8/6/2019 Lipids n Soybean

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 7 4 ) 5 4 , 7 4 4 - 7 4 7

P h o s p h o l i p i d s i n t h e D e v e l o p i n g S o y b e a n S e e d 'R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n A p r i l 1 7 , 1 9 7 4 and i n r e v i s e d form July 1 6 , 1974

RICHARD F . W I L S O N - AND R O B E R T W. R I N N EA g r i c l a l t a l r a l R e s e a r c h S e r v i c e , U n i i t e d S t a t e s D e p a r t m n e n 2 t o f A g r i c u l t u r e , D e p a r t m e n t o f A g i o n omiy,U n t i v e r s i t y o f I l l i n i o i s a t U r b a n a - C h a m p a i g n , U r b a n i a , l l l i n i o i s 6 1 8 0 1

ABSTRA CTTh e d i s t r i b u t i o n o f p h o s p h o l i p i d s i n d e v e l o p i n g s o y b e a n

s e e d s [ G l y c i n e m a x ( L . ) M e r r . , v a r . " C h i p p e w a 6 4 , " " H a r o s o y6 3 , " " W a y n e , " and " C l a r k 6 3 " ] w a s f o l l o w e d . F rom 3 0 t o 6 0d a y s a f t e r f l o w e r i n g e x p r e s s e d a s m o l e p e r c e n t o f p h o s p h o -l i p i d p h o s p h o r u s p h o s p h a t i d i c a c i d d e c r e a s e d from 1 4 . 8 t o9 . 1 ; p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l i n c r e a s e d from 0 t o 9 . 1 ; p h o s -p h a t i d y l c h o l i n e i n c r e a s e d f r o m 8 . 2 t o 9 . 8 ; p h o s p h a t i d y l e t h a -n o l a m i n e i n c r e a s e d from 5 . 3 t o 8 . 6 ; p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l i n -c r e a s e d from 3 . 2 t o 4 . 8 ; d i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l i n c r e a s e d from2 . 7 t o 4 . 1 ; a n d N - a c y l p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e d e c r e a s e d f r o m6 5 . 8 t o 5 4 . 6 . H o w e v e r , from 6 0 d a y s a f t e r f l o w e r i n g t o matu-r i t y , p h o s p h a t i d i c a c i d d e c r e a s e d t o 0 ; p h o s p h a t i d y l i n o s i t o li n c r e a s e d r o u g h l y 2 - f o l d ; p h o s p h a t i d y l c h o l i n e i n c r e a s e dr o u g h l y 4 . 7 - f o l d ; p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e i n c r e a s e d 3 - f o l d ;N - a c y l p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e d e c r e a s e d 1 1 - f o l d ; w h e r e a sp h o s p h a t i d y l g l y c e r o l and d i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l r e m a i n e d e s -s e n t i a l l y c o n s t a n t . P e r c e n t a g e s o f i n d i vi d u a l p h o s p h o l i p i ds p e c i e s w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t b e t w e e n a n y two v a r i -e t i e s a t a g i v e n t i m e p e r i o d .Immature s o y b e a n c o t y l e d o n s i n c u b a t e d w i t h 4 C - a c e t a t e or- p y r u v a t e d e m o n s t r a t e d r a p i d i n c o r p o r a t i o n i n t o t h e p h o s p h o -l i p i d f r a c t i o n . N - a c y l p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e was f o u n d t oa c c o u n t f o r n e a r l y 7 0% o f t h e t o t a l r a d i o a c t i v i t y i n c o r p o r a t e db y t h e t o t a l p o l a r l i p i d f r a c t i o n a n d g r e a t e r t h a n 3 0 % o f t h et o t a l r a d i o a c t i v i t y a d d e d .

NPE3 h a s b e e n r e c o g n i z e d r e c e n t l y i n h i g h e r p l a n t s f r o mt h e l i p i d s o f s o f t w h e a t f l o u r ( 3 ) . Dawson e t a l . ( 5 ) , a n d A n e j ae t a l . ( 1 ) h a v e c o n f i r me d t h e s t r u c t u r e a n d t h e p r e s e n c e o f NPEi n g e r m i n a t i n g p e a s e e d s a n d i n a v a r i e t y o f p l a n t s . T h e a m o u n to f NPE f o u n d i n p l a n t t i s s u e h a s b e e n s h o w n t o d e p e n d o nt i s s u e a g e , i s o l a t i o n t e c h n i q u e , a n d l i p i d e x t r a c t i o n p r o c e d u r e .d e l a R o c h e a n d A n d r e w s ( 6 ) , u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f t h eB l i g h a n d D y e r t e c h n i q u e , h a v e r e p o r t e d 11% NPE a n d1 3 . 2 % l y s o - N P E f r o m t h e l i p i d s o f s o f t w h e a t s e e d ; t h e o r i g i -n a l p a p e r o f B o m s t e i n ( 3 ) s h o w e d o n l y 4 % NPE i n t h e t o t a lp h o s p h o l i p i d s e x t r a c t e d f r o m w h e a t f l o u r w i t h b e n z e n e .

1 R e s e a r c h was s u p p o r t e d b y c o o p e r a t i v e i n v e s t i g a t i o n s o f t h eA g r i c u l t u r a l R e s e a r c h S e r v i c e , U n i t e d S t a t e s D e p a r t m e n t o fA g r i c u l t u r e , a n d I l l i n o i s A g r i c u l t u r e E x p e r i m e n t S t a t i o n .2 T h i s r e s e a r c h r e p r e s e n t s p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f M . S . d e g r e e .' A b b r e v i a t i o n s : NPE: N - a c y l p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ; T G :t r i g l y c e r i d e ; P I : p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ; P E : p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a -m i n e ; P C : p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ; D A F: d a y s a f t e r f l o w e r i n g ; P A :p h o s p h a t i d i c a c i d .

