Introduc)on  to  Sta)s)cal  Gene)cs:  emphasis  on  Gene)c  Associa)on  Studies  

Lisa  J.  Strug,  PhD    Guest  Lecturer  

Biosta)s)cs  Laboratory  Course  (CHL5207/8)  March  5,  2015  

Gene Mapping in the News Study Finds Gene Associated With Prostate Cancer

Study identifies second gene associated with specific congenital heart defects

Unique Study Identifies Gene Associated With Anxiety Phenotypes!

Discovery of a gene associated with a leukemia mostly affecting children

North American Group IDs Loci Influencing Cystic Fibrosis Lung Disease Severity May 23, 2011

A, C, T, G A, C, T, G

M2 M1 haplotype

SNP

Disease-causing variant

Gene)c  Associa)on  Studies  Aim  to  detect  associa)on  between  one  or  more  gene)c  

polymorphisms  and  a  trait  –  A  trait  may  be  some  quan)ta)ve  characteris)c,  a  discrete  aPribute  or  

disease  

•  In  case-­‐control  studies  for  gene)c  associa)on  we  ascertain  unrelated  cases  on  the  basis  of  a  discrete,  dichotomous  trait,  and  unrelated  controls  without  the  trait  who  are  ascertained  from  the  same  popula)on  as  the  cases  to  avoid  poten)al  confounders  (e.g.  ethnicity)  

Measures  of  Associa)on  •  In  epidemiology,  associa)on  between  disease  and  ae)ological  

factors  are  usually  expressed  in  terms  of  rela%ve  risk  measures  i.e.  

Disease  risk/odds  in  exposed  subjects    Disease  risk/odds  in  unexposed  subjects  

•  In  gene)c  epidemiology,  rela)ve  risks/ORs  can  be  defined  for    –  Alleles    –  Genotypes    –  Haplotypes  

   

Mul)plica)ve  Model  for  Risk  •  Allelic  rela)ve  risks  ϕA ϕa are  defined  by  the  mul%plica%ve  

model:  θi/j =ϕi ϕj

where  one  allele  is  taken  as  reference.  •  In  the  diallelic  case  using  a  as  reference  so  that  ϕa=1:  

θA/A =(ϕA)2 , θA/a =(ϕA  )(1)            where  θA/A is the genotypic relative risk

i.e. θA/A =risk for A/A genotype   risk for a/a genotype

Hardy-­‐Weinberg  Equilibrium  

•  If  the  rela)ve  frequency  of  alleles  i,  j  are  fi,  fj    ,  the  rela)ve  frequency  of  genotype  i/j  under  H-­‐W  equilibrium  is    

2fi  fj  if  i≠j  and  (fi)2  if  i=j  •  The  HWE  assump)on  implies  that  each  subject’s  two  

chromosomes    are  sampled  independently  from  the  popula)on  –  A  sample  of  N  independent  subjects  can  be  viewed  as  a  sample  of  2N  

independent  chromosomes  

•  Example:    SNP  marker  with  alleles  A,  a.    Allele  frequency  of  A=0.3.    What  are  the  three  possible  genotypes  at  this  locus  and  their  frequencies  under  HWE?  

HWE  Example    

•  Example:    SNP  marker  with  alleles  A,  a.    Allele  frequency  of  A  is  pA=0.3.    What  are  the  three  possible  genotypes  at  this  locus  and  their  frequencies  under  HWE?  

