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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE MEDICINA DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO DE INVESTIGACIÓN SECRETARÍA DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE PEDIATRÍA DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS MUTACIONES 0188R, K285N, N3 1 4D VSi 351 EN PACIENTES CON GALACTOSEMIA CLÁSICA EN EL INSTITUTO NACIONAL DE PEDIATRÍA. T E S1 S PARA OBTENER EL TÍT ULO DE: ESPECIALIDAD EN GENÉTICA MEDICA PRESENTA: SUSANA MONROY SANTOYO TUTOR DE TESIS: DRA. ARIADNA GONZÁLEZ DEL ÁNGEL Ai ~ 1 PJ MÉXICO, D.F. 2007

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE MEDICINA DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO DE INVESTIGACIÓN

SECRETARÍA DE SALUD

INSTITUTO NACIONAL DE PEDIATRÍA

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS MUTACIONES 0188R, K285N, N3 1 4D VSi 351 EN PACIENTES CON GALACTOSEMIA

CLÁSICA EN EL INSTITUTO NACIONAL DE PEDIATRÍA.

T E S1 S PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

ESPECIALIDAD EN GENÉTICA MEDICA PRESENTA: SUSANA MONROY SANTOYO

TUTOR DE TESIS: DRA. ARIADNA GONZÁLEZ DEL ÁNGEL

Ai~ 1 PJ MÉXICO, D.F. 2007

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El éxito no se mide de acuerdo al lugar que se

ha alcanzado, sino a los obstáculos que han

tenido que vencerse.

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DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS MUTACIONES Q188R, K285N, N314D Y S135L EN PACIENTES CON GALACTOSEMIA

CLÁSICA EN EL INSTITUTO NACIONAL DE PEDIATRÍA.

Jefa del Departamento de Pre y Posgrado

Clluiz Dra. Victoria del Profesor Titular del urso

Dra. Ariadna González del Ángel Tutor del Trabajo de Investigación

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ÍNDICE.

Pags. Resumen 3

Introducción 6

Justificación 29

Objetivos 30

Diseño del estudio 30

Material y Métodos 31

Descripción General del Estudio 32

Análisis Estadístico 36

Consideraciones éticas 36

Resultados 37

Discusión 46

Conclusiones 49

Anexos 51

Referencias 55

2

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DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS MUTACIONES Q18811,

K285N, N314D Y S1351- EN PACIENTES CON GALACTOSEMIA

CLÁSICA EN EL INSTITUTO NACIONAL DE PEDIATRÍA.

RESUMEN.

ANTECEDENTES: La galactosemia clásica es un error del metabolismo

autosómico recesivo causado por deficiencia de galactosa-1-fosfato-

uridiltransferasa (GALT). Su frecuencia es de 1/40,000 recién nacidos vivos. Los

síntomas inician a los pocos días de vida al presentar rechazo al alimento, letargia,

hipotonia, hepatomegalia con o sin falla hepática e ictericia. A pesar de su curso

potencialmente letal, dicho síndrome hepatotóxico neonatal puede ser prevenido

con su diagnóstico temprano y restricción dietética de la galactosa, sin embargo,

las complicaciones de esta patología a largo plazo aún son desconocidas.

Actualmente se han descrito más de 165 mutaciones de GALT; las 3 mutaciones

más frecuentes en población caucásica son la Q188R, K285N y N314D

(observadas en el 80% de los pacientes), siendo las dos primeras

bioquímicamente severas por condicionar ausencia de la actividad enzimática,

mientras que la última, es moderada por exhibir actividad del 50%. La mutación

S1351- es prácticamente exclusiva de raza negra y también produce ausencia

enzimática absoluta. No existen reportes en la literatura que describan la

frecuencia de estas mutaciones en población mexicana.

OBJETIVO: Conocer la frecuencia de las mutaciones 0188R, K285N, N314D y

S1351- en pacientes con diagnóstico confirmado de galactosemia clásica y sus

familiares en primer grado canalizados a través de la Unidad de Genética de la

Nutrición del Instituto Nacional de Pediatría.

MATERIAL Y MÉTODOS: Se incluyeron 18 pacientes con diagnóstico confirmado

de galactosemia clásica y sus familiares en primer grado. A todas las familias

captadas se les realizó historia clínica completa con árbol genealógico y obtención

de DNA genómico de leucocitos y/o células de descamación de mucosa oral,

previa firma de consentimiento informado. La caracterización de las mutaciones

0188R, K285N y N314D se realizó por medio de amplificación por PCR y

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digestión con endonucleasas de restricción específicas. Para la mutación S135L

se realizó la técnica de amplificación por PCR aleló-específica. Se brindó

asesoramiento a las familias captadas de acuerdo a los genotipos encontrados.

RESULTADOS: De los 18 pacientes estudiados, el 56% pertenecen al sexo

femenino y el 44% al sexo masculino. El 78% de las familias presentaron casos

únicos, mientras que en el 22% restante se observaron 2 pacientes afectados por

familia. La edad promedio al momento del estudio fue de 2 años y el número total

de familiares en primer grado estudiados fue de 31. Cinco de los 18 probandos

resultaron homocigotos para la mutación 01881R; ellos presentaron ausencia total

de la actividad de GALT y clinicamente grados variables de hepatomegalia,

ictericia, tubulopatia, rechazo al alimento e hipotonía de inicio temprano, los cuales

remitieron con la restricción dietética de lactosa; sólo uno de estos pacientes

presentó catarata congénita. En 3 casos, dos de ellos referidos por tamiz neonatal

anormal y uno por manifestaciones hepáticas y galactosa total >50 mg/dL, se

identificó la mutación Q188R en un alelo y en el otro no se pudo caracterizar la

mutación. Dos pacientes fueron heterocigotos compuestos (0188R/N314D),

ninguno presentó datos clínicos y el motivo de su envío al INP fue el hallazgo por

tamiz neonatal de actividad enzimática disminuida y galactosa total en sangre >14

mg/dL. Se observaron 2 pacientes homocigotos para la mutación N314D y dos en

el que sólo se caracterizó la mutación N314D en un alelo; en cada uno de estos

grupos se presentó un paciente con catarata congénita incipiente y en el paciente

genotipificado como homocigoto se sospecha disomía uniparental de¡ cromosoma

9 o de una deleción en el alelo materno no identificado por la metodología

utilizada. Un paciente con ausencia total de actividad enzimática, galactosa total

>50 mg/dL, hepatopatia y retraso psicomotor se identificaron ambos alelos con la

mutación S135L. Ninguno de los pacientes presentó la mutación K285N y en 3

casos no fue posible identificar las mutaciones responsables. Las frecuencias de

los alelos fueron: Q188R (42%), N314D (22%), K285N (0%), S135L (6%) y alelos

no identificados (30%).

CONCLUSIÓN: La prevalencia de los alelos 01881R y N314D fue discretamente

más baja y similar, respectivamente, a la reportada en otras poblaciones a nivel

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mundial. La ausencia de alelos K285N pudiera explicarse por el efecto fundador

de la mutación en Europa oriental y a que probablemente la migración de

pobladores originarios de dicha región está limitada en nuestro país. La

identificación de la mutación S1351- en una familia con 2 hermanos afectados

confirma que en población mexicana existe una contribución genética de origen de

raza negra; los dos pacientes portadores de dichos cambios no presentaban

fenotipo negroide, ambos padres son originarios de población endogámica de¡

Estado de México y niegan antecedentes de familiares de dicha raza.

