Biochimica et Biophysica Acta 1822 (2012) 1896-1912

Flor Sánchez * †, Johan SmitzFollicle Biology Laboratory, Vrije Universiteit Brussel, Laarbeeklaan 101, 1090 Brussels, Belgium

1. IntroducciónEn la última década, se ha hecho un progreso sustancial en la eluci-

dación de los factores que regulan los ovocitos y el folículo crecimiento y develop¬ment, así como la maduración de ovocitos, a través del estudio de las funciones fundamentales de un gran número de proteínas expresadas a lo largo de la ovogénesis , en particular durante las primeras etapas de la foliculogénesis. Esto se ha logrado principalmente mediante la evaluación de la falta de sus productos génicos ya sea mediante el uso de enfoques knockout y / o deleción dirigida.

La aplicación de técnicas de biología molecular para el quantifica¬tion de la expresión génica, mediante el uso de análisis de microarrays y en tiempo real PCR tecnologías ha proporcionado nuevos conocimientos sobre la regulación de los ARNm de manera dependiente de la etapa durante la foliculogénesis, tanto en ovocitos y células del cúmulo. Del mismo modo, los enfoques proteómicos y una reciente nueva perfiles de todo el genoma de mRNA materna en asociación con la polisomas, han permitido identificar pro¬teins recién traducidos durante la maduración de ovocitos, en una etapa en la transcripción ya ha cesado.

En este sentido, se ha hecho un gran progreso en los aspectos básicos de la investigación de los ovocitos en el nivel molecular. El descubrimiento de muchos molecular

procesos / vías involucradas en toda la ovogénesis y la ovulación, y la identificación de posibles marcadores de la calidad de los ovocitos se han logrado en los últimos años.

El uso de enfoques in vitro en animales grandes, pero principalmente en el modelo de ratón, se ha convertido también relevante en la prestación

de infor¬mation valioso que no se podría obtener en humanos por razones éticas. Haciendo uso de técnicas de biología molecular junto con los sistemas de cultivo in vitro de folículos preantrales y / o la maduración de ovocitos in vitro, por ejemplo, ha permitido el estudio de la influencia de una serie de factores (tales como hormonas, proteínas recombinantes, y / o crecimiento en fac ¬tors) en el desarrollo del folículo, la supervivencia, la producción de esteroides, el crecimiento y la maduración de ovocitos, y el potencial de desarrollo. Además, el cultivo de células granulosa y el ovocito co-cultivo con células de la granulosa se han convertido en modelos aceptados para estudiar la interacción entre los ovocitos y sus células somáticas que rodean y para proporcionar un enfoque en el potencial de los oocitos para regular una variedad de funciones de células de la granulosa.

Se ha producido un aumento exponencial de los conocimientos en el campo de la biología de los ovocitos; los resultados de varios estudios entregados contribuyen mas¬sively a la comprensión de la base molecular de la adquisición de meiótica del ovocito y competencia de desarrollo. La presente revisión tiene la ambición de proporcionar información sobre los últimos avances en el campo, haciendo hincapié en los factores clave que intervienen en el reg¬ulation de ovogénesis y la maduración de ovocitos. Un enfoque particular que se pro¬vided sobre el papel crucial de las células interacciones ovocito cumulus ovocito y el control de la función de las células de la granulosa en diferentes etapas de desarrollo fol¬licle y maduración.

*☆ This article is part of a Special Issue entitled: Molecular Genetics of Human Reproductive Failure.

† Corresponding author. Tel.: +32 2 477 4645; fax: +322477 5060.

E-mail addresses: fsanchez@vub.ac.be (F. Sánchez), Johan.Smitz@uzbrussel.be (J. Smitz).

0925-4439/$ - see front matter © 2012 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.bbadis.2012.05.013

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Biochimica et Biophysica Acta

Review

Molecular control of oogenesis^

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A R T I C L E I N F O R E S U M E N

Article history:Received 17 January 2012 Received in revised form 8 May 2012 Accepted 13 May 2012 Available online 24 May 2012

Keywords:Oocyte development Folliculogenesis Gene expression Oocyte maturation Cumulus-oocyte complex

Ovogénesis es un proceso complejo regulado por un gran número de factores intra y extra-ovario. Oogonias, que se

originan a partir de células germinales primordiales, proliferan por mitosis y forman ovocitos primarios que la

detención en la etapa de la profase de la primera división meiótica hasta que estén completamente desarrollados.

Dentro de ovocitos primarios, la síntesis y la acumulación de ARN y proteínas a lo largo de la ovogénesis son

esenciales para el crecimiento y la maduración de los ovocitos; y por otra parte, que es crucial para el desarrollo en

un embrión viable después de la fecundación. Meiótica de ovocitos y competencia de desarrollo que se gana en una

manera gradual y secuencial durante la foliculogénesis y se relaciona con el hecho de que el ovocito crece en

interacción con sus células somáticas de compañía. La comunicación entre el ovocito y sus células de la granulosa de

los alrededores es de vital importancia, tanto para el desarrollo de los ovocitos y células de la granulosa

diferenciación. Los ovocitos dependen de células del cumulus diferenciadas, que les proporcionan nutrientes y

señales reguladoras necesarias para promover nuclear de ovocitos y la maduración citoplasmática y en consecuencia

la adquisición de propósito competence.The desarrollo de este artículo es resumir los conocimientos recientes sobre

los aspectos moleculares de la ovogénesis y ovocitos estera ¬uration, y el papel crucial de las interacciones célula-

cumulus, destacando la valiosa contribución de las evidencias experimentales obtenidos en modelos animales. Este

artículo es parte de un número especial titulado: Genética Molecular de la insuficiencia reproductiva humana.

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1. Las primeras etapas de la ovogénesis y foliculogénesis1.1. Las células germinales primordiales y la formación del folículoLos ovocitos se originan a partir de células germinales primordiales

(PGC). Ratón PGC se originan ya a los 7,5 días de desarrollo embrionario (E7.5) en el mesodermo embrionario extra y su desarrollo depende inicialmente en señales derivadas tanto del ectodermo extraembrionario y endodermo visceral. Los miembros de la familia TGF (3 como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), BMP4, BMP8B (origen ectodermo) y BMP2 (origen endodermo) son factores específicos necesarios para la formación de PGC y la regulación de la expresión génica [1-3] (Fig. 1 ).

PGCs migran a la cresta genital en alrededor de E10.5 en el ratón, donde proliferan por mitosis y dan lugar a oogonios. Migración, proliferación y colonización de PGCs a las gónadas en desarrollo están controlados por muchos factores y dependen así como en la interacción de PGCs y sus células somáticas circundantes. En estudios in vitro han demostrado que BMP2 y BMP4 aumentan el número de PGCs de ratón en cultivo [4,5], mientras que knockouts ratón BMP7 muestran una reducción en el número de células germinales alrededor de este período [6]. Activina También se ha demostrado que aumenta el número de PGCs en humanos [7], aunque la activina inhibe la proliferación de PGC en ratón [8]. El papel de los factores de transcripción derivados de células germinales en esta etapa también se ha demostrado mediante el uso de enfoques knockout y deleciones condicionales en ratones. Estos incluyen factores tales como BL1MP1 y PRDM14, que son críticos para la proliferación y migración PGC [9-11], así como OCT4, NANOG [11-13], que son esenciales para la supervivencia PGC. Parecen ser necesarios varios factores para la supervivencia PGC, como F1Ga (factor en la línea germinal alfa), un factor responsable de la expresión temprana de las glicoproteínas que formará la zona pelúcida [14], NANOS3 (nanos homólogo 3; Drosophila) y DND1 (homólogo de punto muerto 1), dos RNA proteínas que protegen PGCs de someterse a apopto¬sis, así como la vía de ligando K1T / K1T (K1TL) de unión. Las mutaciones en cualquiera de los genes que codifican para estos factores conducen a una deficiencia en la formación de folículos primordiales debido a un agotamiento de las células germinales [12-17].

En todo el período de migración de PGC en las crestas genitales (E10.5) la determinación del sexo comienza. Diferenciación en los ovarios parece ser el

vía predeterminada, ya que el XY crestas genitales se diferencian en los testículos bajo la influencia de la Sry gen Y ligado a. Las gónadas XX no tienen SRY, y por lo tanto se convierten en ovarios [18]. Tan pronto como se forman las CGP, la gónada inicialmente bipotencial continuará su diferenciación principalmente bajo la influencia de factores de transcripción somática celular derivada GATA4, FOXL2, Lhx9, WT1, WNT4, y SF1 [19-22] (Fig. 1).

Después de la colonización de la gónada (~ E13.5), CGP serán sometidos a una fase de proliferación mitótica con una citocinesis incompleta, lo que lleva a la formación de 'quistes de células germinales "o" nidos de células germinales "[23]. A raíz de este evento y antes de la formación del folículo divisiones mitóticas detienen y células germinales iniciar la meiosis, se convierten en ovocitos primarios y comprometerse con el programa femenino de desarrollo [24].

Meiosis iniciar con una etapa profase, una fase compleja que se subdivide en cinco etapas: leptotene, zygotene, pachytene, diplotene y diacinesis. En el primer período de la profase, una serie de acontecimientos cruciales ocurren, que involucra el apareamiento de cromosomas homólogos, syn¬apsis (estrecha asociación entre estos cromosomas) y recombina¬tion o 'cruzar' (intercambio de material genético). Posteriormente, los ovocitos avanzan a la etapa diplotene donde entran en una fase de reposo pro¬longed llamada dictyate [25]. En ovarios de ratón embrionarias, la iniciación del programa meiótica es dependiente sobre el ácido retinoico y Stra8 (gen estimulado por el ácido retinoico 8) de señalización. Stra8 es un factor cytoplas¬mic expresado por las células germinales femeninas justo antes de entrar la pro¬phase de primera división meiótica [26], y en respuesta al ácido retinoico (RA) [27-29]. En las hembras se requiere para la replicación del ADN Stra8 premeiotic así como para los eventos meióticos profase (es decir, la condensación de cromosomas, co¬hesion, sinapsis y recombinación) [30].

Fig. 1. figura representativa de los factores implicados en células germinales primordiales (PGC) la formación, la ovogénesis y foliculogénesis. Factores ováricos producidas por las células de la teca / del estroma (en azul), las células somáticas / granulosa (en morado), células germinales (en rojo) o tanto en células de células germinales y granulosa (verde), participan y regulan los ovocitos y el folículo desarrollo en cada uno de las etapas definidas a lo largo de la foliculogénesis. Los factores de transcripción implicados se indican con una estrella (*). Las proteínas del ectodermo embrionario extra que participan en for¬mation PGC se indican en negro.

Los ovocitos se mantienen en la fase de la meiosis 1 dictyate toda oogene¬sis, hasta LH induce la maduración de ovocitos final (en la mayoría de los mamíferos). Pro¬phase eventos son de vital importancia para la supervivencia de las células germinales y la progresión meiótica, y los errores que ocurren a lo largo de esta etapa, así como durante las fases de consecu¬tive de la meiosis, puede originar y / o contribuir a aneuploidías meióticas femeninos. 1ndeed, disruptores endocrinos, como el bisfenol A (BPA), han demostrado que causa alteraciones en la formación del huso,

para interferir con la polimerización de microtúbulos e inducir husos multipolares en ovocitos de ratón. Exposición en el útero 1n a BPA parece interferir con el control de la recombinación en fetales profase 1 ovocitos y el aumento

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los riesgos de errores en la segregación cromosómica en ovocitos de la reanudación de la estera-ración en hembras adultas [31]. Por otra parte, en los ovocitos folículo-cerrado, acondicionado continua exposición a niveles altos (30 pM) de BPA durante vitro el desarrollo folicular en conduce a un arresto meiótico aumento en la etapa GV y un in¬crease en la meiosis I aberrante (la mayoría de ellas con no alineados chromo¬somes) y la meiosis II husillos [32]. Por lo tanto, las dosis bajas de exposición al BPA ha sugerido que sea nocivo para los seres humanos mediante el aumento de los ovocitos ploidía aneu- [33]. -Detallada toda la información sobre la meiosis y el origen de aneuploidías meióticas se revisan en el próximo capítulo de la edición especial sobre "Genética Molecular de la insuficiencia reproductiva humana": Molecular Origen de Mujeres meióticos aneuploidías: factores que determinan el riesgo de aneuploidía, ¿cuál es la efecto, lo que es específico acerca humano.