     Genotypes:      freq(A)=pA                ,  freq(a)=pa  =1-­‐pA              

Allele  Coun)ng  and  the  2x2  table  •  Assuming  the  mul)plica)ve  risk  model,  HWE  in  the  

popula)on,  and  a  rare  disease,  we  can  count  alleles  in  cases  and  controls  to  assess  associa)on  

•  For  a  diallelic  locus:  

•  Test  for  associa)on  using  conven)onal  Χ2  test,  1  df  •  The  allelic  rela)ve  risk  (A  vs.  a)  is  es)mated  by  the  odds  ra)o  

   

Allele   Cases   Controls  

A   DA   HA  

a   Da   Ha  

€

DA /Da

HA /Ha

=DAHa

DaHA

Example:  the  Pro871Leu  SNP  in  BrCa1    

•  Assume  HWE  in  the  popula)on  under  study  (and  hence  in  the  controls)  and  that  the  mul)plica)ve  risk  model  holds,  then  can  treat  chromosomes  as  independent  

•  Therefore  the  es)mated  allelic  OR  is      

•  And  the  mul)plica)ve  model  implies  an  es)mated  OR  for  Leu/Leu  is    

Genotype   Cases   Controls  

Leu/Leu   89   56  

Leu/Pro   369   250  

Pro/Pro   342   266  

Total   800   572  

Subjects

Allele   Cases   Controls  

Leu   547   362  

Pro   1053   782  

Total   1600   1144  

Chromosomes

€

ˆ φ LEU =547 × 782

1053× 362=1.122

€

ˆ θ LEU /LEU = ( ˆ φ LEU )2 = (1.122)2 =1.259

Instead  of  a  Mul)plica)ve  model  of  risk:    

•  Such  tests  are  more  reasonable  for  a  func%onal  variant  •  Associa)ons  with  non-­‐causal  linked  markers  tend  to  give  

alterna)ves  in  which  heterozygotes  have  intermediate  risk;  so  mul)plica)ve  models  might  be  preferable  

Dominant

Genotype   Cases   Controls  

Leu/Leu   89   56  

Pro/*   711   516  

Total   800   572  

Recessive

Genotype   Cases   Controls  

Leu/*   458   306  

Pro/Pro   342   266  

Total   800   572  

Genotype   Cases   Controls  

Leu/Leu   89   56  

Leu/Pro   369   250  

Pro/Pro   342   266  

Total   800   572  

Mul)plica)ve  model  at  the  subject  level  

•  Also  called  the  addi%ve  model  •  1-­‐df  test  where  the  A/a  risk  is  intermediate  between  A/A  and  a/

a  risks  •  Can  be  fit  using  logis)c  regression  with    

         log  odds(case)=  α+xβ,      where  the  risk  factor  x=  number  of  (minor)  alleles  =  0,1,2  

       •  Log  ORA/a  =  β  =>  ORA/a  =eβ=  ϕ •  Log  ORA/A  =  2β  =>  ORA/A  =e2β=  ϕ2

Genotype   x   Log  Odds(case)  =α+βx  

a/a   0   α  

A/a   1   α+β  

A/A   2   α+2β  

Mul)plica)ve  model,  cont’d  

•  In  logis)c  regression,  the  score  test  for  β=0  is  the  Cochran-­‐Armitage  test  for  trend  in  propor)ons    –  This  test  is  preferable  to  allele  coun)ng  since  it  avoids  the  need  to  

assume  HW  equilibrium  

Genotypic  Tests:  3x2  Table  (2  df)  

•  Taking  the  Pro/Pro  as  a  reference  group,  calculate  

•  Compare  these  es)mates  to  those  predicted  by  the  mul)plica)ve  model  fit  to  the  alleles  table    

Genotype   Cases   Controls  

Leu/Leu   89   56  

Leu/Pro   369   250  

Pro/Pro   342   266  

Total   800   572  

€

O ˆ R Leu / Leu,O ˆ R Leu / Pr o

Reasons  for  Gene)c  Associa)on  1.  The  locus/polymorphism  is  a  func%onal  variant.    That  is,  the  

associa)on  is  causal:  Func%onal  variant  è  Disease  

2.  The  locus  is  in  linkage  disequilibrium  with  a  func)onal  variant;  that  is  the  polymorphism  has  no  causal  role  but  is  associated  with  a  nearby  causal  variant  

marker  locus  è  Func%onal  variant  è  Disease  

3.  The  associa%on  is  due  to  confounding  by  popula%on    stra%fica%on;  ie  some  underlying  stra)fica)on  or  admixture    in  the  popula)on    