S i n g h a n d P r i v e t t ( 1 5 , 1 6 ) h a v e f o u n d p r e d o m i n a t e l v TG ,P I , P E , a n d P C i n l i p i d e x t r a c t s f r o m m a t u r e s o y b e a n s , a n dh a v e d e t e c t e d NPE among t h e l i p i d s f r o m i m m a t u r e s o y b e a ns e e d s .T h e o b j e c t i v e o f t h i s p a p e r i s t o d e s c r i b e t h e a c c u m u l a t i o n o fp h o s p h o l i p i d s i n t h e d e ve l o pi n g s o y b e a n s e e d s a n d t o s t u d y t h ei n c o r p o r a t i o n o f r a d i o a c t i v e a c e t a t e o r p y r u v a t e i n t o t h ep h o s p h o l i p i d f r a c t i o n .MAT E R I ALS AND METHODS

S a m p l i n g o f P l a n t M a t e r i a l . F o u r c o m m e r c i a l v a r i e t i e s o fs o y b e a n s ( G l y c i n e m ax [ L . ] M e r r . ) w e r e u s e d i n t h e s t u d yr e p o r t e d h e r e . " C h i p p e w a 6 4 " , " H a r o s o y 6 3 " , " W a y n e " , a n d" C l a r k 6 3 " w e r e g r o w n a t t h e U n i v e r s i t y o f I l l i n o i s S o u t hAgronomy F a r m . U r b a n a , d u r i n g t h e 1 9 7 2 g r o w i n g s e a s o n . Am o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o f R u b e l e t a l . ( 1 4 ) w a s u s e d t od e t e r m i n e D AF. Te n p l a n t s f r o m e a c h v a r i e t y w e r e s e l e c t e da t r a n d o m t o m o n i t o r f l o w e r i n g d a t e s . A t t h e o n s e t o f f l o w e r -i n g , p l a s t i c t a g s w i t h p e n c i l e n t r i e s i n d i c a t i n g v a r i e t a l n a m e ,d a t e , a n d n o d e w e r e a t t a c h e d s e q u e n t i a l l y a t i n t e r v a l s o f 3d a y s t o t h e h i g h e s t f l o w e r i n g n o d e o f t h e m a i n s t e m u n t i lf l o w e r i n g c e a s e d . F l o w e r o p e n i n g w a s a n t i c i p a t e d a t d u s k i fp e t a l c o l o r c o u l d b e s e e n t h r o u g h t h e c a l y x .T a g g e d f l o w e r s o n t h e r e f e r e n c e p l a n t s w e r e u s e d t o d e t e r -m i n e s e e d a g e (DAF) a t s p e c i f i c n o d e s i n t h e r e m a i n i n g p o p u -l a t i o n . S a m p l i n g w a s i n i t i a t e d when s e e d s e x c e e d e d 1 0 0 m gf r e s h w e i g h t a n d c o n t i n u e d a t 1 0 - d a y i n t e r v a l s u n t i l t h e s e e d sw e r e y e l l o w i n c o l o r . One a d d i t i o n a l s a m p l e w a s t a k e n whent h e s e e d s w e r e f u l l y m a t u r e . O n l y o n e p o d w a s h a r v e s t e d p e rn o d e f r o m a n y s i n g l e p l a n t . S i m i l a r a r e a s o n t h e p l a n t s o fa l l v a r i e t i e s w e r e s a m p l e d . To f a c i l i t a t e t h i s t e c h n i q u e , s p e c i f i cg r o u p s o f n o d e s w e r e d e s i g n a t e d f o r p a r t i c u l a r p i c k i n g d a t e s .a n d f i v e a r e a s w e r e e s t a b l i s h e d b e t w e e n t h e 4 t h a n d 1 5 t h n o d et o m a i n t a i n u n i f o r m i t y . At t h e p r o p e r s a m p l i n g t i m e , a p p r o x i -m a t e l y 2 5 0 s e e d s w e r e h a r v e s t e d d u r i n g a p e r i o d b e t w e e n7 : 3 0 a n d 8 : 0 0 A M . A l l o f t h e m a t e r i a l w a s k e p t i n t h e p o d o ni c e a n d u s e d w i t h i n 1 h o u r o f h a r v e s t . B e c a u s e o f t h e l i m i t a -t i o n s i n p e r s o n n e l a n d p a t t e r n s o f b e a n d e v e l o p m e n t , i t w a s n o t

p o s s i b l e t o o b t a i n d u p l i c a t e s a m p l e s a t e a c h h a r v e s t d a t e :h o w e v e r , i n t he c o u r s e o f t h e s e a s o n , r e p l i c a t e s a m p l e s w e r ea n a l y z e d . A l l o f t h e a n a l y s e s o f t o t a l l i p i d d e t e r mi n a t i o n s w e r er e p l i c a t e d a n d c o m p a r e d b y a n a l y s i s o f v a r i a n c e .L i p i d E x t r a c t i o n . One h u n d r e d s e e d s o f e a c h s a m p l e w e r eu s e d t o f o l l o w t h e c h a n g e s i n d r y w e i g h t d u r i n g b e a n d e v e l o p -m e n t . T h e r e m a i n d e r o f t h e s e e d s w e r e e x t r a c t e d f o r t o t a ll i p i d s b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e B l i g h a n d D y e r ( 2 ) m e t h o d o ru s e d i n i s o t o p e i n c o r p o r a t i o n s t u d i e s . F o r t o t a l l i p i d e x t r a c t i o n ,5 - g l o t s o f w h o l e s e e d w e r e h o m o g e n i z e d i n a W a r i n g B l e n d o ra t 2 C f o r 1 5 s e c w i t h 1 0 0 m l o f m e t h a n o l , 1 0 0 m l o f c h l o r o -f o r m , a n d 7 5 ml o f w a t e r . T h e s u s p e n s i o n w a s s u c t i o n - f i l t e r e da n d t h e i n s o l u b l e r e s i d u e w a s w a s h e d w i t h a n a d d i t i o n a l 4 0m l o f c h l o r o f o r m - m e t h a n o l ( 2 : 1 , v / v ) c o n t a i n i n g 5 0 j g o f7 4 4

