini.


39

Povprečno število alelov na vseh lokusih je bilo 11.4 (sd = ±2.4), pričakovana

heterozigotnost pa 0.761 (sd = ± 0.053). FIS indeks za celokupen set podatkov je bil 0.055

(p = 0.0001), kar lahko pomeni parjenje v sorodstvu oziroma podstrukture. Vrednosti FIS

indeksov izračunanih na posameznih vzorčnih mestih, kot tudi na geografsko določenih

skupinah, niso nakazovale na podstrukture (Preglednica 4). Primerjava opažene vrednost

RST (0.087) z vrednostjo RST po permutacijah alelnih velikosti med aleli znotraj populacij

(0.037; p = 0.0018) je pokazala, da so enostopenjske mutacije doprinesle h genetski

različnosti populacij. Signifikantno večji RST v primerjavi z FST (0.051) je pokazal tudi

relativno pomembnost mutacijske stopnje v primerjavi z naključnim genskim drsom.

Preglednica 4: Populacijski parametri imotske gaovice: število osebkov (N); indeksi parjenja v sorodstvu, izračunani s programom FSTAT (FIS), za vsakega od vzorčnih mest in za geografsko določene skupine; povprečno število alelov na lokus, pričakovana in opažena heterozigotnost (Arlequin; Palandačić in sod., 2012a). Table 4: Population parameters; N, number of individuals; FIS (FSTAT) for each population and for pooled groups; NA, average number of alleles per locus; HEXP, expected average heterozygosity; HO, observed heterozygosity (Arlequin; Palandačić et al., 2012a).

GDS Okrajšava N FIS Pooled FIS NA HEXP HO

južni izviri DRA 16 0.111 0.012 9.750 0.710 0.796

BVRG 27 -0.031 11.000 0.822 0.798

MAT 10 -0.003 7.250 0.779 0.772

Rdeče jezero CRV 33 0.082 0.073 10.750 0.676 0.728

izviri v Imotskem GLD 37 0.026 0.016 13.500 0.785 0.806

BVID 25 0.010 13.000 0.773 0.780

REB 23 0.020 13.000 0.785 0.800

GRAN 24 0.030 12.375 0.776 0.795

MED 17 0.060 11.625 0.760 0.807

UDV 28 0.029 12.875 0.770 0.792

VID 40 -0.041 15.625 0.832 0.800

izviri v Grudah GRV 24 0.007 0.016 11.500 0.787 0.792

JAM 40 0.021 14.125 0.784 0.801

Nezdravica NEZ 46 0.012 0.012 5.500 0.615 0.622

izviri Vrljike PJEZ 53 0.004 -0.024 11.250 0.719 0.721

GRB 34 -0.086 10.375 0.817 0.754

STR 19 0.001 9.250 0.748 0.749

Prološko Blato PRBL 29 -0.013 -0.013 12.625 0.779 0.769


40

Paroma primerjane genetske razdalje med vzorčnimi mesti na osnovi F in R statistike so

podane v Prilogi C (FST) in D (RST). Glede na paroma primerjane FST-je je v podatkovnem

setu prisotnih šest skupin, ki so v skladu z razdelitvijo na geografske skupine. Teh šest

skupin je: Nezdravica, Rdeče jezero, izviri Vrljike, Prološko Blato, južni izviri in

»centralna« skupina, ki združuje izvire v Imotskem in okolici (BVID, GLD, GRAN, MED,

REB, UDV in VID) ter oba izvira v Grudah (GRV in JAM). Za analizo molekularne

variance (AMOVA) smo vzorčna mesta razdelili glede na paroma primerjane genetske

razdalje v šest skupin: (i) Nezdravica, (ii) izviri Vrljike, (iii) Rdeče jezero, (iv) Prološko

Blato, (v) »centralna« skupina in (vi) južni izviri. Varianca je bila največja znotraj

populacij (93.3%, p ≤ 0.00001), medtem ko je bila med skupinami 6% (p ≤ 0.00001).

Razlika med populacijami znotraj skupin ni bila statistično signifikantna (0.2%; p ≤

0.20554).

Populacijsko drevo je pokazalo zelo podobne rezultate kot FST analiza (Slika 7). Med

šestimi skupinami sta najbolj oddaljeni Nezdravica in izviri Vrljike. Med izvir v Grudah in

izviri v Imotskem ni razlik.


41

Slika 7: Populacijsko drevo narisano z metodo skupnih alelnih razlik v programu Populations. Figure 7: Population tree based on shared allelic distances (Populations).

Na grafu FCA (Slika 8) prve tri osi razložijo 5.11% celotne genetske variance. Šest skupin

določenih s paroma primerjanimi FST-ji in populacijskim drevesom ni očitnih, čeprav so

vzorci iz Nezdravice in južnih izvirov skoncentrirani na enem koncu ter vzorci iz Vrljike

na drugem koncu grafa. Vzorci iz Rdečega jezera in Prološkega Blata so pomešani med

vzorce iz »centralne« skupine.


42

Slika 8: Graf FCA narejen v programu Genetix. Prve tri osi razložijo 5.11% celotne genetske variance. Pomen barvnih oznak je enak kot na sliki 7. Figure 8: FCA plot, produced with the software Genetix. The first three axes explain 5.11 % of total genetic variance; color coding as in Figure 7.

Test vezavnega neravnovesja je potrdil neodvisnost izbranih mikrosatelitnih lokusov in s

tem omogočil njihovo uporabo za analizo z Bayesovimi metodami.

Analiza podatkovnega seta z z Bayesovimi metodami je razdelila vzorce v tri oziroma štiri

skupine. Program STRUCTURE je kot najverjetnejše število skupin tako za vrednost K=3

kot tudi za K=4 izračunal skoraj enake vrednosti posteriorne verjetnosti (Slika 9).


43

Slika 9: Grafi posterirne verjetnosti (LnP (D)) izračunane pri številu skupin K = 1 – 7 s programom STRUCTURE. Analiza je bila ponovljena dvajsetkrat za vsako K vrednost (prva vrstica). Vrednosti K = 3 in K = 4 imata enako posteriorno verjetnost (druga vrstica), le da je pri vrednosti K = 3 manj odstopanj od srednje vrednosti (tretja vrstica). Figure 9: Plots of posterior probability (LnP (D)) calculated for clusters from K = 1 to K = 7 conducted with software STRUCTURE. Analysis was repeated 20 times for each K value (1st row), values of LnP (D) for K = 3 and K = 4 were the same (2nd row), however K = 4 has more variance around the mean value.

Ko smo rezultate iz analize s programom STRUCTURE modificirali, kot predlaga Evanno

in sodelavci (2004), je bilo najverjetnejše število skupin dve. Program BAPS je podatkovni

set razdelil v štiri skupine (Slika 10).


44

Slika 10: Populacijska struktura določena z metodami na osnovi Bayesovega principa s programi STRUCTURE (K=2 do K=4, prve tri vrstice) in BAPS. Oznaki * in ** sta za MED in MAT. (Palandačić in sod., 2012a) Figure 10: Bayesian clustering analyses: STRUCTURE (K=2 to K=4) and BAPS (bottom row); *, MED; **, MAT (Palandačić et al., 2012a).

Če glede na Evannovo metodo privzamemo, da je število skupin dve, je iz grafa razvidno,

da sta ti dve skupini izviri Vrljike s Prološkim Blatom in Nezdravica z južnimi izviri.

»centralna« skupina in Rdeče jezero sta med njima kot hibridizacijska cona (Slika 10, prva

vrsta). V primeru, da je število skupin tri, je prva skupina Nezdravica, druga izviri Vrljike,

tretja pa Rdeče jezero (Slika 9, druga vrsta). Osebki iz južnih izvirov delno pripadajo

Nezdravici, delno pa ostalima dvema skupinama. Prav tako mešanico genotipov (iz izvirov

Vrljike in Rdečega jezera) predstavljata Prološko Blato in »centralna« skupina (iz

Nezdravice, izvirov Vrljike in Rdečega jezera; Slika 10, druga vrsta). V kolikor

privzamemo, da je število skupin 4, je četrta skupina težko prepoznavna, saj je raztresena

med skupinami prepoznanimi s K=3 (Slika 10, tretja vrsta). Analiza s programom BAPS

kot četrto skupino izpostavi južne izvire (Slika 10, četrta vrsta), Prološko Blato in


45

»centralno« skupino pa določi kot genetsko mešani skupini. Tako STRUCTURE kot BAPS

sta potrdila, da predstavljajo gaovice iz izvirov v Imotskem in v Grudah genetsko enotno

populacijo.

Hierarhična analiza s programom STRUCTURE (Slika 11) ni razrešila vprašanja, ali je

bolj verjetno število skupin v podatkovnem setu tri ali štiri. Prav tako znotraj opaženih treh

oziroma štirih skupin ni bilo podstruktur. Potrdila je, da Prološko Blato, »centralna« in

južni izviri predstavljajo genetsko mešane skupine z genotipi iz izvirov Vrljike, Nezdravice

in Rdečega jezera.

Slika 11: Hierarhična analiza populacijske strukture s programom STRUCTURE (Palandačić in sod., 2012a). Figure 11: Hierarchical structure analysis (Palandačić et al., 2012a)


46

Analiza s programom Bottleneck, s katero smo analizirali podatkovni set kot celoto ter

vsako geografsko določeno skupino ločeno, ni razkrila nobenega ozkega grla v bližnji

preteklosti vrste.

Čeprav uporabljene Bayesove metode nakazujejo, da je v podatkovnem setu manj kot šest

skupin, smo zaradi mešane identitete treh od njih za nadaljnjo analizo s programom IMa2

uporabili šest skupin, ki smo jih osnovali na podlagi paroma primerjanih FST-jev: (i)

Prološko Blato, (ii) izviri Vrljike, (iii) »centralna«, (iv) Rdeče jezero, (v) južni izviri in (vi)

Nezdravica. Da bi potrdili upravičenost združevanja izvirov v Imotskem in izvirov v

Grudah v »centralno« skupino, smo tudi med njima izvedli analizo s programom IMa2.

Analiza je čas od ločitve skupin ocenila kot nič in potrdila, da predstavljata eno

panmiktično populacijo. Rezultati analize s podatki o ocenah parametrov z modelom IM

(čas od ločitve populacij, efektivne velikosti predniške populacije in obeh populacij, ki so

njene potomke, migracijske stopnje in populacijske migracijske stopnje) in njihovi

konvergenci so podani v Prilogi E. Rezultati paralelnih analiz, za katere smo uporabili

različne vzorce iz istih skupin, so bili zelo podobni, v tabeli pa je prikazana tista paralelka,

ki je bolje konvergirala.

Analiza z IMa2 je razkrila kompleksen vzorec s številnimi enosmernimi migracijskimi

potmi (Slika 11). Migracijska stopnja iz Rdečega jezera v »centralno« skupino je bila

sedemkrat višja kot v obratno smer, višja pa je bila tudi migracija iz Nezdravice v južne

izvire. Enosmerne migracije so bile določene iz izvirov Vrljike v Prološko Blato, iz

Prološkega Blata v »centralno« skupino ter iz Nezdravice v »centralno« skupino. Edini par

skupin, med katerima je bila migracijska stopnja ocenjena z nič, sta bili Rdeče jezero in

izviri Vrljike. Najvišja stopnja migracije je bila ocenjena iz izvirov Vrljike v Prološko

Blato.


47

Slika 12: Vzorec migracij ocenjen z modelom IM v programu IMa2. Širine puščic predstavljajo ocene migracijske stopnje (HiPt) in segajo od nič med Rdečim jezerom in izviri Vrljike do štiri med izviri Vrljike in Prološkim Blatom. Točne številke HiPt vrednosti s pripadajočimi intervali zaupanja so podane v Prilogi E. Rdeče številke na sliki predstavljajo število migrantov v zadnji generaciji, ki jih je med skupinami izračunal program Geneclass2 (Palandačić in sod., 2012a). Figure 12: Migration patterns according to IM model estimates. Arrow width directly corresponds to IMa2’s HiPt estimate of migration rate (ranging from 0 between CRV and Vrljika springs to 4 between Vrljika springs and PRBL); see Table E in supplementary for details; red numbers correspond to first-generation migrants (Geneclass2; Palandačić et al., 2012a).

S programom Geneclass2 smo skupno odkrili 84 rib, ki naj bi se preselile v zadnji

generaciji (α=0.05). Čeprav se je večina domnevnih migracij zgodila znotraj šestih

geografsko določenih skupin, se je 32 % migracij zgodilo med skupinami (Slika 11).