Popula)on  stra)fica)on  -­‐>  can  result  in  spurious  associa)on  results  as  a  result  of  a  systema)c  difference  in  allele  and  disease  frequencies  between  sub-­‐popula)ons  in  a  popula)on,  possible  due  to  ancestry  

 

Direct  Associa)on  

•  Studies  of  direct  associa)on  target  polymorphisms  which  are  puta)ve  causal  variants  eg.  a  muta)on  leading  to  an  amino  acid  change  

•  However,  many  causal  variants  will  likely  be  non-­‐coding  and  affect  things  such  as  gene  regula)on,  expression  or  differen)al  splicing  –  >70%  of  variants  iden)fied  as  associated  in  GWAS  are  intergenic  

Indirect  Associa)on  •  The  polymorphism  is  a  surrogate  for  the  causal  locus,  allowing  

us  to  search  for  causal  genes  in  indirect  way    

•  However,  indirect  associa)ons  are  even  weaker  than  direct  associa)ons,  and  typing  many  surrounding  markers  are  required  to  detect  the  associa)on  

•  Cannot  be  a  defini)ve  nega)ve  result,  in  contrast  with  direct  associa)on  studies  (ie.  hard  to  rule  out  a  gene)  

•  This  approach  used  for  candidate  gene  studies  and  for  genome-­‐wide  associa)on  studies  

Confounded  Associa)on  

•  Associa)on  due  to  confounding  by  stra)fica)on  and  admixture  within  the  popula)on  

•  Can  result  in  spurious  findings  (posi)ve  confounding)  or  obscure  true  associa)ons  (nega)ve  confounding)  

•  Gene)c  epidemiology  offers  possibili)es  to  overcome  this  problem  e.g.  adjustment  for  popula)on  stra)fica)on  using  principal  component  analysis  or  other  methods  

Linkage  Disequilibrium  and  Indirect  Associa)ons  

•  mapping  genes  indirectly  depends  on  the  existence  of  associa)on  at  the  popula)on  level  (or  linkage  disequilibrium),  between  causal  variants  and  nearby  markers  

•  Consider  2  loci  –  Locus  1  has  alleles  A,  a  with  frequencies  pA  and  pa,  and  locus  2  has  

alleles  B,  b  with  frequencies  pB  and  pb      in  the  popula)on  –  How  many  possible  haplotypes  are  there  for  the  2  loci?  

Linkage  Disequilibrium  (LD)  

•  Two  loci  are  said  to  be  in  LD  if  their  respec)ve  alleles  do  not  associate  independently  

•  Suppose  that  the  frequency  of  our  4  haplotypes  pAB  ,  pAb  ,  paB  ,  pab        in  the  popula)on  are  0.4,  0.1,  0.2  and  0.3,  where  pA  =  0.8,  pB      =  0.4  ,  are  A  and  B  in  LE?  

•  If  not,  which  alleles  on  the  two  loci  occur  together  on  haplotypes  more  onen  than  would  be  expected  under  LE?  

     

Measures  of  LD  

•  One  measure  of  LD  for  our  two  biallelic  loci  is    DAB=pAB  -­‐  pApB    

•   Similarly,  DAb=-­‐  DAB        and  Dab  =  DAB  

•  LD  is  a  property  of  2  loci,  not  their  alleles  •  Thus  the  magnitude  of  D  is  important  not  the  sign  •  The  magnitude  of  D  does  not  depend  on  the  choice  of  alleles  •  The  range  of  values  that  D  can  take  on  varies  with  allele  

frequency  but      

€

max(−pA pB ,−pa pb ) ≤ DAB ≤min(pa pB , pA pb )

Example  

•  What  is  the  theore)cal  range  of  DAB  when  pA=1/2  and  pB=  1/3?  