8/6/2019 Lipids n Soybean

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PHOSPHOLIPIDS IN SOYBEA N SEEDSb u t y l a t e d h y d r o x y t o l u e n e p e r m l . The p h a s e s w e r e a l l o w e d t os e p a r a t e i n a 5 0 0 - m l s e p a r a t o r y f u n n e l o v e r n i g h t a t 2 C . T h ec h l o r o f o r m l a y e r ( l i p i d f r a c t i o n ) w a s t h e n r e m o v e d a n dr e d u c e d t o a p p r o x i m a t e l y 2 m l u n d e r vacuum a t 2 5 C b y u s i n ga f l a s h e v a p o r a t o r . T h e l i p i d m a t e r i a l s w e r e t r a n s f e r r e d t oT e f l o n - l i n e d s c r e w c a p v i a l s w i t h c h l o r o f o r m - m e t h a n o l ( 2 : 1 ,v / v ) c o n t a i n i n g b u t y l a t e d h y d r o x y t o l u e n e . T h e f i n a l v o l u m ew a s r e d u c e d t o 2 m l b y e v a p o r a t i o n u n d e r n i t r o g e n g a s a n ds t o r e d a t - 15 C .S e p a r a t i o n o f L i p i d C l a s s e s . L i p i d e x t r a c t s w e r e f r a c t i o n a t e db y TLC o n p l a t e s c o a t e d w i t h A b s o r b o s i l - 5 ( A p p l i e d S c i e n c eL a b s 4 ) p r e p a r e d i n a 1 : 1 . 5 s l u r r y w i t h d e i o n i z e d w a t e r . P l a t e sw e r e a i r d r i e d 4 h r p r i o r t o a c t i v a t i o n a t 1 0 0 C f o r 1 h r .S i x d i f f e r e n t TLC s o l v e n t s y s t e m s w e r e u s e d . E a c h s y s t e mw a s d e s i g n e d t o s e p a r a t e s p e c i f i c l i p i d c l a s s e s f r o m a t o t a l l i p i de x t r a c t c l e a r l y i n o n e d i m e n s i o n . T h e s y s t e m s e m p l o y e d a r el i s t e d b y i n c r e a s i n g o r d e r o f p o l a r i t y : A : p e t r o l e u m e t h e r ( b . p .6 0 - 6 8 C ) - d i e t h y l e t h e r - a c e t i c a c i d ( 9 0 : 1 0 : 0 . 7 , v / v / v ) ; B :p e t r o l e u m e t h e r ( b . p . 6 0 - 6 8 C ) - d i e t h y l e t h e r - a c e t i c a c i d( 8 0 : 2 0 : 1 , v / v / v ) ; C : b e n ze n e- e t h y l a c e t a t e - d i e t h y l e t h e r -a c e t i c a c i d ( 1 0 0 : 1 0 : 5 : 0 . 4 , v / v / v / v ) ; D : c h l o r o f o r m- m e t h a -n o l - a m m o n i u m h y d r o x i d e ( 7 0 : 2 0 : 1 . 5 , v / v / v ) ; E : c h l o r o f o r m -m e t h a n o l - a c e t i c a c i d - w a t e r ( 8 0 : 1 5 : 5 : 2 , v / v / v / v ) ; a n d F :c h l o r o f o r m - m e t h a n o l - a c e t i c a c i d - w a t e r ( 2 5 : 1 5 : 5 : 2 , v / v / v / v ) .A l l c h r o m a t o g r a m s w e r e r u n i n e q u i l i b r a t e d t a n k s when l a b -o r a t o r y c o n d i t i o n s w e r e 2 1 t o 2 4 C a n d 3 0 t o 40% r e l a t i v eh u m i d i t y . L i p i d c l a s s i d e n t i f i c a t i o n w a s made b y c o m p a r i s o n o fR F v a l u e s o f known l i p i d s t a n d a r d s a n d f r o m s p e c i f i c r e a c -t i o n w i t h i o d i n e v a p o r , 0 . 2 % 2 , 7 - d i c h l o r o f l u o r e s c i n i n e t h a n o ld i l u t e d 1 : 1 w i t h w a t e r , 0 . 5 % n i n h y d r i n i n b u t a n o l , m o l y b d e -n u m s p r a y , D i t t m e r a n d L e s t e r ( 7 ) , 20% p e r c h l o r i c a c i d s p r a y ,a n d m o d i f i e d p e r i o d a t e S c h i f f ' s r e a g e n t , R a n d e r a t h ( 1 2 ) .S t a n d a r d N P E w a s p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o fDawson e t a l . ( 5 ) b y d i s s o l v i n g 5 8 m g o f s y n t h e t i c P E i n 1 0 m lo f c h l o r o f o r m , t h e n m i x i n g w i t h 1 . 0 m l o f t r i e t h y l a m i n e a n d 2 5m g o f r e d i s t i l l e d p a l m i t o y l c h l o r i d e . A f t e r 2 h r a t room t e m -p e r a t u r e , t h e m i x t u r e w a s s h a k e n w i t h 2 v o l u m e s o f s a t u r a t e ds o d i u m b i c a r b o n a t e . T h e a c y l a t e d p r o d u c t w a s t h e n s e p a r a t e don TLC.P r e p a r a t i o n o f F a t t y A c i d M e t h y l E s t e r s . P o l a r l i p i d c l a s s e si s o l a t e d o n TLC w e r e s c r a p e d i n t o a 1 2 - m l g l a s s c e n t r i f u g et u b e a n d v o r t e x e d w i t h 6 m l o f c h l o r o f o r m - m e t h a n o l ( 2 : 1 ,v / v ) f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 3 0 0 0 g f o r 5 m i n . The p e l l e tw a s r e s u s p e n d e d t w i c e w i t h 6 m l o f c h l o r o f o r m - m e t h a n o l -w a t e r ( 5 0 : 4 5 : 5 , v / v/ v) , a n d f i n a l l y w i t h 6 m l o f a b s o l u t em e t h a n o l . A l l o f t h e s u p e r n a t a n t f r a c t i o n s w e r e c o m b i n e d a n dr e d u c e d i n v o l u m e n e a r l y t o d r y n e s s a t 2 5 C w i t h a f l a s he v a p o r a t o r . F a t t y a c i d m e t h y l e s t e r s w e r e t h e n p r e p a r e d b yt h e m e t h o d o f C r a i g a n d M u r t y ( 4 ) . F a t t y a c i d m e t h y l e s t e r sw e r e s e p a r a t e d b y GLC b y u s i n g a H e w l e t t P a c k a r d 5 7 5 0 r e -s e a r c h c h r o m a t o g r a p h f i t t e d w i t h a f l a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r .T h e c o l u m n ( 2 . 1 5 m X . 6 3 5 c m ) w a s p a c k e d w i t h 15% d i -e t h y l e n e g l y c o l s u c c i n a t e o n 8 0 : 1 0 0 mesh a c i d - w a s h e dC h r o m o s o r b W. C o l u m n t e m p e r a t u r e w a s 1 8 0 C ; t h e i n j e c t i o np o r t a n d f l a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r w e r e h e l d a t 2 5 0 C . H e l i u mf l o w w a s m a i n t a i n e d a t 3 5 m l / m i n . H e p t a d e c e n o i c a c i d ( 1 7 : 0 )w a s u s e d a s a n i n t e r n a l s t a n d a r d .P h o s p h o r u s D e t e r m i n a t i o n . P h o s p h o r u s c o n t e n t o f p h o s -p h o l i p i d s s e p a r a t e d o n TLC a n d s c r a p e d i n t o t e s t t u b e s , w a sd e t e r m i n e d b y B a r t l e t t ' s m o d i f i c a t i o n o f t h e F i s k e a n d S u b b a -R o w t e s t ( P a r k e r a n d P e t e r so n , R e f. 1 0 ) .

' M e n t i o n o f a t r a d e m a r k o f p r o p r i e t a r y p r o d u c t d o e s n o tc o n s t i t u t e a g u a r a n t e e o r w a r r a n t y o f t h e p r o d u c t b y t h e U n i t e dS t a t e s D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e , a n d d o e s n o t i m p l y i t s a p -p r o v a l t o t h e e x c l u s i o n o f o t h e r p r o d u c t s t h a t m a y a l s o b e s u i t a b l e .