Alrededor del momento de la detención meiótica, avería nidos de células germinales para iniciar la formación del folículo. Los ovocitos se vuelven rodeados por células somáticas (pre-granulosa) y forman folículos primordiales. La formación del folículo se produce antes del nacimiento en humanos (durante el segundo trimestre del de¬velopment fetal) e inmediatamente después de su nacimiento en el ratón [23].

Los procesos de mantenimiento quiste células germinales y la descomposición no se entienden completamente (ver para su revisión, [34,35]). Los estudios en roedores señalan a un papel de los estrógenos en el mantenimiento de los nidos de células germinales [36-38]. Por otra parte, el trabajo realizado por Jefferson et al. [39] sug¬gests que los estrógenos mantener nidos de células germinales a través de la recep¬tor de estrógeno (ER) -p, desde ER- (3 ratones knockout expuestos a una genisteína (un compuesto estrogénico) no forman folículos multi-ovocito (MOF) , mientras que ER-un nocaut o ratones de tipo salvaje hacer. MOF son folículos con-que contiene dos o más ovocitos sin mem¬brane sótano de separación. Durante desglose nido, la formación de MOF parece ocurrir como resultado de una ruptura incompleta [35 ]. Además de los esteroides, los miembros de la beta del factor de crecimiento transformante (TGF-p) superfamilia (como GDF9 y BMP15) y otras proteínas tales como FOXL2 y Nobox también parecen estar involucrados en este proceso. La falta de estos genes o una expresión reducida y la función de los productos de los genes afectan el momento de la ruptura nido y perjudica este proceso [40 a 44]. A pesar de que este modelo se puede aplicar en los roedores, todavía no está claro qué señales desglose anidan en-duce células germinales en los humanos, aunque los esteroides también parecen jugar un papel.

A lo largo de germen de ruptura del quiste celular, un número sustancial de oo¬cytes se pierden. Muchos ovocitos que no están rodeados por células somáticas sufren apoptosis [45]. La apoptosis es un proceso crucial, primero determin¬ing la piscina de folículos primordiales, y más tarde jugar un papel en la atresia folicular. Muchas proteínas pro-y anti-apoptóticos han sido demon¬strated para regular la muerte de células germinales. Por ejemplo, en ausencia de BCL2, un miembro anti-apoptótica de la célula B linfoma / leucemia (BCL) de la familia de proteínas, un número reducido de ovocitos y fol¬licles primordiales pero un número normal de folículos primarios han sido reportados en un temprano la edad (6 semanas), lo que sugiere que BCL2 puede tener un impacto sobre la supervivencia del folículo durante el establecimiento de PGC y / o la formación del folículo primordial. Un papel similar ha sido sugerido para BclX [46,47]. Por el contrario, la proteína BAX pro-apoptóticos, también miembro de la familia BCL, promueve la muerte celular. La pérdida de Bax muestra un aumento del número de células germinales en E13.5; y a pesar de algunas re¬sults contradictorios, se ha informado de que la pérdida de Bax o la pérdida de su regulador Ahr (receptor de aril hidrocarburos), resulta en un aumento en el número de folículos primor¬dial como se observa a las 6 semanas y 4 días postnatal, respectivamente [ 48-50].

Del mismo modo, la participación de otras vías, tales como la vía activada por caspasas, también conduce a la apoptosis. Se ha demonstrat¬ed que en ausencia de caspasa 2 (CASP2), un aumento del número de folículos primordiales se puede encontrar [51].

1.1. La activación de los folículos primordialesFolículos primordiales constituyen el depósito total de células germinales

avail¬able durante todo el período de la vida reproductiva femenina. Ellos se activan y se reclutan de forma continua en las cohortes de iniciar la foliculogénesis, un proceso que toma alrededor de dos semanas en ratones y casi seis meses en los seres humanos. La activación del folículo primordial es un proceso muy dy¬namic y estrictamente controlada, ya pesar de la enorme pro¬gress que se ha hecho, muchos mecanismos moleculares son todavía no se entiende completamente. La vía de señalización PTEN / P13K, conocido por ser in¬volved en una serie diferente de procesos celulares tales como regulación de la proliferación celular y la apoptosis [52] es una vía fundamental requerido para ac¬tivation de folículos primordiales. A P13K funcional (fosfatidilinositol 3 quinasa) vía de señalización está presente en ovocitos de folículos primordiales y primarios [53]. La activación de la vía P13K conduce a la activación de AKT su componente, una proteína serina / treonina quinasa que aumenta la proliferación celular y la supervivencia, mientras que PTEN (fosfatasa y homólogo de tensina suprimido en el cromosoma 10) es un regulador negativo de P13K [52] (Fig. 2).

La ausencia de PTEN en oocitos conduce a un aumento de la actividad P13K y, como resultado, un aumento de la fosforilación de AKT y FOXO3a (caja forkhead O3), otro componente de la vía P13K [54]. FOXO3 es un factor de transcripción que conduce a la detención del ciclo celular y la apoptosis (Fig. 2). Mientras que la fosforilación activa AKT, que suprime la acción FOXO3. FOXO3 se expresa en ovocitos de ratón y está implicado en la represión de la activación folículo primordial, probablemente por inhibición de la transcripción de genes esenciales durante la ovogénesis y foliculogénesis. Los ratones que carecen FOXO3 muestran activación prematura de los folículos pri¬mordial y un agotamiento adicional de

folículos a las 18 semanas [55,56] post¬natally. Similar al fenotipo de FOXO3 ovarios mutante nulo, la falta de PTEN da como resultado un agotamiento de la piscina folículo primordial [54].

La manipulación de la vía de PTEN / P13K, mediante tratamiento in vitro de ovarios de ratón y el tejido cortical de ovario humano con un inhibidor de PTEN y un activador P13K, ha permitido a la inducción de ac¬tivation folículo primordial in vitro, la generación de folículos preovulatorios que contienen óvulos maduros, después del trasplante del tejido de ovario [57].

Detención de folículos primordiales, por otra parte, depende de la ex¬istence de otra vía de señalización que implica el supresor de tumor

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La esclerosis tuberosa compleja 1 (TSC1) y el blanco de los mamíferos de la rapamicina complejo 1 (mTORCl). En un modelo de ratón, Tsc1 se ha demostrado que regulan negativamente mTORCl y mantiene la quiescencia de los folículos pri¬mordial (Fig. 2). -Mutación nula en oocitos conduce a una activación prematura de los folículos primordiales y al agotamiento folicular, y los resultados en la insuficiencia ovárica prematura (POF) [58]. Por lo tanto, las acciones sinérgicas medi¬ated por el TSC / mTORCl y PTEN / P13K vías de señalización son fundamentales en la regulación del descanso y la activación de la piscina folículo primordial.

La interacción de ligando KIT y su receptor KIT, expresada temprano por las células somáticas y de los ovocitos, respectivamente, también está involucrado en los eventos clave que controlan la iniciación del crecimiento folicular mediante la promoción de reclutamiento de células de la teca, la proliferación de células de la granulosa y estimular el crecimiento oo¬cyte [59] . Los estudios in vitro han demostrado que el tratamiento con ligando KIT regula el / Akt P13K en oocitos, mediante la activación de AKT y la represión de la transcripción factor de FOXO3, como resultado de una fosforilación in¬creased de ambos componentes [53].

Otros factores de crecimiento importantes, tales como las neurotrofinas (que desempeñan principalmente un papel como parte del sistema nervioso); También se ha demostrado para regular la foliculogénesis temprana. Por ejemplo, fac¬tor de crecimiento nervioso (NGF) se expresa tanto en las células somáticas y de los ovocitos incluso antes de fol¬licle formación y parece jugar un papel en la activación del folículo primordial [60,61]. Ovarios de ratones de siete días de edad que carecen de NGF muestran un pro¬liferation disminución de las células somáticas y contienen pocos folículos primarios, lo que sugiere que se requiere la señalización de NGF para esta transición [62].

Expresión células de la granulosa de anti-Mullerian hormonal (AMH), un miembro de la TGF (3 superfamilia, se requiere para mantener un equilibrio entre el número de folículos primordiales ser activados y los que permanecen estancia en la piscina de reposo. Como se ha demostrado en ratones nulos mutante para el gen Amh, la ausencia de AMH condujo a un aumento de la contratación de los folículos primordiales y un rápido agotamiento de la reserva de folículos en reposo. Más folículos antrales preantral y pequeñas fueron ob¬served en el golpe de gracia en comparación con el tipo salvaje [63, 64]. Por lo tanto, al menos en el ratón, AMH inhibe el reclutamiento de folículos primordiales en la creciente piscina [65,66]. Sin embargo, un efecto positivo en la iniciación de crecimiento del folículo primordial por tratamiento con AMH se ha informado en el modelo humano [ 67], lo que implica que se necesitan más estudios para comprender este proceso en los grandes mamíferos.

Folículos primordiales darán lugar a folículos primarios en el que las células de la granulosa aplanadas se convertirán en células de la granulosa cuboidal de una sola capa (Fig. 1). La expresión temprana de otros dos factores transcrip¬tion de origen ovocito, Sohlhl y Nobox, es decisiva para la progresión de folículos primordiales a la siguiente etapa folicular primaria. En los ovarios que carecen Nobox (Nobox ovogénesis homeobox) la mayoría de los folículos están detenidos en la etapa primordial, los ovocitos se degeneran y no desarrollan más allá cúbicas folículos pri-maria de una sola capa [43]. Una deficiencia en la expresión Nobox conduce a abajo regulación de muchas transcripciones ovocitos

importantes con papeles en etapas differ¬ent de crecimiento tales como Mos, Oct4, Rfpl4, Fgf8, Zarl, Dnmtlo, Gdf9, Bmp15 y Hloo, lo que indica el papel esencial de Nobox como un reg¬ulator de ovocitos y el desarrollo folicular. Del mismo modo, en ratones mutantes nulos para la espermatogénesis y la ovogénesis factor básico tran¬scription hélice-bucle-hélice (Sohlhl - / -), la progresión a la etapa primaria se interrumpe y el crecimiento del folículo es detenido en la etapa de folículo primordial [68]. Por otra parte, una deficiencia de este factor conduce a la regulación a la baja de Nobox y, en consecuencia, a la baja regulación de muchos genes regulados por este último. Esto pone de relieve el papel potencial de ambos Sohlhl y Nobox como reguladores maestros clave de ovogénesis temprana y la foliculogénesis.

Theca / factores estroma derivados, los miembros de la TGF (3 super-familia, también determinará la progresión folículo primordial. 1n exposición in vitro de ovarios de ratas neonatales de BMP4 aumentó la proporción de develop¬ing folículos primarios y redujo el número de folículos primordiales en reposo [69]. Del mismo modo, un aumento en el número de folículos preantrales y an¬tral se obtuvo después de la inyección de BMP7 recombinante en rata bursa de ovario [70].