Reminder:      

€

max(−pA pB ,−pa pb ) ≤ DAB ≤min(pa pB , pA pb )

Normalized  D  or  D’  

•  The  possible  values  of  D  depend  on  allele  frequencies,  making  D  difficult  to  interpret  

•  For  repor)ng  purposes,  the  normalized  D’  is  onen  used  

•  D’  can  then  be  es)mated  from  the  sample  frequencies  

€

DAB' =

DAB

max(−pA pB ,−pa pb ),DAB < 0

DAB

min(pa pB , pA pb ),DAB > 0

#

$ % %

& % %

'

( % %

) % %

Measuring  LD  with  r2  

€

rAB =DAB

pA pa pB pbWhich is the correlation between 2 random variables

•  It is usually more common to consider rAB squared

€

rAB2 =

DAB2

pA pa pB pb•  r2 has the same value regardless of how the alleles are labeled

D’  and  r2  

•  When  D’=1,  referred  to  as  Complete  LD  –  In  this  case  there  are  at  most  3  of  the  4  possible  haplotypes  present  in  the  popula)on  

– The  intui)on  here  is  that  the  2  loci  are  not  being  separated  by  a  recombina)on  in  this  popula)on  

•  When    r2=1,  referred  to  as  Perfect  LD  – occurs  when  there  are  exactly  2  of  the  4  possible    haplotypes  present  in  the  popula)on,  and  as  a  result  the  two  loci  have  the  same  allele  frequencies    

•  Loci  that  are  in  perfect  LD  are  necessarily  in  complete  LD  

D’  and  r2  

•  It  is  possible  for  D’  to  be  1  and  for  r2  to  be  small  

•  r2  =1  implies  that  the  two  loci  carry  the  same  informa)on  whereas  D’  is  derived  from  popula)on  gene)cs  considera)on        

   •  For  this  and  other  reasons,  it  is  onen  useful  to  report  both  D’  and  r2  

LD  and  Haplotype  Blocks  •  The  genome  falls  into  LD  “blocks,”  with  liPle  haplotype  diversity  

within  blocks  and  liPle  disequilibrium  between  blocks  –  Mean  block  size  appears  to  be  about  14kb  in  Caucasians,  8kb  in  Africans  

(but  this  is  variable  with  blocks  up  to  200kb  in  size)  

•  A  consequence  of  the  lack  of  haplotype  diversity  in  regions  of  strong  LD  is  that  there  is  considerable  redundancy  –  that  is,  most  polymorphisms  and  haplotypes  in  a  given  block  can  be  

predicted  from  a  smaller  set    –  Johnson  et  al.  (Nature  Gene)cs  2001)  referred  to  this  smaller  set  as  “haplotype  tagging”  SNPs  

•  The  concept  of  haplotype  tagging  SNPs  is  used  to  create  genome-­‐wide  SNP  chips  to  be  used  for  Genome-­‐wide  associa)on  studies  (GWAS)            

GWAS  •  >1M  haplotype  tagging  SNPs  spanning  the  genome  

•  Substan)al  quality  control  of  the  genotype  data  is  required!  

•  Test  for  associa)on  between  disease/con)nuous  trait/etc.  and  each  SNP;  >1M  tests  (more  if  imputa)on  is  used)!  

•  Requires  strict  significance  criteria;  onen  p<  10^-­‐8  to  reach  genome-­‐wide  significance  for  a  given  SNP  test  

Sample  GWAS  

2.09E-12

3.64E-08

Manhattan Plot QQ Plot

Gene Mapping in the News Study Finds Gene Associated With Prostate Cancer

Study identifies second gene associated with specific congenital heart defects

Unique Study Identifies Gene Associated With Anxiety Phenotypes!

Discovery of a gene associated with a leukemia mostly affecting children

North American Group IDs Loci Influencing Cystic Fibrosis Lung Disease Severity May 23, 2011