V izvirih Vrljike je bilo identificiranih dvanajst priseljenih rib, od katerih naj bi se ena riba

priselila iz »centralne« skupine in ena iz južnih izvirov. Preostalih deset domnevnih

migrantov se je preselilo znotraj skupine, med tremi vzorčnimi mesti.


48

Znotraj »centralne« skupine je program ocenil skupno 34 preseljenih rib, devet naj bi se jih

preselilo med izviri v Imotskem in izviri v Grudah, pet rib prišlo iz izvirov Vrljike, pet iz

Prološkega Blata, ena iz južnih izvirov ter ena iz Rdečega jezera.

V Rdeče jezero sta se v zadnji generaciji domnevno priselili dve ribi in sicer iz »centralne«

skupine.

V južnih izvirih naj bi se osem rib preselilo med tremi vzorčnimi mesti, medtem ko naj bi

jih šest prišlo iz »centralne« skupine in ena iz izvirov Vrljike.

Nezdravica je glede na rezultate programa Geneclass2 popolnoma izolirana, oziroma v

zadnji generaciji naj ne bi izmenjala rib z nobeno od petih skupin. Možno pa je, da

izmenjava rib poteka s kakšno populacijo, ki je nismo vzorčili, saj so bili štirje osebki

označeni kot »home-assigned«. To pomeni, da jim je bližja populacija, v katero so se

priselili (v našem primeru Nezdravica) kot katerakoli druga populacija vključena v analizo.

En osebek, ki je bil določen kot »home-assigned«, je bil opažen tudi v skupini Prološko

Blato. Poleg njega sta se še dve ribi priselili iz izvirov Vrljike in dve iz »centralne«

skupine.

4.3 RAZLIKA V IZRAŽANJU GENOV (POSKUS Z MIKROMREŽAMI)

V poskusu z mikromrežami je bilo identificiranih 107 diferencialno izraženih zapisov, ki

so ob primerjavi dveh poskusnih skupin imeli za več kot enkrat višjo oziroma enkrat nižjo

stopnjo izražanja. Od teh je imelo 28 zapisov stopnjo izražanja povečano oziroma

pomanjšano za več kot dvakrat. Sedem zapisov ima popolnoma neznano funkcijo, devet pa

jih je zelo slabo poznanih in ni točno jasno, kaj kodirajo. Od zapisov, ki imajo poznano

funkcijo, so imeli v temi povečano izražanje zapisi za fibrilin in plazminogen ter za s

HLA-B kompleksom povezan prepis 3 (angl. »HLA-B-associated Transcript 3«) in protein

GASP6 (angl. Growth Arrest Specific Protein 6). Zmanjšano izražanje pa so imeli zapisi za

specialen z AT-bogat protein (angl. Special AT-rich Sequence Binding Protein), CCR4-

NOT prepisovalni kompleks (angl. CCR4-NOT Transcription Complex), s presenilinom


49

povezan romboidni protein (PARL, angl. Presenilin-Associated Rhomboid-like Protein),

komponenta komplementa C3a, mio-inozitol oksidaza, kolagen tipa VI in

ureidopropionaza ß. Rezultati so podani v Preglednici 5.

Preglednica 5: Seznam vseh zaporedji na mikromreži s spremenjenim izražanjem pri primerjavi rib, ki so bile en mesec v temi, in rib z normalno 12 urno foto-periodo (tema vs. normalna). Navedeno je ime zaporedja na mikromreži (sonda), rang spremembe, regulacija in ime gena, kjer je poznano. Table 5: The list of differentially expressed microarray probes, which are the result of comparison of fish kept in the dark for one month and fish with normal 12 hour photoperiod. The name of the probe, fold change, regulation (Dark vs. Normal), and the gene title, where it is known. Sonda Rang

spremembe Regulacija (tema vs. normalna)

Ime gena

EA_Pp_52731 4.463 znižana EA_Pp_70486 4.100 znižana EA_Pp_60167 3.551 znižana Gen za protein, ki se veže na z

AT bogate sekvence (angl. Special AT-rich Sequence Binding Protein 1)

EA_Pp_56373 3.246 znižana EA_Pp_62128 3.026 znižana Tretja podenota

transkripcijskega kompleksa CCR4-NOT (angl. CCR4-NOT Transcription Complex, Subunit 3)

EA_Pp_67034 2.943 znižana EA_Pp_70902 2.861 znižana Gen za s presenilinom povezan

romboidni protein (angl. Presenilin Associated, Rhomboid-like Protein)

EA_Pp_64321 2.613 znižana Odprti bralni okvir 1 na kromososmu 18 (angl. Chromosome 18 Open Reading Frame 1)

EA_Pp_64381 2.499 znižana Gen za protein podoben DNA-vezavnemu proteinu (angl. Similar To DNA-binding Protein)

EA_Pp_62596 2.416 znižana EA_Pp_69763 2.361 znižana Gen za komponento

komplomenta C3a (angl. Complement Component C3a)

EA_Pp_71093 2.335 znižana Odprti bralni okvir 29 na kromososmu 2 (angl. Chromosome 2 Open Reading Frame 29)

EA_Pp_50582 2.284 znižana Homolog Unc-13 (angl. Unc-13 Homolog B)

EA_Pp_53579 2.262 znižana Odprti bralni okvir 34 na kromososmu X (angl. Chromosome X Open Reading Frame 34)

(se nadaljuje)


50

Sonda Rang

spremembe Regulacija (tema vs. normalna)

Ime gena

EA_Pp_50674 2.239 znižana Mio-inozitol oksigenaza (angl. Myo-inositol Oxygenase)

EA_Pp_52026 2.102 znižana Kolagen tipa VII (angl. Collagen, Type VII, Alpha 1)

EA_Pp_55711 2.098 znižana EA_Pp_55406 2.068 znižana EA_Pp_69533 2.055 znižana Ureidopropionaza (angl.

Ureidopropionase, Beta) EA_Pp_56238 5.168 povišana S HLA-B povezan transkript 3

(angl. HLA-B-associated Transcript 3)

EA_Pp_59444 3.839 povišana RIKEN CDNA E430025E21 EA_Pp_52442 3.202 povišana Homolog cinkovega proteina 64

(angl. Zinc Finger Protein 64 Homolog)

EA_Pp_67561 2.665 povišana Domena podobna CUB in zoni pellucidi (angl. Similar To CUB And Zona Pellucida-like Domains 1)

EA_Pp_67426 2.599 povišana Fibrilin 2 EA_Pp_68222 2.503 povišana Gena za protein podoben

treoninski sintazi (angl. Threonine Synthase-like Protein)

EA_Pp_67937 2.433 povišana Palzminogen EA_Pp_51237 2.298 povišana Gen za faktor, ki zaustavlja rast

(angl. Growth Arrest Specific Faktor 6)

EA_Pp_68176 2.259 povišana Segment DNA na kromosomu 6 (angl. DNA Segment, Chr 6, Wayne State University 163)

5 RAZPRAVA

5.1 RAZREŠEVANJE TAKSONOMSKIH NEJASNOSTI V SKUPINI GAOVICE

Rezultati raziskav v okviru prvega sklopa Razreševanje taksonomskih nejasnosti v skupini

gaovice so bili predstavljeni v članku »Revised classification of former genus Phoxinellus

using nuclear DNA sequences« (Palandačić in sod., 2010). V njem smo z deli jedrnih

zapisov za rodopsin, EGRF2 in ITS1 potrdili hipotezo, ki jo je na osnovi sekvenčne analize

mitohondrijskega gena za citokrom b in neanotirane jedrne sekvence Cyp_unFLP postavil

Freyhof s sodelavci (2006), da vrste D. adspersus, D. gethaldi, D. jadovensis in D.

krbavensis predstavljajo svoj rod Delminichthys. S tem smo tudi potrdili predpostavko, da

je rod Phoxinellus polifiletski. V skladu z raziskavo Freyhofa in sod. (2006) je bil tudi


51

položaj rodu Pelasgus kot sestrske skupine rodu Delminichthys, kar je poleg filogenetske

analize pokazala tudi opažena sinapomorfija v obliki deset baznih parov dolge insercije v

zapisu za ITS1, ki si jo rodova delita, medtem ko je pri drugih rodovih ni.

V opravljeni filogenetski analizi pa nismo podprli vključitve vrst T. croaticus, T. fontinalis

in T. metohiensis v rod Telestes, kot so predlagali Ketmaier in sod. (2004) ter Freyhof in

sod. (2006). T. fontinalis in T. croaticus sta bili sicer z nizko podporo (28/-/46) prepoznani

kot sestrski skupini in pri T. metohiensis je bilo opaziti tendenco do uvrščanja skupaj z

njima. Vendar je zaradi slabe ločljivosti, ki je verjetno posledica uporabe le enega

potrjenega predstavnika rodu Telestes (T. souffia) kot referenčnega vzorca, nemogoče

potrditi uvrstitev teh treh vrst v predlagan rod. Prav tako naši rezultati niso v skladu z

ugotovitvijo Freyhofa in sodelavcev (2006), da Ph. pseudalepidotus skupaj s Ph.

dalmaticus in Ph. alepidotus tvori enotno skupino, kar so ugotovili na osnovi

mitohondrijske ne pa tudi jedrne DNA. Na našem filogenetskem drevesu se je vrsta Ph.

pseudalepidotus z visoko podporo (91/0.97/90) uvrstila kot sestrska skupina skupine

Delminichthys–Pelasgus (Slika 4). Perea in sodelavci (2010) so sočasno z našo raziskavo

opravili obsežno študijo predstavnikov poddružine Lauscisinae, ki naseljujejo Mediteran.

Izvedli so jo na mitohondrijskih zapisih za citokromu b in citokrom oksidazo 1 ter na

jedrnih zapisih za RAG1 (angl. Recombination Activating Gene) in prvem intronu

ribosomalnega proteina S7, vendar se rezultati mitohondrijske in jedrne DNA niso ujemali.

Na osnovi kombiniranega seta jedrne in mtDNA kot tudi samo na osnovi jedrnih odsekov

so sicer potrdili, da rod Phoxinellus sestavljajo Ph. pseudalepidotus, Ph. dalmaticus in Ph.

alepidotus. Vendar pa so uvrstitev vrsts T. metoiensis, T. croaticus in T. fontinalis v rod

Telestes, potrdili le na kombiniranem setu, saj so se na filogenetskem drevesu izračunanem

le na osnovi jedrne DNA uvrstile med predstavnike rodu Chondrostoma. Na istem

filogenetskem drevesu se je rod Delminichthys uvrstil kot sestrska skupina vrste

Pseudophoxinus egridiri, ne rodu Pelasgus.

Kljub trem izvedenim študijam na predstavnikih bivšega rodu Phoxinellus, odnosi znotraj

rodu Delminichthys, položaj vrst T. metoiensis, T. croaticus in T. fontinalis ter treh vrst, ki

naj bi ostale v rodu Phoxinellus, še vedno niso pojasnjeni, zato so potrebne dodatne

raziskave.


52

5.2 POPULACIJSKO GENETSKA STRUKTURA IMOTSKE GAOVICE IN PRETOK GENOV MED GEOGRAFSKO LOČENIMI POPULACIJAMI

Rezultati raziskav v drugem sklopu Populacijsko genetska struktura imotske gaovice in

pretok genov med geografsko ločenimi populacijami so predstavljeni v članku »Fish

migrate underground: the example of Delminichthys adspersus (Cyprinidae)« (Palandačić

in sod., 2012a). V okviru teh raziskav smo določili populacijsko strukturo D. adspersus, ki

nakazuje na genski pretok med populacijami brez površinskih vodnih povezav, in v

kombinaciji z znanimi hidrološkimi podatki podpira hipotezo o podzemni migraciji rib. Ob

enem smo poglobili znanje o tem slabo raziskanem endemitu, kar je možno aplicirati na

gaovici sorodne vrste oziroma druge kraške organizme.

