Laporan Praktikum Tanggal : 17 September – 5 November 2012Fisiologi Molekuler Waktu : 11.00 wib s.d selesai

PJP : Dr. Anja MeryandiniAsisten : Bu Dewi

ISOLASI BAKTERI PENGHASIL ENZIM SELULASE

MUTI DIANDA SARIP051114021

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGISEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR2012

METODOLOGI

Waktu dan Tempat

Praktikum ini telah dilaksanakan pada tanggal 17 September s/d 5 November

2012 di Laboratorium Bioteknologi Hewan jurusan Bioteknologi PAU Institut Pertanian

Bogor.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain tabung reaksi, ose,

pembakar Bunsen, rak tabung reaksi, cawan petri, tisu, mikropipet, pipet tip, botol kaca,

Erlenmeyer, oven, incubator, shaker water bath, sentrifuse, vortex mixer, laminar air

flow, spektofotometer, kelereng, seal dan autoklaf.

Sedangkan bahan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain sampel tanah

kering yang didapat dari depan perpustakaan IPB, aquades, CMC (Carboxymethyl

Cellulose), media agar CMC, pereaksi Bradford, garam fisiologis 0,85%, pereaksi DNC

(3,5-dinitrosalicilat acid), buffer fosfat pH 7, D-glukosa, congo red indicator 0,1%, NaCl

0,2%, alcohol 70%, dan spiritus.

Langkah Kerja

1. Isolasi Bakteri dari Tanah

Tanah ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dihaluskan dengan mortar dan

disuspensikan dengan larutan NaCl 10 ml 0,85%. Kemudian dilakukan pengenceran

dengan larutan garam fisiologis hingga 10-7.

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7

Pada pengenceran 10-4 10-5 10-6 10-7 masing-masing diambil sebanyak 1 ml dan

disebar kedalam petri yang berisi media CMC (Carboxymethyl Cellulose) padat

dengan batang penyebar/ose. Petri tersebut kemudian di seal dan di inkubasi

pada suhu ruang selama 48 jam. Setelah 48 jam bakteri yang tumbuh pada

media tersebut diidentifikasi dan diberi kode sesuai masing-masing kelompok.

2. Pembuatan Koloni Tunggal

Bakteri yang tumbuh dibuat koloni tunggal dengan cara membuat kuadran dan

diamati setelah 48 jam kemudian. Tahap yang dilakukan adalah dengan

mengambil satu ose koloni bakteri dan digoreskan berurutan berdasarkan nomor

yang telah ditentukan dari kuadran 1 hingga kuadran 4.

3. Pemurnian dan Peremajaan

Hasil dari kuadran berupa bakteri tunggal yang tumbuh diseleksi kemudian

ditanam kedalam tabung yang berisi media CMC agar miring dan diinkubasi

selama 48 jam. Peremajaan perlu dilakukan untuk membuat stok bakteri dan

agar bakteri dalam kondisi optimal ketika akan diproduksi enzim ekstra kasar.

Peremajaan bakteri dilakukan sebelum enzim ekstrak kasar akan diproduksi.

1

24

3

4. Uji Selulolitik

Masing-masing dari isolat bakteri diinokulasikan pada media CMC agar miring.

Masing-masing bakteri dititikkan pada permukaan media, kemudian diinkubasi

selama 72 jam. Koloni yang telah tumbuh kemudian diukur ukuran koloni

bakterinya lalu ditetesi indikator congo red 0.1 % dan didiamkan selama 15

menit, kemudian dibilas menggunakan NaCl 0,2 % sebanyak tiga kali. Zona

bening yang terbentuk di sekitar koloni bakteri mengindikasikan adanya aktivitas

enzim selulase. Kemudian indeks selulolitiknya diukur dengan cara

membandingkan antara diameter koloni dan diameter zona bening yang

terbentuk. Kemudian dipilih 7 bakteri dengan nilai index potensial tertinggi, 7

bakteri selulolitik ini selanjutnya yang akan digunakan untuk produksi enzim

selulase.