I n c o r p o r a t i o n o f L a b e l e d S u b s t r a t e . S t u d i e s o n t h e i n c o r p o -r a t i o n o f r a d i o a c t i v e a c e t a t e o r p y r u v a t e w e r e c a r r i e d o u tw i t h c o t y l e d o n s f r o m " C h i p p e w a 6 4 " a t 2 0 , 3 0 , a n d 4 0 DAF;a n d " H a r o s o y 6 3 " a n d " W a y n e " a t 3 0 , 4 0 , a n d 5 0 D AF.C o t y l e d o n s w e r e s e p a r a t e d f r o m t h e s e e d c o a t a n d w e r e s l i c e du n i f o r m l y w i t h a r a z o r b l a d e . T h e s l i c e s ( 5 0 0 m g f r e s h w e i g h t )w e r e i n c u b a t e d a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f R i n n e a n dC a n v i n ( 1 3 ) w i t h 2 . 5 , u m o l e s o f a c e t a t e - 1 - " C , a c e t a t e - 2 - 1 4 C ,p y r u v a t e - 2 - ' 4 C , o r p y r u v a t e - 3 - " C c o n t a i n i n g 5 1 i C i . P y r u v a t es o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d i n 0 . 0 0 1 N H 3 P O 4 .I n c u b a t i o n s w e r e t e r m i n a t e d a t 5 , 1 5 , 3 0 , 6 0 , 1 2 0 , o r 2 4 0m i n w i t h 5 . 0 m l o f h o t m e t h a n o l . T h e t i s s u e w a s t r a n s f e r r e dt o a 4 0 - m l T e n B r o e c k t i s s u e g r i n d e r w i t h a n a d d i t i o n a l 5 m lo f m e t h a n o l . D u r i n g g r i n d i n g , 1 0 m l o f c h l o r o f o r m , 7 . 5 m l o fd e i o n i z e d w a t e r , a n d 4 . 0 m l o f c h l o r o f o r m - m e t h a n o l ( 2 : 1 ,v / v w i t h 5 0 , u g o f b u t y l a t e d h y d r o x y t o l u e n e p e r m l ) w e r ea d d e d . T h e h o m o g e n a t e w a s s u c t i o n - f i l t e r e d t h r o u g h What manN o . 1 p a p e r i n t o a 5 0 - m l g l a s s c e n t r i f u g e t u b e , w h i c h w a ss u b s e q u e n t l y s p u n a t 3 0 0 0 g f o r 2 0 m i n t o g i v e t w o d i s t i n c tp h a s e s . T h e c h l o r o f o r m p h a s e w a s s e p a r a t e d f r o m t h e a q u e o u sp h a s e , e v a p o r a t e d u n d e r vacuum w i t h 1 m l o f f o r m i c a c i d t ov o l a t i l i z e u n m e t a b o l i z e d s u b s t r a t e , a n d a s s a y e d f o r ' 4 C i nB r a y ' s s c i n t i l l a t o r . T h e c h l o r o f o r m - s o l u b l e p r o d u c t s w e r es t o r e d a s s t a t e d p r e v i o u s l y . L i p i d c l a s s e s w e r e s e p a r a t e d b yTLC m e t h o d s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . E a c h c l a s s w a s s c r a p e di n t o a s c i n t i l l a t i o n v i a l a n d c o u n t e d w i t h 1 0 m l o f m o d i f i e dB r a y ' s s c i n t i l l a t i o n f l u i d .R a d i o a c t i v i t y was d e t e r m i n e d w i t h a P a c k a r d 3 0 0 3 l i q u i ds c i n t i l l a t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r . C o u n t s p e r m i n u t e w e r e c o r -r e c t e d f o r q u e n c h i n g b y t h e c h a n n e l s r a t i o m e t h o d .

RESULTS AND DISCUSSIONL i p i d c l a s s s e p a r a t i o n b y TLC a s d e s c r i b e d i n " M a t e r i a l sa n d M e t h o d s , " i s s h o w n i n T a b l e I .T h e s y s t e m w h i c h b e s t r e s o l v e d NPE f r o m t h e t o t a l l i p i dc o n t a i n e d c h l o r o f o r m , m e t h a n o l , a n d a m m o n i u m h y d r o x i d ei n a v o l u m e r a t i o o f 7 0 : 2 0 : 1 . 5 . G a l a c t o l i p i d s w e r e s e p a r a t e d

b e s t b y t h e s y s t e m o f c h l o r o f o r m - m e t h a n o l - a c e t i c a c i d - w a t e r( 8 0 : 1 5 : 5 : 2 , v / v/ v / v ) . M o d i f i c a t i o n o f t h e c h l o r o f o r m c o n -t e n t i n t h e p r e v i o u s s y s t e m f r o m 8 0 t o 2 5 v o l u m e s a l l o w e ds e p a r a t i o n o f l y s o - P C a n d l ys o- P E f r o m P l . The r e m a i n i n gt h r e e s y s t e m s w e r e u s e d e x c l u s i v e l y f o r n e u t r a l l i p i d i d e n t i f i c a -t i o n .N o s t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e w a s d e t e r m i n e d a m on g t h e v a r i e t i e sb y t h e a n a l y s i s o f v a r i a n c e f o r t h e p e r c e n t a g e o f a n i n d i v i d u a lp h o s p h o l i p i d a t a g i v e n s t a g e o f d e v e l o p m e n t . W e t h e r e f o r er e p o r t d a t a o n l y f o r " H a r o s o y 6 3 " b e a n s , w i t h t h e e x c e p t i o no f t h e i n f o r m a t i o n i n c l u d e d o n T a b l e s I I a n d I V . " H a r o s o y 6 3 "s e e d s t u r n e d y e l l o w a t 6 5 DAF a n d w e r e m a t u r e a t 7 5 D A F .P h o s p h o r u s a n a l y s i s o f p h o s p h o l i p i d s i n i m m a t u r e s e e d s( T a b l e I I I ) d e m o n s t r a t e d s i z a b l e a m o u n t s o f NPE a n d l e s s e rq u a n t i t i e s o f P I , P C , P E , P A , p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l , a n d d i -p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l i n t h e p o l a r l i p i d f r a c t i o n .L i t t l e f l u c t u a t i o n i n t h e m o l e p e r c e n t o f i n d i v i d u a l p o l a rl i p i d s o c c u r r e d b e t w e e n 3 0 a n d 6 0 D A F, w i t h t h e e x c e p t i o no f P I w h i c h was n o t d e t e c t e d i n i t i a l l y b u t i n c r e a s e d t o 9 . 1m o l e % a t 6 0 D A F . G r e a t e r t h a n 5 0 m o l e % o f t h e t o t a lp h o s p h o l i p i d p e r s e e d w a s a t t r i b u t e d t o NPE i n i m m a t u r ec o t y l e d o n s .A t m a t u r i t y , t h e m o l e p e r c e n t o f p h o s p h o l i p i d p h o s p h o r u sa n d a l l o f t h e p h o s p h o l i p i d c o m p o u n d s e x c e p t p h o s p h a t i d y l -g l y c e r o l a n d d i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l c h a n g e d q u i t e d r a m a t -i c a l l y . T h e s e t w o p o l a r l i p i d s m a i n t a i n e d t h e s a m e m o l e p e rc e n t a s i n immature s e e d s . P A c o u l d n o t b e d e t e c t e d a t m a -t u r i t y . I n t h e p e r i o d f r o m 6 0 DAF t o m a t u r i t y ( a p p r o x i m a t e l y1 5 d a y s ) , PI i n c r e a s e d f r o m 9 . 1 t o 1 7 . 4 m o l e % ; P C i n c r e a s e d