Populacijska struktura določena na osnovi mitohondrijske DNA je pokazala nerazčlenjeno

populacijo, brez očitnih izoliranih skupin. Vendar pa se najpogosteje zastopan haplotip

(H1) pri vzorcih iz izvirov Vrljike pojavi le enkrat, medtem ko pri vzorcih iz Nezdravice

ne najdemo haplotipov, ki so značilni za izvire Vrljike. Medsebojno izoliranost teh dveh

skupin je potrdila tudi primerjava genetskih razdalj med vzorčnimi mesti, ki je

identificirala Nezdravico in izvire Vrljike kot najbolj oddaljeni skupini. Zvezdasto obliko

genealogije z majhnim številom najpogostejših haplotipov, ki se razlikujejo za samo eno

substitucijo, nekateri avtorji opisujejo kot posledico nedavne kolonizacije na novo ozemlje,

čemur sledi širjenje vrste (Kvist, 2000; Norgat in sod., 2009; Polihronakis in Caterino,

2010). Vendar pa je analiza, ki testira možnost nenadne demografske ekspanzije (angl.

mismatch analysis), to hipotezo zavrnila, kar pomeni, da vzrok za majhno raznolikost

haplotipov ni nedavna ločitev med skupinami (populacijami). Oblika genealogije razvidne

iz drevesa je lahko posledica nizke stopnje mutacij, ki jo za rod Delminichthys

predpostavljajo Freyhof in sod. (2006), ali pa ponavljajoči genski pretok, ki lahko popolno

izolacijo populacij prepreči že z migracijo nekaj osebkov na generacijo (Hartl in Clark,

1989). Tudi nukleotidna diverziteta imotske gaovice je nizka (1.2 × 10-3) in v primerjavi z

nukleotidno raznolikostjo tajske jamske ribe Schistura oedipus bolj podobna nukleotidni

raznolikosti S. oedipus znotraj populacij (1 × 10-3) kot med populacijami (5 × 10-3;

Borowsky in Mertz, 2001). Vendar je tudi nizka nukleotidna raznolikost pri imotski


53

gaovici lahko posledica nizke mutacijske stopnje, genskega toka ali majhne efektivne

velikostji populacije.

Osnovne mere populacijske raznolikosti določene na podlagi analize mikrosatelitov so

pokazale, da je večina molekularne variance razporejena znotraj vzorčnih mest. Vendar je

koeficient parjenja v sorodstvu (FIS) izračunan na celotnemu setu podatkov nakazal na

obstoj podstruktur in paroma primerjani fiksacijski indeksi so razkrili 6 skupin, ki so bile

skoraj popolnoma v skladu z geološko in hidrološko določenimi skupinami. Izjema so bile

ribe iz izvirov v Imotskem in njegovi okolici, ki se genetsko niso razlikovale od vzorcev iz

dveh izvirov iz vasi Grude (skupina imenovana »centralne«). Bayesove metode določanja

podstruktur v podatkovnem setu so potrdile genetsko homogenost skupine »centralna«,

hkrati pa so število podstruktur v setu zmanjšale iz šest na tri oziroma štiri (Slika 10).

Vendar te predlagane podstrukture niso bile popolnoma geografsko izolirane in v vsaki

skupini so bili prisotni genotipi iz drugih skupin, kar je bilo še posebno očitno v skupinah

»centralna« in Prološko Blato, ki sta bili mešanica genotipov iz Rdečega jezera, izvirov

Vrljike ter južnih izvirov (obe Matici in Draga). Vendar je podobnost med skupinami lahko

poleg genskega toka tudi posledica nedavne ločitve med skupinami. Primerjava metod, ki

so osnovane na dolžini alelov (RST) z metodami osnovanimi na njihovi identiteti (FST) je

pokazala, da so mutacije bistveno doprinesle k raznolikosti v preučevanem podatkovnem

setu. Ker je število mutacij odraz starosti sistema (Hardy in sod., 2003), lahko sklepamo,

da do ločitve skupin ni prišlo pred kratkim. V skladu s to ugotovitvijo je tudi odsotnost

ozkih grl, ki jih nismo zaznali ne v celotnem podatkovnem setu ne v posameznih

geografsko določenih skupinah. Dodatno je možno o starosti sistema sklepati na podlagi

geološke zgodovine območja, na katerem ni bilo poledenitev (Taberlet in sod., 1998).

Program IMa2, ki deluje na osnovi modela migracija-z-izolacijo (»migration with

isolation«; Hey, 2004), je pokazal genski pretok med šestimi skupinami, določenimi s

paroma primerjanimi FST-ji. Vendar ta model predvideva stalno stopnjo migracije od časa

ločitve populacij do sedanjosti, zato nihanja v migracijski stopnji lahko pomenijo

odstopanje od modela in privedejo do nepravilnih rezultatov. Program ne loči med stalnim

genskim pretokom, migracijo, ki se je zgodila v omejenem časovnem obdobju, ali

sekundarnim stikom med preučevanimi skupinami. Da v našem primeru migracija rib ni


54

bila časovno omejen pretekli dogodek, nakazujejo rezultati programa Geneclass2, glede na

katere naj bi se šestnajst procentov vseh vzorčenih osebkov preselilo v zadnji generaciji.

Sekundarnega stika sicer to ne izključuje, vendar ni verjetno, da bi komercialno

nepomembne ribe, kot so gaovice (Mrakovčić in sod., 2006), vlagali ali prenašali ljudje.

Poleg tega poznamo vsaj eno lokacijo (i.e. Rdeče jezero /tipska lokacija/), katere

nedostopnost zagotavlja naravno prisotnost rib. Hipoteza o ponavljajočem se genskem

pretoku med geografsko izoliranimi ribjimi populacijami je torej podprta z opisano

populacijsko strukturo imotske gaovice, hidrološki podatki in sledenje vode v krasu

(Kanaet 1959, Bonacci 2006, Džeba 2010) pa podpirajo del teze, da vsaj nekaj genskega

pretoka poteka pod zemljo, kar najbolje prikazujejo trije spodaj opisani primeri.

Prvi primer sta »centralna« skupina in skupina rib iz brezna Rdeče jezero z vodno gladino

250 metrov pod robom (Slika 3), od koder je površinska disperzija rib v okoliške vodne

vire v času poplav nemogoča. Številni avtorji opisujejo obstoj vsaj dveh podzemnih

kanalov (za pregled glej Bonacci, 2006), ki jezero povezujeta z nižje ležečimi izviri v

okolici Imotskega, kar je v skladu tudi z našimi rezultati. Rdeče jezero in »centralna« imata

skupne najpogostejše haplotipe gena za citokrom b. Paroma primerjana vzorčna mesta na

osnovi dolžin alelov (RST) niso pokazale signifikantne različnosti med Rdečim jezerom in

vzorčnimi mesti (BVID, GRAN and REB) iz »centralne« skupine. Program BAPS med

skupinama ne razločuje, s programom Geneclass2 pa smo odkrili tri domnevno preseljene

ribe med skupinama v zadnji generacij. Številke so majhne, vendar metoda upošteva samo

zadnjo generacijo migrantov, medtem ko je kanal med Rdečim jezerom in izviri aktiven le

v letih, ko je veliko padavin (Bonacci, 2006). Do selitve rib verjetno ne prihaja v vsaki

generaciji, kar nakazuje tudi nehomogenost med vzorci nabranimi v različnih letih (2007 in

2010), ki je opazna v neravnotežju lokusa Ca3. IM program, ki pokaže tudi pretekli genski

tok, je razkril visoke stopnje migracij, še posebno iz smeri Rdečega jezera v »centralno«

skupino.

Drug primer, ki podpira hipotezo podzemne migracije, je genetska homogenost med vzorci

iz površinsko nepovezanih rek Rastočke in Vrgoračke Matice, ki so bili določeni kot ena

panmiktična populacija z vsemi izvedenimi analizami. Vrgoračka Matica je popolnoma

izolirana in brez nadzemnih vodnih povezav, pa vendar smo s programom Geneclass2


55

identificirali dva osebka v Rastočki Matici, ki naj bi se v zadnji generaciji priselila iz

Vrgoračke Matice, medtem ko naj bi se trije osebki preselili v obratni smeri. Poleg

genetskih dokazov je sledenje z barvo leta 1954 zasledilo podzemne vodne povezave med

obema Maticama (Kanaet, 1959), kar potrjuje našo hipotezo o podzemni migraciji imotslih

gaovic.

Tretji primer, ki podpira hipotezo o podzemni migraciji, so genotipi značilni za

»centralno« skupino, ki so prisotni tudi v južnih izvirih (obe Matici in Draga), in obratno,

kar jasno ilustrirajo programi STRUCTURE in BAPS (Slika 10) ter Geneclass2 in IMa2

(Slika 12). Če obravnavamo le površinske vodotoke, izviri »centralne« skupine formalno

pripadajo rečnemu sistemu Vrljike, ki se konča v požiralniku Sajnoviči (Slika 2). Voda

nato teče skozi umetni podzemni kanal pod hribovjem Drinovci in vsaj delno izvira na

drugi strani kot reka Tihaljina, s katero pa so indirektno povezani južni izviri. Čeprav bi

lahko predpostavljali, da precejšnja razlika v višini med ponorom Vrljike in izvirom

Tihaljine (90 m) predstavlja neprehodno oviro za selitev rib, naši rezultati nakazujejo

drugače. Poleg tega so hidrologi z barvanjem odkrili vodno povezavo med izviri v Grudah

(»centralna«) in rečnim sistemom Tihaljine (glej »Opis vzročnih mest«). Izviri so

medsebojno povezani z estavelami, v katerih ob naraslih vodah v porečju Tihaljine zaradi

pritiska voda lahko začasno teče navzgor v porečje Vrljike (Jović 2003). Čeprav ta pojav v

kraškem svetu ni redek in bi lahko razložil migracijo imotske gaovice, je verjetnejša

razlaga selitev rib po kakšnih še ne odkritih, a bolj dostopnih vodnih poteh. Kanaet (1959)

je s pomočjo hidroloških meritev, pri katerih je meril količino vode, ki izgine v požiralniku

Vrljike, in količino vode na izviru Tihaljine, ugotovil, da Tihaljino z vodo poleg Vrljike

oskrbujejo še drugi vodni viri, ki mogoče predstavljajo tudi poti selitve rib.

Od več kot 125 zabeleženih troglomorfnih vrst rib jih večina naseljuje kraška območja

Avstralije, Kitajske, ZDA, Mehike, Tajske in Srednjega Vzhoda (Proudlove, 2006;

Romero in Paulson, 2001). Za mnoge vrste je značilno, da jih sestavljajo tako

troglobiontske kot tudi površinske populacije ter »vmesne« populacije na različni stopnji

razvoja troglomorfoz, ki pa se v primeru stika med seboj lahko parijo. Pri mehiških ribah

Astyanax mexicanus in A. fasciatus so Strecker in sod. (2004) obstoječi poselitveni vzorec

razložili s ponavljajočo kolonizacijo jam s površja. Površinske populacije, ki so bile vir rib


56

za razvoj podzemnih populacij, so večkrat izumrle, nato pa so populacije iz drugih območji

najprej poselile nadzemne vodotoke, od tam pa podzemne vode. Zato so jamske populacije

iz sosednjih jam pogosto nesorodne, saj nimajo skupnih prednikov. Kompleksna

populacijska struktura rodu Astyanax torej ni posledica podzemnih povezave temveč

ponavljajočega poseljevanja iz površja. Nasprotno pa so Dilman in sod. (2010)

populacijsko strukturo ameriških troglomorfnih perkopsiformov razložili s pomočjo

podzemnih povezav. Sedanjo populacijsko strukturo vidijo kot odraz nekdanjih povezav v

krasu, ki so se kasneje spremenile oziroma prekinile. Tudi Borowsky in Mertz (2001)

menita, da je tajska vrsta S. oedipus podzemlje naselila v enkratni invaziji ter se nato

razširila po podzemnih vodnih poteh, ki so se nato prekinile. Posledica pa je bila izolacija

in diferenciacija populacij. Pri nadzemnih ribah je primer domnevne podzemne disperzije

mehkoustna postrv (Salmo obtusirostris), ki naj bi naselila reko Vrljiko iz reke Trebižat

(pritok Neretve), čeprav reki nista površinsko povezani (Snoj in sod., 2008). V treh

opisanih primerih naj bi šlo za kratkotrajno oziroma enkratno podzemno selitev, ne za

ponavljajočo podzemno migracijo kot jo predlagamo za vrsto D. adspersus. Vendar pa trije

opisani primeri dokazujejo, da je podzemna migracija verjeten način disperzije

organizmov. Z morfološkega vidika vrsta nima vidnih prilagoditev na podzemno življenje,

razen zmanjšanega števila in kompleksnosti lusk, ki ga Mrakovčić in sod. (2006) opisujejo

kot začetni znak prilagoditve na podzemlje. Ker naj bi bil rod Delminchthys na tem

kraškem območju ujet že od dviga Dinaridov pred deset do osem milijonov let nazaj, pa

menimo, da pomanjkanje troglomorfnih znakov ni posledica upočasnjene prilagoditve na

podzemlje, temveč dejstva, da gaovice periodično kolonizirajo podzemlje.

