MICOTOSSINE NELLA FILIERA DEL MAIS: MICOTOSSINE NELLA FILIERA DEL MAIS: QUALE RISCHIO PER IL CONSUMATORE ?QUALE RISCHIO PER IL CONSUMATORE ?

Prof. Arnaldo DossenaDipartimento di Chimica Organica e Industriale,

Università degli Studi di Parma

e-mail: arnaldo.dossena@unipr.it

IARC: C.P. Wild, Y.Y. Gong. “Mycotoxins and human disease: a largely ignored global health issue”; Carcinogenesis, 31 (1), 2010, 71 – 82

…”there is no doubt that mycotoxins have adverse effects on human and animal health […]. The wider economic effect of mycotoxin contamination […] should also be considered.”

452

48 38 12 1088 18

19514543

211116 61 121

931

63 39178105

0100200300400500600700800900

1000

path

ogen

ic m

icro

-…

alle

rgen

es

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min

ants

biot

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sch

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feed

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tives

food

addi

tives

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O

heav

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indu

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mic

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myc

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ins

orga

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ptic

aspe

cts

para

sitic

infe

stat

ion

pest

icid

es re

sidue

s

vete

rinar

y res

idue

s

Le micotossine sono metaboliti naturali prodotti da funghi patogeni in grado di

colonizzare le colture cerealicole in condizioni ambientali favorevoli.

La contaminazione può avvenire in campo oppure durante le fasi successive di trasporto,

lavorazione e stoccaggio.

Mentre il fungo può essere considerato

un agente patogeno per la pianta,

l’ingestione della micotossina può indurre

tossicità cronica e acuta sia nell’uomo

che nell’animale.

Principali micotossine nel mais

Aflatossine (Aspergillus flavus, A. parasiticus):

La contaminazione, molto diffusa, avviene prevalentemente durante lo stoccaggio.

Ocratossina A (Aspergillus ochraceus, P. viridicatum):

La contaminazione è prevalente su frumento e orzo.

Tossine prodotte da Fusarium:

Sono le più diffuse nelle colture maidicole italiane, soprattutto la fumonisina.

AFB1

OTA

Epatotossiche

Cancerogeni di classe 1 (IARC)

Nefrotossica

Cancerogena di classe 2B (IARC)

AFB1

AFM1

OTA

OTA

Contaminazione lungo la filiera…

Micotossine prodotte da Fusarium

O

OOHO

OH

O

CH3

O

CH3 R2

R1 OH

NH2

OOHO

OH

O

FB1: R1 = OH, R2 = OHFB2: R1 = OH, R2 = HFB3: R1 = H, R2 = OH

Fumonisine(F. verticillioides, F. proliferatum)

Cancerogeni classe 2B (IARC)

Principali contaminanti dei cereali (frumento, mais, cereali minori)Contaminazione “in campo”

Tricoteceni Zearalenone(F. graminearum, F. culmorum)

O

CH3

OH

OH

O

O

ZON

Immunosoppressivo

Attività estrogenica

O

CH3

OH

OO

CH3

HHOH

OHH

H

H

DON

Micotossine mascherate…

Comportamento apparentemente strano dovuto al ”…breakdown del DON indotto dagli enzimi della pianta.”

Qual‘è il destino della micotossina?

Che tipo di potenziali metaboliti?

Miller et al., Canadian Journal of Plant Pathology 1985, 7, 132-134

“Diminuzione rapida del DON dopo un picco” in frumento infettato naturalmente e artificialmente con F. culmorum.

fase IIglucosilazione

fase IIIcompartimentalizzazione

vacuolo

citosol

glucosiltransferasi

Incorporazione nelle pareti cellulari (biosintesi della lignina)?!

Trasportatori ABC ?!

Fusariumtossine

Possibile meccanismo di biotrasformazione nelle cellule vegetali

Poppenberger et al. J. Biol. Chem. 2003, 278 (48), 47905

Micotossine mascherate…

Non rilevabili con i metodi analitici di routine:

• Difficili da estrarre

• Perdite durante il clean up

• Mancanza di standard analitici Sintesi chimica dei derivati

Analisi LC-MS

Ancora pochi dati di presenza e di tossicità!

OOH

OH

OHO

OH

O

CH3

OH

OO

CH3

HH

OHH

H

H

DON-3-Glu

Frumento (n = 5) e mais (n = 3) naturalmente contaminati: DON-3-Glu 4-12% della conc. di DON

Berthiller et al., J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 3421-3425

Schneweis et al., J. Agric. Food Chem.2002, 50 (6), 1736-1738

ZON-4-Glu presente in 10 su 24 frumenti naturalmente contaminati, in un range 10-20% dello ZON.