7 4 5l a n t P h y s i o l . V o l . 5 4 , 1 9 7 4

8/6/2019 Lipids n Soybean

3/4

WILSON AND RINNET a b l e I . RF V a l u e s o f L i p i d S t a n i d a r d s D e t e r m i n i e d b y T h i n i L a y e rC l h r o i n a t o g r a p h l

A l l t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a m s w e r e r u n i n e q u i l i b r a t e d t a n k swhen t h e l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s w e r e 2 1 t o 2 4 C a n d 3 0 t o 4 0 c %r e l a t i v e h u m i d i t y . P l a t e s w e r e c o a t e d w i t h 0 . 2 5 mm A b s o r b o s i l - 5a n d w e r e a i r d r i e d 4 h r p r i o r t o a c t i v a t i o n a t 1 0 0 C f o r 1 h r . S o l v e n ts y s t e m s w e r e i d e n t i f i e d i n " M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . "

R F V - a l u e s i n S o l - e n tCompound

A B

N e u t r a l l i p i d TLCP h o s p h o l i p i dM o n o g l y c e r i d eS t e r o l1 , 2 - D i g l y c e r i d e1 , 3 - D i g l y c e r i d eF a t t y a l c o h o l sF r e e f a t t y a c i d sT r i g l y c e r i d eF a t t y a c i d m e t h y l e s t e r sS t e r o l e s t e r sH y d r o c a r b o n

0 . 0 00 . 0 00 . 0 60 . 0 30 . 0 60 . 1 30 . 1 60 . 3 30 . 5 60 . 7 70 . 9 1

P o l a r l i p i d TLCL y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i n eP h o s p h a t i d y l c h o l i n eL y s o p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n eP h o s p h a t i d y l i n o s i t o lP h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n eD i g a l a c t o s y l d i g l y c e r i d eP h o s p h a t i d y l g l y c e r o lP h o s p h a t i d i c a c i dC e r e b r o s i d eN-acylphosphatidylethanolamineD i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o lM o n o g a l a c t o s y l d i g l y c e r i d e

00

C 0

0 . 0 00 . 0 10.090 . 0 60 . 1 10 . 2 00 . 2 90 . 7 10 . 7 40 . 8 00 . 9 7

C

0 . 0 00 . 0 30 . 2 40 . 3 40 . 4 70 . 3 90 . 4 50 . 9 70 . 9 70 . 9 70 . 9 7

I ) E F

1 . 0 0 0 . 6 1 0 . 1 4) . 2 1 0 . 2 3 0 . 5 0) . 0 0 0 . 1 6 0 . 5 91 . 3 9 0 . 1 1 0 . 7 5) . 4 3 0 . 5 8 0 . 9 1) . 2 6 0 . 3 7 0 . 9 1) . 6 0 0 . 3 1 0 . 9 1) . 0 3 0 . 5 7 0 . 9 1) . 7 9 0 . 6 9 0 . 9 1) . 9 3 0.83 0.91) . 7 1 0 . 9 8 0 . 9 1) . 8 3 0 . 9 8 0 . 9 1

T a b l e I T . A v e r a g e F r e s h a n d D r y X W e i g h t s D u r i n i g Seed D e v e l o p m n e n t' C h i p p e w a 6 4 " " H a r o s o y 6 3 ' Wavne ' C l a r k 6 3 '

Time a f t e rflowering ! r e s t Dry w v t F r e s h Drv t F Drv w t Fr e Dry wt

d a ! s w g ' s e e d2 0 1 3 7 . 0 2 2 . 2 1 ...3 0 2 9 5 . 0 8 1 . 2 2 0 6 . 1 44.7 1 7 3 . 1 3 0 . 5 t 1 2 7 . 1 2 2 . 94 0 3 8 9 . 6 1 2 8 . 9 3 2 6 . 3 1 1 0 . 5 2 5 4 . 1 93.9 3 5 7 . 8 6 7 . 55 0 4 9 5 . 3 1 8 7 . 2 4 4 3 . 2 1 5 8 . 5 443.4 1 4 2 . 1 1 3 3 8 . 6 1 0 5 . 96 0 4 5 9 . 0 1 9 7 . 8 i 5 1 5 . 0 1 9 6 . 6 5 0 2 . 4 1 7 5 . 4 1 3 8 7 . 1 1 3 2 . 97 0 -i .. . 4 7 6 . 2 1 8 9 . 9M a t u r e 2 2 2 8 . 3 , 1 9 3 . 3 1 2 7 3 . 2 2 2 1 . 1 2 6 5 . 5 2 0 7 . 6 2 2 0 . 9 1 8 8 . 5

'N o s a m p l e t a k e n .2 "Chippewa 6 4 " , "Harosoy 6 3 " , " W a y n e " , a n d " Cl a rk 63" wered e t e r m i n e d m a t u r e a t 7 0 , 7 5 , 7 4 , a n d 8 0 D A F , r e s p e c t i v e l y .

from 9 . 8 t o 4 6 . 0 mole %; and P E i n c r e a s e d f r o m 8 . 6 t o 2 5 . 0m o l e %. NPE, h o w e v e r , d e c r e a s e d f r o m 5 4 . 6 t o 4 . 8 m o l e %.S i n g h and P r i v e t t ( 1 5 ) h a v e s u g g e s t e d t h a t NPE i s p r e s e n t i nr e l a t i v e l y l a r g e amou nts i n t h e l i p i d o f immat u re s o y b e a n s ;t h e y ( 1 6 ) h a v e l i s t e d t h e main c o n s t i t u e n t s o f t h e p o l a r l i p i df r a c t i o n o f " C h i p p e w a 6 4 " s o y b e a n ( 4 0 D A F ) t o b e P A , P I ,