1.1. La progresión de la primaria a la fase folicular secundariaLos primeros folículos preantrales son independientes de FSH para

su crecimiento inicial, como se evidencia por el hecho de que el desarrollo de la etapa primaria y secundaria puede tener lugar en ausencia de hormonas [71], aunque folículo estimulantes receptores de hormonas (FSHR) están presentes en la granulosa células (GC) de estos primeros folículos, tanto en ratón y humanos [72,73]. Primaria a la transición folículo secundario es más bien impulsado por factores paracrinos intraováricos locales producidos por los oocitos, sus células de la granulosa de compañía y células de la teca [74] (Fig. 1).

Dos miembros muy conocidos de la TGF (3 superfamilia, GDF9 y BMP15, tienen un papel que se inicia durante las primeras etapas y continúa a lo largo de la foliculogénesis y la ovulación. Ovarios femeninos ratones que carecen Gfd9 son capaces de formar folículos primordiales, pero no progresan be¬ allá de la etapa de folículo primario; como consecuencia, estos ratones no son fértiles Concordantemente, la exposición in vitro de tejido ovárico para GDF9 sup¬ports un papel de GDF9 en la promoción del desarrollo del folículo más allá de la etapa primaria [75,76] Resulta interesante.. , GDF9 ovarios ratones knockout desarrollan células de la granulosa anormales con un aumento de la expresión de KitL y no adquieren células de la teca [77-79]. Esto demuestra un papel de GDF9 en la regulación de la función de las células pre-granulosa desde etapas muy tempranas on¬wards [ 79]. BMP15 juega un papel en la estimulación de la proliferación de las células de la granulosa no diferenciadas de una manera-FSH independiente [80]. Sin embargo, a diferencia de GDF9, ratones hembras mutantes nulos que carecen del gen de exposiciones Bmp15 únicos problemas de fertilidad menores [81].

La progresión del desarrollo folicular temprana también requiere la proteína expres¬sion y acción ofTATA vinculante 2 (Tbp2), un factor de transcripción-ovocito específico expresado a lo largo de la foliculogénesis. Ovarios Ratones de¬ficient en Tbp2 tener un número reducido de folículos secundarios y, además, tienen una expresión alterada de tran¬scripts ovocitos específicos involucrados en la foliculogénesis temprana; niveles de Gfd9, Bmp15 y ZP3 son las reguladas, mientras que los niveles de Oct4 y Nobox fueron arriba regulados [82]. Por lo tanto, un papel potencial ofTBP2 en la regulación del control tran¬scriptional de ovogénesis ratón ha sugerido.

TAF4b, también conocida como proteína de unión caja TATA (TBP) factor de -Associated es otro factor de transcripción expresado preferencialmente en células germinales, pero también se encuentra para estar presente en células de la granulosa. Análisis de TAF4b nulos ovarios ratones hembras mutantes han revelado un papel importante de TAF4b, primero en la foliculogénesis temprana, documentado por un número reducido de folículos primordiales y en crecimiento y la supervivencia celular por comprometida gran¬ulosa [83,84]. Curiosamente, TAF4b ratones hembra nulos han el¬evated niveles de FSH, lo que sugiere que sus folículos en crecimiento son resistentes a la proliferación de las células de la granulosa inducida por FSH [83,84]. Esta deficiencia podría estar asociado con una interrupción de la vía AKT / FOXO también observado en nulos mutante ovarios [85]. En una etapa posterior del desarrollo, ovocito reanudación meiótica se deteriora y existe un bloqueo alrededor de la etapa de dos células de desarrollo temprano del embrión [83].

La expresión de los genes de efectos maternos (es decir, Mater, Zarl, NPM2), esencial para la embriogénesis temprana para proceder adecuadamente también se inicia en la etapa de folículo primario y continúa hasta las etapas antrales [86-88].

1.2. La progresión a lo largo de las etapas preantral y para la etapa antral temprana

El desarrollo folicular largo de las etapas muy tempranas ha sido considerado como independiente de gonadotropina y, esencialmente impulsado por factores secretados localmente. Cuando los folículos alcanzan las etapas preantral, devel¬opment largo de este período y la progresión a la etapa antral temprano todavía dependen principalmente de factores intraováricos; Sin embargo, a diferencia de en las etapas

Growth factors. Kit-ligand

Fig. 2. Representación esquemática de la participación ofPI3K / PTEN y path¬ways TSC / mTOR en la activación del folículo primordial y arresto. La activación de la vía P13K (es decir, por factores de crecimiento o Kit-ligando) conduce a la fosforilación y la activación de AKT, que a su vez fosforilan FOXO3. FOXO3 es un factor de transcripción que induce la expresión de genes detención del ciclo celular. Cuando FOXO3 se fosforila y se transloca desde el núcleo hasta el citoplasma, se convierte en inactivada, por lo tanto permitiendo devel¬opment folículo para el progreso. PTEN es un regulador negativo de la vía P13K. Además 1N, a través de la vía de AKT, TSC, un regulador negativo de mTOR, se convierte en fosforilada y inactivado. Como resultado, vía mTOR se activa conduce a señales que reg¬ulate la traducción de proteínas y el desarrollo del folículo para el progreso.

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anteriores, los folículos expresan receptores de FSH y LH funcionales y son capaces de responder a las gonadotropinas, como se ha demostrado tanto in vivo como in vitro.

Análisis de la expresión génica in vivo en el crecimiento de los oocitos en el ratón ha demostrado que durante la transición de la primordial a la fase folicular secundaria, el perfil de expresión de algunos genes oogénesis no se alteró después de gonadotropina tratamiento. Sin embargo, la diferencia de regula¬tion de la expresión de genes entre las condiciones de gonadotropina inducida y naturales se mostró desde el preantral a la etapa antral [89]. Además, los estudios in vitro han mostrado que los folículos preantrales cultivadas responden a las gonadotropinas [90], y la exposición de los folículos preantrales primeras a la FSH es favorable para la supervivencia del folículo y necesario para la formación antro in vitro que se produzca [91-95].

De hecho, los ratones deficientes en tanto FSH (FSH (3 nocaut) y FSHR (FSHR nocaut) son infértiles debido a un bloqueo en el desarrollo del folículo antes del desarrollo del antro [96,97]. Sin embargo, debido a las funciones específicas de las gonadotropinas en todo el etapa antral, más detalles de la respuesta y la gonadotropina modelos knockout se explicarán en la siguiente fase folicular.

Células de la granulosa dentro de los folículos preantrales proliferan a una velocidad muy alta, dando lugar a un folículo preantral multi-capa, un aumento de tamaño follic¬ular, seguido por la aparición de una cavidad antral (Fig. 1).

Muchos reguladores positivos durante la transición de preantral al desarrollo antral temprana han sido identificados, especialmente aquellos be¬longing a la TGF (3 superfamilia. El GDF9 conocido y factores de ovocitos-secretada BMP15 actúan en sinergia para seguir promoviendo la proliferación celular granu¬losa . BMP15 es conocido por promover muy potentemente mi¬tosis en células de la granulosa indiferenciado de una manera FSH-independiente mientras que al mismo tiempo que está implicado en la granulosa FSH dependiente de cito-diferenciación en etapas posteriores ratones hembra mutante [80]. Bmpi5-null , sin embargo, mostrar el desarrollo normal hasta las etapas antrales han reducido las tasas de ovulación y la fertilización y son subfértiles [81];. En contraste, una mutación natural del gen Bmp15 causa una tasa de ovulación in¬creased en ovejas [98] La diferente naturaleza de estas especies (mono-ovulatoria frente a la poli-ovulatoria) puede ayudar a explicar la observación de diferentes fenotipos [99]. En los seres humanos un heterocigoto heredó la mutación de este gen está relacionada con la insuficiencia ovárica hyper¬gonadotropic y disminución de la proliferación de células de la granulosa [ 100]. Además, otras mutaciones naturales del gen BMP15 han sido identificados y podrían estar asociados con fail¬ure ovárica prematura (FOP). De hecho, una asociación entre estas variantes y una producción de¬creased de la forma de la proteína madura BMP15 ha sugerido, concordantemente con un efecto biológico reducido de la pro¬tein [101]. Sin embargo, otros factores deben tenerse en cuenta, como el origen étnico y / o algunos factores predisponentes, y por lo tanto se necesitan más estudios para aclarar una asociación real con POF y el impacto potencial de tales mutaciones en funcionalidad ovárica [102].

Comparable a la función de BMP15, GDF9 juega un papel crucial como un mitógeno de células de la granulosa potente. GDF9 induce la expresión de FSHR en los folículos preantral cultivadas [103]. La inyección de GDF9-morfolino en oocitos de folículos preantrales cultivadas induce apoptosis y suprimió el crecimiento del folículo preantral. Por lo tanto, GDF9 puede al menos en parte tener un papel en el crecimiento del folículo en la protección de las células de la granulosa de la apoptosis de someterse a través de la activación de la fosfatidilinositol 3- quinasa (PI3K) / Akt [103].

Un papel de los andrógenos en la proliferación de células de la granulosa preantral y la supervivencia se ha indicado [104,105]. De hecho, en el porcino, un inter¬action entre los factores de ovocitos secretada y andrógenos parece existir para promover el crecimiento del folículo [106]. Una más clara participación de andro¬gens en el desarrollo del folículo, a través del receptor de andrógenos (AR), será con mayor detalle en la revisión de la siguiente etapa de desarrollo del folículo.

Activinas y inhibinas, dos proteínas estrechamente relacionadas con roles opuestos pertenecen a la TGF (3 superfamilia y también influyen en devel¬opment folículo. Ambos complejos de proteínas constan de dos subunidades que origi¬nate de la misma familia de genes y proteínas relacionadas pero difieren en su composición [107]. Además de un aumento de diame¬ter folicular, y la diferenciación de células de la granulosa, el tono activina disminuye mientras que los aumentos de expresión de inhibina. inhibina-B (a (3B) se expresa predom¬inantly durante las primeras etapas de la foliculogénesis, un período de alta proliferación de células de la granulosa no diferenciadas, sin embargo, después de la selección y la diferenciación del folículo para convertirse en un folículo antral, inhibina-A (una (3A) resulta ser la inhibina más predominante [108109].

Activina-A se ha demostrado que induce la proliferación en el in-vitro cul¬tured células de la granulosa en ratones y ratas [110-112]. Del

mismo modo, los ratones mutantes nulos para la inhibina una subunidad (Inha) muestran una proliferación incontrolada de células de la granulosa y el desarrollo de tumores de ovario, lo que podría ser el resultado de un fuerte incremento en la secreción de proteínas activina en estos ratones [113].

Un papel de AMH como un regulador negativo de la selección del folículo, por re¬ducing capacidad de respuesta a la FSH folículo para pasar a las etapas antrales, se ha sugerido [66114115].

La comunicación entre células de la granulosa y entre las células de la granulosa y el ovocito es crucial en todas las etapas de la foliculogénesis. El papel de las proteínas de unión Gap también conocido como conexinas 43 y 37 (Cx43 y CX37, respectivamente), desempeñan un papel importante en la mainte¬nance de esta comunicación. Cx43 se expresa por las células de la granulosa y la obligación de los cruces brecha formas entre las células de la granulosa [116-118], mientras que CX37, expresado en ovocitos en todas las etapas de desarrollo del folículo, es crucial para una comunicación brecha ocasiones ovocitos de las células de la granulosa. En ratones que carecen de ovarios CX37, un arresto en la foliculogénesis se evidencia en la etapa antral temprano y ovocitos Mei- competencia ótica se ve comprometida [119,120]. Los ratones deficientes en Cx43 mueren poco después del nacimiento [121]. Sin embargo, estudios en los que Cx43 knock¬out ovarios son removidos prenatalmente y cultivadas bajo condi¬tions in vitro o in vivo (bajo la cápsula renal de ratones de tipo salvaje) han demostrado que la falta de Cx43 conduce a una detención del folículo develop¬ment en la etapa primaria [116,122].