O

OHOH

OHO

OH

O

CH3OH

O

O

ZON-4-Glu

Le micotossine, come tutti gli altri xenobiotici, possono essere parzialmente metabolizzati dalle piante.

Uomini e animali, consumando alimenti contaminati, non sono esposti alle sole forme native delle micotossine, ma anche ai loro metaboliti.

Ad oggi poco si sa della tossicità propria di queste forme mascherate e della loro stabilità in condizioni gastro-intestinali.

Campioni di frumento italiano

Sample DON DON-3-Glu Ac-DON ZEN

1 6541 ± 272 2009 ± 203 575 ± 72 112 ± 15

2 694 ± 73 77 ± 19 n.d. n.d.

3 405 ± 6 8 ± 1 n.d. n.d.

4 5149 ± 196 841 ± 3 76 ± 5 n.d.

Time4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00

%

75

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00

%

14

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00

%

69

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00

%

30

septDON101_trico2 5: MRM of 3 Channels ES- TIC

1.85e49.90

8.227.82

septDON101_trico2 4: MRM of 3 Channels ES- TIC

7.94e37.05

6.01 8.477.76 8.11

septDON101_trico2 3: MRM of 3 Channels ES- TIC

4.01e46.50

septDON101_trico2 2: MRM of 3 Channels ES- TIC

7.34e36.49

5.375.02 5.94 7.17 7.64

DON

DON-3-GLU

Ac-DON

13C-DON

Time4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00

%

75

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00

%

14

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00

%

69

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00

%

30

septDON101_trico2 5: MRM of 3 Channels ES- TIC

1.85e49.90

8.227.82

septDON101_trico2 4: MRM of 3 Channels ES- TIC

7.94e37.05

6.01 8.477.76 8.11

septDON101_trico2 3: MRM of 3 Channels ES- TIC

4.01e46.50

septDON101_trico2 2: MRM of 3 Channels ES- TIC

7.34e36.49

5.375.02 5.94 7.17 7.64

DON

DON-3-GLU

Ac-DON

13C-DON

DON-3-Glu:fino al 30% rispetto alla

forma nativa.

Sintesi dei derivati.Analisi LC-ESI-MS.12 campioni inoculati artificialmente.8 campioni naturalmente contaminati.

Maltazione del frumento: effetto sul DON

0

50

100

150

200

250

300

350

C813 C831 C793

[TO

X] (µ

g/Kg

)

DON Raw DON Malted Acetyl-DON Raw Acetyl-DON Malted

DON frumento

DON malto

AcDON frumento

AcDON malto

Maltazione del frumento: effetto sullo ZON

0

5

10

15

20

25

30

35

40

C415/12 C415/4 C433/5 DM-7 DM-6

[ZON

] (μg

/Kg)

ZON Raw

ZON

Aumento della forma nativa dovuto a: - rilascio da forme mascherate? - degradazione delle interazioni con la matrice (pareti cellulari, amido o proteine)?

ZON malto

ZON frumento

Fumonisine: il paradosso

Nonostante FB1 abbia una bassa biodisponibilità, gli effetti tossici sono evidenti anche dopo l’ingestione di mangimi poco contaminati.

Fumonisine nascosteFumonisine nascoste

Shier et al., J. Nat. Toxins, 1997, 6, 225–242Aggiunta di FB1 radiottiva a farina di mais, successiva cottura in forno

Solo il 37% della radioattività viene recuperata con i comuni metodi di analisi

Un ulteriore 46% è fortemente associato alla frazione proteica

Park et al. Food Add. & Contam., 2004, 21 (12), 1168–1178FB1 nascosta nei corn-flakes può essere estratta con SDS.HFB1 viene rilasciata dalla matrice in seguito ad idrolisi alcalina e purificazione su SPE.

Le forme nascoste sono in quantità comparabile a quelle legate.