Indeks selulolitik = diameter zona bening – diameter koloni

5. Pembuatan Kurva Standar Glukosa

Larutan gula standart yang digunakan adalah deret glukosa dengan konsentrasi 0

mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,15 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,25 mg/mL, dan 0,3

mg/mL. Untuk membuat deret glukosa maka dibuat terlebih dahulu stok glukosa

sebesar 1 mg dalam aquades 1 mL dengan konsentrasi 1 mg/mL. Stok gukosa

diambil 0 mL (0 mg/mL), 0,1 mL (0,05 mg/mL), 0,2 mL (0,1 mg/mL), 0,3 mL (0,15

mg/mL), 0,4 mL (0,2 mg/mL), 0,5 mL (0,25 mg/mL ) dan 0,6 mL (0,3 mg/mL) dan

masing-masing larutan ditambahkan aquades hingga 2 ml. Setelah deret glukosa

tersebut jadi, langkah berikutnya ditambahkan 2 mL pereaksi DNS dan divortex

hingga homogen, kemudian dipanaskan pada suhu 100oC selama 15 menit.

Selanjutnya didinginkan dengan merendamnya kedalam air dingin. Pengukuran

absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang 540 nm.

6. Peremajaan Isolat Terseleksi

Isolat bakteri terpilih yang memiliki indeks potensial selulose tertinggi yang telah

diremajakan sebelumnya di pindahkan ke media padat CMC yang digoreskan

secara penuh ke cawan petri kecil di dalam laminar. Inkubasi 24 jam. Setelah itu

di pindahkan ke media CMC cair 20 ml dengan mengambil 3-6 cock borer dari

media padat CMC yang telah tumbuh.

7. Produksi Enzim Selulase

Isolat yang telah ditanam ke media cair CMC 20 ml di inokulasikan ke media cair

CMC 100 ml dan kemudian di uji aktivitasnya setiap hari selama 8 hari. Isolat

bakteri dimasukkan ke dalam 100 ml media cair CMC dan diinkubasi pada water

bath shaker selama 8x24 jam pada suhu 25oC . Setiap hari, media inokulum

diambil dan disentrifuge selama 20 menit dengan kecepatan 280 rpm untuk

memisahkan sel dengan ekstrak kasar enzim. 1 ml Ekstrak kasar enzim

dimasukan kedalam ependrof untuk ukur kadar protein pada hari ke 8, dan sisa

supernatant dimasukan kedalan tabung reaksi siap diukur aktivitas enzim

selulase untuk setiap harinya 8 tabung reaksi.

8. Penentuan Aktivitas Enzim Selulase

Substrat 1% CMC dimasukkan ke dalam 9 tabung reaksi masing-masing sebanyak

0,5 mL. Ekstrak kasar enzim dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi yang berisi 1%

CMC dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi, sampel,

kontrol dan blanko didinginkan ke dalam air dingin selanjutnya diukur

absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang 540 nm. Absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menentukan

kadar glukosa dengan rumus persamaan regresi linear yang diperoleh dari kurva

standar glukosa. Satu unit dari aktivitas selulase didefinisikan sebagai jumlah dari

enzim yang melepaskan satu µmol glukosa dalam satu menit pada kondisi

pengujian.

Aktivitas selulase (µmol/ menit) = kadar glukosa x Fp x 1000 BM Glukosa x t

Keterangan :

Fp = Faktor Pengenceran

BM (Berat Molekul) Glukosa = 180

T = Lamanya waktu inkubasi (60 menit)

9. Pengukuran Kadar Protein Enzim

Pengukuran kadar protein enzim dilakukan untuk mengetahui aktivitas spesifik

enzim selulase. Analisis protein enzim dilakukan dengan metode Bradford (1976)

dengan menggunakan standar Bovine Serum Albumine (BSA). Untuk pengukuran

sampel, enzim ekstrak kasar dimasukkan ke dalam tabung sebanyak 0,2 ml dan

pereaksi Bradford sebanyak 2 ml kemudian di vortex dan diinkubasi selama 5

menit pada suhu 25oC. Selanjutnya diukur absorbansi dengan menggunakan

spektofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Sedangkan untuk blanko 0,2

ml H2O steril ditambah dengan 2 ml Bradford kemudian divortex, diinkubasi

selama 5 menit pada suhu 25oC dan diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 595 nm.

10. Pembuatan Kurva Standar Protein

Pembuatan kurva standar protein menggunakan metode Bradford (1976).