El conocer la frecuencia y tipo de mutaciones que condicionan la galactosemia

clásica en la población mexicana, permitirá realizar la genotipificación en el tamiz

neonatal ampliado, para establecer un tratamiento temprano en los pacientes y así

evitar secuelas. En las familias se podrá brindar asesoramiento genético de

certeza con relación a la identificación de portadores, e incluso ofrecerles la

posibilidad de diagnóstico prenatal. En un futuro, además, nos permitirá el realizar

la búsqueda de mutaciones responsables de galactosemia clásica en otro grupo

de padecimientos, como aquellos con defectos de canalización genital, infertilidad

femenina o catarata presenil aislada, en los cuales se ha demostrado en la

literatura que un porcentaje de ellos son causados por mutaciones de GALT en

estado heterocigoto.

5

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INTRODUCCIÓN.

ANTECEDENTES HISTÓRICOS

La primera descripción detallada de la galactosemia fue realizada por Goppert en

1917. El paciente presentaba hepatomegalia, ictericia, falta de ganancia de peso,

albuminuria y glucosuria. Al excluir la leche de la dieta, estos signos y síntomas

desaparecieron, sin embargo, posterior a la ingesta de lactosa o galactosa

presentaba galactosuria dosis-dependiente. Tanto el hermano mayor como el

menor presentaron ictericia, hepatomegalia y murieron a las 4 semanas de vida.

Goppert concluyó que estos pacientes sufrían de un padecimiento hepático

familiar en el que la lactosa debía ser substituido por otro tipo de carbohidrato1.

Desde entonces, numerosas publicaciones han detallado los signos y síntomas del

padecimiento conocido como galactosemia "clásica"2.

En 1956 se determinó que la enzima deficiente en los pacientes afectados por

galactosemia es una transferasa3 capaz de catalizar la conversión de galactosa en

galactosa-1-fosfato, la cual posteriormente se convertirá en glucosa-1-fosfato. El

seguimiento de la evolución de pacientes con galactosemia inició en la década de

los 80. Finalmente, en 1990, se conoció la secuencia del cDNA codificante de la

galactosa-1 -fosfato uridiltransferasa5.

FRECUENCIA

La galactosemia es un error del metabolismo clinicamente heterogéneo. Es un

padecimiento autosómico recesivo cuya incidencia se estima en dos casos por

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cada 100,000 recién nacidos vivos, con una mortalidad neonatal que puede llegar

hasta el 20%.

FISIOPATOLOGíA

La galactosa y la glucosa son absorbidas en el intestino por un sistema acoplado a

sodio y dependiente de energía7. En individuos normales las cargas de galactosa

son absorbidas y eliminadas de la sangre rápidamente8. Evolutivamente la

glucosa ha emergido como la principal fuente de energía gracias a su estabilidad y

al potencial limitado para la glucosilación de proteínas. La galactosa no cuenta con

estas propiedades, por lo que la rápida conversión de galactosa a glucosa es

necesaria9.

En la mayoría de los organismos, la conversión de la 3-D-galactosa a la forma útil

de glucosa 1-fosfato se lleva a cabo por la acción de las 4 enzimas que

constituyen la vía Leloir o vía principal del metabolismo de la galactosa. En el

primer paso, la 3-D-galactosa es epimerizada a cz-D-galactosa por medio de la

galactosa mutarotasa. El siguiente paso involucra la fosforilación dependiente de

ATP de la cz-D-galactosa por la galactocinasa (GALK) para dar lugar a la

galactosa-1-fosfato. La tercera enzima de la vía, la galactosa 1-fosfato

uridiltransferasa (GALT), cataliza la transferencia de un grupo uridil-monofosfato

de la uridil fosfato-glucosa (UPD-Glc) a la galactosa-1-fosfato, generando glucosa

1-fosfato y uridil fosfato-galactosa (UPD-Gal). Para completar la vía, la UPD-Gal

es convertida a UPD-Glc por la UPD-galactosa 4-epimerasa (GALE). La UDP-Gal

es un cofactor esencial para las galactosa-transferasas que se encuentran

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involucradas en la incorporación de galactosa a glicoproteínas y glicolipidos. En

los humanos, defectos en los genes que codifican para GALK, GALT o GALE dan

lugar a la enfermedad referida colectivamente como galactosemia 10

La enzima involucrada en la galactosemia clásica es GALT. Esta proteína funciona

como homodimero11. En la primera parte de la reacción, un residuo de histidina en

el sitio activo (His-186) sirve como nucleófilo, atacando el fósforo-u de la UPD-Glc.

Una molécula de Glc-1-P es liberada, dejando un intermediario uridilado de la

enzima. En la segunda parte de la reacción, Gal-1-P entra a la hendidura del sitio

activo y ataca al nitrógeno uridilado en el anillo imidazol de¡ sitio activo de

histidina, produciendo UPD-Gal. Este segundo producto se disocia,

regenerándose enzima libre12 (Fig. 1). La enzima tiene una cinética conocida como

"ping-pong" 13 (Fig. 2).

Los niveles de GALT en eritrocitos de pacientes afectados con galactosemia

clásica son prácticamente nulos, por lo que las manifestaciones son muy

severas14. Cuando el cuadro clínico de la galactosemia es leve o se obtienen

resultados positivos para esta enfermedad por medio de la prueba de tamiz

metabólico, generalmente, los pacientes son heterocigotos compuestos para una

mutación que condiciona galactosemia y para la variante Duarte (GJD), con

deficiencia parcial de GALT15.

8

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* ATP (1)

' Galactosa-1 -fosfato

TP (4)

,J (4)

UPD-Gal

(611

Glicoproteinas Glicolípidos

Glucosa-1 -fosfato

+UTP(4)

+1 f

(3)

UPD-Glc (3)

FIGURA 1

VÍA METABÓLICA DE LA GALACTOSA

(3)

Galactitol

\1.1

Galactosa

/ Galactonatc

UPD-Glc 1 (3) UPD-Gal

++

(1) Galactocinasa, (2) Galactosa-1 -fosfato uridiltransferasa, (3) Galactosa-4-

epimerasa, (4) UPD-Glc pirofosforilasa, (5) UPD-GaI pirofosforilasa,

(6) Galactosiltransferasa, (7) Reserva de galactosa libre, (8) Aldosa

reductasa, (9) Galactosa deshidrogenasa.

9

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FIGURA 2

REACCIÓN PING-PONG DE GALT"

GALT-UDP GLUCOSA

-GLUCOSA UDP '

GLUCOSFATO I

GALT 1 GALT-UMP

UD TO

k P-GALACTOSA

UDP-GALACTOSA

GACTO

GALT-UDP GALACTOSA

Reacción reversible catalizada por GALT, donde los grupos no equivalentes

funcionalmente se tornan equivalentes vía una reacción intermediaria o producto. La

reacción en el a-fósforo de la UDP-glucosa, claramente demuestra que esta enzima

tiene un mecanismo de reacción "ping-pong" a partir del cual se forma un intermediario

covalente uridil-enzimático.