050

100150200250300350400450500

corn

flak

es 1

corn

flak

es 2

corn

flak

es 3

corn

flak

es 4

past

aflo

ur 1

flour

2

cake

s

crisp

brea

d

conc

entr

ation μg/

Kg

HFB1 FB1FBs libere FBs nascoste

Fumonisine libere e legate nei prodotti a base di mais

Farina di mais

Dall'Asta et al., Mol. Nutr. Food Res. 2009, 53, 492 – 499

Fumonisine nascoste nella granella di mais

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

FB1

FB2

FB3

FB1

FB2

FB3

FB1

FB2

FB3

FB1

FB2

FB3

FB1

FB2

FB3

FB1

FB2

FB3

ter 1 ter 2 ter 3 mais F mais CM mais CRPV

FBs μ

g/K

g

libere legate

FBs libere

FBs nascoste

La presenza di fumonisine nascoste nella granella di mais non può essere dovuta a trattamenti termici.

Digestione simulata in vitro

2 g di campione

3 ml saliva

6 ml succo gastrico

6 ml succo duodenale + 3 ml bile + 1 ml HCO3

-

Chimo(+ matrice digerita)

Centrifugazione

Analisi

Bioaccessibilitàdei contaminanti

pH = 6.8

pH = 2-3

pH = 6.5-7

5 min

2 h

2 h

Versantvoort et al.Food and Chem. Tox.43 (2005) 31-40

FBs libere e nascoste in granella di mais e in materiali di riferimento certificati.

La quantità di FBs rivelabili dopo digestione è all’incirca doppia rispetto a quelle rivelabili con i comuni protocolli di analisi!!!

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Sample 5 Sample 52 Fapas

μg/

kg

Free FBs FBs after hydrolysis FBs after digestion

Dall’Asta et al.Anal.& Bioanal. Chem., 2010

3486 ± 677 μg/kg

8011 ± 453 μg/kg

TDI: 2 μg/Kg bw

Prodotti gluten-free: quale rischio?

Gruppo 1:40 volontari affetti da celiachia dieta gluten free

Gruppo 2:40 volontari controllo dieta normale

Raccolta del diario alimentare per pesata (7 giorni):

1)Valutazione dell’intake medio giornaliero di mais nei due gruppi

2)Valutazione della contaminazione media dei prodotti consumati

3)Stima dell’intake medio di fumonisina nei due gruppi

Caratteristiche gruppi

N° Soggetti Età (anni) Peso (Kg) B.M.I. (Kg/m2)

Controllo 40 39.4 ± 12.3 64.3 ± 11.0 22.3 ± 3.4

Celiaci 40 40.2 ± 13.8 57.7 ± 9.6 20.7 ± 2.8

Presenza di fumonisina

/ Totali

Media(µg/ kg)

Valore massimo(µg/ kg)

Limite di leggeCOMMISSION

REGULATION (EC) No 1126/ 2007.

Prodotti estrusi 16/19 262 2253

800 µg/kgPasta 27/29 124 335

Pane e sostitutivi 20/22 138 514

Dolci e biscotti 16/17 301 555

Polenta 10/10 1190 33081000 µg/kgFarine 2/4 67 210

Snacks 14/17 443 2625 800 µg/kg

Totale 105/118 309 3308

Presenza di fumonisina nei prodotti analizzati

Nonostante la limitata numerosità di campioni finora analizzati, i risultati possono considerarsi significativi in quanto alcuni studi tossicologici riportano che un’esposizione bassa ma continuativa alle fumonisine sembra essere più pericolosa che l’assunzione di una singola dose elevata.

0

1000

2000

Inta

ke m

edio

di F

Bs

(mg/

Kg

b.w

./die

Gruppo celiaci Gruppo controllo

Inta

kem

edio

di F

Bs(m

g/Kg

b.w

./die

)

2000

1000

0

Inta

kem

edio

di F

Bs(n

g/kg

b.w

./die

) Tukey’s Testp = 4.24x10-8

Intakemedio controlli 0.023 µg/kg b.w./die

Intakemedio celiaci 0.372 µg/ kg b.w./ die

Lo studio dimostra la maggiore esposizione a fumonisine della popolazione celiaca.

Tali dati, se riconfermati da ulteriori studi, potrebbero fornire il supporto scientifico per una rivalutazione dei limiti definiti per questi alimenti dietetici.

