Introducción a la Fluorescencia.ppt
-
Upload
paulveasnajar -
Category
Documents
-
view
222 -
download
0
Transcript of Introducción a la Fluorescencia.ppt
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
1/35
Introducción a la
FluorescenciaAbril, 2012
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
2/35
2
Antes que todorecordemos que…
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
3/35
3
E n e r g i a
S0
S1′
h νex h νem
S1
1
2
3(λ)
(λ′)longitud deonda larga
Física de laFluorescencia
Estadodeexcitación
Estadofundamental
S0′
4alabras cla!e"
#ransición, estado excitado,energía absorbida, estabilidad$
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
4/35
%
roducción de laFluorescencia
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
5/35
&
'once(tos ) terminologíaim(ortanteEs(ectro de excitación"
Es(ectro de emisión"
Es la re(resentación del n*mero de fotones absorbidos (or unamol+cula con su corres(ondiente longitud de onda$
e(resentación de los fotones liberados al (asar del estado deexcitación al estado fundamental donde los electrones sonestables$
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
6/35
-
.F / ariantes de 'ur!asde Fluorescencia
.F .reen Fluorescence rotein" Es una (roteínaque se utilia en biología molecular 4abitualmente
como marcador$
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
7/35
5
6icrosco(ía de Fluorescencia
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
8/35
7
6icrosco(ía de E(i8uorescencia
Fue descubierto en 1907 (or :;4ler )s larga$
=os colorantes 8uorescentes utiliados (ara latinción celular se denominan fuorocromos ó
fuoróoro (hechas a base de proteínas).
=a intensidad ) el color de la lu de emisión esuna (ro(iedad característica de la mol+cula8uorescente utiliada$
?o (ueden ser obser!ados durante largo
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
9/35
9
enta@as
ermite un alto constraste entre la seal lo queinteresa ) el ruido lo que no interesa$
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
10/35
10
El cubo Bltro de Fluorescencia
'om(onentes
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
11/35
11
El cubo Bltro de Fluorescencia
Filtro de Excitación
(asar las longitudes en el rango desde %&0C%90 nm color aul
Espejo dicroico
Este es(e@o tienen la (ro(iedad de re8e@ar la lu de ciertas longitudes deonda ) de de@ar (asar otras, ($e$ re8e@ar> longitudes de onda &10nm ómenos aul ) de@ar> (asar longitudes su(erior a &10nm !erde emitida(or el 8uorocromo de la muestra$
Filtro de emisión
($ e$ de@ar> (asar la longitud deonda &1&nm !erde
Por ejemplo:
'ubo Bltro I3, datos t+cnicos" excitation Blter D %&0%90, dic4romatic
mirror" &10, su((ression Blter" = &1&
'om(onentes
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
12/35
12
El cubo Bltro de Fluorescencia
C=as rendi@as del Bltro de excitación 4an de ser losuBcientemente estrec4as como (ara obtener un es(ectro bienresuelto$
C=os es(ectros de emisión a menudo son acom(aados (or otras
emisiones indeseables que diBcultan el estudio aquí el Bltrosu(resor adquiere im(ortancia$
CExiste un gran n*mero de @uegos de Bltros de excitación )emisión (ara los diferentes 8uorocromos, 4a) algunos que(ermiten la obser!ación simult>nea de dos o tres 8uorocromos$
'om(onentes
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
13/35
Fuente de luminación
'om(onentes
“Lo ideal es tener una fuente de radiación potente que emita de
manera continua sobre un amplio intervalo espectral”
Lampara aló!ena
=>m(ara de arco de alta (resión de enón e
=>m(ara de ba@a (resión !a(or de 6ercurio Gg
=am(ara de Galogenuros 6et>licos
=EH
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
14/35
b@eti!os
'om(onentes
CA ma)or A$?$ ma)or8uorescencia ser> ca(tada
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
15/35
1&
http://www.atto.com/Carv/CarvSkinSection.htm
"onocal #icroscop$
J atented b) 6insK) in 19&5
J Eliminación de (lanos fuerade enfoque obser!ados en8uorescencia
esolución L(tica" 'on!encional #ambi+n llamado MideField!s$ 'onfocal
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
16/35
'onBguración
"ubo Filtros
C reguntar que sondas o 8uorocromos utiliar>n en sus estudiosestos (ueden ser" Isotiocianato de 8uorceína, HAI, naran@ade acridina, etc$
El FI#' es am(liamente utiliado en microsco(ía de 8uorescenciaaco(lada a anticuer(os$ Entre FI#' ) HAI usado (ara A?Hest>n casi el 70N de las a(licaciones$
C Oncontrar la corres(ondencia entre los 8uorocromos ) loscubos Bltros #abla$
C He acuerdo a la cantidad de cubos Bltros a utiliar seleccionarel modelo del microco(io$ H65&01000 cuando sean comom>ximo 02 cubos Bltros, H620002&003000%000 ) H6I3000(ara m>ximo 0% cubos Bltros, H6I%000-000D (ara 0& cubos,H6&000&&00-000 4asta 05 cubos Bltro$
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
17/35