10

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La deficiencia completa de GALT tiene un efecto profundo sobre varias vias

metabólicas, especialmente cuando la ingesta de galactosa continúa. La galactosa

por sí sola se acumula en distintos tejidos y la sangre. El aumento en la

concentración de galactitol es una característica común en este padecimiento y ha

sido implicado en la formación de cataratas oculares galactosémicas16. Dado que

la conversión de la galactosa a galactitol por la aldolasa reductasa representa uno

de los finales de la vía metabólica, los productos producidos por las vías alternas

de la galactosa, el galactitol y el ácido galactónico, tienen que ser removidos

exclusivamente por la vía renal17, sin embargo también tienden a acumularse en

diversos tejidos.

Aunque el hígado es el órgano principal en donde se efectúa el metabolismo de la

galactosa, las enzimas de la vía Leloir se han encontrado en varios tipos celulares

y tejidos. La GALT y la GALK están presentes en los eritrocitos fetales, hígado,

pulmón, bazo y músculo cardiaco a partir de la semana 10 de gestación y su

actividad es mayor en el segundo y tercer trimestre que en la etapa postnataí18.

Esto sugiere la posibilidad de que el daño puede ocurrir in utero ante la deficiencia

de GALT; con la transferencia materno-fetal de galactosa por la misma vía que

sigue la glucosa, al existir aumento en la concentración de galactosa en sangre

materna podrían causar su elevación en el feto, de modo que si éste es

homocigoto, se acumularía galactosa-1 -fosfato y galactitol en sus tejidos. Por esto,

algunos autores aconsejan que las madres homocigotas o heterocigotas para

alelos mutados sigan una dieta exenta de galactosa durante el embarazo con el fin

de mejorar el pronóstico fetal19.

11

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CUADRO CLÍNICO

El defecto enzimático produce en el neonato alimentado al seno materno o con

fórmula maternizada una gama de signos y síntomas graves que pueden llevarlo a

la muerte en pocos días. Los síntomas iniciales incluyen rechazo al alimento con

poca ganancia de peso, vómito, diarrea, letargia e hipotonía. A la exploración

física el niño se observa ictérico, en algunas ocasiones con catarata congénita,

con hepatomegalia y puede presentarse sangrado prolongado posterior a las

venopunciones o procedimientos sencillos. La disfurición hepática suele comenzar

con cambios inflamatorios o infiltración grasa de] hígado, para evolucionar hacia

cirrosis. Los estudios de la investigación inicial reportan hiperbilirrubinemia no

conjugada o mixta, aumento de las transaminasas hepáticas, aumento de

aminoácidos en plasma (especialmente fenilalanina, metionina y tirosina),

tubulopatía renal (acidosis metabólica, galactosuria, glucosuria, albuminuria y

aminoaciduria). Además, las anormalidades hemorrágicas son comunes

secundarias a la hepatopatía.

Durante la primera semana de vida, muchos neonatos con la forma aguda de

galactosemia tienen infección por Escherichia coli u otras bacterias gram

negativas. Esta susceptibilidad a infecciones se relaciona con una disminución en

la actividad fagocitaria y bactericida leucocitaria2° por la elevación en la

concentración sanguínea de galactosa y por el déficit de la transferasa

leucocitaria6.

Se ha postulado que la acumulación de galactitol es responsable de la mayoría de

los efectos tóxicos sistémicos y del deterioro neurológico. La síntesis anormal de

glicolípidos parece que también contribuye a la alteración de la función cerebral.

Ep

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Además, la elevación de la galactosa en la sangre puede inhibir la captación de la

glucosa por el sistema nervioso central, así como una defectuosa conversión de la

glucosa en inositol y la secundaria disminución de ATP neuronal21.

Estudios con resonancia magnética nuclear han demostrado disminución de la

materia blanca como resultado de una mielinización deficiente producida por la

alteración primaria de la estructura de la mielina, ya que el 40% de esta sustancia

es compuesta de galactocerebrósidos22.

La sintomatología inicial desaparece dramáticamente al restringir totalmente la

galactosa de la dieta, sin embargo, a pesar del buen apego a la dieta, los niños

con galactosemia clásica tienen una morbilidad significativa en los siguientes años

de la vida, condicionada por bajo desarrollo cognhtivo, ataxia y, en mujeres, falla

ovárica.

DIAGNÓSTICO

La prueba de Beutler es un estudio cualitativo que determina la presencia de la

actividad de GALT; actualmente es ampliamente utilizada para realizar el

diagnóstico neonatal de galactosemia clásica23. Pueden ocurrir resultados falsos

negativos cuando el paciente ha sido transfundido durante los últimos 3 meses así

como resultados falsos positivos en pacientes con deficiencia de glucosa-6-fosfato

deshidrogenasa.

La determinación de GALT en eritrocitos es un ensayo cuantitativo que confirma el

diagnóstico. También es capaz de identificar variantes del padecimiento con

actividad enzimática residual24.

13

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Las concentraciones de galactosa-1 -fosfato siempre se encuentran elevadas en

pacientes con galactosemia clásica y no se ven significativamente afectadas por

transfusiones sanguíneas25.

La presencia de sustancias reductoras de azúcares o galactosa en orina no se

considera un resultado sensible ni especifico, ya que pequeñas cantidades de

galactosa son excretadas en la orina de pacientes con daño hepático o tubular,

además de que la galactosa puede desaparecer rápidamente en la orina de los

pacientes con galactosemia a las pocas horas de retirar el disacárido de la dieta19.

TRATAMIENTO Y MANEJO

En los pacientes con datos clínicos que apoyen el diagnóstico de galactosemia o

en aquellos detectados por medio del tamiz neonatal con sintomatología, la

galactosa debe excluirse inmediatamente de su dieta; se recomienda que para ello

no se deba esperar hasta tener los resultados de los análisis diagnósticos. Por lo

tanto, la alimentación al seno materno y las fórmulas maternizadas deben

suspenderse; las fórmulas a base de soya son las más adecuadas a menos de

que el paciente curse con hepatopatía severa, en cuyo caso se recomienda una

fórmula con triglicóridos de cadena media e hidrolizado de caseína (PregestimilTM)

hasta que el cuadro se resuelva. Los hidrolizados de caseína contienen una

pequeña cantidad de galactosa, por lo que en ausencia de hepatopatia no es la

fórmula de primera elección.

Los niños críticamente enfermos deberán ser manejados con medidas de soporte

adecuadas a la severidad de la hepatopatia, nefropatía y alteraciones de sistema

nervioso central. La admiñistración de antibióticos, fluidos intravenosos, plasma y

14

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vitamina K son requeridos con frecuencia. La ictericia usualmente no es tan severa

como para requerir fototerapia o exanguineotransfusión, sin embargo, aquellos

pacientes con bajos niveles de albúmina secundarios a la hepatopatia pueden

estar en riesgo de presentar kernicterus. Para evitar resultados falsos negativos en

los análisis erizimáticos, todas las muestras de sangre y orina deben tomarse

antes de realizar cualquier transfusión.

Aquellos neonatos en riesgo de padecer galactosemia, por ejemplo, los hermanos

de pacientes diagnosticados, no deben ser alimentados al seno materno o con

fórmula hasta que se haya excluido en ellos el diagnóstico de galactosemia.