Valutazione dell’intake medio di fumonisina

Conclusioni e prospettive future

Micotossine libere

Micotossine nascoste

Maggiori informazioni sul destino delle Fusarium-tossine durante i processi tencologici

Maggiori informazioni sulla natura delle interazioni micotossina-matrice

Effetti su:StakeholdersEnti regolatoriDati di esposizione

Maggiori informazioni sulla biodisponibilità e sulla tossicitàdelle forme mascherate

RingraziamentiRingraziamenti

Rosangela MarchelliGianni GalavernaStefano SforzaChiara Dall’AstaMattia MangiaClaudia Falavigna

Dip. Chimica Organica e Industriale – Universitàdi Parma

Paola BattilaniAmedeo PietriTerenzio Bertuzzi

Università Cattolica del Sacro Cuore -Piacenza

SITEIA(Emilia-Romagna Region, Italy)

Rudolf KrskaRainer SchuhmacherFranz Berthiller

Department for Agrobiotechnology (IFA-Tulln), University of Natural Resources and Applied Life Sciences, Vienna (BOKU)Austria

Quali trasformazioni può subire la fumonisina?

NH2

OHOH

CH3OH

OH

CH3 OH

HFB1

idrolisi

Coniugazione con l’amido

Coniugazione con le proteine

digestione

Il prodotti di trasformazione

potrebbero essere anche più tossici della

fumonisina, in quanto meglio assimilabili, oppure

potrebbero liberare la tossina a livello gastrico

NON è possibile PRESUPPORREche la diminuzione di fumonisina

durante i trattamenti tecnologici induca un

miglioramento del prodotto!

MESSA A PUNTO DEL METODO DI ANALISI DELLE FUMONISINE NASCOSTE

FB1 STANDARD

IDROLISI BASICA CON NAOH 1 M CINETICA: 4 ore al buio

Neutralizzazione con HCl 5N

Purificazione con Sep-Pak C18

ANALISI HPLC-MS-MS

SALI ELIMINATI CON H20

HFB1 ELUITA CON CH3CN

RISULTATI CINETICHE

Idrolisi basica

Idrolisi acida

1) Resa di reazione 99% in 30 min.

2) Prodotto stabile anche dopo 24 h.

- Bassa resa di reazione

- Rapido degrado del prodotto per disidratazione

NH2

OHOH

CH3OH

OH

CH3 OH

HFB1

ANALISI HPLC-MS-MS

A) H2O + 0.1% HCOOH

B) CH3OH + 0.1% HCOOH

45%55%30

45%55%26

85%15%25

85%15%20

45%55%5

45%55%0

BATempo (min)

[M+H-H2O]+ 406 388

[M+H]+ 406 406

HFB1

M+H-2H2O]+ 406 370

M+H-3H2O]+ 406 352

[M+H-4H2O]+ 406 334

Transizioni MRM monitorate

m/z200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440

%

0

100

%

0

100

%

0

100

HFB1_Tamb_2 276 (10.101) Cm (254:293) Daughters of 406ES+ 1.90e5334.31

236.24208.44

226.21254.27

238.53 316.47271.91 306.38

334.50

352.52352.08

351.64

370.36388.39

HFB1_Tamb_1 114 (9.214) Cm (105:126) 2: Daughters of 406ES+ 5.77e5370.42

352.33

334.24

254.33236.18226.21 272.29 316.41

388.32 406.41

HFB1_Tamb 503 (10.305) Cm (488:541) Scan ES+ 3.59e7406.34

388.21

Regolazione energia di frammentazione

CE: 30eV

CE: 20eV

Q1: m/z 406

Schema triploEluenti e gradiente

NATURA DELLE FUMONISINE NASCOSTE

SEPARAZIONE FRAZIONI PROTEICHE

FRAZIONE PROTEINE %NEL MAIS

MISCELA DI ESTRAZIONE

Prima ALBUMINE

4% H2O

Seconda GLOBULINE 2,8%Soluz.

NaCl O.4M

Terza PROLAMMINE 47,9%Etanolo:H2O

70:30

Quarta GLUTELINE 45,3%1-Propanolo:H2O = 50:50

+ 1%Ditiotreitolo

IDROLISI DI OGNI FRAZIONE

ANALISI HPLC-MS-MS

FUMONISINA LEGATA ALLE FRAZIONI PROTEICHE

Time2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00

%

0

100

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00

%

0

100

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00

%

0

100

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00

%

0

100H_glut_M Sm (SG, 3x1) MRM of 4 Channels ES+

TIC7.31e4

H_prol_M Sm (SG, 3x1) MRM of 4 Channels ES+ TIC

7.31e47.72754

H_glob_M Sm (SG, 3x1) MRM of 4 Channels ES+ TIC

7.31e4

7.81764

H_alb_M Sm (SG, 3x1); Sm (SG, 3x1) MRM of 4 Channels ES+ TIC

7.31e4

ALBUMINE

GLOBULINE

PROLAMMINE

GLUTELINE

1

2

3

4