Un enfoque utilizando ovarios ratones quiméricos que combina bien CX37 o 43 ovocitos KO con células de la granulosa WT, y viceversa, ha revelado los roles diferenciales importantes para conexinas 37 y 43 en cualquiera de los tipos de células. Los folículos carece de Cx43 sólo en el ovocito, o CX37 sólo en las células de la granulosa, son capaces de crecer normalmente con ovocitos capaces de re¬suming meiosis y ser fertilizado. Sin embargo, la falta de Cx43 en células gran¬ulosa imita la detención temprana en la foliculogénesis observado en los ovarios Cx43 KO, mientras que los oocitos que carecen de la expresión de CX37 tiene una reanudación meiótica deteriorado y no son capaces de ser fertilizado, similar a lo que se observa en CX37 ovarios KO [123,124].

Curiosamente, aunque el fenotipo observado en los ovarios que carecen de CX37 sugiere un papel crítico y única de CX37 en oocitos, un modelo de ratón trans¬genic ha revelado que estos efectos adversos pueden ser re¬stored cuando los ovocitos en crecimiento que carecen de CX37 ectópica expresan Cx43. En este modelo transgénico, la comunicación de las células de la granulosa de los ovocitos, el crecimiento oo¬cyte, y el potencial de los ovocitos para madurar y ser fertilizados fueron re¬stored [125].Antral development — role of gonadotropins

Antral development starts with antrum formation (Fig. 1) and the differentiation of granulosa cells into the cumulus and mural cell compartments, which confers to the oocyte the competence to resume meiosis. However, although the oocyte has become meiotically competent, the acquisition of developmental competence will occur along these later stages (see also Oocyte maturation).

The progression throughout the antral stages and ovulation has been considered to be dependent on pituitary-secreted gonadotropin (FSH and LH) support. FSH is the essential driver of in vivo antral de-velopment. FSH induces luteinizing hormone receptor (Lhcgr) mRNA expression in mural cells, which will be required for follicles to respond to LH, the latter being crucial for triggering the ovulatory process.

Action of both gonadotropins in the ovary is mediated by binding and activation of their receptors (LH receptor, LHR and FSH receptor, FSHR). Knockout mouse models of each of these receptors have shown the relevant role of gonadotropin signaling within the ovary.

In LHR knockout (LuRKO) mice, follicle development does not pro-gress beyond the antral stage; these mice are infertile due to the low estrogen production and anovulation [126]. Moreover, high doses of FSH are not capable of inducing final follicular development and

F. Sanchez, J. Smitz / Biochimica et Biophysica Acta 1822 (2012) 1896-1912 1903

la ovulación cuando LHR no está presente [127]. Por lo tanto, la expresión de LHR es esencial no sólo para la ovulación, sino también para la maduración del folículo antes de la ovulación.

Los ratones deficientes en la FSH (FSH (3 nocauts) son infértiles debido a un bloqueo del desarrollo del folículo antes de la etapa antral. Dentro de estos folículos, las células de la granulosa expreso niveles de tran¬scripts FSH-R aumentó, pero los niveles de aromatasa disminuyó, . sub¬units y la inhibina / activina Por otra parte, no logran expresar niveles normales de receptores de LH [97] FSHR nulos ratones hembras mutantes, en los que se han eliminado todas las formas de la FSHR (también conocido como Forko -. folitropina ratones knockout del receptor ), mostrar un útero atrófica y también son infértiles debido a un bloque en la foliculogénesis antes de la formación antral [96]. En estos mutantes, los folículos más grandes observados tienen no más de cuatro capas de células de la granulosa. Sin embargo, a pesar de una expresión normal de aroma¬tase mRNA y proteína en ratones mutantes FSHR-null, hay una pérdida completa de la producción de estrógenos por el ovario, lo que lleva a alter¬ations metabólicos tales como la obesidad y la anormalidad esquelético (algunos de los cuales puede ser revertida mediante tratamiento con estradiol-17 beta ). Esto puede sugerir que la señalización a través de la FSHR puede estar implicada en la activación de la enzima aromatasa [128].

Si el bloque en el desarrollo del folículo en tanto FSH (FSHR 3 y knockouts es debido a la proliferación de células de la granulosa o alterada debido a la apoptosis in¬creased no se entiende completamente. Aunque la función precisa de la ciclina D2 (un gen sensible a la FSH y que participan en granulosa pro¬liferation celular) en este proceso no ha sido identificado, FSH (3 ratones knockout tienen una modesta disminución en la expresión de la ciclina D2, mientras que esto no se ha demostrado claramente en ratones Forko [96].

Estos estudios son relevantes para la reproducción humana ya que se han encontrado pheno¬types similares a los reportados en ratones en humanos con mutaciones en FSH (FSHR 3 y [129]. Por otra parte, una serie de síntomas men¬opausal en las mujeres, así como características de hipogonadismo hypergonadotropic- que se pueden observar en las mujeres infértiles también se mim¬icked por el fenotipo de los ratones Forko.

Por enfoques in vitro, los estudios han demostrado que en el ab¬sence de FSH folículos cultivados son detenidos en su desarrollo, no son compatibles con la formación de antro y exhibir la apoptosis, todos los cuales se pueden prevenir mediante la suplementación de FSH [91,92]. A pesar de esto, la investigación llevada a cabo por nuestro grupo ha demostrado que una vez establecida la forma¬tion antro, el desarrollo del folículo preovulatorio a la etapa de bajo disminución de las concentraciones de FSH inducir una mejor células del cumulus differentia¬tion [130131]. En consecuencia, los bajos niveles de FSH aplicados en el cultivo de folículos después de la formación del antro parecen promover el desarrollo de fol¬licles primates y de los ovocitos alcanzar diámetros mayores [95]. Por el contrario, expo¬sure a suprafisiológicamente altos niveles de FSH durante las etapas antrales o durante todo el desarrollo de preantral a las etapas antrales in vitro de ovocitos per¬turbs de control de la diferenciación de células de la granulosa, así como la función de células del cumulus, en cultivos de ratón y el folículo primate [95130 ]. Por lo tanto, al¬though gonadotropinas son esenciales durante las etapas antrales in vitro, una puesta a punto dosis es fundamental para lograr un desarrollo adecuado del antro.

Bajo la influencia de las gonadotropinas, los folículos sintetizan hormonas esteroides, tales como andrógenos y estrógenos, que contribuyen a fol¬licular desarrollo, mediante la inducción de la proliferación de células de la granulosa y dif¬ferentiation a través del receptor de andrógenos (AR) y receptor de estrógeno (ER), respectivamente [109132133 ]. A través de la bien conocida de células dos, modelo de dos gonadotropina, células de la teca producen andrógenos bajo influ¬ence de estímulos de LH, mientras que las células de la granulosa producen andrógenos estrógenos utilizando como sustrato, bajo la influencia de FSH [108134].

Los andrógenos, se ha demostrado que participar en pro¬liferation células de la granulosa y la supervivencia a través del receptor de andrógenos (AR). Ratones hembra-AR deficientes son subfértiles, y muestran un número reducido de fol¬licles antrales y ovocitos ovularon, y una alta tasa de células de la granulosa apopto¬sis; eventualmente desarrollan insuficiencia ovárica prematura [135,136]. La mayor parte de las características observadas en estos ratones Ar-nulos parecen ser el resultado de una falta de expresión AR más específicamente en las células gran¬ulosa, como se ha demostrado por un modelo en el que knockouts específicas para la AR en las células de la granulosa o ya sea ovocitos eran hecho. Por lo tanto, granulosa AR específica de la célula parece ser esencial para desarrollo del folículo mentand supervivencia [137].

El estradiol es el estrógeno predominante en términos de activ¬ity estrogénica. De hecho, una de las principales funciones de las células de la granulosa preovulatorio es la síntesis de estradiol. En el interior del folículo, el estradiol se produce a través de la enzima aromatasa, y mejora la respuesta de las células de la granulosa a las gonadotropinas [138].

Modelos knockout para el dos receptores de estrógeno diferentes, ERA y ER ^ tienen ventaja a la elucidación del papel de los estrógenos en el desarrollo follic¬ular. Ratones knockout para la era, también conocidos como los ratones ERKO, se han incrementado los niveles de estradiol y LH, mientras que los niveles de FSH son normales. Los ovarios de ratones ERKO muestran una detención en la etapa antral temprano y son infértiles [139140]; esto demuestra el papel esencial de estradiol en inducida por gonadotropina diferenciación folículo. Por el contrario, en ER ^ nocaut (BERCO) folículos ratones desarrollar las etapas an¬tral y estos ratones son fértiles, pero no tienen una respuesta disminuida a los estímulos ovu¬latory hCG [140-142].

Otro enfoque implicó la alteración dirigida del gen Cyp19 (aromatasa) en ratones (ArKO), que causa una deficiencia en la síntesis de estra¬diol. Estos ratones tienen niveles elevados de gonado¬tropins circulantes y la testosterona y son infértiles. En la edad adulta, los ovarios de ratones hembra ArKO pueden contener grandes folículos antrales, pero después de una foliculogénesis año es severamente afectada y folículos secundarios hay lon¬ger encontrado [143,144], lo que sugiere un papel importante de estradiol en el desarrollo folicular. Por otra parte, el fenotipo ArKO parece re¬sult no sólo de la falta de estrógenos, sino también de los altos niveles de gonadotropinas circulantes, principalmente LH [145].

Los miembros de la del factor de crecimiento de insulina (IGF), la familia (es decir, IGF1, IGF2) también cooperan con gonadotropinas para determinar la selección del folículo y la progresión a través de las etapas más antrales. En roedores, IGF1 y IGF2 son las formas predominantes en las células de la granulosa y la teca, respec¬tively, donde cooperar con FSH y LH acción en cada tipo de células [146]. Por otra parte, en los ratones deficientes en IGF1, el desarrollo del folículo no progresa más allá del pequeño escenario antro. En estos ratones se reduce la expresión de FSHr, y la disminución de la síntesis de estradiol y la proliferación de células de la granulosa reducida [147,148].

Además de los IGF, el desarrollo folicular en todas las etapas antrales depende claramente de muchos otros factores intraováricos. Similar a anteriores etapas, activinas y inhibinas producidos por las células de la granulosa desempeñan papeles paracrinos esenciales mediante la regulación de la syn¬thesis andrógenos inducida por LH-producida por células de la teca [149-151], y por lo tanto, garantizar el suministro estradiol. En ratones que carecen de ACVR2B (la activina tipo IIB-re¬ceptor), la progresión más allá de las primeras etapas antrales falla [152]. El sistema de activina-inhibina no sólo regulan prolifer¬ation células de la granulosa, sino también la diferenciación de células de la granulosa y la maduración de ovocitos, estando el último acelerado por la acción activina A [153-155].

Secretada-ovocitos GDF9 y BMP15 también juegan un papel crítico en las etapas an¬tral. GDF9 y BMP15 regulan la función de células del cumulus (más explicación de¬tailed se da en la siguiente sección). Como se evidencia en la rata y humano, estos factores de ovocitos solo, o en combinación, atenúan ef¬fects de FSH y estimulan la proliferación de células de la granulosa y la diferenciación. GDF9 suprime la secreción de estradiol estimulada por FSH por la represión de la actividad aro¬matase y también suprime la formación de los receptores de LH inducida por FSH en células del cumulus diferenciados. BMP15 se cree que reduce la apoptosis de células del cumulus y para suprimir la expresión del receptor de FSH [79156157]. Tanto BMP15 y GDF9, junto con BMP6, se ha demostrado que in¬hibit la producción de progesterona inducida por FSH, que puede ser considerada importante para la supervivencia del folículo y la prevención de la luteinización prematura.