V zadnjem času se je med raziskovalci, ki se ukvarjajo z različnimi vidiki raziskovanja

krasa, pojavila ideja o združitvi različnih ved z namenom oblikovanja celostnega pristopa

raziskovanja tega kompleksnega območja ter predvsem njegove zaščite. Čeprav je pomen

medsebojnega vpliva hidroloških pojavov na floro in favno v krasu že leta 1939 opisal

Hawes, so se šele pred kratkim pojavile ideje o kombiniranih raziskavah, z njimi pa

podlaga za novo vedo, ekohidrologijo krasa (Bonacci in sod., 2009). Pronk in sod. (2009)

so predlagali uporabo mikrobioloških združb za sledenje vode, Pipan in Culver (2007) pa

sta predstavila idejo o uporabi dognanj s področja biologije za določanje vodnih povezav v

krasu kot dodatek k sedanjim tehnikam sledenja z barvo, temperaturo oziroma soljo. Ker


57

konkretnih študij, ki bi primerjale hidrološke povezave z disperzijo organizmov po našem

vedenju ni, smo hidrološke podatke, ki so na voljo za areal vrste imotske gaovice,

primerjali z njeno populacijsko strukturo oziroma predvidenimi migracijskimi potmi.

Študija je bila objavljena v obliki članka z naslovom »Molecular data as a possible tool for

tracing groundwater flow in karst environment: example of Delminichthys adspersus in

Dinaric karst system« (Palandačić in sod,. 2012b) in je poleg primerjave poskušala oceniti

potencial bioloških sledilcev ter podati primer interdisciplinarnega sodelovanja za boljšo

zaščito kraških območji. Dostopni hidrološki podatki (Kanaet, 1959; Bonacci; 2006,

Džeba, 2010) se ujemajo s populacijsko strukturo in hkrati predstavljajo okvir za njeno

razumevanje. Tako smo z genetskim ujemanjem med skupinami rib podprli povezavo

Rdečega jezera z izvir v okolici Imotskega (kanal iz Rdečega jezera je direktno povezan z

izvirom Jažva, ki je v naši raziskavi poimenovan kot vzorčno mesto Glavina Donja), rek

Vrgoračke in Rastočke Matice ter rečnih sistemov Vrljika in Tihaljina. Poleg teh smo

predlagali tudi možne nove podzemne povezave med Grudami in Imotskim izviri,

Prološkim Blatom in izviri Vrljike ter med Drago in obema Maticama. Vsi ti izviri so sicer

posredno povezani tudi preko površinske mreže potokov in umetnih kanalov, ki pa pogosto

presušijo. Poleg tega je opaženo vedenje rib (redko jih je opaziti daleč od izvirov, osebna

opažanja) neskladno z njihovo več kilometrsko migracijo po toku navzgor, kjer bi bile

izpostavljene plenilcem in neprimernim življenskim pogojem ob pogostih presušitvah.

Zato predvidevamo, da tudi med naštetimi lokacijami obstajajo podzemne povezave, ki pa

s tradiconalnimi tehnikami sledenja podzemnih vodnih poti še niso bile odkrite. Drugi cilj

raziskave je bil oceniti uporabnost bioloških sledilcev v primerjavi s kemičnimi in

fizikalnimi. Ker so ribe živi organizmi, se ne gibajo le pasivno z vodnim tokom, temveč

imajo svojo lastno energijo in nagone, zato do neke mere lahko kljubujejo silam

gravitacije. V krasu večino časa prevladuje nizek nivo talne vode (80%), in glede na

genetsko homogenost populacij lahko sklepamo, katere izmed njih so v tem času povezane,

s čimer lahko ugotavljamo tudi kvalitativno oceno podzemnih vodnih povezav. Tak primer

so izviri v Imotskem in Grudah, kjer so ribe popolnoma premešane, česar z občasni

mešanjem v času poplav (malo število rib, ne vsako generacijo) ne moremo razložiti.

Dodatna prednost bioloških sledilcev je tudi ta, da so v vodotokih že naravno prisotni, zato

ni potrebe po vnašanju umetnih snovi kot je barva. Nove kombinirane metode bi lahko


58

omogočile izris posebnih zemljevidov občutljivosti za posamezna področja (Goldscheider,

2010), kar bi pomagalo pri zaščiti ogrožene kraške favne (Culver, 2001).

5.3 SPECIFIČEN METABOLIZEM VEZAN NA DOLGOTRAJNO ŽIVLJENJE V PODZEMLJU

V tretjem sklopu Specifičen metabolizem vezan na dolgotrajno življenje v podzemlju smo

s pomočjo mikromrež primerjali izražanje genov v jetrih skupine imotskih gaovic, ki je en

mesec preživela v pogojih normalne foto-periode, s skupino, ki je bila ta čas v popolni

temi. V nasprotju s pričakovanji, rezultati niso pokazali znižane stopnje metabolizma pri

skupini, ki je živela v temi. Od zapisov za gene, katerih funkcija je poznana, sta imela

SAT-B1 (angl. Special AT-rich Sequence Binding Protein 1) in CCR4-NOT kompleks, ki

sta vključena v zaviranje transkripcije, nižjo stopnjo izražanja v primerjavi s skupino z

normalno foto-periodo. SAT-B1 je protein, ki se veže na določene z A in T bogate

sekvence v zankah kromatina in prepreči njihovo razvijanje. Primarno je izražen v

timocitih in verjetno z vezavo vpliva na regulacijo genov specifičnih za T-celice (de Belle

in sod., 1998). CCR4-NOT je vključen v številne funkcije mRNA metabolizma. Najprej je

bil odkrit kot zaviralec RNA polimeraze II, vključen pa je tudi v razgradnjo mRNA preko

razgradnje poli-A repa (Tucker in sod., 2001; Yamashita in sod., 2005). Mio-inozitol je

sekundarni sporočevalec, ki je vključen v številne procese, kot so signalna transdukcija in

ozmoregulacija, njegovi derivati pa so vključeni tudi v organizacijo signaliziranja,

preurejanje aktinskega citoskeleta in znotrajcelični transport veziklov (Arner in sod.,

2001). Mio-inozitol v celicah razgrajuje mio-inozitol oksigenaza, katere izražanje je v

skupini z neprestano temo zmanjšano. To bi lahko pomenilo večjo aktivnost procesov, v

katerih kot sekundarni sporočevalec nastopa mio-inozitol. Prav tako je v skupini z

neprestano temo zmanjšano izražanje encima ureidopropionaza ß, ki je vključen v

razgradnjo pirimidinov uracila in timina. Primidina sta vključena v številne biološke

procese, kot je sinteza DNA, RNA, fosfolipidov in glikogena (van Kullenburg in sod.,

2004), torej je znižana stopnja njune razgradnje kvečjemu pokazatelj zvišanega

metabolizma kot obratno. Prav tako na zvišan metabolizem nakazuje povišano izražanje

plazminogena, katerega glavna produkcija poteka v jetrih, vključen pa je v raztapljanje

krvnih strdkov, aktivacijo komplementnega sistema, ovulacijo in obnavljanju jetrnih celic

po poškodbi (Bezerra in sod., 1999). Edini odkriti gen, ki bi lahko pomenil zmanjšano


59

stopnjo metabolizma, je zapis za komponento komplementnega sistema C3a, katere glavna

produkcija poteka v jetrih, njena stopnja izražanja pa je v skupini z neprestano temo nižja.

Zanimivo je, da je med diferencialno izraženimi geni veliko takih, ki so povezani s

kontrolirano celično smrtjo ali apoptozo. Vendar so si rezultati nasprotujoči. Medtem ko

GASP6 (angl. Growth Arrest Specific Protein 6), HLA-B in PARL (angl. Presenilin-

Associated Rhomboid-like Protein) s svojim izražanjem nakazujejo, da je stopnja apoptoze

v temi povečana, zmanjšano izražanje Unc13 homologa B, ki je induktor apoptoze (Song,

1999), kaže ravno obratno. HLA-B preko acetilacije aktivira apoptotski faktor p53 in s tem

vzpodbuja apoptozo (Sasaki in sod., 2007) in GASP6, ki v zadnjih stopnjah apoptoze

deluje kot most med apoptotičnimi celicami in fagociti (Wu in sod., 2005), imata povišano

stopnjo izražanja. V skladu s tem je tudi nižje izražanje gena za PARL, ki ščiti celice pred

apoptozo, tako da preprečuje izpust citokroma c iz membrane mitohondrija v citoplazmo

(Jeyaraju in sod., 2006). Pri vrsti vrabca (Zonotrichia leucophrys gambelii) so povečano

izražanje PARL odkrili med selitvijo, ko ptice veliko manj spijo.

Možna razlaga za višjo stopnjo apoptoze ter večje izražanje plazminogena in fibrilina 2 pa

je tudi poškodba jeter pri skupini v neprestani temi. Medtem ko je v zdravih jetrih

izvenceličnega matriksa malo, se ob poškodbi jeter zmanjša število celic, poveča pa se

količina izvenceličnih tvorb, katerih glavni gradnik je kolagen tipa I. Pojavi se fibroza

jeter. Fibrilini 1 je bil odkrit pri fibrozi podganjih jeter (Lorena in sod., 2004), zato je

možno, da ima fibrilin 2 podobno vlogo. Plazminogen sodeluje v obnavljanju jeter po

poškodbah (Bezerra in sod., 2011), enako vlogo pa naj bi imela tudi komponenta C3a, ki

pa ima nasprotno od plazminogena zmanjšano izražanje. Zmanjšano izražanje pa ima tudi

kolagen tipa VII, ki v jetrih še ni bil opisan, oziroma naj ga v epitelnem tkivu jeter sploh ne

bi bilo (Wetzels in sod., 1991).

Glede na nasprotujoče si rezultate je težko določiti, kateri procesi se med bivanjem v temi

pri imotski gaovici spremenijo in zakaj. Za večjo zanesljivost bi bilo dobljene

diferencialno izražene gene potrebno dodatno ovrednotiti z verižno reakcijo s polimerazo v

realnem času. Zaradi finančnih omejitev je bila študija izvedena na majhnem številu

vzorcev in bi jo bilo za večjo zanesljivost ugotovitev potrebno ponoviti na večjem številu


60

rib. Od vseh metodoloških omejitev pa je največji izziv vsaj približno posneti pogoje,

katerim so gaovice izpostavljene v naravi, saj o njihovem podzemnem življenju nimamo

nobenih podatkov.

6 SKLEPI

Rezultati prvega sklopa raziskave Razreševanje taksonomskih nejasnosti v skupini gaovice

so potrdili hipotezo Freyhofa in sod. (2006), da je rod Phoxinellus polifiletski ter uvrstitev

štirih vrst D. adspersus, D.gethaldi, D. jadovensis in D. krbavensis v nov rod

Delminichthys, katerega sestrska skupina je rod Pelasgus. Niso pa potrdili premestitve vrst

T. croaticus, T. metohiensis in T: fontinalis v rod Telestes in sorodstvenih odnosov med

preostalimi tremi predstavniki rodu Phoxinellus, Ph. alepidotus, Ph. pseudoalepidotus in

Ph. dalmaticus.

Rezultati drugega sklopa raziskave Populacijsko genetska struktura imotske gaovice in

pretok genov med geografsko ločenimi populacijami so pokazali, da je populacijsko

strukturo imotske gaovice (D. adspersus) sestavljajo vsaj tri skupine, ki pa med seboj niso

popolnoma izolirane. Primerjava določene populacijske strukture z znanimi hidrološkimi

podatki je doprinesla k hipotezi o delnem genskem toku po podzemnih vodnih poteh.

V tretjem sklopu Specifičen metabolizem vezan na dolgotrajno življenje v podzemlju je

bilo s pomočjo mikromrež določenih 28 diferencialno izraženih genov, ki so imeli za več

kot dvakrat spremenjeno izražanje. Rezultati so nakazali, da se pri skupini, ki je preživela

en mesec v popolni temi, spremeni izražanje genov povezanih s transkripcijo, apoptozo,

izvenceličnim matriksom in strjevanjem krvi.


61

7 POVZETEK (SUMMARY)

7.1 POVZETEK

V centralnem Dinarskem krasu živi deset endemnih vrst rib s poljudnim imenom

»gaovice«. Taksonomsko jih uvrščamo v družino Cyprinidea in poddružino Leuscisinae ter

do pred kratkim v rod Phoxinellus, ki pa se je izkazal za polifiletskega. S filogenetsko

raziskavo bivših predstavnikov rodu Phoxinellus in referenčnih vrst smo potrdili hipotezo

Freyhofa in sodelavcev (2006), da gre pri gaovicah vsaj za tri različne rodove, od katerih

so štiri vrste uvrščene v rod Delminichthys. Nismo pa uspeli razrešiti položaja treh vrst, ki

naj bi ostale v rodu Phoxinellus, in treh vrst, ki so bile premeščene v rod Telestes. Poleg

naše sta se vsaj še dve študiji ukvarjali z razreševanjem taksonomske pozicije desetih vrst,

vendar so določene nejasnosti ostale. Tako bo za razreševanje odnosov znotraj skupine

gaovice potrebno izvesti še dodatne raziskave.