Digunakan konsentrasi 0 mg/mL, 0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,08

mg/mL, dan 0,1 mg/ml. Masing-masing larutan diambil sebanyak 5 ml dan

ditambahkan 0,01 gr pereaksi Bradford Divortex hingga homogen, kemudian

diinkubasi pada suhu 25oC selama 15 menit. Selanjutnya dilakukan pengukuran

absorbansi dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang 595 nm.

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Selulolitik merupakan aktivitas bakteri dalam perombakan selulosa dengan

bantuan enzim selulase. Enzim selulolitik dibentuk oleh sebagian besar mikroorganisme.

Selulosa merupakan senyawa paling melimpah di dunia dan merupakan sumber daya

alam terbarukan sehingga menjadikannya sebagai bahan mentah potensial sebagai

makanan, bahan bakar, dan senyawa kimia. Beragam bakteri, actinomycetes dan fungi

filamentous dapat memproduksi selulase ekstraselular ketika ditumbuhkan pada

substrat mengandung selulosa. Komponen dari sistem selulase pertama diklasifikasikan

berdasarkan pada model aksi katalitiknya dan saat sekarang diklasifikasikan berdasarkan

sifat strukturalnya. Tiga tipe utama dari aktivitas enzimatik yang ditemukan; (1)

Endoglucanase atau 1,4-B-D-glucanase, termasuk 1,4-B-D-glucan-4-glucano-hydrolase

(EC 3.2.1.4), (2) exoglucanase, termasuk 1,4-B-D-glucan glucanohydrolase (juga dikenal

sebagai cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) dan 1,4-B-D-glucan cellobiohydrolase)

(cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), dan (3) B-glucosidase atau B-glucosida glucohydrolase

(EC. 3.2.1.21) (Sa’adah, 2010).

Enzim selulase yang dihasilkan pada praktikum ini diisolasi dari bakteri tanah.

Tanah yang digunakan berasal dari tanah yang diambil dari daerah depan perpustakaan

IPB. Tanah tersebut ditimbang sebanyak ± 1 gram dimasukkan ke dalam larutan

fisiologis 0,85% (NaCl), dihomogenkan kemudian dilakukan pengenceran hingga 10-7.

Fungsi garam fisiologis disini adalah untuk menjaga tonisitas sel dan juga berfungsi

sebagai pemurnian yang artinya hanya mikroorganisme yang mampu hidup pada

konsentrasi garam sebesar 0,85%. Tujuan pengenceran hingga 10-7 yaitu memperkecil

atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Pada tahap isolasi

digunakan CMC sebagai media seleksi pertumbuhan mikroorganisme yang mempunyai

kemampuan selulolitik. CMC merupakan eter polimer selulosa linear dan berupa

senyawa anion yang memiliki sifat higrokopis dan biodegradable, mudah larut dalam air

dan membentuk larutan koloid. Dalam praktikum ini, semua isolat ditumbuhkan pada

media CMC padat yang mengandung CMC 1% (b/v) yang berfungsi sebagai komponen

induser enzim selulase serta glukosa 0,1% (b/v) dan yeast ekstrak 0,2% (b/v) sebagai

komponen pemacu tumbuh sel di fase awal. Setelah glukosa pada medium tumbuhnya

habis maka bakteri akan memanfaatkan sumber karbon dari selulosa dengan

mensintesis enzim selulase.

Tabel 1. Indeks Selulolitik

Kelompok 1 Ф Bakteri (x) Ф Bakteri + Zona Bening (y)

NIP = y−xx

2 0,95 1,4 0,47

4 0,65 - -

6t 0,95 - -

6y 0,4 0,45 0,13

Pengujian kualitatif berdasarkan zona bening berfungsi untuk mendeteksi bisa

atau tidaknya bakteri yang diisolasi menghasilkan enzim selulase. Indikasinya adalah jika

pada koloni bakteri terbentuk zona bening artinya bakteari tersebut mampu

menguraikan selulosa menjadi glukosa dengan bantuan enzim selulase. Pada tabel

diatas hanya pada nomor 2 dan 6y yang memiliki nilai indeks potensial selulolitik yaitu