En los folículos preovulatorios, un papel crítico de GDF9 y BMP15 en la inducción de cúmulos mucificación / expansión y la regulación de los genes implicados en este proceso ha sido demostrada y será fur¬ther adelante [79158159] explicó.

Otros factores tales como teca derivados de factores de BMP4 y BMP7 son posibles reguladores paracrinos de la función de células de la granulosa. En la rata, estos dos factores atenúan la secreción de progesterona inducida por FSH-mientras que mejoran la secreción de estradiol inducida por FSH [70160].

Transcription

rRNA synthes

isand

storage

1902 F. Sanchez, J Smitz / Biochimica et Biophysica Acta 1822 (2012) 1896-1912

Finalmente, los folículos preovulatorios que contienen oocitos totalmente crecido están dispuestos a someterse a la ovulación, que es inducida por la oleada preovulatoria de las gonadotropinas. La ovulación se caracteriza por la ruptura de la pared del folículo y la liberación del complejo cumulus-ovocito; en este momento el ovocito tiene meiosis reanudado y ha progresado hasta la metafase II de la meiosis (Fig. 1) (maduración de los ovocitos se describe en detalle en las secciones siguientes).

Después de la ovulación, las células de la granulosa y la teca se convierten en células lútea y son responsables de la producción de estradiol y progesterona, este último se expresa predominantemente en el cuerpo lúteo [161].

1. Regulación de la expresión génica y de almacenamiento de mRNA durante la ovogénesisDurante la ovogénesis, ovocitos aumento de tamaño (aproximadamente 20 a 80 horas, en el ratón y el 35 a 120 horas, en humanos) como en volumen (~ 100 veces)

[162,163]. A lo largo de este período, los ovocitos sintetizan y acumulan ARN y proteínas que son vitales para su crecimiento adecuado y mat¬uration, e indispensable para el desarrollo en un embrión viable [164-166].

 Síntesis de las transcripciones es más alta en las primeras fases de devel¬opment, que coincide con la proliferación activa de células foliculares; sin embargo, por el

final del crecimiento (etapas antrales) y en el momento de la maduración oo¬cyte, el silenciamiento de la actividad transcripcional y la degradación de algunos ARNm será los procesos predominantes [167-169] (Fig. 3).

Totalmente crecido y oocitos murinos meiotically competentes han es-calcula participa contener ~ 6 ng de ARN total que es casi ~ 200 veces la cantidad de ARN que se encuentra en una célula somática típica [170,171]. Aproximadamente el 10-15% del total de ARN producido por un ovocito totalmente crecido comprende ARN heterog¬enous, mientras que la mayoría, ~ 65% comprende ARN ribosomal [171].El destino de mRNA de ovocitos depende, en gran parte, de su asociación con diferentes tipos de proteínas que regulan la accesibilidad a initia¬tion factores y ribosomas [166]. Después de la transcripción, poliadenilación ocurre por defecto, es decir, una cola poli-A (> 150 residuos) se añade en el extremo 3 'del ARNm. Después de poliadenilación, la asociación con factores cap¬binding y de iniciación es un paso crucial para determinar el inicio de la activación de la traducción. Posteriormente, una más compleja asociación in¬volving proceso con subunidades ribosomales y la participación de un gran número de factores permitirán que la etapa de traducción dependiente de mRNAs [166172] (Fig. 3).

Activation of transcription by transcription factors and chromatin remodeling

l

Initiation of nucleolar activity bychromatin remodeling/acquisition

of nucleolar proteins

Oocyte growth, and acquisition of meiotic,maturational and developmental competence

mRNA synthesis

and polyadenyl

ationmRNA

deadenylationand

storage

Interaction of proteins associated with 5'and 3'UTR of

polyadenylated RNA, circularization:

Initiation of translation

Stage-specific polyadenylation

Stage-specific, default

deadenylation and degradation of

mRNAs

Stage-specific modification of masking and associated

proteins, and of cap structure, and

recruitment of Poly(A) polymerase

(PAP)

.^3AAAA ■

F. Sanchez, J. Smitz / Biochimica et Biophysica Acta 1822 (2012) 1896-1912 1903

Association of mRNA withY-box RNA-binding

proteins (e.g. MSY1),storage in mRNP particles

-5'UTR Deadenylating\ 3'AAA£ "

^ nuclease '

Masking of mRNA with shorter poly(A) tails/inaccessibility to cap-associated

initiation factors”^5'UTPR Masking 3AAAA

Vfactorsly mRNA

mRNA

Fig. 3. Representación de algunos eventos generales implicados en la regulación de la expresión en el ovocito durante el crecimiento y la maduración. Como se explica en el

texto, el destino de mRNAs puede variar considerablemente. Después de la transcripción, algunos mRNAs se someten traducción inmediatamente después de poliadenilación,

mientras que otros se someten a deadenylation y se almacenan para ser traducido además en etapas específicas

de acuerdo a las necesidades de los ovocitos. La acumulación de transcripciones de ovocitos y proteínas es crucial

para la adquisición de la competencia meiótica de ovocitos y de desarrollo. Reproducido con permiso de Oxford

University Press, desde Eichenlaub-Ritter y Peschke [166].

1904 F. Sanchez, J. Smitz / Biochimica et Biophysica Acta 1822 (2012) 1896-1912

Regulación de la expresión génica en el ovocito no sólo es dependiente de poliadenilación, sino también en la presencia de se¬quences altamente conservadas en el extremo 3 'y 5' regiones no traducidas (UTRs) de ARN que están implicados en procesos tales como la poliadenilación, la iniciación de trans ¬lation, el enmascaramiento de los ARN y la disposición de mRNA a someterse a deadenylation y la degradación [166173]. La regulación de las transcripciones oc¬curs de una manera bien orquestada y etapa específica. Mientras que algunas transcripciones se sintetizan para su uso inmediato, se deadenylated otras transcripciones (por acortamiento de la cola poli-A, que confiere más estabilidad) a ser degradados o almacenada en el ooplasma en partículas ribonucleares (RNPs) para ser utilizado en las etapas posteriores . Transcripciones almacenados en RNPs no se asocian con polirribosomas sino más bien se asocian con factores de enmascaramiento, y por lo tanto no se traducen (Fig. 3).

Regulación activa de transcripciones en el ovocito se produce predominantemente durante la transición de primordial para la etapa primaria folicular [174], donde la mayoría de los genes relacionados con la proliferación celular, el ciclo celular y la transcripción están regulados. Del mismo modo, la transición de la primaria a la fase folicular secundaria se caracteriza por una regulación ascendente activa de muchos genes de ovocitos (es decir, las transcripciones que participan en el ciclo celular, la biosíntesis y el metabolismo macromolecular). Desde la secundaria a la etapa antral, los genes implicados en la transcripción basal de la polimerasa II promotores están regulados hacia abajo, y pueden explicar el silenciamiento transcripcional a gran escala hacia el final del crecimiento de los ovocitos [174]. Una degradación se¬lective de las transcripciones se produce durante la maduración de ovocitos en el ratón [167-169,175] y humanos [176]. En el ratón, una disminución de ~ 30% en el total de ARN se ha descrito que se produzca durante la maduración [175]. How¬ever, aunque ovocitos no sintetizar ARN de novo en esta etapa, las modificaciones post-transcripcional son cruciales en la regulación de la expresión pro¬tein en esta etapa [167,177]. En la siguiente sección (maduración de ovocitos) se da más información sobre las transcripciones cruciales regulados dur¬ing esta etapa.

La regulación génica a nivel post-transcripcional, también es inducida por la interacción de las transcripciones con pequeños RNAs. ARNs pequeños se non¬coding ARN de una longitud corta: 19-31 nucleótidos (nt), cuya función principal es el silenciamiento génico de ARNm diana. Tres clases principales de pequeños RNAs no codificantes se han identificado que desempeñan papeles esenciales en el desarrollo mam¬malian: endógenos-pequeños RNAs de interferencia (siRNAs), micro ARN (miRNAs) y ARNs Piwi-que interactúan (piRNAs) (véase, por re¬view , [178179]).

SiRNAs y miRNAs endógenos son originalmente un largo transcripciones de aproximadamente 200 nt. siRNAs son inicialmente hebra (ds) RNA dobles que se cortan directamente por Dicer, una RNasa citoplasmática III, en una longitud más corta de 19-25 nt. miRNAs se transcriben como a largo primario-miRNAs, que se reconoce por primera vez y escindido por el complejo formado por Drosha, una enzima RNasa III, y la proteína de unión al ARN DGCR8 (síndrome de DiGeorge crítico región del gen 8) en una pre-miRNAs, y más tarde escindido por Dicer en un ~ 22-nt miARN [180,181]. Al contrario de siRNAs y miRNAs, piRNAs no requieren Dicer para su procesamiento; sin embargo, piRNAs biogénesis aún es poco caracteriza [179].

Después de ser procesado por Dicer, ambos miRNAs y siRNAs son incor porado como una sola hebra en el silenciar complejo (RISC), y actuar a través de este complejo para silenciar ARNm diana ARN inducida. El silenciamiento de la expresión génica por siRNAs es inducida por la escisión del ARNm diana. El Argonauta 2 (AGO2) es un componente clave de la siRISC ya que pos¬sesses una actividad endonucleasa y es responsable de la escisión del ARNm diana [178].

De manera diferente a siRNAs, el papel de miRNAs en la represión del ARNm trans-mento se especifica mediante mecanismos alternativos [178]. La traducción se puede suprimir, ya sea en la etapa de iniciación o después de la traducción ha sido ini¬tiated [182]. miRNAs aceleran mRNAdegradation mediante, por ejemplo, trig¬gering desestabilización del ARNm por deadenylation; o secuestran mRNAs y los transportan a un compartimiento de almacenamiento en el que se de¬graded, y finalmente interferir con la expresión de genes [178183].

La regulación de la función de reproducción por miRNAs no ha sido estudiado ex tensively. Recientemente, los estudios in vitro han demostrado que el miR-224 se expresa en las células de la granulosa en diferentes etapas de desarrollo del folículo y sus niveles están regulados por TGF (31 y activina A. In¬terestingly, Smad4 parece ser un objetivo potencial de miR -224, y por la regulación negativa de la expresión de la proteína SMAD4, miR-224 podría estar in¬volved en TGF (31 mediada por la proliferación de células de la granulosa y la función [184].

Con respecto a las ofmiRNAs de expresión en ovocitos, un análisis de patrón de expresión de miRNAs Ofthe sugiere que miRNAs se heredan de la madre el ovocito al cigoto, mientras que la expresión de novo de miRNAs puede producirse más allá de la etapa de 2 células de

desarrollo del embrión. Entre los miRNAs maternas existentes, la familia let-7 se ha demostrado que someterse a una regulación dinámica durante el crecimiento de los ovocitos y más tarde en el desarrollo embrionario temprano (como se muestra por un aumento abundante) [185].

Curiosamente, un papel esencial para siRNA en la maduración de ovocitos se ha implicado a partir de ratones deficientes en cualquiera de Dicer o DGCR8. Pérdida de Dicer en ovocitos mutantes provoca un agotamiento de la mayoría de los miRNAs en el ovocito y más críticamente, miles de ARNm se dysregulated (es decir expres¬sion de dos transcripciones de ovocitos, Mos y H2AX, han demostrado estar sobreexpresado en comparación con el control de los ovocitos ). Por otra parte, los ovocitos mutantes tienen una organización husillo aberrante y segre¬gation cromosómica, dando como resultado la detención meiótica. Por el contrario, cuando DGCR8 está ausente en los ovocitos de ratón, los niveles de mRNA permanecieron inalterados y no hay efecto ad¬verse en la maduración de ovocitos. A partir de estos hallazgos se dedujo que los efectos observados en los ovocitos mutantes Dicer se determinan por la pérdida de siRNAs en lugar de miRNAs, y por lo tanto no están miRNAs re¬quired para la maduración de ovocitos, pero, como se mencionó antes, para los acontecimientos posteriores del desarrollo del embrión [185 -187].