Los lactantes sin riesgo y con buen estado de salud pero con resultado positivo

para galactosemia en el tamiz neonatal deberán ser evaluados cuidadosamente

en búsqueda de signos o síntomas del padecimiento. Estos casos pudieran ser

resultado de una deficiencia parcial de GALT, ya que éstas pueden ser hasta 10

veces más comunes que la galactosemia clásica15. La necesidad de intervención

en estos pacientes es aún desconocida.

El tratamiento a largo plazo en los pacientes con galactosemia clásica sintomática

se basa en la eliminación de la galactosa de la dieta, lo que en esencia significa la

restricción definitiva de leche y lácteos en general ya que la ingesta del disacárido

tiene efectos tóxicos a cualquier edad. La leche materna y las fórmulas

maternizadas están contraindicadas. A pesar de estas medidas, la dieta aún

puede contener pequeñas cantidades de galactosa presente en frutas, verduras y

ciertas leguminosas como los chícharos y frijoles26, sin embargo, algunos autores

no justifican su restricción27. La ingesta de vísceras está prohibida.

15

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Un gran número de medicamentos contienen lactosa, por lo que debe revisarse

su composición antes de prescribirlos a pacientes con galactosemia. Esto es

especialmente importante con las tabletas masticables de uso pediátrico. Sin

embargo, la dosis total es pequeña en comparación con la producción endógena

de galactosa28, particularmente si el medicamento no se administra por un periodo

prolongado.

Las fórmulas con base en soya contienen cantidades adecuadas de calcio, sin

embargo su ingesta tiende a disminuir en los lactantes a partir del año de edad,

por lo que es necesario administrar suplementos de sales de calcio libres de

lactosa o cambiar a leche de soya rica en calcio para cumplir con los

requerimientos de este mineral y así, evitar disminución de la densidad ósea que

puede agravarse por la falla ovárica29.

SEGUIMIENTO Y MONITORIZACIÓN

La determinación de las concentraciones eritrocitarias de Gal-1-P es el método

más usado para la monitorización del apego a la dieta. La concentración de este

metabolito se encuentra muy elevada al momento del diagnóstico y es esencial

demostrar su disminución hasta niveles aceptables después de instaurar la dieta.

Los rangos límite de concentración varían entre los laboratorios de acuerdo a la

metodología utilizada2:

pmol/L eritrocitos: 150

pg/mL de paquete globular: 50

mg/lOO mL: 5

pmol/g hemoglobina: 0.5

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En pacientes con galactosemia clásica, a pesar del apego a la dieta, las

concentraciones de Gal-1-P nunca disminuyen hasta cifras de pacientes sanos

(cerca de 0).

La monitorización a largo plazo de pacientes con galactosemia clásica a través de

la determinación de Gal-1-P puede resultar injustificada; su costo es elevado y las

cifras sólo reflejan la ingesta de galactosa en las últimas 24 horas; no se ha

demostrado su total correlación con el pronóstico clínico a largo plazo. Walter y

colaboradores sugieren el siguiente esquema de monitorización2:

< 1 año, cada 3 meses.

1-14 años, cada 6 meses.

>14años,anual.

Por otro lado, la determinación de la concentración de galactitol urinario no ha

demostrado su utilidad en el seguimiento de los pacientes con galactosemia

clásica.

GEN

El gen de la enzima GALT se localiza en el cromosoma 9p1330. Tiene una longitud

de 3900 pares de bases y codifica para uñ polipéptido de 379 aminoácidos con

una masa estimada de 43 kilodaltones. El gen es relativamente pequeño y se

organiza en 11 exones con 10 intrones (Fig. 3). Algunos exones contienen

secuencias altamente conservadas a través de la evolución. El promotor

localizado en la región 5' del gen contiene dos sitios ricos en OC, tres secuencias

AP-1 y una secuencia CCAAT. No tiene caja TATA consenso, por lo tanto, se

17

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considera un gen "housekeeping", pero contiene dominios reguladores que

pudieran jugar un papel en la expresión tejido-específica y desarrollo-específica31.

FIGURA 3

ESTRUCTURA, ORGANIZACIÓN Y MUTACIONES MAS FRECUENTES DEL GEN HUMANO GALT16

PROMOTOR

EXONES 1 ~ MUTACIONES

3 — 4

5 — o S135L

6 4 0188R

7 — L2IRL

9 K285N

_____ N314D 10 — -1

E340X

18

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mRNA

Un mRNA sencillo de 1.4-kb se ha identificado y su cDNA correspondiente codifica

una proteína de 43-kDa. El marco de lectura abierto inicia con la tripleta ATG en el

sitio 29 y termina con un codón de paro TGA en la base 1166. Tiene un sitio poli

(A) y splicing de fusión de 2 genes adyacentes, que codifican para GALT y para el

receptor de la cadena-a de la interleucina 11 (IL-liRa) en células humanas

normales. Esta unidad de transcripción de 16-kb contiene 2 promotores (el primero

constitutivo y el segundo, a 8kb río abajo, altamente regulado) y 2 señales de

hendidura/poliadenilación separadas por 12 kb. Dos mRNA son generados a partir

de¡ promotor GALT, un mRNA de 1.4-kb que codifica para GALT y un mRNA de

fusión de 3-kb que codifica una porción de GALT y la cadena completa de lL-

11 Ra. Este evento sucede cuando el primer sitio poli(A) es cortado y empalmado

y el segundo sitio poli(A) es utilizado. La existencia del transcrito de fusión

probablemente es secundaria a la hendidura/poliadenilación deslizante en el sitio

poli(A) de GALT y a un evento de splicing alternativo entre el sitio donador de

GALT en el exón 10 y el sitio aceptor de IL-liRa en el exón 2 (Fig. 4). El

significado biológico del mRNA de fusión aún no se ha aclarado32.

19

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FIGURA 4

EVENTOS DE SPLICING INTERGÉNICOS ENTRE LOS GENES HUMANOS

GALT E IL-11Ra17

Gen hGALT

Gen hlL-llRa -

234567 89 1 11

COTRANSCRIPCIÓN

SPLICING INTERGÉNICO

$ Ii-441 1

1 'I su--

mRNA GALTM 1/IL-1 1 Ra

CALI. ttI lO

PROTEÍNA

Se trata de un homodímero, cuyas subunidades contienen 348 residuos de

aminoácidos y adicionalmente uno de zinc y uno de hierro. El plegamiento de la

subunidad se describe como "medio barril" con nueve hebras-P antiparalelas

flanqueadas a ambos lados por a-hélices. 33 El hierro sirve como puente al unir 2

hebras-p y un a-hélice cerca del espacio subunidad-subunidad del dímero5. El ion

de zinc se localiza a 8Á del sitio activo y se une como tetraedro por Cys-52, Cys-

20

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55, His-115 a His-164, sin embargo, de acuerdo al alineamiento de la secuencia

de aminoácidos, aparentemente en organismos superiores, Cys-52 e His-115 no

se encuentran conservados, sugiriendo que algunas undiltransferasas no se unen

a dicho metal. EF sitio activo de la uridiltransferasa se forma por residuos de

aminoácidos aportados por ambas subunidades de¡ homodímero 34 (Fig. 5).

FIGURA 5

REPRESENTACIÓN DE GALT DE E. COL!