0,47 dan 0,13. Tetapi karena pada kelompok 1 bakteri yang dihasilkan masih dianggap

kurang potensial maka kelompok ini menggunakan bakteri dari kelompok 2 dengan

kode 2.3. Nilai indeks potensial bakteri diperoleh dari nisbah antara diameter zona

jernih dengan diameter koloni. Congo red yang digunakan pada uji selulolitik akan

mengikat pada ikatan 1,4-β glikosida di dalam selulosa sehingga menimbulkan warna

merah, sedangkan warna bening yang timbul disekitar koloni bakteri mengindikasikan

bahwa selulosa sudah terurai menjadi monosakaridanya. Karena ikatan 1,4-β

glikosidanya sudah dilepaskan oleh enzim selulase yang dihasilkan bekteri tersebut

maka congo red tidak dapat mengikat glukosa, darisinilah terbentuk zona bening.

Berdasarkan nilai indeks potensial yang tertinggi maka bakteri tersebut

digunakan untuk melakukan uji aktivitas enzim selulase selanjutnya. Pengukuran

aktivitas enzim dilakukan dengan assay enzim selulase setiap hari selama 8 hari untuk

mengetahui aktivitas optimum dan waktu terbaik dalam produksi enzim selulasenya. Uji

aktivitas enzim selulase dilakukan berdasarkan kadar glukosa. Kadar glukosa diukur

dengan menggunakan metode DNS. Fungsi pemberian DNS yaitu sebagai pewarnaan

untuk menentukan panjang gelombang serta untuk mengoksidasi glukosa yang

terbentuk. Pada penentuan kadar glukosa juga digunakan blanko, larutan blanko ini

digunakan sebagai kalibrasi sebagai larutan pembanding dalam analisis fotometri.

Menurut Lesmana (2011), larutan blanko dibagi menjadi 3 jenis yaitu Kalibrasi blanko

dimana larutan yang digunakan untuk membuat titik nol konsentrasi dari grafik kalibrasi,

larutan ini hanya berisi pengencer yang digunakan untuk membuat larutan sendiri;

kemudian, reagen blanko yaitu larutan yang berisi reagen yang digunakan untuk

melarutkan sampel, pembacaan absorbansi untuk larutan ini biasanya dikurangi dari

pembacaan sampel; Metode blanko yaitu larutan yang diperlakukan sama dengan

sample ditambah dengan reagen yang sama, mengalami kontak dengan alat yang sama

dan diperlakukan dengn prosedur yang sama.

Tabel 2. Aktivitas Harian Selulase, Kadar protein dan Aktivitas Spesifik Isolat Bakteri Selulolitik K1

Kode Isolat

Waktu Produksi (24

jam)

Aktivitas Selulase (nkat)

Protein (mg/mL)

Aktivitas Spesifik

(nkat/mg)K1 1

-0.0042853 0.253 -0.016942

0.01485581 0.267 0.055643

-0.0117132 0.274 -0.042754

0.00342826 0.236 0.0145275

-0.0108562 0.244 -0.044496 0.00599946 0.240 0.024998

7-0.0017141 0.251 -0.00683

80.00228551 0.251 0.009106

Berdasarkan dari tabel diatas menunjukkan bahwa aktivitas enzim selulosa yang

dimiliki isolat bakteri seluloloitik K1 berbeda-beda setiap waktu inkubasi selama 8

hari. Untuk lebih jelasnya aktivitas selulase harian dapat dilihat pada grafik dibawah

ini :

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

-0.0008

-0.0006

-0.0004

-0.0002

0

0.0002

0.0004

0.0006

0.0008

0.001

1, -0,00428530

2, 0,01485581

3, -0,01171320

4, 0,00342826

5, -0.01085620

6, 0,00599946

7, -0,00171410

8, 0,0228551

Grafik Aktivitas Selulase Harian

Hari Ke-

Aktiv

itas S

elul

ase

(nka

t)

y = 2E-06x - 2E-05R² = 9E-05

Grafik Aktivitas Enzim Selulase Isolat Bakteri Selulolitik K1 yang Diuji pada Substrat CMC Suhu 25oC, pH 7.