La regulación de miRNAs por gonadotropinas no ha sido totalmente en investigados. Hasta el momento, la expresión de tres miRNAs dentro del ovario de ratón, miR-21, miR-132 y miR-212 se ha encontrado que aumentar en las células de la granulosa mural después del pico de LH [188]. Además, la expresión de miR-143, let-7a y mir-15b durante la foliculogénesis ha sugerido que ser regulada negativamente por FSH [189].

Por lo tanto, la regulación de la expresión génica en el ovocito a lo largo de la ovogénesis en el nivel transcripcional y post-transcripcional es un proceso crucial que está estrechamente controlado de una manera dependiente de la etapa, y en última instancia, este proceso se asegura de que el ovocito se madurar y adquirir competencia completo desarrollo.

La maduración de ovocitos 1.Los ovocitos adquieren gradualmente la maduración dur¬ing

crecimiento nuclear y citoplasmática. Competencia meiótica, que es la capacidad de los ovocitos para reanudar la meiosis y convertirse en nuclearmente madurado, se adquiere durante la foliculogénesis y coincide con la formación de antro, cuando los oocitos han alcanzado aproximadamente 80% de su tamaño final (en ratones [190]; y humano [191 ]). Competencia de desarrollo se relaciona con la madurez citoplasmática de los ovocitos y se refiere a la capacidad del ovocito para ser fer¬tilized y convertirse en un embrión sano capaz de continuar su de¬velopment a plazo y producir un nacimiento vivo. Maduración citoplasmática se adquiere después de que el ovocito se convierte en meiotically competente y in¬volves una acumulación de transcripciones y otros factores descritos en más detalle en las páginas siguientes.

Un claro ejemplo de adquisición de tanto mat-ración nuclear y citoplasmática a tiempo es que a pesar de ovocitos aislados de folículos antrales tempranos son capaces de reanudar la meiosis, no avanzan más allá de la meta¬phase I (MI) fase [192]. Además, si estos mismos pequeños folículos antrales son madurados y fecundados in vitro que son capaces de pasar a la fase MII y fertilizar, sin embargo, diferente a los ovocitos aislados de grandes etapas an¬tral, el desarrollo temprano del embrión se ve comprometida [193194]. Por lo tanto, un ovocito que ha adquirido competencia meiótica no ha adquirido la madurez nec¬essarily citoplasmática.

1.1. La maduración meióticaDesde ovocito competencia meiótica se adquiere en una etapa

anterior, cuando los oocitos son todavía desarrollo incompetente, los ovocitos tienen que se mantenga en la etapa de vesícula germinal hasta que completen su plena maduración.

Dentro del ovocito, niveles elevados de monop¬hosphate cíclico de adenosina (cAMP), producido por la adenilato ciclasa, son cruciales en el mantenimiento de los ovocitos bajo arresto meiótica (en roedores [195]; en los seres humanos [196]) (Fig. 4, panel superior) . En oocitos, la fuente de cAMP se ha sugerido que el producto de la afluencia de cAMP a través de la comunicación brecha de la salida de las células del cumulus para el ovocito [197] y / o la producción de cAMP en¬dogenous dentro del ovocito, inducida por la activación de receptores acoplados a proteínas G-3 y 12 (GPR3,12) [198199].

Recientemente, se ha propuesto que la entrada de monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) a partir de las células del cumulus al ovocito (también a través de la comunicación brecha de la salida), impide la activación de ovocitos cAMP-fosfodiesterasa (PDE3A), la enzima que es responsable de la degradación de cAMP y, al hacerlo, evita resump¬tion meiótica [200] (Fig. 4, panel superior).

Notablemente, los mismos, y a través de la interacción con sus células del cumulus que rodean ovocitos, se han demostrado que contribuyen a su propia detención meiótica. Los ovocitos promueven la expresión de células cúmulo de Npr2 (receptor del péptido natriurético

2). NPR2 es activado por su ligando CNP (péptido natriurético de tipo C) para producir cGMP, que como se mencionó anteriormente se difunde en el ovocito para inhibir la actividad PDE3A [200-202]. Re¬cently, los experimentos in vitro han revelado un papel directo de oocyte- secretada factores, entre los que GDF9, BMP15 y FGF8B han iden¬tified y un papel del estradiol en la regulación de la expresión de NRP2 en células del cumulus [203]. Esto pone de relieve un papel único de estradiol en los folículos preovu¬latory en el control de detención meiótica del ovocito antes de la ovulación.

En conjunto, estos hallazgos contribuyen a la comprensión de los mecanismos implicados en el mantenimiento de la detención meiótica, y pueden ser de particular importancia en el diseño de la maduración in vitro (MIV) técnicas para mejorar la competencia de desarrollo.

La maduración de ovocitos meiótica implica una cascada de procesos que se inicia con el pico de LH preovulatorio, conduciendo a la progresión del ovocito (por ese tiempo suspendido en la profase I de la primera di¬vision meiótica) a la etapa de metafase II y terminando con la extrusión del primer cuerpo polar.

Después de la oleada de LH, un evento que es esencial para el ovocito para reanudar la meiosis es el mucificación / expansión de células del cumulus, que es causada por la producción de ácido hialurónico producido por las células del cumulus en respuesta a las gonadotropinas. La expansión del cumulus depende de la estimulación del factor de crecimiento epidérmico inducida por LH (EGF) -al igual que los péptidos, a través de la activación de la proteína quinasa A (PKA) y en respuesta a altos niveles de AMPc producidos por las capas externas de la com¬ células de la granulosa partamento. Bajo estos estímulos, los niveles de transcripciones que participan en mucificación / expansión tales como HAS2, la PTX3 y Tnfaip6 [204-207] se incrementan en células del cumulus (Fig. 4, panel inferior).

La inducción de esta respuesta por factores similares a EGF está mediada por la ac-tivación de la / 2 vía ERK1, que a su vez estimula la produc¬tion de la prostaglandina E2 (PGE2) a través de la inducción de mRNA tanto Ptgs2 y expresión de la proteína. PGE2 se ha demostrado que induce, además, la producción de células de la granulosa de los factores similares a EGF, que mejora la señal de LH [208]. Como se representa en la Fig. 4 (panel inferior), ambos tipos de células de la granulosa (células murales y cúmulos) responden y contribuyen a EGFR señalización mediada, aunque la expansión (y la expresión de genes relacionados con la expansión del cumulus-) es una respuesta única de células del cúmulo.

Por otra parte, la expansión del cumulus también es inducida por factores cumulus¬expansion permitiendo (CEEFs) producidos por el ovocito [158,209]. La regulación de ovocitos de expansión del cumulus se discutirá con más detalle en la siguiente sección (interacción de ovocitos cumulus) (Fig. 4).

Dentro del ovocito, la LH estimula la reanudación meiótica se inicia por una drástica caída en los niveles de cAMP. Después de señalización LH-desencadenado, PDE3A en los ovocitos se activa [210] y degrada cAMP. Alternativamente, una difusión limitada de cGMP y / o cAMP de las células del cumulus al ovocito también parece contribuir a la reanudación meiótica. Esto es apoyado por el hecho de que después de gatillo LH, los niveles de mRNA Nppc (que codifica CNP) disminución, dando lugar a una producción limitada y la difusión de cGMP en el ovocito, que permite PDE3 para degradar activamente cAMP [211]. Por otra parte, el cierre de las uniones gap también puede contribuir a este proceso, como resultado de la activación de la vía de señalización de ERK / MAPK inducida después de la activación de EGFR [212213] (Fig. 4, panel inferior).

1.1.1. Reglamento de las transcripciones de ovocitos requerido para la maduración meiótica

Los ovocitos participan activamente en el proceso de maduración meiótica, asegurando así su progresión a la etapa madura. Como se mencionó anteriormente, una degradación masiva predominante de las transcripciones de los ovocitos se produce durante la maduración; Sin embargo, este evento parece ser un pro¬cess selectivo [169]. Evidentemente, las transcripciones y / o proteínas asociados con el ovocito detención meiótica en la etapa (GV) de vesícula germinal son degradados o los niveles de expresión han disminuido drásticamente. Por ejemplo, la traducción de CDH1 - un co-activador del complejo / cyclosome anafase de la promoción (APC / C) que reprime los niveles de ciclina B1 a través de ubiquinylation mantener detención meiótica - se reduce en un 70% [214,215].

Por otra parte, las transcripciones que participan en vías de señalización es¬sential para la regulación de la meiosis de los ovocitos y el mantenimiento de la detención meiótica en MII, tales como ERK / MAPK y P13 / AKT se retienen [169216]. Aunque se han mostrado algunas transcripciones de efecto materno para someterse a la degradación durante esta transición, algunas otras transcripciones parecen ser estables.

La degradación o el mantenimiento de algunas transcripciones aberrante durante la maduración de ovocitos y / o fertilización pueden ser perjudiciales para la calidad de los ovocitos y pueden comprometer la competencia de desarrollo [217].

Aunque la mayoría de las transcripciones dentro del ovocito se degradan durante la maduración, muchas otras transcripciones someten poliadenilación y as¬sociate con los polisomas a someterse a la traducción [177,215]. A través de perfiles de todo el genoma de los ARNm maternas, un estudio reciente ha re¬vealed diferentes patrones de transcripciones de ovocitos en asociación con los polisomas, lo que indica la regulación de traducción activo durante mat¬uration. Por este enfoque, se ha demostrado que aproximadamente 7.600 transcripciones para ser traducido activamente durante la maduración de ovocitos, mientras que la traducción de muchos otros es reprimida [215].

Curiosamente, parece que hay dos mecanismos diferentes de represión trans-relacional durante la maduración de ovocitos: transcripción de degradación, como se ha demostrado previamente [169216]; y el otro parecen estar indepen¬dent de degradación. En este último caso, la traducción parece ser reprimidos por la translocación de los transcritos que permanecen tan estable, desde el poly¬some a la fracción subpolysome / RNP [215].

Entre las transcripciones sometidos traducción activa durante la transición GV-M11, bien establecidos los reguladores del ciclo celular (CCNB1 y Mos) han sido identificados, así como componentes de la anafase de la promoción de complejos y los componentes del puesto de control conjunto del husillo (Mad2, BUB1B, y Sogl2). Esta clase también incluye un conjunto de transcripciones que codifican reguladores transcripcionales y remodeladores de la cromatina [215].

CPEB y DAZL se han identificado recientemente como dos moduladores cruciales de traducción durante la maduración de ovocitos. CPEB promueve la traducción Dazl mRNA durante la transición a la etapa de MI; DAZL pro¬tein induce posteriormente la traducción de su propio ARNm, esta¬blishing de ese modo un bucle regulador positivo. Aunque un papel de DAZL como un regulador de traslación durante la maduración de ovocitos se ha propuesto anteriormente [218,219], Chen et al. [215] han demostrado recientemente un papel claro y crucial de DAZL durante esta última etapa. Los oocitos en el que DAZL se ha reducido regulado por la inyección de oligonucleótidos de morfolino antisentido específicos (MOS) han demostrado que se retrase su re¬sumption meiótica y los pocos ovocitos que extruyen un cuerpo polar tenido un husillo en su mayoría defectuoso [215]. Por otra parte, DAZL se ha demostrado que regulan la traducción de las transcripciones necesarias para el ensamblaje del huso y la transición M1-M11 (es decir Tex19.1, TPX2 y Dazl sí mismo).