Ker je znano, da so vodne povezave v krasu zelo raznolike in nepredvidljive ter pogosto

potekajo pod zemljo, je razdrobljeni areal imotske gaovice (D. adspersus), ki naseljuje

izvire v okolici Imotskega, Grud in Vrgorca, idealen za študijo populacijske strukture

kraških organizmov. Čeprav je že več avtorjev predvidevalo disperzijo organizmov po

podzemnih poteh, po našem vedenju ni študije, ki bi odkrila ponavljajoč genski pretok med

površinsko izoliranimi populacijami. Določena populacijska struktura imotske gaovice je v

povezavi z znanimi hidrološkimi podatki podprla hipotezo o podzemni migraciji, ki

preprečuje popolno izolacijo rib iz površinsko nepovezanih izvirov. Nakazala pa je tudi na

možnost uporabe kraških organizmov oziroma njihove populacijske strukture za sledenje

vodnih povezav v krasu.

Ker gaovice na prvi pogled nimajo prilagoditev na podzemno življenje in bi jih glede na to,

da se drstijo v površinskih vodotokih označili kvečjemu za subtroglofile ne za prave vodne

troglobionte, nas je zanimalo, ali pride do spremembe metabolizma v času bivanja pod

zemljo. V ta namen smo izvedli poskus z mikromrežami, v katerem smo primerjali

izražanje genov v jetrih rib, ki so preživele cel mesec v temi, z ribami z normalno 12 urno


62

foto-periodo. Ugotovili smo, da se diferencialno izražajo geni povezani z apoptozo,

transkripcijo, komplementnim sistemom, strjevanjem krvi in izvenceličnim matriksom.

7.2 SUMMARY

The central part of Dinaric karst is inhabited by ten endemic fish species with vernacular

name »gaovice«. They were classified into family Cyprinidae and subfamily Leuscisinae,

and until recently into genus Phoxinellus, which turned out to be polyphyletic. With

phylogenetic study of former Phoxinellus taxa and reference species, we determined that

the group »gaovice« is composed of at least three genuses, of which four species form

genus Delminichthys. However; we could not corroborate the placement of three species in

the genus Telestes and also the position of remaining three Phoxinellus species. Besides the

present research, two more studies were performed on former Phoxinellus taxa,

nevertheless; the results remain unclear and require additional studies.

Since karst has complex aquifer with many underground water connections, the

fragmented distribution range of imotska gaovica (D. adspersus), inhabiting springs around

Imotski, Grude and Vrgorac, offers ideal background for population study of karst

organisms. Even though many researches suggested underground dispersion through

underground karst water connections, we found none that would explicitly detect recurrent

genetic flow between surface-isolated populations. Determined population structure of D:

adspersus in combination with known hydrological data supports the hypothesis of

underground migration, which prevents complete isolation of fish from surface-isolated

springs. Further, the research implies the use of organisms and their population structure

for water tracing in karst areas.

Because there are no obvious adaptations of »gaovice« to the subterranean environment,

and they are better described as subtroglophils rather than water troglobionts, we

performed a microarray experiment to find possible changes in the methabolism of fish in

the underground stage of life. We compared the gene expression in liver of fish, which

spend one month in complete darkness, with fish, which had normal 12 hour photoperiod.

We found that genes with altered expression are related to apoptosis, transcription,

complement system, blood clotting and extracellular matrix.


63

8 VIRI

Akaike H. 1974. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on

Automatic Control, 19, 6: 716–723 Allendorf F., Ryman N., Utter F. 1987 Genetic and Fishery Management: Past, Present,

and Future. V Population Genetics and Fishery Management. Seattle, University of Washington Press: 420 str.

Arner R.J., Prabhu S., Thompson J.T., Hildenbrandt G.R., Liken A.D., Reddy C.C. 2001.

Myo-Inositol oxigenase: molecular cloning and expression of a unique enzyme that oxidizes myo-inositol and D-chiro-inositol. Biochemical Journal, 360: 313-320

Avise J.C.2000. Phylogeography, the history and formation of species. Harvard university

press, London, 447 pp. Baerwald M.R., May B. 2004. Characterization of microsatellite loci for five members of

the minnow family Cyprinidae found in the Sacramento–San Joaquin Delta and its tributaries. Molecular Ecology Notes, 4, 3: 385–390

Beaumont M.A. 1999. Detecting population expansion and decline using microsatellites.

Genetics, 153: 2013–2029 Beerli P. 2006. Comparison of Bayesian and maximum-likelihood inference of population

genetic parameters. Bioinformatics, 22, 3: 341-345 Beerli P., Felsenstein J. 1999. Maximum-likelihood estimation of migration rates and

effective population numbers in two populations using a coalescent approach. Genetics, 152: 763–773

Belkhir K., Borsa P., Chikki L., Raufaste N., Bonhomme F. Genetix Version 4.05.2,

Logiciel sous Windows pour la Génétique des Populations, 1996 -2004. Page Web de Genetix. http://www.genetix.univ–montp2.fr/genetix/constr (10.sep. 2009)

Bezerra J.A., Bugge T.H., Melin-Aldana H., Sabla G., Kombrinck K.W., Witte D.P.,

Degen J.L.1999. Plasminogen deficiency leads to impaired remodeling after a toxic injury to the liver. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96, 26: 15143-15148


64

Bogutskaya N.G., Zupančič P. 2003. Phoxinellus pseudalepidotus (Telostei: Cyprinidae), a new species from the Neretva basin with an overview of the morphology of Phoxinellus species of Croatia and Bosnia-Herzegovina. Ichthyological Exploration of Freshwaters, 14: 359–383

Bonacci O., Pipan T., Culver D. 2009. A framework for karst ecohydrology.

Environmental Geology, 56: 891-900 Bonacci O. 2006. Crveno i Modro jezero kod Imotskog [Red and Blue Lakes near

Imotski]. Hrvatske Vode, 14: 45-54 Borowsky R.B., Mertz L. 2001. Genetic differentiation among populations of the cave fish

Schistura oedipus (Cypriniformes: Balitoridae). Environmental Biology of Fishes, 62, 1-3: 225–231

Cabin R.J., Mitchell R.J. 2000. To Bonferroni or Not to Bonferroni: When and How Are

the Questions. Ecological Society of America, 81, 3: 246–248 Chakraborty R., Jin L. 2004. A unified approach to study hypervariable polymorphicism:

statistical considerations of determining relatedness and population distances. V DNA Fingerprinting: State of the Science. Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T., Jeffreys, A.J. (eds.) Basel, Switzerland, Berkhauser Verlag: 153-175

Chen W.J., Miya M., Saitoh K., Mayden R.L. 2008. Phylogenetic utility of two existing

and four novel nuclear gene loci in reconstructing tree of life of rayfinned fishes: the order Cypriniformes (Ostariophysi) as a case study. Gene 423, 2: 125–134

Corander J., Marttinen P., Mäntyniemi S. 2006. Bayesian identification of stock mixtures

from molecular marker data. Fishery Bulletin, 104, 4: 550–558 Corander J., Marttinen P., Sirén J., Tang J. 2008. Enhanced Bayesian modelling in BAPS

software for learning genetic structures of populations. BMC Bioinformatics, 9: 539 Corander J., Marttinen P. 2006. Bayesian identification of admixture events using multi-

locus molecular markers. Molecular Ecology, 15, 10: 2833–2843 Corander J., Waldmann P., Sillanpää M.J. 2003. Bayesian analysis of genetic

differentiation between populations. Genetics, 163, 367–374


65

Cornuet J.M., Luikart G. 1996. Description and power analysis of two tests for detecting recent population bottlenecks from allele frequency data. Genetics, 144, 4: 2001–2014

Culver D.C. 2001. The dark zone. The Science 41, 2: 30-35 Culver, D.C. 1982. Cave life: evolution and ecology. Harvard University Press,

Cambridge: 189 str. Culver D.C., Kane T.C., Fong D.W. 1995. Adaptation and natural selection in caves.

Cambridge, Harvard University Press: 223 str. de Belle I., Cai S., Kohwi-Shigematsu T. 1998. The Genomic Sequences Bound to Special

AT-rich Sequence-binding Protein 1 (SATB1) In Vivo in Jurkat T Cells Are Tightly Associated with the Nuclear Matrix at the Bases of the Chromatin Loops. The Journal of Cell Biology, 141, 2: 335–348

Deharveng L., Stoch F., Gibert J., Bedos A., Galassi D., Zagmajster M., Brancelj A.,

Camacho A., Fiers F., Martin P., Giani N., Magniez G., Marmonier P. 2009. Groundwater biodiversity in Europe. Freshwater Biology, 54, 4: 709-726

Dillman C.B., Bergstrom D.E., Noltie D.B., Holtsford T.P., Mayden R.L. 2010. Regressive

progression, progressive regression or neither? Phylogeny and evolution of the Percopsiformes (Teleostei, Paracanthopterygii). Zoologica Scripta, 40, 1: 45-60

Dimsoski P., Toth G.P., Bagley M.J. 2000. Microsatellite characterization in central

stoneroller Campostoma anomalum (Pisces: Cyprinidae). Molecular Ecology, 9, 12: 2187–2189

Džeba T. 2010. Određivanje otjecanja u slivu rijeke Ričine, Suvaje i Matice

(Determination of runoff in the Ričina, Suvaja and Matica river basins). Master’s thesis, University of Split, Faculty of Civil Engineering and Architecture: 237 str.

Edgar R.C., 2004. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high

throughput. Nucleic Acids Research, 32, 5: 1792–1797 Ellegren H. 2004. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature

Reviews Genetics, 5: 435-445


66

Evanno G., Regnaut S., Goudet J. 2005. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology, 14, 8: 2611–2620

Excoffier L. 2007. Arlequin ver. 3.11 An integrated software package for population

genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online, 1: 47–50 Falush D., Stephens M., Pritchard J.K. 2003. Inference of population structure using

multilocus genotype data: linked loci and correlated allele frequencies. Genetics, 164, 4: 1567–1587

Falush D., Stephens M., Pritchard J.K. 2007. Inference of population structure using

multilocus genotype data: dominant markers and null alleles. Molecular Ecology Notes 7, 4: 574–578

Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach.

Journal of Molecular Evolution, 17: 368-376 Field M.S. 1999. The QTRACER Programm for Tracer-Breakthrough Curve Analysis for

Karst and Fractured Aquifers. Washington DC, USEPA: 137 str. Fitch W.M. 1971. Toward defining the course of evolution: minimum change for a specific

tree topology. Sytematic Zoology, 20: 406-416. Ford D, Williams P. 2007. Karst Hydrogeology and Geomorphology. Chichester, Wiley:

576 str. Franičević M., Tičina V. 2003. Biometric characteristics of rare endemic fish, Phoxinellus

adspersu (Heckel 1843), from Red Lake (Imotski, Croatia). Periodicum Biologorum, 4: 453-460

Frankham R., Ballou J.D., Briscoe D.A. 2004. Conservation Genetics. Cambridge,

Cambridge University Press: 220 str. Freyhof J., Lieckfeldt D., Bogutskaya N.G., Pitra C., Ludwig A. 2006. Phylogenetic

position of the Dalmatian genus Phoxinellus and description of the newly proposed genus Delminichthys (Teleostei: Cyprinidae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 38, 2: 416-425

Gams I. 2003. Kras v Sloveniji v prostoru in času, Ljubljana, ZRC SAZU: 293 str.


67

Garašić M. 2001. New speleohydrogeological research of Crveno jezero (Red Lake) near Imotski in Dinaric karst area (Croatia, Europe). Proceedings 13th International Congress of speleology. Brasilia; Brasilia DF (15.7. – 22.7.): 168-171

Goldscheider N., Meiman J., Pronk M., Smart C. 2008. Tracer test in karst hydrogeology

and speleology. International Journal of Speleology, 37, 1: 27-40 Goldscheider N. 2005. Fold structure and underground drainage pattern in the alpine karst

system Hochifen-Gottesacker. Ecologae Geologicae Helvetiae, 98, 1: 1-17 Goldscheider N. 2010. Delineation of spring protection zones.V Groundwater Hydrology

of Springs. Kresic N, Stevanovic Z (eds). Amsterdam, Elsevier: 305-338 Goldstein D., Schlötterer C. 1999. Microsatellites: Evolution and applications. Oxford,

UK, Oxford University Press: 368 str. Goodman S.J. 1997. RST-CALC: a collection of computer programs for calculating

estimates of genetic differentiation from microsatellite data and a determining their significance. Molecular Ecology, 6, 9: 881–885.