P E , P C , a n d p h o s p h a t i d y l s e r i n e . A t m a t u r i t y , t h e y d e t e c t e do n l y P E , P C , a n d P I . R e c e n t l y , P r i v e t t e t a l . ( 1 1 ) u s i n g d e -v e l o p i n g s o y b e a n s e e d s w h i c h w e r e f r o z e n a n d s t o r e d b e f o r el i p i d e x t r a c t i o n , h a v e r e p o r t e d l a r g e a m o u n t s o f P A a n d u n -i d e n t i f i e d m a t e r i a l i n p h o s p h o l i p i d f r a c t i o n s . A l t h o u g h N P Ew a s n o t i d e n t i f i e d i n t h a t p a p e r , S i n g h a n d P r i v e t t ( 1 5 , 1 6 )h a v e p r e vi o u sl y r e p o r t e d l a r g e a m o u n t s o f NPE i n i m m a t u r es o y b e a n s e e d . We h a v e made p r e l i m i n a r y s t u d i e s o n t h e e f f e c t so f f r e e z i n g s o y b e a n t i s s u e b e f o r e l i p i d e x t r a c t i o n a n d h a v ef o u n d t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f N P E e x t r a c t e d f r o m n o n f r o z e nt i s s u e w a s a b o u t t w i c e t h e a m o u n t t a k e n f r o m f r o z e n s e e d . I nt h i s r e p o r t , l i p i d e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d w i t h i n 1 h o u r a f t e rh a r v e s t f r o m n o n f r o z e n t i s s u e .T h e p h o s p h o l i p i d p h o s p h o r u s d e t e r m i n a t i o n a n d GLCa n a l y s i s o f f a t t y a c i d m e t h y l e s t e r s l i b e r a t e d f r o m t h e w h o l ep h o s p h o l i p i d f r a c t i o n d e m o n s t r a t e d a n i n c r e a s e i n t o t a l p h o s -p h o l i p i d p e r s e e d o v e r t h e g r o w i n g s e a s o n ( T a b l e I V ) .T h e r e f o r e . t h e c h a n g e i n p h o s p h o l i p i d d i s t r i b u t i o n w h i c h o c -c u r r e d a f t e r 6 0 DAF w o u l d s u g g e s t t h a t NPE w a s c o n v e r t e dt o P E a n d P C ( T a b l e I I I ) .A c e t a t e - 1 - ` C , a c e t a t e - 2 - ' 4 C , p y r u v a t e - 2 - " C , a n d p y r u v a t e -3 - 4 C w e r e a l l i n c o r p o r a t e d r a p i d l y i n t o t h e l i p i d f r a c t i o n . A f t e r4 h r o f i n c u b a t i o n , 6 1 . 7 % o f t h e i n c o r p o r a t e d r a d i o a c t i v i t yf r o m e i t h e r a c e t a t e - 1 - 1 4 C o r - 2 - ` 4 C a n d 6 1 . 0 % o f t h e i n -c o r p o r a t e d r a d i o a c t i v i t y f r o m e i t h e r p y r u v a t e - 2 - ' 4 C o r - 3 - 4 Cw e r e i n t h e l i p i d f r a c t i o n . N o d i f f e r e n c e s w e r e n o t e d d u e t o t h el o c a t i o n o f t he l a b e l i n t h e s u b s t r a t e m o l e c u l e a n d t h e r e f o r e wer e p o r t o n l y d a t a f o r a c e t a t e - 2 - ' 4 C .

T a b l e I I I . C h a n g e s i n P h o s p h o l i p i d s o f D e v e l o p i n l g" H a r o s o y 6 3 " S e e dD A F

P h o s p h o l i p i d3 0 4 0 5 0 0 0 a-t u r e )s n o l e % p h o s p i z o l i p i d p / o p h o r u s ' s e e d

P h o s p h a t i d i c a c i d 1 4 . 8 1 4 . 9 1 5 . 1 9 . 1 0 . 0P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 0 . 0 0 . 4 4 . 4 9 . 1 1 7 . 4P h o s p h a t i d y l c h o l i n e 8 . 2 1 0 . 2 8 . 5 9 . 8 4 6 . 0P h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e 5 . 3 1 0 . 3 8 . 5 8 . 6 2 5 . 0P h o s p h a t i d y l g l y c e r o l 3 . 2 4 . 0 5 . 8 4 . 8 3 . 6D i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l 2 . 7 4 . 0 3 . 4 4 . 1 3 . 4N - a c y l p h o s p h a t i d y l e t h a n o l - 6 5 . 8 5 6 . 2 5 4 . 7 5 4 . 6 4 . 8a m i n e

T a b l e I V . S o y b e a n S e e d P h o s p h o l i p i d C o n i t e n t" C h i p p e w a 6 4 " " H a r o s o y 6 3 " " W ' l a y n e " " C l a r k 6 3 "Time a f t e rf l o w e r i n g P i l GLC2 P i GLC P i G LC P i GLC

d a y s pm l i p i d p h l o s p h l a t i d e l s e e d3 0 1 . 6 9 1 . 5 6 1 . 9 4 2 . 0 3 1 . 3 9 1 . 4 4 0 . 8 3 0 . 8 44 0 1 . 6 9 l -3 1 . 6 0 2.05 1 . 1 7 1 . . . 2 . 2 85 0 2 . 3 0 . . . 2 . 6 0 2 . 6 2 1 . 7 6 .. . 2 . 0 5 2 . 1 06 0 2 . 4 2 . . . 2 . 4 4 2 . 2 9 2 . 3 9 .. . 2 . 2 4M a t u r e 4 2 . 6 1 2 . 4 5 2 . 2 0 2 . 6 3 2 . 7 0 2 . 7 0 2 . 0 0 2 . 7 0

1 I n o r g a n i c p h o s p h o r u s d e t e r m i n a t i o n .2 Gas l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y d e t e r m i n a t i o n f r o m p o l a r l i p i df a t t y a c i d m e t h y l e s t e r s .3 Not a n a l y z e d .4 " C h i p p e w a 6 4 " , " H a r o s o y 6 3 " , " W a y n e " , a n d " C l a r k 6 3 " wered e t e r m i n e d m a t u r e a t 7 0 , 7 5 , 7 4 , a n d 8 0 DAF, r e s p e c t i v e l y .