4.2. La maduración citoplasmáticaMuchos aspectos diferentes determinan la maduración de ovocitos

citoplásmica. Síntesis y acumulación / almacenamiento de transcritos durante el crecimiento de los ovocitos y el silenciamiento transcripcional a gran escala al final del ovocito

1906 F. Sanchez, J. Smitz / Biochimica et Biophysica Acta 1822 (2012) 1896-1912

Fig. 4. Representación esquemática ofLH inducida por la maduración de ovocitos. El panel superior (por encima de las líneas) muestra el mantenimiento de la detención meiótica del ovocito antes de la LHsurge. Los ovocitos se mantienen en arrestdue meiótica a los altos niveles intracelulares de cAMP. Interacción de los CNP producida por las células murales y su receptor NPR2, expresada en células del cumulus (y hasta reguladas por OSF y E2) induce la conversión de GTP en GMPc, que se transfiere a continuación, en los ovocitos a través de uniones comunicantes. cGMP previene la activación PDE3 dentro del ovocito y cAMP se mantiene entonces en niveles altos. Después de la LH-aumento (por debajo de las líneas), la vía de señalización de PKA es activada e induce la producción de los factores similares a EGF (es decir, AREG / EREG). Factores similares a EGF, a su vez, activan una cascada de eventos mediados por el EGFR (tanto en células murales y cúmulos). Como resultado, ERK1 / 2 inducirá otros eventos principales: 1) la sobre regulación de las transcripciones responsables de la expansión del cumulus HAS2, Tnfaip, PTX3 y Ptgs2 (que también están regulados positivamente por los CEEFs derivados del ovocito); 2) producción ofPTGS2, que mejoran la respuesta a la LH estímulos a través de la producción ofPGE2 y por inducir la producción de más factores similares a EGF y activación de la cascada subsiguiente; y, 3) el cierre de las gapjunctions, lo que evita la transferencia de cGMP en el ovocito. Al mismo tiempo, los niveles de CNP y NPR2 disminuyen y también contribuyen a la baja producción de cGMP. Dentro del ovocito, algunas transcripciones cruciales para la transición de la GV a la etapa MII se traducen activamente.

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crecimiento son esenciales para apoyar primeras etapas de desarrollo del embrión (tal como fue revisado en la sección anterior). En efecto, una contribución de las células granu¬losa en ovocitos silenciamiento transcripcional global en ovocitos de ratón pre-ovulatorios, y por lo tanto en la adquisición de la maduración de ovocitos citoplásmica, se ha sugerido [220].

Silenciamiento transcripcional global en el ovocito se asocia con - aunque no depende de - otro evento clave que también determina la competencia de desarrollo de los ovocitos, la condensación de la cromatina en la configuración nucléolo rodeado [221]. Mattson y Albertini [222] inicialmente demostraron que el tiempo de la formación de antro en co¬incides ratón con la aparición de dos configu¬rations cromatina ovocito diferentes, la configuración 'nucleolo rodeado' (SN), en los que un anillo de cromatina puede ser distinguido alrededor del nucleolo, y el "nucleolo rodeado no '(NSN), en el que la cromatina se dispersa en todo el nucleolo. Mientras ovocitos NSN son transcripcionalmente ac¬tive y tienen una competencia pobre desarrollo, debido a un bloqueo en la etapa de dos células, los ovocitos en la configuración SN son transcripcionalmente in¬active y tener una mejor competencia de desarrollo [223-225].

Además, un análisis de microarrays ha revelado que vitro en-ma¬tured ovocitos MII derivados de cualquiera de los ovocitos en la SN o etapa NSN mostraron diferentes patrones de expresión génica. OCT4 (o POU5F1), ha demostrado tener un papel importante como un regulador clave potente de eventos mo¬lecular que rigen el establecimiento de compe¬tence desarrollo de los ovocitos de ratón [226]. Niveles de transcripción de el regulador transcripcional de Stella, una transcripción regulada por ovocito OCT4, con un papel esencial durante el desarrollo embrionario temprano, se han encontrado Oct4 y para ser downregulated, y sus proteínas se ha demostrado que estar ausente en antral y MII ovocitos con una configuración de NSN.

Hay evidencia creciente que sugiere que los factores presentes en oo¬cytes en la etapa SN, pero ausente en la configuración NSN determinar la competencia oo¬cyte, según lo informado por Zuccotti et al. [226]. Sus resultados también han sido apoyados por los resultados de los experimentos de micromanipulación de la vesícula germinal de ovocitos completamente crecidos (SN y NSN), que indican fuertemente que los factores (s) presentes en el citoplasma de los ovocitos MII SN (después de que ocurra GVBD), determinar la competencia de desarrollo y no están presentes en ovocitos con la configuración NSN [227].

DAZL es otra proteína crucial no sólo es esencial para mat¬uration meiótica sino también necesario para la adquisición de la competencia en el desarrollo de los ovocitos. Down-regulación de DAZL en ovocitos GV no sólo no comprometer la progresión de la meiosis, sino también la fertilización. Por otra parte, la baja regulación de DAZL derivados de la madre en los primeros cigotos provoca un bloqueo en la etapa de dos células. Por lo tanto, un papel importante de DAZL como un regulador de la traducción en el desarrollo temprano del embrión y como deter¬minant de competencia de desarrollo también se ha propuesto [215].

Interacción celular 1. ovocitos-cumulusEn los últimos años, se han logrado avances notables en el estudio

de la interacción de las células de la granulosa de ovocitos y de la regulación de los ovocitos de la función celular de la granulosa [228-233].

En concierto con los correctos patrones de expresión génica en el ovocito, la interacción ovocitos de las células de la granulosa mediada por cualquiera de sig¬nals paracrinos y / o por falta de comunicación de la unión de las primeras etapas de de¬velopment determina la tasa de crecimiento del folículo y la diferenciación. Por otra parte, después de la diferenciación, la interacción célula-ovocito cumulus es esencial promover nuclear de ovocitos y la maduración citoplasmática, que determinan la capacidad del ovocito para apoyar el desarrollo embrionario temprano [192220234].

La interacción de células de la granulosa de ovocitos y el control de los ovocitos de la función de las células de la granulosa son esenciales antes y después del pico de LH. De hecho, en fol¬licles antrales, los ovocitos GV completamente crecidos han demostrado ser los reguladores más potentes de la función de las células cumulus [235]. Antes de que el pico de LH, los ovocitos no sólo influyen en la proliferación de células de la granulosa [233236] y differ¬entiation [231,232], pero muy importante, ovocitos regulan la actividad metabólica de las células del cúmulo dentro del COC (la captación de aminoácidos, la glucólisis y la biosíntesis de colesterol) [229237238] . Después del pico de LH, los ovocitos regulan la expresión de genes de cúmulo responsables del proceso mucificación / expansión.

En general, el conocimiento de control de los ovocitos de la situación de cumulus DIF-dife- y la función se ha logrado por ovocito co-cultivo ex-perimentos, generación de ratones knockout, y por técnicas de biología molecular, incluyendo análisis de cuantificación de los ARNm y ARN, para regu¬lation ejemplo a través de la interferencia de ARN.

1.1. Interacción Cumulus-ovocito antes de que el pico de LH1.1.1. La regulación de la diferenciación de células del cumulus

En el momento de la formación de antro, células de la granulosa se diferencian en dos compartimentos: las células de la granulosa cumulus permanecen cerca de la oo¬cyte, mientras que las células de la granulosa murales permanecen en la parte externa del folículo. Estudios in vitro han proporcionado evidencias de que dentro de las células del folículo, murales y granulosa cúmulos están regulados de manera diferente por el op¬posing intrafolicular efectos de gonadotropinas (FSH) y ovocitos, re¬spectively, que determinan su fenotipo y funcionalidad [231,232].

Los ovocitos promueven la expresión de células del cumulus transcripciones mientras que suprimen transcripciones celulares murales [79231232239]. Cuando ovocitos GV completamente crecidos se eliminan microquirúrgicamente de los complejos cumulus-ovocito (un procedimiento conocido como oocytectomy - oox), células del cúmulo tienden a dedifferentiate, como lo demuestra la baja regulación de la expresión de marcadores de células del cumulus (es decir Amh, Slc38a1) [ 232 239] y, bajo esta condición, la FSH es capaz de inducir transcripciones murales (es decir LHCGR, CYP11A1) en estas células. Ovocitos co-cultivo con células del cumulus oox re¬verts este efecto.

Como se mencionó anteriormente, los altos niveles de FSH durante folículo plomo cultura a una expresión alterada de las transcripciones de cúmulo, como lo demuestran los niveles disminuidos ofAmh y altos niveles de LHCGR funcional [130] .Este phe¬notype atípica causada por altas dosis de FSH durante el cultivo aparentemente También se refleja en los ovocitos, que bajo estas condiciones expreso aumentaron significativamente los niveles de Gdf9 y Bmp15 mRNA en comparación con los ovocitos cul¬tured bajo dosis más bajas de FSH [130]. Teniendo en cuenta la regulación de LHCGR y Amh por transcripciones de ovocitos, se cree que el aumento de los niveles de Gdf9 y Bmp15 ARNm para reflejar una respuesta ovocito para compensar ef¬fects que se producen en las células del cúmulo.

Los ovocitos tienen el potencial de inducir la expresión de las transcripciones de células cumulus en las células murales, incluso en la presencia de FSH. Esto claramente dem-uestra que dentro del folículo, características de células cumulus están influenciados principalmente por su estrecha asociación con el ovocito, que potent¬ly puede amortiguar los efectos continuos de FSH con el fin de mantener las células del cumulus diferenciadas [232240]. Curiosamente, una fuerte evidencia sugiere que estas acciones están mediadas a través de la activación de Smad2 / 3, identificando así GDF9, que actúa a través de esta vía, como uno de los candidatos ideales entre los factores de ovocitos-secretada que ejercen tales ef¬fects [232233].

1.1.2. Cooperatividad metabólicoSeñales paracrinas mediadas por factores de ovocitos secretadas

son probablemente uno de los mecanismos más esenciales, pero no exclusivas, que median las interacciones cu-Mulus ovocito. Gap cruces son altamente especializados conexiones inter¬cellular que facilitan la comunicación entre el ovocito y sus células del cumulus que rodean. En particular, dado que los oocitos y células cu¬mulus están separados físicamente por la zona pelúcida, la comunicación de la unión GAP puede ocurrir gracias a las proyecciones especializados trans¬zonal citoplasmáticas (TZP) desarrollados por las células del cumulus. Estas proyecciones son capaces de penetrar a través de la zona pelúcida de llegar a la membrana del ovocito y permitir la formación de uniones gap [241].

Gap cruces juegan un papel crucial en la communica¬tion bidireccional entre ovocitos y células del cumulus, permitiendo el paso de mol¬ecules de diferentes tipos (es decir, aminoácidos y metabolitos tales como piruvato) del cumulus para el ovocito [228]. De hecho la expresión de las proteínas de unión brecha Cx43 y CX37 en las células de la granulosa y de los ovocitos, respectivamente, se ha demostrado que es de vital importancia en guarantee¬ing ovocitos y el folículo desarrollo [123,124].

1910 F. Sánchez, J. Smitz / Biochimica et Biophysica Acta 1822 (2012) 1896-1912

En los últimos años, los ovocitos y células del cumulus se han demostrado para cooperar en más de un proceso metabólico. Por ejemplo, los ovocitos, por sí mismos, no son capaces de metabolizar la glucosa [242], mientras que las células del cúmulo de manera muy eficiente de hacerlo, como lo demuestra la medición de la actividad glucolítica de AOC cultivadas en comparación con los ovocitos denudados [229,230]. Desde ovocitos exigen que los productos obtenidos a partir de pro¬cesses metabólicos como una fuente de energía para apoyar su crecimiento y maduración, se requieren células cu¬mulus para metabolizar la glucosa para ovocitos [242243].