Las 2 subunidades de la enzima dimérica

se presentan en azul y rojo con la posición

de los metales indicada por esferas. El

sitio activo de este modelo contiene unida

UDP-glucosa5.

MUTACIONES

Hasta el año 2006 se han documentado 165 mutaciones y 11 polimorfismos en el

gen GAL T35 . Cerca de¡ 9% son mutaciones sin sentido, pequeñas deleciones o

inserciones 10% y mutaciones en el sitio de splicing 5%, por lo que la mayoría de

las mutaciones son de sentido erróneo que se presentan a todo lo largo de¡ gen36.

21

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De éstas, 29 ocurren en sitios CpG hipermutables y dos terceras partes son

transiciones C—.T, que ocurren en ambas hebras (Fig. 6).

En el caso de la mutación Q188R, el cambio de glutamina por arginina en la

posición 188 de la proteína GALT, resulta de la transición CAG>CGG en el exón 6.

Es la mutación más prevalente a nivel mundial, con una frecuencia de 60 a 70%

en caucásicos norteamericanos37 y en latinos de 5058%38. Esta mutación se

localiza en un dominio altamente conservado entre especies y se encuentra muy

cerca del sitio catalítico de la enzima, la región histidina-prolina-histidina; la unión

usual del hidrógeno entre la glutamina y la histidiña en el sitio activo de la enzima

se compromete por la sustitución de arginina por glutamina, desestabilizando el

complejo UMP-GALT39.

En la mutación K285N, la sustitución de lisina por aspartato en el exón 9, resulta

de la transversión AAG>AAT en el nucleótido 855. La sustitución del aminoácido

no sucede en un dominio de la proteína tan conservado entre especies y sus

efectos están aún por determinarse. Globalmente dicha mutación es mucho más

rara que la Q188R, sin embargo, es la segunda más frecuente40. Existe gran

variación de su prevalencia en distintas poblaciones pero en Europa suma en total

entre el 25 y 35% de los alelos mutados19.

Para la mutación N314D el cambio de aspartato por asparragina está dictada por

la transición AAC>GAC. Inicialmente se pensaba que esta mutación era un

polimorfismo, sin embargo, ahora se sabe que está asociada con los alelos

Duarte41 que se encuentran en el exón 10. La variante Duarte (D o D2) se

caracteriza por presentar actividad enzimática reducida42, mientras que la variante

Los Angeles (LA o Dl), a pesar de tener isoformas y reacciones inmunoquimicas

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idénticas a las de D2, se asocia con actividad enzimática aumentada cuando se

compara con controles43. Diversos estudios in vitro han demostrado que la

mutación N314D no afecta la actividad de GALT44 N314D se encuentra en

desequilibrio de ligamiento con otros cambios de base distintos de los alelos Dl y

D2. La mutación "silenciosa" L218L, producida por la transversión CTA>TTA

localizada en el exón 7, coexiste con N313D en Dl, pero no en los alelos D2,

mientras que los polimorfismos intrónicos lVS4nt-27g---c, lVS5nt-24g—*a y

lVS5nt+62g—*a se encuentran en desequilibrio de ligamiento con N13413 en los

alelos D246. En raras ocasiones, N314D se puede encontrar en cis en

cromosomas de galactosemia que poseen otras mutaciones bien reconocidas. Por

ejemplo, en Alemania todos los cromosomas de galactosemia que poseen la

mutación E340X ocurren en cis con N314D/L2181-, mientras que la mutación

W316X se encuentra exclusivamente en cromosomas que poseen N314D y

polimorfismos intrónicos47.

Como en otras patologías con alta heterogeneidad genética, por ejemplo, fibrosis

quistica y fenilcetonuria, pocas mutaciones en el gen GALT son frecuentes en

todas las poblaciones. Las mutaciones que con mayor frecuencia se han reportado

a nivel mundial son Q188R, K285N, N314D y S1351-, siendo la última

prácticamente exclusiva de la raza negra 48 Este cambio de sentido erróneo

C—*G en el codón 135 produce la sustitución de serma por lisina y es altamente

prevalente sólo en el sur de África y sugiere que sus habitantes negros fueron una

fuente de esclavos para América del Norte. La deriva génica y la expansión

pudieron haber contribuido también con la alta frecuencia de la mutación S1351- en

afro-americanos.

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Existe una distribución particular de las mutaciones comunes de GALT entre los

distintos grupos étnicos. La variante Duarte (N314D) se encuentra en todas las

poblaciones y su prevalencia se encuentra entre 6-20% de los alelos "normales"

de GALT49 (Tabla 1).

FIGURA 6

MAPA DE MUTACIONES DE GALT60

Á Á 1 Lp 200

Á k Á 2@i

Mutación de sentido erróneo

O Mutación sin sentido

A Deleción

Inserción

24

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TABLA 1

PREVALENCIA DE LAS MUTACIONES QII8R, K285N, N3141) Y 5135L EN

DISTINTAS POBLACIONES 51,52

MUTA

FRECUENCIA

Q18811 EE.UU. Caucásicos bU-íU'Yo

EE.UU. Descendencia Europea 63.5%

EE.UU. Hispanos 50-58%

EE.UU. Afroamericanos 12-21%

Europa 64%

Turquía 57%

Viajeros de Irlanda 100%

Japón

K285N Europa Central 25-35%

Japón

N3141) EE.UU 6-20%

EE.UU. población no galactosémica 5-6%

Japón 2%

N314D1L218L Alemania 5.4%

N314D/IVS4/IVS5 Alemania 9.5%

S135L Población Afro-Americana 50%

Población negra de Sudáfrica 91%

25

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RELACIÓN FENOTIPO-GENOTIPO

A pesar de que sólo 2 o 3 mutaciones se encuentran hasta en el 80% de los

pacientes galactosémicos, se han identificado más de 160 mutaciones, lo que

sugiere que la variabilidad fenotipica puede ser explicada por la heterogeneidad

alélica.

Los pacientes homocigotos para la mutación 0188R tienen prácticamente niveles

indetectables de actividad enzimática en eritrocitos y linfocitos, hallazgo que es

compatible con la localización de la mutación en un dominio altamente conservado

entre las especies y en proximidad con el sitio catalítico de la enzima53.

La mutación K285N se asocia invariablemente a pérdida total de la actividad de

GALT eritrocitaria y, por lo tanto, un fenotipo bioquímico severo54.

Los pacientes homocigotos para la mutación N314D tienen el 50% de la actividad

de GALT, pero no por reducción en la transcripción del mRNA, sino por

inestabilidad térmica de la enzima que produce disminución en la vida media de la

misma55. La misma mutación sin sentido puede tener actividad enzimática normal

en algunos pacientes y es conocida como variante Los Angeles (LA). Los efectos

compuestos de mutaciones adicionales en cis con el alelo N314D son variables y

probablemente influenciados por el tipo y posición de la segunda mutación. Tanto

Dl como D2 han sido implicados como causa de infertilidad en mujeres con

defectos de canalización a nivel genital56.

Los pacientes homocigotos para la mutación S1351- carecen de actividad

enzimática de GALT en eritrocitos y linfoblastos, sin embargo, los leucocitos

presentan actividad del 10% del alelo silvestre, lo que sugiere que pudiera existir

actividad enzimática residual en hígado. Esta diferencia en la expresión de GALT

26

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en diversos tejidos sugiere la combinación de catálisis defectuosa y estabilidad

enzimática dependiente del órgano o tejido involucrado. El pronóstico a largo

plazo de estos pacientes es bueno al compararlo con el de pacientes homocigotos

para la mutación 0188R57.