'onBguraciónCubo Filtros
HAI, tie el AH?,(ermite ubicarc+lulas (or susn*cleos (ero nodistingue c+lulasmuertas de c+lulas!i!as$
FI#''on@ugado m>sem(leado (ara !er
reacciones antígenoCanticuer(o$
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
18/35
Fuente de Iuminación
Fuente de luminación
Es necesario tener en cuenta tres com(onentes im(ortantes"
CIntensidad de la l>m(ara
CHistribución de longitudes de onda de la radiación que emite lafuente
CEstabilidad
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
19/35
Fuente de luminación
Lampara Halógena
'onBguración
Lámpara de arco de alta presión de Xenón (Xe)
Lámpara de baja presión vapor de Mercurio (Hg)
Lampara de Halogenuros Metálicos
LED
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
20/35
'onBguración
L%mparas de arco de alta presión de &enón
Emiten una radiación relati!amente estable de 8u@o contínuoentre 300 a 1300 nm, est>n limitados (or el desgaste delelectrodo ) la di!agación del arco$
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
21/35
'onBguración
L%mparas de 'apor de #ercurio de baja presión
s frecuentemente utiliados, el arco resultante es difusa) muc4o menos intensa (ero con me@or estabilidad encom(aración al arco de enón una radiación intensa )relati!amente estable de 8u@o contínuo entre 300 a 1300 nm,esta limitado (or el desgaste del electrodo ) la di!agación del
arco$
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
22/35
0,0%
10,0%
20,0%
30,0%
40,0%
50,0%
60,0%
70,0%
80,0%
90,0%
100,0%
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
Lambda [nm]
P o w e r [ m W ]
HBO
HXP120
FITC
Amarillo578
Verde 546
Azul 436
Viol45
!V365
!V334
'onBguración
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
23/35
'onBguración
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
24/35
'onBguración
ccesorios
C '>maras digitales
C
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
25/35
equerimientos (ara ladigitaliación de la Fluorescencia
• Adquisición acti!a de$$ – (ida de im>genes
• Da@o ni!el de ruido con alto
rango din>mico – Extraer seales d+biles• Dinning
– Incrementar sensibilidad
•
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
26/35
• A(licaciones de Fluorescencia en .eneral
DFC450
DFC450 CDFC495
DFC500
'onBguración
ccesorios
C '>maras
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
27/35
'onBguración
ccesorios
C genes digitales en8uorescencia es es(ecial )a que loses(ecimenes frecuentemente no son estables) las im>genes (ueden (erder intensidad
• Esto 4ace a la fotografía tradicional com(le@a )(oco con!eniente
• =a imagen digital (roduce im>genes en unformato que (uede mani(ularse f>cilmente
(ara identiBcar detalles ) que es adecuado(ara medidas ) an>lisis
R'uando ) (or que utiliarlo S
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
28/35
'onBguración
ccesorios
C mara digital ) una '• (timiado (ara adquisición de im>genes
multicanal (ara – isualiación, me@ora, documentación de im>genes
8uorescentes coloreadas de microsco(ia
• =as im>genes de los distintos canales secombinan en una imagen
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
29/35
'onBguración
ccesorios
C ndar
– uede recombinar im>genes de canales (ara obtenerel as(ecto necesario utilia desde 2 4asta 7 canales
– uede adquirir m*lti(les canales ) combinar sólo losdeseados
– uede utiliarse tambi+n con HI' o DF
• cil com(osición de la imagen ) a@uste de la c>mara
los tiem(os de ex(osición se a@ustan (or se(arado(ara cada canal
• ecu(eración de datos de conBguración
– e(roducir adquisiciones es sim(le
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
30/35
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
31/35
• Lente de refuer! "#r#
$nre&ent#r '# $nten($d#d
• F)* +F'u!re(ene )nten($t
*#n#-er. /e(t!r de )nten($d#d de
'# F'u!re(en$# "#r# #&$#r '#$nten($d#d de 'u ($n "erder
!ntr#(te
• /e(t!r de $t#$n "#r# #u(te
de $nten($d#d de d$ferente('!n-$tude( de !nd#
• D$#fr#- de #&"!(
ret#n-u'#re( "#r# "t$ (e#'
de r#t$! de ru$d! en $&-ene(
d$-$t#'e(
Otr!( !&"!nente(
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
32/35
F'u! B!!(ter
• Lente de('$#nte !"$!n#'
• )nre&ent# '# $nten($d#d de'u #(t# 30%
• Puede (er #&$#d! "#r#
#'t# !&!-ene$d#d ! #'t#
$nten($d#d
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
33/35
/e(t!r de )nten($d#d de '# F'u!re(en$#
+F'u!re(ene )nten($t *#n#-er.
F)*
• tenu#$n de '# $nten($d#d de 'u
f'u!re(ente
• :$t# '!( efet!( de de(:#ne$&$ent!
• /$:e( 'e(( (tre(( t! '$:$n- e''( !r
!r-#n$(&(
• 5 "!($$!ne(; 100%, 55%, 30%, 17%,10%
• L# #tenu#$n (e #($-n# d$ret#&ente
# '!( u!( f$'tr!(
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
34/35
/e(t!r de $t#$n+$t#t$!n *#n#-er.
• C!ntr!' de('$#nte O"$!n#'
• u(te de $nten($d#d #
d$ferente( '!n-$tude( de !nd#
• P#r# #'#ne :erde
-
8/17/2019 Introducción a la Fluorescencia.ppt
35/35
Fin