Berdasarkan grafik aktivitas selulase harian diatas puncak aktivitas dan waktu

yang optimum untuk produksi enzim selulase isolate K1 adalah pada hari ke-2 dengan

aktivitas 0,01485581 nkat. Pada hari ke-3, aktivitas selulase menurun hingga -0,0

1171320 nkat dan kemudian meningkat lagi pada hari ke-4 0,00342826 nkat. Namun

setelah hari ke-5 aktivitas selulase mengalami penurunan menjadi -0,01085620 nkat,

tetapi aktivitas selulase tersebut naik pada hari ke-6 0,00599946 nkat, mengalami

penurunan kembali pada hari ke-7 menjadi -0,00171410 nkat dan naik pada hari ke-8

menjadi 0,0228551 nkat. Nilai aktivitas enzim berkaitan dengan proses pendegradasian

substrat sebagai nutrisi bagi mikrofungi. Setiap mikrofungi memiliki kemampuan yang

berbeda dalam mendekomposisi substrat. Jika mikrofungi menempel pada substrat,

maka mikrofungi tersebut akan mengeluarkan enzim spesifik (Moore-landecker, 1996).

Nilai yang negative mengindikasikan bahwa tidak adanya aktivitas enzim tersebut. Hal

tersebut juga dapat disebabkan oleh faktor-faktor seperti aktivitasnya terlalu kecil dan

sensitivitas alat kurang tinggi sehingga aktivitasnya tidak terbaca. Aktivitas enzim

selulase yang meningkat berkaitan dengan fase pertumbuhan sebelumnya. Bakteri

tersebut mengalami fase pertumbuhan dimana bakteri tersebut memanfaatkan substrat

yang tersedia sebagai media pertumbuhannya. Substrat yang digunakan sebagai media

pertumbuhan bakteri adalah CMC (Carboximethyl Cellulose). Bakteri tersebut dapat

memecah selulosa menjadi glukosa didalam substrat dengan bantuan enzim selulase.

Pada fase logaritmik terjadi aktivitas enzim optimum dimana bakteri dapat membelah

dengan cepat dan konstan. Hal ini juga dipengaruhi pH, suhu, kelembaban udara,

kandungan nutrient dan juga kondisi lingkungannya. Pembelahan tersebut dapat

berlangsung terus hingga hasil metabolisme menghasilkan racun dan menyebabkan

pertumbuhannya melambat, kemudian masuk ke fase statis. Fase statis adalah jumlah

sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Setelah fase statis maka akan

masuk ke fase eksponensial yaitu fase kematian.

Selain menentukan aktivitas enzim selulase, kadar protein yang terkandung

dalam isolate juga perlu untuk diukur dan diketahui karena enzim merupakan protein

yang perlu diketahui berapa besar protein terlarutnya. Pengukuran kadar protein

menggunakan metode Bradford dimana didasarkan pada pengikatan secara langsung

zat warna Coomassine Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein yang memiliki residu

asam amino dengan rantai samping aromatik (Tyrosine, Tryptophan dan Phenylalanine)

atau yang bersifat basa (Arginine, Histidine dan Leucine). Reagen CBBG bebas berwarna

merah kecoklatan dengan panjang gelombang maksimal 465 nm. Suasana asam reagen

CBBG berada dalam bentuk anion yang mengikat protein yang membentuk warna biru

dengan panjang gelombang maksimal 595 nm. Jumlah CBBG yang terikat pada protein

proposional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein (Azhari dkk, 2010).

Protein yang terlarut dalam media produksi perlu diukur untuk mengetahui jumlah

protein enzim yang disintesis oleh mikroba dan untuk menghitung aktivitas spesifik

enzim. Namun protein terlarut yang terukur tidak mutlak mencerminkan bahwa yang

terukur semuanya enzim yang disintesis oleh mikroorganisme, karena di dalam media

juga mengandung protein terlarut berupa sisa media (yeast ekstrak) atau hasil

metabolisme protein mikroorganisme yang disekresikan. Selain itu tidak semua protein

enzim adalah kelompok dari selulase.