Muchos autores han correlacionado el fenotipo bioquímico, determinando la

actividad de GALT en eritrocitos, con las distintas mutaciones obteniendo

resultados significativos58, sin embargo, los intentos para determinar los efectos

de las mutaciones con relación a las complicaciones a largo plazo no han sido

exitosos. Un estudio sugiere que la homocigocidad para Q188R es un factor

determinante para un pronóstico clínico pobre59, mientras otro ha expuesto que no

existe diferencia estadísticamente significativa en el pronóstico a largo plazo de

individuos galactosémicos homocigotos-Q188R, heterocigotos-Q188R o no-

0188R60. Desafortunadamente, la correlación fenotipo-genotipo en la

galactosemia clásica ha sido difícil de establecer a pesar de contar con estudios

con grandes series de pacientes61, probablemente por que muchos pacientes son

diagnosticados de manera tardía, cuando los altos niveles de galactosa han

producido daño a nivel cerebral y hepático, principalmente62.

Aparentemente la mutación K285N, es la mutación que con mayor frecuencia se

ha asociado a la aparición de catarata presenil idiopática en portadores de alelos

de galactosemia clásica; mientras que no se ha logado establecer una relación

con el alelo D2, probablemente por que los heterocigotos para la variante Duarte

tienen actividad enzimática del 75%, la cual es demasiado alta para conducir a la

formación de catarata presenil63.

27

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PRONÓSTICO

La patogenia de las complicaciones crónicas en galactosemia clásica es compleja

y poco conocida. La severidad de las alteraciones neonatales es probablemente la

variable más importante en el pronóstico.

El crecimiento generalmente se encuentra retrasado en la mayoría de los

pacientes, pero la taita final no varía de manera significativa con relación a la

población general, sin embargo, las mujeres afectadas tienen más tendencia a la

talla baja20.

El bajo coeficiente intelectual de algunos pacientes diagnosticados y tratados

oportunamente, pudiera explicarse por la transferencia materno-fetal de galactosa

por la misma vía que la glucosa, por lo que la elevación de galactosa en la madre,

podría causar elevación en el feto; si éste es homocigoto para mutaciones

bioquímicamente severas en el gen GALT, se acumulará galactosa-1-fosfato y

galactitol en sus tejidos64. Un segundo postulado involucra la producción

endógena de galactosa que intoxica continuamente el sistema nervioso central65.

En las mujeres homocigotas o heterocigotas para mutaciones bioquímicamente

severas se ha descrito falla ovárica primaria con frecuencia y es una complicación

independiente de la edad en la que se instaura el tratamiento o del apego a éste66.

Se puede manifestar con pubertad retrasada, amenorrea primaria o secundaria o

con oligomenorrea. Se desconoce su fisiopatología pero se sugiere que el daño

inicia en la etapa prenatal por el efecto tóxico directo de la galactosa67.

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JUSTIFICACIÓN.

Los estudios moleculares para mutaciones comunes en aquellos pacientes

con resultados bioquímicos positivos para entidades autosómicas recesivas han

sido utilizados para brindar asesoramiento genético de certeza, realizar

diagnóstico prenatal e identificar a portadores de¡ padecimiento dentro de las

familias de los pacientes afectados.

El conocer la frecuencia y tipo de mutaciones que condicionan la galactosemia

clásica en la población mexicana, permitiría incluir la genotipificación al tamiz

neonatal ampliado, con el fin de establecer el tratamiento adecuado para cada

paciente y así evitar secuelas y realizar prevención en otros miembros de la

familia.

En un futuro, además, permitiría realizar la búsqueda de mutaciones responsables

de galactosemia clásica en otro grupo de padecimientos, como aquellos con

defectos de canalización genital, infertilidad femenina o presencia de catarata

presenil aislada, en los cuates se ha demostrado que un porcentaje de ellos son

causados por mutaciones de GALTen estado heterocigoto.

Por lo tanto, la creación de un sistema que brinde estas ventajas es de gran

beneficio para los pacientes y familias afectadas por la galactosemia clásica,

pudiendo prevenir su curso potencialmente letal y la morbilidad en los

sobrevivientes y heterocigotos.

29

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OBJETIVOS.

1. OBJETIVO GENERAL

1. Describir las características clínicas y conocer la frecuencia de las

mutaciones más comunes en el gen de la galactosa-1 -fosfato

uridiltransferasa en pacientes del Instituto Nacional de Pediatría con

galactosemia clásica y sus familiares.

H. OBJETIVOS PARTICULARES

Describir las características clínicas de los pacientes con diagnóstico

confirmado de galactosemia clásica.

Identificar mediante amplificación de DNA por PCR y corte con

endonucleasas de restricción las mutaciones 0188R, K285N y N314D del

gen GALT.

Identificar mediante amplificación de DNA alelo específica la mutación

S1351- del gen GALT.

Identificar portadores de las mismas mutaciones en los familiares de

primer grado de los pacientes.

DISEÑO DEL ESTUDIO.

Es un estudio observacional, descriptivo, transversal, prospectivo.

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MATERIAL Y MÉTODOS.

CRITERIOS DE INCLUSIÓN

Pacientes con diagnóstico confirmado de galactosemia clásica.

Cualquier género.

Cualquier edad.

Familiares en primer grado (padres y hermanos) de pacientes con

diagnóstico confirmado de galactosemia clásica.

Firma de carta de consentimiento informado para casos índice y familiares.

(Anexo 1).

CRITERIOS DE EXCLUSIÓN

Padres o hermanos no biológicos de los casos índice.

Pacientes transfundidos en un periodo menor a tres meses (se excluirán de

manera temporal).

POBLACIÓN OBJETIVO:

Pacientes mexicanos con diagnóstico confirmado de galactosemia clásica

por la ausencia de actividad enzimática de GALT documentada por una

prueba de Beutler negativa y/o ausencia de GALT en el tamiz neonatal plus

ampliado, así como presencia de galactosuria en prueba cualitativa y/o

cifras de galactosa total en sangre mayores a 14 mg/dL.

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POBLACIÓN ELEGIBLE:

Casos canalizados a través de la Unidad de Genética de la Nutrición-lIB-

UNAM-INP con diagnóstico confirmado de galactosemia clásica realizado

de 1990 a 2006, así como sus familiares en primer grado.

DESCRIPCIÓN GENERAL DEL ESTUDIO.

Los pacientes se captaron a través de los servicios de consulta externa y/u

hospitalización y se contactó vía telefónica a aquellos diagnosticados en la unidad

de Genética de la Nutrición en años anteriores para que participaran en el estudio.

Fueron evaluados por los servicios de la Unidad de Genética de la Nutrición y el

Departamento de Investigación en Genética Humana del INP. A las familias se les

realizó historia clínica completa con árbol genealógico y en ella se asentaron los

resultados de los estudios enzimáticos de GALT yio galactosa en orina y/o sangre.