Regulación de la actividad glucolítica de células del cumulus por los oocitos se ha evidenciado mediante el análisis de transcripciones en las células del cumulus que participan en este proceso. Sugiura et al. [229] demostraron que las transcripciones que codifican para enzimas glucolíticas involucrados en me¬tabolism glucosa como Enol, PKM2, LDH1 y PFKP se redujeron regulado en células del cumulus oox cultivadas en comparación con los controles AOC intactas, y esto fue acompañado de una reducción de la actividad glicolítica mea¬sured en estas células. Sin embargo, el co-cultivo de células del cumulus oox con ovocitos resultó en la recuperación a los niveles de transcripción normales y la actividad glucolítica nor¬mal [229].

Un estudio muy interesante ha apuntado hacia un papel directo de factores secretados oocyte- en la regulación de las transcripciones glucolíticas y la glucólisis en células del cumulus. Células de cúmulo de Bmp15 - / - o doble mutante (DM) Bmp15 - / - ratones gdf9 +/- eran defectuosos en la promoción de la expresión de las transcripciones que participan en la glucólisis en células del cumulus y también se defec¬tive en el metabolismo de la glucosa [230]. Además, en particular, sólo el efecto com¬bined de BMP15 y factor de crecimiento de fibroblastos 8 (FGF8B) administrada exógenamente a las células del cumulus oox cultivadas era capaz de restaurar la expresión normal de enzimas glucolíticas y restaurar la actividad glyco¬lytic [230].

A la cooperación metabólica similar parece existir entre ovocitos y células del cumulus con respecto a la biosíntesis de colesterol. Ovocitos y embriones de ratón parecen requerir el colesterol para apoyar el desarrollo pre¬implantation [244,245]. Los ovocitos no son capaces de sintetizar el colesterol desde las enzimas requeridas para este proceso (tales como MVK, PMVK, FDPS, SQLE, CYP51, Sc4mol y EBP) están apenas detectado o ausente en los ovocitos, mientras que las células del cumulus activamente y altamente expresan estas en¬zymes [238]. Como se muestra por la cultura de los AOC intactas y desprovistas de ovocitos, la capacidad de los ovocitos para convertir de etilo para el colesterol ha demostrado ser muy pobre, que apoya la idea de que las células del cumulus proporcionan los ovocitos con los productos de esta vía [238].

La participación de GDF9 y BMP15 como factores que median estas acciones se ha evidenciado por un enfoque similar a la men¬tioned antes. Células del cúmulo mutantes derivados de Bmp15 - / - o DM Bmp15 - / - ratones GDF9 +/- no fueron capaces de producir de¬novo colesterol a tasas similares a las células de control de tipo salvaje (WT) de cúmulo, mientras que en las células del cúmulo oox esta deficiencia fue aún mayor en comparación con WT AOC. Del mismo modo, co-cultivo de oox con ovocitos denudados totalmente crecido restauró las tarifas normales de la biosíntesis de esteroles [238].

Un tercer ejemplo muy conocido está relacionada con la absorción de ácidos amino. Los ovocitos, en comparación con células del cumulus, parecen tener una pobre capacidad de absorción de aminoácidos. Un claro ejemplo es la baja cantidad de radio¬labeled L-alanina presente en ovocitos denudados después del cultivo cuando com¬pared a las cantidades muy altas se encuentran en los AOC [237,246]. L-alanina ha demostrado ser un sustrato preferentemente transportado por el SLC38A1 transportador de aminoácidos (familia portador de soluto 38, miembro 3). Transcripciones Slc38a1 no se expresan en oocitos aunque Slc38a1 es altamente expresado en células del cumulus [237]. La participación de los ovocitos en la captación de aminoácidos de células del cumulus se ha dilucidado por cultur¬ing células del cumulus oox, mostrando que, en ausencia de los ovocitos no sólo una incorporación reducida drásticamente de L-alanina se observa, sino también una importante reducción de los niveles de transcripción Slc38a1 en células del cumulus. Co-cultivo con ovocitos totalmente crecido puede restaurar los niveles normales tran¬script en células del cumulus y, al mismo tiempo, la incorporación de L-alanina [237]. Una vez más, esto demuestra que los ovocitos regulan una actividad metabólica diferente en las células del cúmulo.

En general, estos estudios han demostrado la cooperación be¬tween ovocitos y sus células del cumulus que rodean, e indican que la actividad metabólica de las células del cumulus se controla por el ovocito. Los productos del metabolismo celular cumulus son los más probable trans¬ferred a los ovocitos a través de uniones gap y se compensar la incapacidad metabólica de los ovocitos.

En gran medida, estos procesos parecen estar mediada por oocyte- factores secretados que implican la GDF9, BMP15 y las vías de señalización FGF8. Si estos factores son los únicos reguladores de estos pro¬cesses, y si otros procesos dependen de la cooperación de los ovocitos y células del cumulus antes del pico de LH, requiere mayor

investigación.1.1. Interacción Cumulus-ovocito después del pico de LH 5.2.1.

Expansión CumulusComo revisado en la sección anterior, una respuesta evidente a la

oleada de LH es la expansión células del cúmulo, que es crucial para la ovulación.

Los ovocitos participa en la expansión del cumulus como lo ilustra el ob-servación que oox células del cúmulo no expandirse en respuesta a la FSH, mientras que co-cultivo con ovocitos completamente crecidos restaura la capacidad de estas células para someterse a la expansión [234]. A través de la secreción de expansión cumu¬lus permitiendo factores (CEEFs), los ovocitos promueven la expresión de las transcripciones de células del cumulus, como HAS2, Ptgs2, PTX3 y Tnfaip6, que son responsables de la expansión del cumulus [79158231247].

De manera similar, la implicación de factores de ovocitos (tales como GDF9, TGF (31, BMP15 y activina A) en la expansión del cumulus se ha establecido a través de la adición exógena de estos pro¬teins recombinantes en cultivo. La inducción de la expansión de células del cumulus y oox , fur¬thermore, la promoción de la expresión de HAS2, Tnfaip6, Ptgs2, y PTX3 en células del cumulus oox y / o células de la granulosa aisladas en cultivo ha demostrado ser reproducida por la adición de estos fac¬tors ovocitos, lo que sugiere que son componentes potenciales de los CEEFs [79.158.159.209.248].

Estas y otras observaciones proporcionan pruebas claras de que GDF9 y BMP15 son elementos importantes de las CEEFs. Por un ap-abordaje interferencia de ARN, la generación de gdf9 ovocitos desmontables se ha demostrado que comprometer expansión de células del cumulus que rodean [249], mientras que este no es el caso en los ovocitos desmontables BMP15. Sin embargo, los estudios en Bmp15 - / - o en doble mutante (Bmp15 - / - Gdf9 +/-) ratones knockout han demostrado que las células del cumulus de estos ratones mutantes fracasan para expandir [250]. Por otra parte, los ovocitos de estos ratones no son capaces de restaurar la capacidad del cumulus para expandirse en oox tipo salvaje (WT) células del cumulus, y células del cumulus mutantes fracasan para expandir incluso en presencia de ovocitos WT [250]. Estos estudios ponen de relieve la importancia tanto GDF9 y BMP15 en la inducción de la expansión del cumulus y sugieren que su presencia antes del pico de LH podría ser crucial para la correcta diferenciación celular cu¬mulus, y conferir a las células del cúmulo del capac¬ity para apoyar la expansión . Además, BMP15 recombinante se ha demostrado que induce la expresión de los péptidos similares a EGF, epirregulina, anfirregulina y betacelulina, que apunta hacia un papel más importante de BMP15 después de la inducción de la ovulación por LH [159].

Después GDF9 y BMP15 interactúan con sus respectivos receptores ALK5 y ALK6, que actúan a través de moléculas de señalización aguas abajo llamados moléculas receptoras reguladas 'SMADs. Señales GDF9 través SMAD2 / 3, mientras que BMP15 activa Smad1 / 5/8 [233251252]. El uso de un bloqueador de la fosforilación SMAD2 (SB-431542) se ha demostrado para neutralizar tanto GDF9 y ovocito inducción de expan¬sion en células del cumulus oox [209]. Por otra parte, Díaz et al. [232] han demostrado que la expresión de ovocitos PTX3 inducida en células del cumulus requiere la activación de ambos SMAD2 y SMAD3, mientras que expres¬sion de Ptgs2 y HAS2 transcripciones solamente depende de la activación de Smad2. Por lo tanto, estos estudios indican fuertemente GDF9 como un factor crucial la regulación de la expansión del cumulus. A pesar de esto, GDF9 anticuerpo neutralizante se ha demostrado no ser capaz de contrarrestar oocyte- inducida por la expresión de HAS2 en células del cumulus [158], lo que sugiere que GDF9 no es el único OSF involucrados en este proceso.

2. ConclusionesDescubrimientos fundamentales en aspectos básicos de ovocitos y

bi¬ology folículo han proporcionado información sobre la regulación de las vías moleculares que controlan primeras etapas de ovogénesis, foliculogénesis y mat¬uration ovocito, que se determinan por la activación compleja y la interacción de muchos factores que actúan en una etapa- manera específica. Desde las primeras etapas de ovogénesis en el ovario fetal, factores de crecimiento (es decir, muchos mem¬bers del TGFp superfamilia) y la interacción entre el medio ambiente y el desarrollo somático ovocito unidad de células germinales

y la formación del folículo pri¬mordial. Durante los últimos quince años, muchos estudios han contribuido en señalar la importancia de la interacción entre los ovocitos y sus células del cúmulo sur¬rounding; el ovocito se ha revelado como el orches¬trator en la promoción del desarrollo folicular y en asegurar su propia competencia de desarrollo mediante la regulación de la función de células de la granulosa.

Esta información es de particular interés ya que contribuye a la creación de la base molecular que determina la adquisición de la competencia de los ovocitos; Además, refuerza el nexo que debe existir entre la ciencia básica y la aplicación clínica.

Debido a que la generación in vitro de una gran fuente de óvulos maduros para el tratamiento de las mujeres infértiles con pacientes de

F. Sanchez,}. Smitz / Biochimica et Biophysica Acta 1822 (2012) 1896-1912 1911

reserva o cáncer de ovario reducidos con ovarios criopreservados sigue siendo un reto obvio, más datos sobre la regulación in vitro tienen que ser adquiridos. El achieve¬ment de una visión precisa sobre la regulación de las transcripciones bajo ciertas condiciones in vitro y / o debajo de un estímulo específico podría contribuir tremen¬dously al refinamiento de metodologías de cultivo para el cultivo in vitro de folículos y en las técnicas de maduración in vitro.

En los pacientes con trastornos de la fertilidad como ar¬rest maduración de ovocitos, fallo ovárico prematuro, síndrome de ovario poliquístico, y especialmente aquellas condiciones de infertilidad con etiología desconocida, la identificación y la asociación de alteraciones de los patrones de genes específicos en estos con¬ditions particulares pueden ayudar a iniciar nuevas modalidades de tratamiento. Finalmente, el as¬sessment de ciertos genes y productos génicos puede ser de uso potencial para la generación de fármacos que pueden mejorar su fertilidad.

AgradecimientosLos autores están muy agradecidos con el Profesor Dr. Michel De

Vos, de la Universidad Libre de Bruselas (Bélgica) para la corrección del texto en En¬glish. La investigación realizada en el Laboratorio de Biología folículo fue apoyado por el Fondo de Investigación de Flandes (FWO proyecto KN 1.5.040.09).References