7 4 6 P l a n t P h y s i o l . V o l . 5 4 , 1 9 7 4

8/6/2019 Lipids n Soybean

4/4

PHOSPHOLIPIDS IN SOYBEAN SEEDST a b l e V . I n c o r p o r a t i o n i o f A c e t a t e - 2 - 1 4 C b y D e ve l o p i n g " H a r o s o y6 3 " C o t y l e d o n t s ( 3 0 DAF) i n t o L i p i d C l a s s e s

R a d i o a c t i v i t y I n c o r p o r a t e d a t V a r i o u s T i m e sL i p i d C l a s s 5 1 5 3 0 6 0 1 2 0 2 4 0m i n m i n m i n m i n m i n mn

d p m X 10 2T o t a l p o l a r l i p i d 6 2 1 1 6 1 2 3 4 9 3 6 0 9 2 1 2 , 0 6 9 2 1 , 4 5 2M o n o g l y c e r i d e 9 1 7 4 5 8 1 2 9 4 2 4 6D i g l y c e r i d e 7 9 3 0 0 5 7 5 9 9 9 1 6 3 3 2 4 7 3F r e e s t e r o l 8 1 1 4 4 6 0 1 5 5 3 5 4Long c h a i n f a t t y a l c o - 6 1 4 3 6 9 4 2 0 4 6 6 6

h o lF r e e f a t t y a c i d 1 6 2 5 7 2 9 9 1 3 3 1 8 6E s t e r i f i e d s t e r o l g l u - 7 9 2 1 4 4 6 7 1 7 6c o s i d e IT r i g l y c e r i d e 3 5 1 1 7 2 9 7 7 7 1 2 2 1 9 6 7 7 4S t e r o l e s t e r 8 2 7 4 9 1 0 7 1 2 6 2 4 3H y d r o c a r b o n 4 2 1 4 1 3 0 4 5 3 9 1 1 4 4 2 1 6 8T a b l e V I . I n c o r p o r a t i o n t o f A c e t a t e - 2 - 1 4 C b y D e v e l o p i n i g " H a r o s o y6 3 " C o t y l e d o n i s ( 3 0 D AF ) i / i t o P o l a r L i p i d s

R a d i o a c t i v i t y I n c o r p o r a t e d a t V a r i o u s T i m e sP o l a r L i p i d 5 1 5 3 0 6 0 1 2 0 2 4 0m in min min m in m in m in

dpm X 1 0 O 2P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 6 3 1 5 0 4 1 6 2 2 0 7 1 3 1 2 3 8P h o s p h a t i d y l g l y c e r o l 1 8 4 7 1 0 3 1 5 4 3 8 2 4 6 6P h o s p h a t i d y l c h o l i n e 1 2 1 1 2 4 3 4 4 8 6 1 2 2 3 9D i g a l a c t o s y l d i g l y c e r i d e 4 3 1 7 4 5 3 7 1 1 5 1 4 9P h o s p h a t i d y l e t h a n o l - 9 1 7 3 3 7 2 2 4 4 5 2 7a m i n eP h o s p h a t i d i c a c i d 1 0 5 2 4 3 4 9 7 3 7 5 4 8 7 9 4 9D i p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l 1 9 4 9 8 1 6 5 1 4 0 2 1 6M o n o g a l a c t o s y l d i - 2 0 3 7 7 8 1 4 2 2 6 8 3 9 5g l y c e r i d eN - a c y l p h o s p h a t i d y l - 3 6 4 9 9 5 2 1 8 6 4 5 5 6 8 7 2 3 1 4 , 4 4 9e t h a n o l a m i n e

The t o t a l p o l a r l i p i d f r a c t i o n had a very h i g h i n c o r p or a t i onp e r c e n t a g e e v e n t h o u g h a s l i g h t d e c r e a s e o c c u r r e d w i t h t i m e( T a b l e V ) . Th e i n c o r p o r a t i o n o f " C i n t o t h e m o n o g l y c e r i d e ,f r e e s t e r o l , s t e r o l e s t e r , and e s t e r i f i e d s t e r o l g l u c o s i d e c l a s s e sremained s t a b l e and i n c o m b i n a t i o n , a c c o u n t e d f o r o n l y 2 . 8t o 3.9% o f t h e " C i n c o r p o r a t e d i n t h e t o t a l l i p i d s . T h e TGc l a s s d e m o n s t r a t e d a s l o w b u t s t e a d y i n c r e a s e w h i c h r e a c h e d19.5% a f t e r 4 h r o f i n c u b a t i o n . Th e d i g l y c e r i d e c l a s s d i s -p l a y e d a p e a k o f i n c o r p o r a t i o n b e t w e e n 1 5 a n d 3 0 m i n . D u r -i n g t h i s p e r i o d , t h e " C i n c o r p o r a t i o n i n t o d i g l y c e r i d e s wast w i c e a s g r e a t a s TG i n c o r p o r a t i o n . The f r e e f a t t y a c i d c l a s sg a v e a d e c r e a s i n g i n c o r p o r a t i o n t r e n d w h i c h was c o i n c i d e n t a li n m a g n i t u d e t o t h e i n c r e a s i n g t r e n d o f t h e l o n g c h a i n f a t t ya l c o h o l c l a s s . I n c o r p o r a t i o n l e v e l s o f " C f o r t h e h y d r o c a r b o nc l a s s s t a b i l i z e d a t a b o u t 6 . 9 % . D y b i n g a n d C r a i g ( 8 ) r e p o r t e dr a p i d i n c o r p o r a t i o n o f " C f r o m a c e t a t e i n t o f l a x e m b r y o

p h o s p h o l i p i d a n d 1 , 2 - d i g l y c e r i d e s ; TG w e r e r e p o r t e d t o b el a b e l e d m o r e s l o w l y .N P E w a s t h e p r e d o m i n a t e p o l a r l i p i d t o a c c u m u l a t e l a b e lf r o m " C - a c e t a t e i n c u b a t i o n s ( T a b l e V I ) . O v e r t h e 2 4 0 m i n o fi n c u b a t i o n , N P E c o n t a i n e d f r o m 6 1 . 6 % t o 7 6 . 4 % o f t h e l a b e li n t h e p o l a r l i p i d f r a c t i o n , a n d a b o u t 30% o f t h e t o t a l dpma d d e d . T h e o n l y o t h e r p o l a r l i p i d s t h a t c o n t a i n e d a s i z e a b l ea m o u n t o f t h e " C w e r e P A , P C , a n d P I . A f t e r 5 m i n , P Ac o n t a i n e d 1 7 . 7 % o f t h e l a b e l i n t h e p o l a r l i p i d s ; t h e a m o u n td e c r e a s e d t o 4 . 6 % a t 2 4 0 m i n . P C , h o w e v e r , s h o w e d a n i n -c r e a s e f r o m 2 . 1 t o 1 0 . 9 % o v e r t h e p e r i o d o f i n c u b a t i o n .D y b i n g a n d C r a i g ( 8 ) r e p o r t e d t h a t "C i n c o r p o r a t i o n f r o ma c e t a t e i n t h e p o l a r l i p i d s w a s l a r g e l y a s s o c i a t e d w i t h PC i nf l a x s e e d e m b r y o s a n d d i d n o t d e t e c t NPE. S i n g h a n d P r i v e t t( 1 5 ) d e m o n s t r a t e d a n i n c r e a s i n g r e l a t i o n i n t h e i n c o r p o r a t i o no f N a I , H K P O , b e t w e e n P A a n d N P E o f i m m a t u r e s o y b e a ns e e d s w h e r e NPE b e c a m e t h e m o s t h i gh l y l a b e l e d p h o s p h o l i p i da f t e r 2 4 h r .S i n g h a n d P r i v e t t ( 1 6 ) h a v e a l s o s u g g e s t e d t h a t N P E may b ei n v o l v e d i n l i p i d m e t a b o l i s m a s s o c i a t e d w it h m a t u r a t i on . F u r -t h e r m o r e , b e c a u s e p o l a r l i p i d s a r e i n v o l v e d i n TG b i o s y n -t h e s i s ( 9 ) , a n d b o t h f a t t y a c i d s ( 1 3 ) a n d N P E a r e h e a v i l yl a b e l e d f r o m a c e t a t e - 1 4 C i n c u b a t i o n s , N P E may p l a y a r o l e i nTG b i o s y n t h e s i s . S t u d i e s h a v e b e e e n i n i t i a t e d w h i c h d e a l w i t ht h e m e t a b o l i s m o f N P E i n t h e d e v e l o p i n g s e e d , a n d t h e c h a n g e si n p h o s p h o l i p i d d i s t r i b u t i o n b e t w e e e n 6 0 D A F a n d m a t u r i t y .LITERATURE CITED