En cada caso se asentaron los datos clínicos de las variables a analizar en la Hoja

de Captación de Datos (Anexo 2).

a) Creación del banco de DNA:

Para el estudio molecular del gen GALT se obtuvo el DNA genómico

mediante la técnica de precipitación salina con el kit PuregeneTM (Gentra

Systems, Minneapolis, MN, USA) a partir de leucocitos de sangre periférica con

EDTA como anticoagulante (3-5 mL), muestras de tamiz neonatal en tarjetas

de Güthrie o de células de descamación de mucosa oral, tanto del caso índice

como de sus familiares en primer grado (padres y hermanos). El DNA

genómico obtenido se cuantificó y se valoró su pureza e integridad mediante

32

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espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa. Las muestras de DNA se

conservaron a 4°C hasta su análisis.

b) Búsqueda de las mutaciones Q188R, K285N, N314D y S1351- en el gen

GAL T:

Las 3 primeras mutaciones se identificaron mediante amplificación de las

secuencias de los exones 6, 9 y 10, respectivamente, por medio de PCR y

corte con endonucleasas de restricción.

Los primers de cada secuencia se enlistan a continuación55

ALELO 1 PRIMERF PRIMERR

Q188R

K285N

N314D

5'AAGCTTTGGTT 5'AATGGATGGGA CTGGGGAGT 3' CAGAGGAAA 3'

5'GATGGAGGTT 5'ACCTGATACTT GCTCCCAGTA 3' CTGTTGCCCTTG

TGCT 3'

5'ACTGTAAAAG 5TrGGCTACGAA GGCTCTCTCTC ATGCTTGC3' C 3'

La amplificación del DNA para el análisis de las mutaciones Q188R y N314D

se llevó a cabo con las siguientes condiciones: Ciclo 1: desnaturalización a

95°C por 5 minutos, alineamiento a 59°C por 1 minuto, extensión a 72°C por 1

minuto. De los ciclos 2 a 34: 95°C por 1 minuto, 59°C por 40 segundos y 72°C

por 1 minuto. Ciclo 35: 95°C por 1 minuto, 59°C por 1 minuto y 72°C por 10

minutos. La amplificación de DNA del exón 9 para la búsqueda de la mutación

33

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K285N se realizó de acuerdo a las siguientes condiciones: Ciclo 1:

desnaturalización a 95°C por 5 minutos, alineamiento a 60°C por 40 segundos,

extensión a 72°C por 1 minuto. De los ciclos 2 a 40: 95°C por 1 minuto, 60°C

por 40 segundos, 72°C por 1 minuto. Ciclo 41: 95°C por 1 minuto, 60°C por 40

segundos y 72°C por 10 minutos.

En los productos de PCR la digestión se realizó con endonucleasas de

restricción para generar fragmentos de distinta longitud (Tabla 2); en la

mutación 0188R la transición de A—*G en el exón 6 en el codón 188 introduce

un nuevo sitio de corte Hpall, el cual es utilizado para determinar este genotipo

en la población de estudio. La transversión de AAC>AAT en la mutación

K285N crea un sitio de restricción adicional para la endonucleasa Tsp5091.

En la mutación N314D la transición A—G introduce un nuevo sitio de corte

para la endonucleasa Avall. De las enzimas Hpall y Avali se utilizaron 2.5 U

(para volúmenes totales de 15 pl) y la restricción se llevó a cabo a 37°C

durante 24 horas; para determinar la mutación K285N, los productos de PCR

fueron digeridos con 3 U de Tsp5091 (para volúmenes totales de 15 pl) a 65°C

por 12 horas60. Los productos de la restricción se visualizaron por

electroforesis (U100V, l60mA, por 60 minutos) en gel de agarosa al 4%.

TABLA 2 ALELO PRODUCTOS

MUTACIÓN EXON ENZIMA SITIO DE CORTE NORMAL ALELO MUTADO

Q188R 6 Hpall 5'...CYCGG ... 3' 255pb 36pb/219pb 3'...GGCÁC ... 5'

K285N 9 Tsp5091 5'...VAATT ... 3' 716 pb 98pb/618pb 3'...TrAAA ... 5'

N314D 10 Avatl 5'...GYGWCC ... 3' 171 pb 82 pb /89 pb 3'...CCWGÁG ... 5'

34

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Para la mutación S1351- se realizó la técnica de amplificación por PCR

alelo-específica utilizado el siguiente juego de primers:

ALELO S135L

SILVESTRE

PRIMER F 5'TCATGTGCTTCCACGC CTGTTC3' 5'TCATGTGCTTCCACCC CTGTTT3'

PRIMER R 513GAAGGGGGGACCTCAGA AAC3' 5GGAAGGGGCGACCTCACA AAC3'

Dichos primers se utilizaron para amplificar selectivamente el alelo mutado

o bien, el alelo silvestre; por lo tanto, se realizaron dos reacciones por

separado siguiendo las siguientes condiciones: Ciclo 1: desnaturalización a

95°C por 5 minutos, alineamiento a 65°C por 40 minutos, extensión a 72°C

por 1 minuto. Ciclos 2 a 34: 95°C por 40 segundos, 65°C por 40 segundos,

72°C por 1 minuto. Ciclo 35: 95°C por 40 segundos, 65°C por 40 segundos,

72°C por 10 minutos. Los productos de las 2 reacciones se visualizaron por

electroforesis en gel de agarosa al 4%.

c) Detección de portadores y asesoramiento genético:

Se brindó asesoramiento genético a las familias captadas de acuerdo a los

genotipos observados (familias con ambos alelos caracterizados, familias con al

menos un alelo GALT caracterizado o sin mutación identificada).

35

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ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

El análisis estadístico se realizó utilizando la base de datos generada a

partir de las hojas de captación de datos por medio de estadística descriptiva. Los

resultados se presentan por promedio y la frecuencia de las mutaciones se reporta

en porcentajes.

CONSIDERACIONES ÉTICAS.

El presente trabajo fue aprobado por los comités de Investigación y Ética

de¡ Instituto Nacional de Pediatría, además, se solicitó el consentimiento informado

de los padres de los casos índice que cumplieron con los criterios de inclusión,

para la obtención de 3-5 mL de sangre venosa periférica, raspado de mucosa oral

o sangre en papel filtro, extracción de DNA y su posterior análisis, lo que

representó un riesgo mínimo para el paciente.

Se pidió al padre o tutor de¡ paciente que firmara la carta de consentimiento

informado de él y de¡ paciente. La información personal, de identidad y de¡

genotipo se manejó en forma estrictamente confidencial, siguiendo las normas

establecidas por la declaración de Helsinki, las Buenas Prácticas Médicas y de¡

ELSI (de¡ inglés "Ethical, Legal and Social Issues"). El asesoramiento genético se

brindó en todos los casos de acuerdo a los resultados obtenidos de¡ estudio

molecular.

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RESULTADOS.

Se estudiaron 18 familias en las que existía por lo menos un afectado con

diagnóstico confirmado de galactosemia clásica. El 78% de las familias

presentaron casos únicos (n=14), mientras que en el 22% restante se presentaron

2 pacientes afectados por familia (n=4). En el 21% de familias con casos únicos

(n3), así como en todos los casos familiares se identificó el antecedente de

endogamia o consanguinidad. En 3 de los casos familiares los probandos

contaban con un hermano(a) finado(a) por complicaciones atribuibles a una

galactosemia clásica.