Goudet J. 2001. FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation

indices (version 2.9.3). Lausanne, Switzerland, University of Lausanne http://www.unil.ch/izea/softwares/fstat.html (9. jul. 2009)

Guindon S., Gascuel O. 2003. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large

phylogenies by maximum likelihood. Systematic Biology, 52, 5: 696–704. Hall B.G. 2004. Phylogenetic trees made easy. A how-to manual. Second edition.

Sunderland, Sinauer Associates, Inc: 221 str. Hamilton P.B., Tyler C.R. 2007. Identification of microsatellite loci for parentage analysis

in roach Rutilus rutilus and eight other cyprinid fish by crossspecies amplification, and a novel test for detecting hybrids between roach and other cyprinids. Molecular Ecology Notes, 8, 2: 462–465

Hardy O.J., Charbonnel N., Freville H., Heuertz M. 2003. Microsatellite allele sizes: a

simple test to assess their significance on genetic differentiation. Genetics, 163, 4: 1467–1482


68

Hardy O.J., Vekemans X. 2002. SPAGeDi: a versatile compute program to analyse spatial genetic structure at the individual or population levels. Molecular Ecology Notes, 2, 4: 618 - 620

Harpending H.C. 1994. Signature of ancient population growth in a low-resolution

mitochondrial DNA mismatch distribution. Human Biology, 66, 4: 591–600 Hawes R.S. 1939. The flood factor in the ecology of caves. Journal of Animal Ecology, 1:

1-5 Hey J., Nielsen R. 2004. Multilocus methods for estimating population sizes, migration

rates and divergence time, with applications to the divergence of Drosophila pseudoobscura and D. persimilis. Genetics, 167, 2: 747–760

Hey J., Nielsen R. 2007. Integration within the Felsenstein equation for improved Markov

chain Monte Carlo methods in population genetics. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104, 8: 2785 - 2790

Hubisz M.J., Falush D., Stephens M., Pritchard J.K. 2009. Inferring weak population

structure with the assistance of sample group information. Molecular Ecology Resources, 9, 5: 1322 - 1332

Hwang U.W., Kim W. 1999. General properties and phylogenetic utilities of nuclear

ribosomal DNA and mitochondrial DNA commonly used in molecular systematics. The Korean Journal of Parasitology, 37, 4: 215–228

Jeyaraju D.V., Xu L., Letellier M.C., Bandaru S., Zunino R, Berg E.A., McBride H.M.,

Pellegrini L. 2006. Phosphorylation and cleavage of presenilin-associated rhomboid-like protein (PARL) promotes changes in mitochondrial morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 103, 49: 18562-18567

Jović V. 2003. Vode zabiokovskog dijela neretvanskog sliva: istraženost i prijedlog

daljnjih aktivnosti (Waters of Biokovo hinterland in Neretva watershead: research and future activity). Symposium Voda u kršu Cetine, Neretve i Trebišnice, Neum, Zbornik radova, 25–27, 18–30

Juvan P. Rozman D. 2006. Tehnologija mikromrež in njena uporaba v medicini.

Informatica Medica Slovenica, 11, 1: 2-15


69

Kanaet T. 1959. Hidrografske prilike u slivu Tihaljina-Malde-Trebižat (Hydrographic characteristics in watershed of Tihaljina-Malde-Trebižat), Zbornik radova: 5. Kongres geografa FNR Jugoslavije u NR Crnoj Gori (Abstract book of geographic symposium in Yugoslavija, Montenegro), Cetinje, 531

Käs W. 1998. Tracing Techniques in Geohydrology. Rotterdam, Balkema, 526 str. Ketmaier V., Bianco P.G., Cobolli M., Krivokapic M., Caniglia R., De Matthaeis E. 2004.

Molecular phylogeny of two lineages of Leuciscinae cyprinids (Telestes and Scardinius) from the peri-Mediterranean area based on cytochrome b data. Molecular Phylogenetics and Evolution, 32, 3: 1061–1071

Kingman J.F.C. 1982. The coalescent. Stochastic Processes and their Applications, 13, 3:

235–248 Kranjc O. 2004. Dinaric karst. V Encyclopedia of caves and karst science. Gunn J. (ed)

New York : Fitzroy Dearborn: 287–289 Kress W.J., Wurdack K.J., Zimmer E.A., Weigt L.A., Janzen D.H. 2005. Use of DNA

barcodes to identify flowering plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A, 102, 23: 8369–74

Kuhner M.K., Yamato J., Felsenstein J. 2000. Maximum likelihood estimation of

recombination rates from population data. Genetics, 156, 3: 1393–1401 Kvist L. 2000. Phylogeny and phylogeography of European pardis. Academic Dissertation

Acta Universitatis Ouluensis, Academic Dissertation, Finland, University of Oulu: 341 str.

Langella O. 1999. Populations, 1.2.30,

http://www.bioinformatics.org/~tryphon/populations/ (23. nov.2009) Li W.H. 1977. Distribution of nucleotide differences between two randomly chosen

cistrons in a finite population. Genetics, 85, 2: 331–337 Lorena D., Darby I.A., Reinhardt D.P., Sapin V., Rosenbaum J., Desmoulie A. 2004.

Fibrillin-1 expression in normal and fibrotic rat liver and in cultured hepatic fibroblastic cells: modulation by mechanical stress and role in cell adhesion. Laboratory Investigation, 84: 203–212


70

Matschiner M., Salzburger W. 2009. Tandem: integrating automated allele binning into genetics and genomics workflows. Bioinformatics, 25: 1982–1983

Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. 1988. A simple salting out procedure from human

nucleated cells. Nucleic Acids Research, 16: 3: 1215 Mrakovčić M., Brigić A., Buj I., Ćaleta M., Mustafić P., Zanella D. 2006. Crvena knjiga

sladkovodnih riba hrvatske. Republika Hrvatska, Ministrstvo kulture, Državni zavod za zaštitu prirode: 253 str.

Muenzel F.M., Sanetra M., Salzburger W., Meyer A. 2007. Microsatellites from the

vairone Leuciscus souffia (Pisces: Cyprinidae) and their application to closely related species. Molecular Ecology Notes, 7, 6: 1048–1050

Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. New York, Columbia University Press:

302 str. Nesbo C.L., Fossheim T., Vollestad L.A., Jakobson K.S. 1999. Genetic divergence and

phylogeographic relationships among European perch (Perca fluviatis) populations reflect glacial refugia and postglacial colonization. Molecular Ecology, 8, 9: 1387-1404

Norgat M., Chamings J., Pavlova A., Bull J.K., Murray N.D., Sunnuck P. 2009.

Mitochondrial DNA indicates late Pleistocene divergence of populations of Heteronympha merope, an Emerging Model in Environmental Change Biology. PLoS ONE, 4, 11: e7950

Okasha S. 2008 Population Genetics. V The Stanford Encyclopedia of Philosophy, Edward

N. Zalta (ed.) http://plato.stanford.edu/archives/fall2008/entries/population-genetics (15. nov. 2011)

Paetkau D., Calvert W., Stirling I. Strobeck C. 1995. Microsatellite analysis of population

structure in Canadian polar bears. Molecular Ecology, 4, 3: 347-354 Paetkau D., Slade R., Burdens M., Estoup A. 2004. Genetic assignment methods for the

direct, real-time estimation of migration rate; a simulation-based exploration of accuracy and power. Molecular Ecology, 13, 1: 55–65

Palandačić A., Zupančič P., Snoj A. 2010. Revised classification of former genus

Phoxinellus using nuclear DNA sequences. Biochemical Systematics and Ecology, 38, 5: 1069–1073


71

Palandačić A., Matschiner M., Zupančič P., Snoj A. 2012a. Fish migrate underground: the example of Delminichthtys adspersus (Cyprinidae). Molecular Ecology,

Palandačić A., Bonacci O., Snoj A. 2012b. Molecular data as a possible tool for tracing

groundwater flow in karst environment: example of Delminichthys adspersus in Dinaric karst system. Ecohydrology,

Perdices A., Bohlen J., Doadrio I. 2008. The molecular diversity of adriatic spined loaches

(Teleostei, Cobitidae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 46, 1: 382-390 Perea S., Bohme M., Zupančič P., Freyhof J., Šanda R., Ozulug M., Abdoli A., Doadrio I.

2010. Phylogenetic relationships and biogeographical patterns in Circum-Mediterranean subfamily Leuciscinae (Teleostei, Cyprinidae) inferred from both mitochondrial and nuclear data. BMC Evolutionary Biology, 10: 265

Pipan R., Culver D.C. 2007. Epikarst communities: biodiversity hotspots and potential

water tracers. Environmental Geology, 53, 2: 265-269 Piry S., Alapetite A., Cornuet J.M., 2004. GENECLASS2: A software for genetic

assignment and first-generation migrant detection. Journal of Heredity, 95, 6: 536-539

Piry S., Luikart G., Cornuet J.M. 1999. BOTTLENECK: a computer program for detecting

recent reductions in the effective population size using allele frequency data. Journal of Heredity, 86: 502–503

Polihronakis M., Caterino M.S. 2010. Contrasting patterns of phylogeographic

relationships in sympatric sister species of ironclad beetles (Zopheridae: Phloeodes spp.) in California's Transverse Ranges. BMC Evolutionary Biology, 10, 195-206

Posada D. 2008. jModelTest 0.1 Package. Spain, Department of Biochemistry, Genetics

and Immunology, University of Vigo Pritchard J.K., Stephens M., Donnelly P. 2000. Inference of population structure using

multilocus genotype data. Genetics, 155, 4: 945–959 Pronk M., Goldscheider N., Zopfi J. 2009. Microbial communities in karst groundwater

and their potential use for biomonitoring. Hydrogeology Journal, 17, 1: 37-48


72

Proudlove G.S. 2006. Subterranean fishes of the world: An account of the subterranean (hypogean) fishes described up to 2003 with a bibliography 1541-2004. Kalifornija, ZDA, International Society for Subterranean Biology, 300 str.

Reynders H., van der Ven K., Moens L.N., van Remortel P., De Coen W.M., Blust R. 2006

Patterns of gene expression in carp liver after exposure to a mixture of waterborne and dietary cadmium using a custom-made micriarray. Aquatic Toxicology, 80, 2: 180-193

Rice W.R. 1989. Analyzing tables of statistical tests. Evolution, 43, 1: 223–225 Robalo J.I., Almada V.C., Levy A., Doadrio I. 2007. Re-examination and phylogeny of the

genus Chondrostoma based on mitochondrial and nuclear data and the definition of 5 new genera. Molecular Phylogenetics and Evolution, 42, 2: 362-372

Romero A., Paulson K.M. 2001. It’s a wonderful hypogean life: a guide to the

troglomorphic fishes of the world. Environmental Biology of Fishes, 62, 1 - 3: 13–41 Ronquist, F., Huelsenbeck, J.P. 2003. MRBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference

under mixed models. Bioinformatics 19, 12: 1572–1574 Saitou N., Nei M. 1987. Thee Neighbour-joining Method: A New Method for

Reconstructing Phylogenetic Trees. Molecular Biology and Evolution 4, 4: 406-425 Sasaki T., Gan E.C., Wakeham A., Kornbluth S., Mak T.W., Okada H. 2007. HLA-B-

associated transcript 3 (Bat3)/Scythe is essential for p300-mediated acetylation of p53. Genes and Developement, 21, 7: 848-861

Schwarz G. 1978. Estimating the dimension of a model. The Annals of Statistics, 6, 2:

461–464 Seaview, Version 4.2.3 Manolo Gouy Laboratoire de Biometrie et Biologie Evolutive

CNRS/Universite Lyon 1996–2009 http://pbil.univ-lyon1.fr/software/seaview.html, (3. mar. 2010)

Sket B., Paragamian K., Trontelj P. 2004. A census of the obligate subterranean fauna of

the Balkan Peninsula. V Balkan Biodiversity, Pattern and Process in the European Hotspot. Griffiths H.I., Kryštufek B., Reed J.M. (eds.). Dordrecht, Kluwer: 309–322

Sket B. 2004a. Dinaric Karst, Diversity in, V Encyclopedia of Caves. Culver D.C., White

W.B. (eds.). Elsevier Science and Technology: 680 str.