1 . A N - E J A , R . , J . S . CHADHA, A N D J . A . K N A G G S . 1 9 6 9 . N - a c y l p h o s p h a t i d y l -e t h a n o l a m i n e : o c c u r r e n c e i n n a t u r e , s t r u c t u r e , a n d s t e r e o c h e m i s t r y . B i o -c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 3 6 : 4 0 1 - 4 0 6 .2 . B L I G H , E . G . AND W. J . DYER. 1 9 5 9 . A r a p i d method o f t o t a l l i p i d e x t r a c t i o nan d p u r i f i c a t i o n . C a n . J . B i o c h e m . P h ys i ol . 3 7 : 9 1 1 - 9 1 7 .3 . B O M S T E I N , R . A . 1 9 6 5 . A new c l a s s o f p h o s p h a t i d e s i s o l a t e d from s o f t w h e a tf l o u r . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 2 1 : 4 9 - 5 4 .

4 . C R A I G , R . M. AND N. L . MLRTY. 1 9 5 9 . Q u a n t i t a t i v e f a t t y a ci d a n a l y s i s o fv e g e t a b l e o i l s by g a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J . Amer. O i l C h e m . S o c .3 6 : 5 4 9 - 5 5 2 .5 . D A W S O N , R . M. C . , N . C L A R K E , AND R . H. Q U A R L E S . 1 9 6 9 . N - a c y l p h o s -p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e , a p h o s p h o l i p i d t h a t i s r a p i d l y m e t a b o l i z e d d u r i n gt h e e a r l y g e r m i n a t i o n o f p e a s e e d s . B i o c h e m . J . 1 1 4 : 2 6 5 - 2 7 0 .6 . D E LA ROCHE, I . A . , A N - D C . J . A N ' D R E W S . 1 9 7 3 . Changes i n p h o s p h o l i p i dc o m p o s i t i o n o f a w i n t e r w h e a t c u l t i v a r d u r i n g g e r mi n a t i o n a t 2 C and 2 4C . P l a n t P h y s i o l . 5 1 : 4 6 8 4 7 3 .7 . D I T T M I E R , J . C . A N ' D R. L . L E S T E R . 1 9 6 4 . A s i m p l e , s p e c i f i c s p r a y f o r t h ed e t e c t i o n o f p h o s p h o l i p i d s o n t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a m s . J . L i p i d R e s .5 : 1 2 6 - 1 2 7 .8 . D Y B I N G , C . D. A N - D B . A M . C R A I G . 1 9 6 9 . F a t t y a c id b io s yn t h e s is an d i n -c o r p o r a t i o n i n t o l i p i d c l a s s e s i n s e e ds and s e e d t i s s u e s o f f l a x . L i p i d s 5 :4 2 2 - 4 2 9 .

9 . KENNEDY, E . P . 1 9 6 1 . B i o s y n t h e s i s o f c o m p l e x l i p i d s . F e d . P r o c . 2 0 : 9 3 4 - 9 4 0 .1 0 . P A R K E R , F . A N D N . F . P E T E R S O N . 1 9 6 5 . Q u a n t i t a t i v e a n a l y s is o f phospho-l i p i d s a n d p h o s p h o l i p i d f a t t y a c i d s f r o m s i l i c a g e l t h i n - l a y e r c h r o m a t o -g r a m s . J . L i p i d . R e s . 6 : 4 55 -4 6 0.1 1 . P R I V E T T , 0 . S . , K . A . D O U G H E R T Y , W. L . ERDAHL, AND A . S T O L Y H W O . 1 9 7 3 .S t u d i e s o n t h e l i p i d c o m p o s i t i o n o f d e v e l o p i n g s o y be a n s . J . A m e r . O i lC h e m . S oc . 5 0: 5 1 6 - 5 2 0 .1 2 . R A N - D E R A T H , K . 1 9 6 6 . T h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y . I n : P r in c ip l es o f T h i n -L a y e r C h r o m a t o g r a p h y . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . p p . 7 - 2 0 .1 3 . R I N - N E , R . W. A N - D D . T . C A N v I N . 1 9 7 1 . F a t t y a c i d b i o s y n t h e s i s f r o ma c e t a t e a n d c a r b o n d i o x i d e i n t h e d e v e l o p i n g s o y b e a n c o t y l e d o n . P l a n tC e l l P h y s i o l . 1 2 : 3 8 7 - 3 9 3 .1 4 . R U B E L , A . , R . W. R I N ' N - E , A N D D . T . C A N V I N . 1 9 7 2 . P r o t e i n , o i l , and f a t t ya c i d i n d e v e l o p i n g s o y b e a n s e e d s . Crop S c i . 1 2 : 7 3 9 - 7 4 1 .1 5 . S I N G H , H . A N D 0 . S . P R I V E T T . 1 9 7 0 . I n c o r p o r a t i o n o f 3 3 P i n s o y b e a n p l i o s -p h a t i d e s . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 2 0 2 : 2 0 0 - 2 0 2 .1 6 . S I N G H , H . AN D 0 . S . P R I V E T T . 1 9 7 0 . S t u d i e s o n g l y c o l i p i d s an d p h o s -p h o l i p i d s o f i m m a t u r e s o y b e a n s . L i p i d s 5 : 6 9 2 - 6 9 7 .

7 4 7P l a n t P h y s i o l . V o l . 5 4 , 1 9 7 4