Untuk lebih jelasnya kadar protein yang terkandung dalam isolate tersebut dapat dilihat

pada grafik dibawah ini :

0 1 2 3 4 5 6 7 8 90.21

0.22

0.23

0.24

0.25

0.26

0.27

0.28

0.253

0.2670.274

0.236

0.244

0.24

0.2510.251

Grafik Kadar Protein

Hari Ke-

Kada

r Pro

tein

(mg/

ml)

Grafik Protein Terlarut dalam Enzim Ekstrak Kasar Isolat Bakteri Selulolitik K1

Beradasarkan grafik diatas yang menunjukan hasil analisis protein terlarut

diperoleh bahwa mulai dari produksi enzim ekstrak kasar isolate bakteri selulolitik

terjadi peningkatan dan penurunan dari hari pertama hingga hari ke delapan. Aktivitas

optimum kadar protein yang dihasilkan terjadi pada hari ketiga dengan jumlah hingga

0,274 mg/ml. Tetapi, pada hari keempat terjadi penurunan menjadi 0,236 mg/ml yang

juga merupakan produksi protein terlarut yang terendah pada aktivitas kadar protein

y = -0.002x + 0.262R² = 0.178

ini, dan terjadi peningkatan dan penurunan hingga hari ketujuh dan stagnan hingga hari

kedelapan. Analisis kadar protein ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi protein

terlarut pada enzim ekstrak kasar sehingga aktivitas enzim spesifik dari enzim selulosa

terhadap kadar protein terlarut dapat diketahui, sehingga besarnya aktivitas enzim

dalam protein pun dapat diketahui. Protein merupakan zat makanan yang sangat

penting bagi tubuh karena zat ini selain berfungsi sebagai bahan bakar dalam tubuh juga

berfungsi sebagai zat pembangun dan pengatur. Fungsi utama protein bagi tubuh ialah

untuk membentuk jaringan baru dan mempertahankan jaringan yang telah ada

(Winarno, 1997). Analisis kadar protein pada praktikum ini menggunakan metode

Bradford yang menggunakan standard Bovine Serum Albumine (BSA). Albumin sendiri

merupakan salah satu jenis protein globuler yang larut dalam air dan terkogulasi oleh

panas (Winarno, 1989). Fungsi dari larutan BSA sendiri adalah untuk mengetahui kadar

protein. Larutan blanko yang dibuat berfungsi sebagai kalibrasi angka dari hasil

pengukuran oleh spektofotometer dengan panjang gelombang tertentu (OD terpilih).

Untuk memperjelas dan mengetahui hubungan antara konsentrasi BSA dan

absorbannya maka dibuatlah kurva standard (Sudarmadji, 1996).

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.120

0.050.1

0.150.2

0.250.3

f(x) = 2.40214285714286 x + 0.0246428571428572R² = 0.955394095442525

Kurva Standar BSA

Konsentrasi (mg/ml)

Abso

rban

si

Grafik Kurva Standar hubungan antara Konsentrasi BSA dan absorbannya.

Gambar dibawah ini menunjukkan aktivitas enzim selulase dari isolate bakteri

selulolitik terhadap waktu produksi yang menunjukkan pola kuadratik dengan

persamaan y = 2E-0,5x-0,000 dengan R2 = 4E-0,5.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

-0.06

-0.04

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

-0.01694

0.05564

-0.04275

0.014527

-0.04449

0.024998

-0.00683

0.009106

Aktivitas Spesisik Enzim

Hari Ke-

Aktiv

itas S

pesifi

k (n

kat/

mg)

y = 0.000x - 0.001R² = 0.000

Grafik Aktivitas Enzim Spesifik Selulase Isolat Bakteri Selulolitik

Berdasarkan grafik diatas puncak aktivitas spesifik terjadi pada hari kedua

dengan jumlah 0,05564 nkat/mg dan aktivitas terendah terjadi pada hari ketiga sebesar

-0,04275 nkat/mg. Pada grafik tersebut dapat dilihat bahwa lamanya waktu fermentasi

dapat mempengaruhi aktivitas enzim spesifik yaitu memiliki kecendrungan meningkat

dan menurun pada hari-hari tertentu. Menurut Hans (2011), aktivitas spesifik

memberikan pengukuran aktivitas enzim yang merupakan jumlah waktu tertentu dalam

kondisi tertentu per milligram total protein. Aktivitas tertentu adalah sama dengan laju

reaksi dikalikan dengan volume reaksi dibagi dengan massa total protein.

DAFTAR PUSTAKA

Azhari, A. Mentaya, I. dan Gayang, F. 2010. Penentuan Kadar Protein dengan Metode Bradford. Laporan praktikum. IPB. Bogor.

Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of icrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

Hans, Otto. 2011. Assays Enzim. http://hansottopratamayohan.blogspot.com/2011/08/asayz-enzim.html?m=1

Lesmana, Indra. 2011. FUNGSI LARUTAN BLANKO. http://indralesman.blogspot.com/2011/03/fungsi-larutan-blanko.html?m=1

Moore-Landecker, E. 1996. Fundamentals of the Fungi. Prentice Hall. Upper Saddle River. New Jersey. 574 pp.

Sa’adah, Z. Ika,N. dan Abdullah. 2010. Produksi Enzim Selulase oleh Aspergillus niger Menggunakan Substrat Jerami dengan Sistem Fermentasi Padat. http://eprints.undip.ac.id/13064/1/BAB_I_-_V.pdf

Sudarmadji, S., Bambang Haryono dan Suhadi. 1996. Analisa Bahan Makan dan Pertanian. Liberty. Yogyakarta.

Winarno. 1989. Kimia Pangan dan Gizi. Cetakan keempat. PT. Gramedia. Jakarta

Winarno. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Cetakan kedelapan. PT. Gramdia. Jakarta

LAMPIRAN

Pembuatan larutan yang digunakan :

1. Larutan pereaksi DNS

Pembuatan larutan pereaksi DNS dilakukan dengan cara melarutkan 10 gr NaOH,

182 gr KNa-Tartat, 10 gr DNS, dan 10 gr Na2SO3 kedalam 1000 mL aquades. Simpan

dalam botol yang berwarna gelap (Miller, 1959).

2. Larutan pereaksi Bradford

Pembuatan larutan pereaksi bradford dilakukan dengan cara melarutkan 0,05 g

Commassie Briant Blue G-250, 25 mL Etanol 95% (v/v), 50 mL Asam Phospor 85%

(v/v) ke dalam 500 mL aquades. Campuran dihomogenkan lalu disaring dengan

kertas saring dan disimpan dalam botol yang berwarna gelap dengan suhu 4oC

(Miller, 1959).

3. Substrat 1 %CMC

Pembuatan substrat dilakukan dengan cara 1 gram CMC dilarutkan kedalam 100 mL

buffer phospat pH 7. Kemudian diaduk dan dipanaskan dengan menggunakan

magnetic stirrer hingga homogen.

4. Garam fisiologis

Garam fisiologis dibuat dengan cara melarutkan 0,85 gram NaCl ke dalam 100 mL

aquades.

5. 0,1 % Congo red

Pembuatan congo red dilakukan dengan cara 0,1 gram congo red dilarutkan ke

dalam 100 mL etanol 96%.

6. 2% NaCl

Garam fisiologis dibuat dengan cara melarutkan 2 gram NaCl ke dalam 100 mL

aquades.

7. Kurva Standar GlukosaPengukuran kadar glukosa dalam berbagai konsentrasi

Konsentrasi (mg/ml)

OD 1 OD 2 Rata2 OD Terkoreksi

0.000 0.116 0.117 0.117 0.000

0.050 0.163 0.161 0.162 0.046

0.100 0.293 0.295 0.294 0.178

0.150 0.437 0.439 0.438 0.322

0.200 0.578 0.578 0.578 0.462

0.250 0.746 0.745 0.746 0.629

0.300 0.895 0.892 0.894 0.777

0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.3500.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.900

f(x) = 2.70142857142857 x − 0.0606428571428571R² = 0.985826344880328

Grafik Standar Glukosa

Konsentrasi (mg/ml)

Abso

rban

si

Grafik Standar Glukosa

8. Kurva Standar BSAAbsorbansi Protein Pada Berbagai Konsentrasi

Konsentrasi

(mg/ml) OD 1 OD 2 Rata-rata

OD

Terkoreksi

0 0.311 0.306 0.3085 0

0.02 0.394 0.398 0.396 0.0875

0.04 0.491 0.479 0.485 0.1765

0.06 0.496 0.513 0.5045 0.196

0.08 0.483 0.475 0.479 0.1705

0.1 0.52 0.541 0.5305 0.222

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.120

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

f(x) = 2.40214285714286 x + 0.0246428571428571R² = 0.955394095442525

Grafik Standar BSA

Konsentrasi (mg/ml)

Abso

rban

si

Grafik Standar BSA