73

Sket B. 2004b. Subterranean habitats. V Encyclopedia of Caves and Karst Science. Gunn J.

(ed.). New York. Fitzroy Dearborn: 902 str. Sket B.; Velkovrh F. 1980. Postojnsko-Planinski jamski sistem kot model za preučevanje

onesnaženja podzemeljskih voda, Naše jame, 22: 27-44 Slatkin M. 1994. Linkage disequilibrium in growing and stable populations. Genetics, 137,

1: 331–336 Slatkin M., Excoffier L. 1996. Testing for linkage disequilibrium in genotypic data using

the Expectation-Maximization algorithm. Heredity, 76, 4: 377–383 Smart C., Worthington S.R.H. 2004. Water tracing. V Encyclopedia of Caves and Karst

Science. Gunn J (ed.). New York. Fitzroy Dearborn: 777-779 Snoj A., Bogut I., Sušnik S. 2008. Evidence of a genetically distinct population of Vrljika

softmouth trout Salmo obtusirostris (Heckel) evolved by vicariance. Journal of Fish Biology, 72: 1945–1959

Song Y., Ailenberg M., Silverman M. 1999. Human MunC13 is a diacylglycerol receptor

that induces apoptosis and may contribute to renal cell injury in hyperglycemia. Molecular Biology of the Cell, 10, 5: 1609-1619

Strecker U., Faúndez V.H., Wilkens H. 2004. Phylogeography of surface and cave

Astyanax (Teleostei) from Central and North America based on cytochrome b sequence data. Molecular Phylogenetics and Evolution 33, 2 :469-8

Swofford D.L. 2003. PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other

Methods), ed. 4.04a. Sunderland, Massachusetts, Sinauer Associates (software) Taberlet P., Fumagalli L., Wust-Saucy A.G., Cosson J.F. 1998. Comparative

phylogeography and postglacial colonization routs in Europe. Molecular Ecology, 7, 4: 453-464

Tamura K., Nei M. 1993. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the

control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution, 10, 3: 512–526

Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. 2011. MEGA5:

Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood,


74

Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739

Trajano E. 2001. Ecology of subterranean fishes: an overview. Environmental Biology of

Fishes 62, 1 - 3: 133–160 Tucker M., Valencia-Sanchez M.A., Staples R.R., Chen J., Denis C.L., Parker R. 2001.

The transcription factor associated Ccr4 and Caf1 proteins are components of the major cytoplasmic mRNA deadenylase in Saccharomyces cerevisiae. Cell 104, 3: 377–386

Vähä J.P., Erkinaro J., Niemelä E., Primmer C.R. 2007. Life-history and habitat features

influence the within-river genetic structure of Atlantic salmon. Molecular Ecology, 16, 13: 2638–2654

van Kuilenburg A.B.P, Meinsma R., Beke E., Assmann B., Ribes A., Lorente I., Busch R.,

Mayatepek E., Abeling N.G.G.M., van Cruchten A., Stroomer A.E.M., van Lenthe H., Zoetekouw L., Kulik W., Hoffmann G.F., Voit T., Wevers R.A., Rutsch F., van Gennip A.H. 2004 ß-Ureidopropionase deficiency: an inborn error of pyrimidine degradation associated with neurological abnormalities. Human Molecular Genetics, 13, 22: 2793-2801

Van Oosterhout C., Hutchinson W.F., Wills D.P.M., Shipley P. 2004. Micro-checker:

software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data. Molecular Ecology Notes, 4, 3: 535-538

Vignal A., Milan D., SanCristobal M., Eggen A. 2002. A review on SNP and other types of

molecular markers and their use in animal genetics. Genetics, Selection, Evolution, 34, 3: 275–305

Weir B.S., Cockerheim C.C. 1984. Estimating F-statistics for the analysis of population

structure. Evololution, 38, 6: 1358-1370 Wetzels R.H.W., Robben H.C.M., Leigh I.M., Schaafsma H.E., Vooijs G.P., Ramaekerst

FCS. 1991. Distribution Patterns of Type VII Collagen in Normal and Malignant Human Tissues. American Journal of Pathology, 139, 2: 451-459

Wilgenbusch J.C., Warren D.L., Swofford D.L. 2004. AWTY: a system for graphical

exploration of MCMC convergence in Bayesian phylogenetic inference. http://ceb.csit.fsu.edu/awty (se uporablja na internetu)


75

Wright S. 1978. Evolution and the Genetics of Populations, 4. Chicago, Illinois. University of Chicago Press: 590 str.

Wu Y., Singh S., Georgescu M.M., Birge R.B. 2005. A role for Mer tyrosine kinase in

alphavbeta5 integrin-mediated phagocytosis of apoptotic cells. Journal of Cell Science, 118, 3: 539-553

Wyatt P.M.W., Pitts C.S., Butlin R.K. 2006. A molecular approach to detect hybridization

between bream Abramis brama, roach Rutilus rutilus and rudd Scardinius erythrophthalmus. Journal of Fish Biology, 69, Supplement sa: 52–71

Yamashita A., Chang T.C., Yamashita Y., Zhu W., Zhong Z., Chen C.Y., Shyu A.B. 2005.

Concerted action of poly(A) nucleases and decapping enzyme in mammalian mRNA turnover. Natural Structure and Molecular Biology 12, 12: 1054–1063

Yang Z. Rannala B. 1997. Bayesian phylogenetic inference using DNA sequences: a

Markov Chain Monte Carlo Method. Molecular Biology and Evolution, 14, 17: 717-724.

Zardoya R., Doadrio I. 1998. Phylogenetic relationships of Iberian cyprinids: Systematic

and biogeographical implications. Proceedings of the Royal Society of London, 265, 1403: 1365–1372

Zupančič P. 2008. Rijetke i ugrožene slatkovodne ribe jadranskog slijeva Hrvatske,

Slovenije i Bosne i Hercegovine (Rare and endangered freshwater fishes of Croatia, Slovenia and Bosnia and Hercegovina) Atlas u boji, Dolsko.

Zwickl D.J., 2006. GARLI: Genetic algorithm approaches for the phylogenetic analysis of

large biological sequence datasets under the maximum likelihood criterion. PhD dissertation, The University of Texas at Austin. www.bio.utexas.edu/faculty/antisense/garli/Garli.html, version 1.0 and GARLI-PART Version 0.97. (https://www.nescent.org/wg_garli/Partition_testing_version) (10. jul. 2010)


76


77

ZAHVALA Mentorju dr. Alešu Snoju se zahvaljujem za strokovno vodstvo in podporo.

Zahvaljujem se dr. Simoni Sušnik, ki me je uvedla v laboratorijsko delo in me naučila osnov

računalniških analiz.

Prof. Petru Trontlju se zahvaljujem za pomoč v prvem letu doktorskega študija in koristnih

nasvetov pri pisanju doktorata. Tudi dr. Eleni Varljen Bužan se zahvaljujem za tehtne

pripombe.

Zahvaljujem se Dušanu Jesenšku, Ante Mikuliću, prof. Ivanu Bogutu, prof. Ognjenu

Bonaciju, Arnetu Hodaliču in še posebno Gašperju Pustovrhu za pomoč na terenu.

Prof. Walterju Salzburgerju in dr. Michaelu Matschinerju se zahvaljujem za pomoč in

svetovanje pri uporabi računalniških programov.

Za pomoč v laboratoriju in pri pisanju gradiva se zahvaljujem dr. Ireni Oven, Daliborki

Dušanić ter dr. Ivanki Cizelj.

Zahvaljujem se tudi vsem ostalim sodelavcem, ki so bistveno pripomogli k mojemu delu.

Staršem in prijateljem se zahvaljujem za podporo in potrpežljivst.


78

PRILOGE Priloga A: Seznam haplotipov citokroma b (mtDNA) po vzorčnih mestih Appendix A: Haplotype distribution per sampling site (cytochrome b, mtDNA) VZORČNA MESTA HAPLOTIPI PROLOŠKO BLATO H1 – 13 %

H2 – 35 % H6; H50; H59 – 9 % H3; H10; H14; H45; H71 – 4%

NEZDRAVICA H1 – 81 % H49 – 14 % H19 – 5 %

DRAGA H1 – 73 % H41 – 13 % H43; H72 – 6 %

BANJA VRGORAC H1 – 60 % H2; H20; H24; H40; H42; H48; H64; H74 – 5 %

PROLOŽAC JEZERINE H2; H3 – 37 % H1; H7; H9; H61; H62 – 5 %

STARI VODOVOD H2; H3 – 31 % H62 – 14 % H16; H23; H31; H70 – 6 %

GRBAVAC H2 – 45 % H3 – 34 % H62 – 11 % H8; H35 – 5 %

RDEČE JEZERO H1 – 68 % H2 – 7 % H53 – 4 % H12; H21; H22; H25; H26; H29; H32 – 3 %

GRUDSKO VRIJELO H1 – 60 % H2 – 12 % H3; H34; H46; H66 – 7 %

JAMINE H1 – 30 % H2; H4; H5; H11; H33; H50; H27; H28; H36; H37 – 7 %

VINJANI DONJI – BUNAR H1 – 58 % H2 – 20 % H54; H58 – 11 %

VINJANI DONJI H1 – 48 % H2 – 22 % H13; H15; H55; H63; H69; H67 – 5 %

UDOVICE H1 – 62 % H2 – 18 % H12; H56; H57; H65 – 5 %

GLAVINA DONJA H1 – 45 % H2; H3 – 10 % H39, H47 – 10 % H33; H44; H51 – 5 %

MEDVIDOVIČEVA DRAGA

H1 – 35 % H2 – 29 %


79

H3; H33; H52; H55; H60; H65 – 6 % GRANČICE H1 – 52 %

H2 – 24 % H30 – 9 % H17; H45; H73 – 5 %

REBIĆ H1 – 67 % H2 – 24 % H18; H38 – 5 %


80

Priloga B: Parne genetske primerjave med vzorčnimi mesti na osnovi mitohondrijske DNA. Φ-statistika je bila izračunana s programom Arlequin 3.11 s 16, 000 permutacijami originalnega seta podatkov. P-vrednosti so bile modificirane z Bonferroni korekcijo. Pod diagonalo so parne vrednosti ΦST indeksov, nad diagonalo pa statistična signifikantnost za p = 0.001. Appendix B: Pairwise genetic distances between sampling sites on the basis of mitochondrial DNA. Φ-statistics, performed with Arlequin 3.11, was tested by 16,000 permutations of the original data set and with p-values adjusted by Bonferroni correction. Below the diagonal: ΦST-values, above the diagonal: significance for p = 0.001. GRV BVID GLD REB VID MED JAM GRAN UDV PJEZ STR GRB CRV PRBL NEZ BVRG DRA GRV 0.000 - - - - - - - - - - - - - - - BVID 0.005 0.000 - - - - - - - - - - - - - - - GLD 0.005 0.018 0.000 - - - - - - - - - - - - - - REB -0.021 0.015 0.039 0.000 - - - - - - - - - - - - - VID -0.021 -0.001 0.018 -0.021 0.000 - - - - - - - - - - - - MED -0.023 0.028 0.039 -0.018 -0.023 0.000 - - - - - - - - + - - JAM -0.003 0.011 0.009 0.023 0.008 0.019 0.000 - - - - - - - - - - GRAN -0.016 0.006 0.038 -0.021 -0.024 -0.012 0.022 0.000 - - - - - - - - - UDV -0.019 0.002 0.021 -0.024 -0.018 -0.013 0.010 -0.014 0.000 - - - - - - - - PJEZ 0.087 0.172 0.133 0.155 0.120 0.081 0.138 0.131 0.148 0.000 - - + - + + - STR 0.047 0.142 0.117 0.098 0.077 0.030 0.106 0.085 0.095 -0.015 0.000 - + - + + - GRB 0.079 0.184 0.146 0.143 0.114 0.061 0.141 0.129 0.137 -0.027 -0.043 0.000 + - + + + CRV 0.020 0.003 0.015 0.025 0.013 0.053 0.020 0.025 0.006 0.216 0.187 0.225 0.000 + - - - PRBL 0.029 0.090 0.097 0.046 0.033 0.015 0.072 0.037 0.058 0.087 0.034 0.060 0.136 0.000 + - - NEZ 0.101 0.074 0.047 0.150 0.088 0.143 0.047 0.127 0.093 0.280 0.271 0.316 0.031 0.195 0.000 - - BVRG 0.027 0.007 0.013 0.049 0.029 0.058 0.010 0.047 0.027 0.184 0.160 0.196 0.011 0.125 0.025 0.000 - DRA 0.071 0.059 0.036 0.119 0.067 0.108 0.029 0.101 0.074 0.228 0.213 0.256 0.036 0.159 0.067 -0.007 0.000


81

Priloga C: Parne genetske primerjave med vzorčnimi mesti na osnovi osmih mikrosatelitnih lokusov. F-statistika je bila izračunana s programom Arlequin 3.11 s 1000 permutacijami originalnega seta podatkov in 5% manjkajočih podatkov. P-vrednosti so bile modificirane z Bonferroni korekcijo. Pod diagonalo so parne vrednosti FST indeksov, nad diagonalo pa statistična signifikantnost (NS, ne signifikantno; *, signifikantno za p-vrednost 0.05; **, signifikantno za p-vrednost 0.01; ***, signifikantno za p-vrednost 0.001). Appendix C: Pairwise genetic distances between sampling sites on the basis of eight microsatellite loci. F-statistics, performed with Arlequin 3.11, was tested by 16,000 permutations of the original data set and with p-values adjusted by Bonferroni correction. Below the diagonal: FST-values, above the diagonal: significance (NS, not significant; *, significant with p-value 0.05; **, significant with p-value 0.01; ***, significant with p-value 0.001). BVID BVRG CRV DRA GLD GRAN GRB GRV JAM MAT MED NEZ PJEZ PRBL REB STR UDV VID BVID 0.000 *** *** *** NS NS *** NS NS NS NS *** *** *** NS *** NS NS BVRG 0.043 0.000 *** NS *** *** *** ** *** NS ** *** *** *** *** *** *** *** CRV 0.041 0.081 0.000 *** *** *** *** ** *** * *** *** *** *** *** *** *** *** DRA 0.037 -0.005 0.070 0.000 *** NS *** NS NS NS NS *** *** *** NS *** NS * GLD 0.009 0.028 0.045 0.029 0.000 NS ** NS NS NS NS *** *** *** NS * NS NS GRAN 0.002 0.031 0.040 0.022 0.006 0.000 *** NS NS NS NS *** *** *** NS *** NS NS GRB 0.049 0.057 0.085 0.063 0.024 0.049 0.000 *** *** *** *** *** NS *** *** NS *** *** GRV -0.009 0.027 0.025 0.022 -0.002 -0.007 0.051 0.000 NS NS NS *** *** *** NS *** NS NS JAM 0.002 0.033 0.039 0.021 0.001 -0.005 0.043 -0.005 0.000 NS NS *** *** *** NS *** NS NS MAT -0.009 -0.058 0.048 -0.047 -0.007 -0.012 0.054 0.007 -0.010 0.000 NS NS *** * NS *** NS NS MED 0.003 0.026 0.045 0.021 -0.002 -0.006 0.038 -0.004 -0.003 -0.006 0.000 *** *** * NS * NS NS NEZ 0.109 0.072 0.148 0.071 0.116 0.115 0.165 0.106 0.114 0.026 0.119 0.000 *** *** *** *** *** *** PJEZ 0.063 0.082 0.111 0.088 0.040 0.062 0.002 0.060 0.052 0.066 0.049 0.183 0.000 *** *** NS *** *** PRBL 0.038 0.068 0.074 0.062 0.028 0.035 0.024 0.037 0.027 0.040 0.028 0.176 0.029 0.000 ** NS ** *** REB 0.002 0.031 0.038 0.020 -0.001 0.003 0.033 -0.004 -0.004 -0.017 -0.009 0.112 0.047 0.026 0.000 ** NS NS STR 0.056 0.074 0.091 0.072 0.031 0.051 -0.002 0.055 0.043 0.067 0.037 0.184 -0.006 0.019 0.035 0.000 *** *** UDV -0.002 0.030 0.042 0.022 0.010 0.003 0.048 -0.006 -0.004 -0.008 -0.002 0.100 0.060 0.032 -0.001 0.049 0.000 NS VID -0.005 0.029 0.033 0.023 0.004 -0.001 0.045 -0.005 -0.005 -0.001 -0.003 0.102 0.055 0.035 -0.004 0.044 -0.005 0.000


82

Priloga D: Parne genetske primerjave med vzorčnimi mesti na osnovi osmih mikrosatelitnih lokusov. R-statistika je bila izračunana s programom RST-CALC s 1000 ponovitvami. P-vrednosti so bile modificirane z Bonferroni korekcijo. Pod diagonalo pa statistična signifikantnost (NS, ne signifikantno; *, signifikantno za p-vrednost 0.05; **, signifikantno za p-vrednost 0.01; ***, signifikantno za p-vrednost 0.001). Appendix D: Pairwise genetic distances between sampling sites on the basis of eight microsatellite loci. R-statistics, performed with RST-CALC, was tested by 1000 iterations and with p-values adjusted by Bonferroni correction. Below the diagonal: RST-values, above the diagonal: significance (NS, not significant; *, significant with p-value 0.05; **, significant with p-value 0.01; ***, significant with p-value 0.001). BVID BVRG CRV DRA GLD GRAN GRB GRV JAM MAT MED NEZ PJEZ PRBL REB STR UDV VID BVID *** ** *** NS NS ** NS ** *** NS *** ** ** NS ** NS NS BVRG 0.236 *** NS *** *** *** *** *** NS *** *** *** *** *** *** *** *** CRV 0.054 0.402 *** *** ** *** *** *** *** *** *** *** *** ** *** *** *** DRA 0.167 0.018 0.321 *** *** *** *** *** NS *** *** *** *** *** *** *** *** GLD -0.001 0.179 0.069 0.108 NS ** NS * *** NS *** ** ** NS ** NS NS GRAN -0.018 0.237 0.051 0.164 -0.005 *** NS * *** NS *** *** * NS ** NS NS GRB 0.055 0.239 0.112 0.151 0.029 0.047 ** *** *** * *** NS *** * NS ** *** GRV -0.001 0.233 0.082 0.166 0.002 -0.008 0.040 NS *** NS *** ** ** NS * NS NS JAM 0.040 0.215 0.104 0.162 0.018 0.032 0.087 0.020 *** NS *** *** *** NS *** * ** MAT 0.177 -0.011 0.358 0.052 0.142 0.188 0.226 0.189 0.172 ** NS *** *** *** *** *** *** MED -0.012 0.210 0.071 0.130 -0.013 -0.018 0.023 -0.021 0.017 0.173 *** NS * NS NS NS NS NEZ 0.277 0.129 0.474 0.213 0.249 0.288 0.352 0.282 0.254 0.024 0.279 *** *** *** *** *** *** PJEZ 0.047 0.247 0.107 0.162 0.028 0.043 -0.008 0.033 0.074 0.226 0.019 0.343 *** * NS *** *** PRBL 0.055 0.328 0.054 0.249 0.058 0.036 0.050 0.048 0.098 0.307 0.040 0.401 0.061 NS NS * ** REB 0.002 0.228 0.041 0.152 -0.006 -0.010 0.036 -0.007 0.011 0.200 -0.016 0.290 0.034 0.023 NS NS NS STR 0.054 0.300 0.087 0.222 0.041 0.044 -0.007 0.032 0.085 0.274 0.027 0.392 -0.003 0.026 0.033 * ** UDV -0.008 0.216 0.053 0.154 -0.002 -0.014 0.046 -0.003 0.036 0.170 -0.009 0.271 0.049 0.033 -0.006 0.042 NS VID -0.005 0.255 0.045 0.197 0.011 -0.009 0.064 -0.001 0.032 0.199 0.001 0.275 0.058 0.041 0.000 0.049 -0.005

Priloga E: Rezultati anlize z modelom izolacija-z-migracijo, izračunani s programom IMa2. Čas od ločitve populacij (t0), efektivne velikosti predniške in obeh populacij, ki so iz nje nastale (qA, q1, q2), migracijske stopnje (m0>1 and m1>0) in populacijske migracijske stopnje (2N0m0>1 and 2N1m1>0) in s 95 % intervali posteriorne gostote. Okrajšave: RCENT = izviri v Imotskem (7 vzorčnih mest); JAGR = izviri v Grudah (2vzorčni mesti); CENT, izviri v Imotskem + izviri v Grudah; NEZ = Nezdravica; BVDR = Banja Vrgorac + Draga; GPJS = Grbavac + Proložac Jezerine + Stari vodovod; CRV= Crveno jezero; PRBL = Prološko Blato; GLD = Glavina Donja. Appendix E: IM model estimates: time since divergence (t0), effective population sizes of ancestral and descendent populations (qA, q1, q2), migration rates (m0>1 and m1>0) and population migration rates (2N0m0>1 and 2N1m1>0) with the lower and upper boundaries of the 95 % Highest Posterior Density (HPD) interval. Abbreviations: RCENT = Imotski springs (7 locations); JAGR = Grude (2 locations); CENT = Imotski springs + Grude; NEZ = Nezdravica; BVDR = Banja Vrgorac + Draga; GPJS = Grbavac + Proložac Jezerine + Stari vodovod; CRV = Crveno jezero; PRBL = Prološko Blato; GLD = Glavina Donja. Group pair

t0 HiSmth (95%Lo–95%Hi)

qA HiPt (95%Lo–95%Hi)

q1 HiPt (95%Lo–95%Hi)

q2 HiPt (95%Lo–95%Hi)

m0>1 HiPt (95%Lo–95%Hi)

m1>0

HiPt (95%Lo–95%Hi)

2N0m0>1


2N1m1>0


CENT–NEZ

0.223 (0.105–1.751)

73.75 (39.75–485.8)

0.75 (0.25–1.25)

20.25 (12.75–34.75)

0.62 (0.1–1.74)

0.02 (0.02–3.9)

18.81 (2.179–38.96)

0.007 (0.0111–0.8393)

CENT–BVDR

1.599 (0.625–1.967)

16.75 (10.75–36.25)

10.25 (6.25–18.75)

36.25 (21.25–83.75)

0.18 (0.02–1.22)

0.1 (0.02–0.82)

3.098 (0.2599–9.975)

0.7556 (0.06985–3.651)

CENT–CRV

0.285 (0.149–1.891)

27.75 (16.75–458.2)

2.75 (1.75–5.75)

19.75 (12.25–50.75)

1.06 (0.14–3.06)

0.14 (0.02–3.5)

15.39 (3.178–38.24)

0.6138 (0.07485–3.678)

CENT–PRBL

0.175 (0.069–1.905)

30.75 (19.25–480.2)

4.75 (2.75–10.75)

21.25 (12.75–53.75)

2.3 (0.18–5.98)

0.02 (0.02–4.38)

20.97 (2.139–38.96)

0.01999 (0.09995–8.376)

CENT–GPJS

0.239 (0.149–1.911)

97.75 (40.25–487.2)

2.75 (1.75–4.75)

21.75 (13.25–55.75)

2.34 (0.82–4.62)

1.22 (0.14–3.98)

39.96 (7.536–39.52)

1.934 (0.269–4.035)

CRV–GPJS

0.315 (0.173–1.515)

3.25 (1.75–6.25)

3.75 (2.25–6.75)

27.25 (15.75–66.25)

0.02 (0.02–1.7)

0.02 (0.02–1.58)

0.00397 (0.02779–2.322)

0.00407 (0.03663–2.56)

PRBL–GPJS

0.123 (0.027–1.483)

5.75 (3.25–419.2)

3.25 (1.25–6.25)

20.75 (12.25–60.25)

4.06 (0.38–11.46)

0.3 (0.1–6.54)

12.01 (1.779–36.56)

2.099 (0.1399–7.816)

BVDR–NEZ

0.689 (0.259–1.899)

236.2 (54.75–488.8)

0.75 (0.75–1.25)

30.25 (18.75–76.75)

1.98 (1.34–3.86)

1.62 (0.46–4.7)

39.96 (11.09–39.64)

0.6746 (0.245–1.267)

GLD–CRV

0.345 (0.155–1.823)

11.75 (6.75–32.25)

4.25 (2.25–7.25)

30.25 (19.25–67.25)

0.82 (0.06–2.38)

0.02 (0.02–1.94)

5.657 (0.4997–16.89)

0.09671 (0.03563–2.733)

RCENT–JAGR

0.001 (0.001–1.565)

499.8 (36.25–488.2)

7.75 (3.25–454.2)

26.75 (18.25–56.25)

0.02 (0.1–13.14)

0.3 (0.06–6.54)

0.01999 (0.6597–38.6)

1.299 (0.3398–30.88)

molekularna ekologija imotske gaovice (delminichthys adspersus ...

Documents

Transcript of molekularna ekologija imotske gaovice (delminichthys adspersus ...