La edad promedio de los pacientes al momento del estudio fue de 2 años y

la proporción de pacientes de sexo femenino y masculino fue de 56% y 44%,

respectivamente.

Seis familias proceden del Distrito Federal, 2 de Yucatán, 3 de Guanajuato,

2 del Estado de México, 2 de Michoacán, 1 de Jalisco, 1 de Guerrero y 1 de

Colima.

Cinco de los 18 casos índice (27.7%), cuya edad promedio fue de 7 años,

resultaron homocigotos para la mutación Q188R. Todos estos pacientes carecen

de actividad enzimática de GALT y presentaron galactosa total en sangre >50

mg/dL (valor de referencia: <14mg/dL), galactosuria severa y prueba de Beutler

positiva para galactosemia al momento del diagnóstico (periodo neonatal) y 2

pacientes durante el tiempo de exposición alimentaria a la galactosa (±12 meses);

todos presentaron hepatomegalia, ictericia y tubulopatia de grado variable,

acompañado de rechazo al alimento y vómito. Neurológicamente todos los

pacientes de este grupo presentaron hipotonía y letargia durante el periodo agudo

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de intoxicación con galactosa y 2 (40%) persistieron con retraso psicomotor de

leve a moderado a pesar de la restricción dietética de galactosa posterior al

diagnóstico; en uno de estos pacientes (5.5%) se diagnosticó catarata congénita

después del primer año de vida.

Tres casos (16.6%) fueron heterocigotos compuestos, ya que se identificó

la mutación Q188R en un alelo y en el otro no se caracterizó la mutación. Dos

pacientes presentaron actividad de GALT disminuida y ausencia de

sintomatología; ambos fueron diagnosticados por anormalidades en el tamiz

neonatal como galactosuria moderada, galactosa total en sangre >14 mg/dL y

prueba de Beutier con fluorescencia deficiente. El tercer paciente fue

diagnosticado a los 5 días de vida al presentar un cuadro severo de

hepatomegalia, coagulopatia, vómito e ictericia; a nivel bioquímico presentó

galactosa total en sangre >50mg/dL y ausencia de actividad enzimática. El manejo

de todos estos pacientes fue restricción dietética absoluta de galactosa.

Dos pacientes (11%) fueron heterocigotos compuestos Q188R/N3141D y

ninguno de ellos presentó datos clínicos; el motivo de su ingreso al INP fue el

hallazgo por tamiz neonatal de actividad enzimática disminuida y galactosa total

en sangre >14 mg/dL.

Se observaron 2 pacientes (11%) homocigotos para la mutación N314D.

Uno fue diagnosticado por anormalidades en el tamiz neonatal y actividad

enzimática deficiente, mientras que en el segundo se evidenció catarata congénita

y actividad enzimática casi ausente; sorpresivamente en el análisis molecular

familiar de este paciente, sólo el padre es portador de la mutación N3141) y en la

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madre no se identificó ningún cambio (fig. 8); a ambos padres se les realizó

prueba de Beutier, confirmando actividad enzimática normal.

En 2 pacientes (11%) sólo se identificó la mutación N31413 en un alelo.

Ambos presentan actividad enzimática disminuida y uno de ellos desarrolló

catarata congénita incipiente.

En un paciente de 1 año de edad, con ausencia total de actividad

enzimática, galactosa total >50 mg/dL, hepatopatía y retraso psicomotor se

identificó en ambos alelos la mutación S135L.

En ninguno de los casos analizados se identificó el cambio K285N y en 3

pacientes (16.6%) no fue posible identificar las mutaciones responsables.

Todos los pacientes fueron evaluados clínicamente a distintos intervalos de

tiempo de acuerdo a su edad; durante el primer año de vida se les dio seguimiento

cada 3 meses para adecuar la dieta en base a la ablactación y ganancia de peso.

A mayores de un año de edad se les citó cada 6 meses para registrar su

desarrollo y crecimiento. El apego a la dieta libre de galactosa fue total en todos

los casos, sin embargo, en los pacientes en edad escolar, los padres no pudieron

garantizar la restricción absoluta de galactosa de los alimentos ingeridos en la

escuela.

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-255 pb

-219 pb

-36 pb

PM 1 2 3 4 5

FIGURA 7

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 4% PARA ANÁLISIS DE LA

MUTACIÓN Q188R.

Carriles 1, 3 y 4: Heterocigotos para la mutación, se observan tanto el alelo

silvestre como los productos de corte de¡ alelo mutado. Carril 2: Homocigoto para

la mutación, sólo se observan los productos de corte del alelo mutado. Carril 5:

Alelo silvestre de 255 pb.

40

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PM 11.2 111.2 11.3

-171 pb

-89 pb -82 pb

FIGURA 8

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 4% PARA ANÁLISIS DE LA

MUTACIÓN N314D.

Carril 1.2: en la madre del caso índice se observa una sola banda de 171 pb que

corresponde al alelo silvestre. Carril 111.2: alelo mutado con sitio de corte que crea

dos productos de 89 y 82 pb que sugiere homocigocidad. Carril 11.3: Padre del

caso indice, molecularmente se confirma estado de portador heterocigoto en el

que se observan tanto el alelo silvestre como el mutado.

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FIGURA 9

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 4% PARA ANÁLISIS DE LA

MUTACIÓN K285N.

En todos los carriles se observa alelo silvestre de 716 pb.

42

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A B

PM 1 2 3

PM 1 2 3

FIGURA lOA y 1013

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 4% PARA ANÁLISIS DE

AMPLIFICACIÓN ALELO-ESPECÍFICA PARA LA MUTACIÓN S135L.

Carril 2 figura lOA: Ausencia de amplificación del alelo mutado al utilizar oligos

con secuencia silvestre. Carril 2 figura 1013: amplificación del alelo mutado

utilizando oligos con secuencia mutada.

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TABLA 3

FRECUENCIA DE LOS ALELOS

ALELO 1 % N

Q188R 1 42 15

K285N 1 0 0

N314D 1 22 8

S1351- I 6 2

No identificados 1 30 11

Total I 100 36

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TABLA 4

RELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO

GENOTIPO NÚMERO

PACIENTES FENOTIPO

ENZIMÁTICO

0188R10188R 5 Severo1

Q188R/X 3 Moderado2

0188R/N314D 2 Moderado2

N314D/N314D 2 Moderado2

N314D/X 2 Moderado2

S135L/S1351 1 Severo1

n total=18 pacientes. En 5 casos no se identiticaron las mutaciones responsables. 1 Ausencia total de GALT. 2 Valores de GALT 3-18 U/g Hb.

En cuanto a la detección de portadores, se estudiaron a 32 familiares en

primer grado: 14 padres, 16 madres y 1 hermanos. En 2 familias no fue posible

obtener muestra de DNA de los padres ya que no se contaba con datos para

contactarlos. En 2 casos sólo se obtuvo muestra de las madres ya que a los

padres no les fue posible asistir a la consulta por que residen en provincia. Se

confirmaron 11 portadores heterocigotos para la mutación Q188R (6 madres y 5

padres) y 7 portadores heterocigotos N314D (4 madres y 3 padres). En las 6

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madres y 6 padres restantes no se caracterizaron las mutaciones responsables de

la galactosemia clásica. Se identificó como homocigoto S1351- al hermano de la

paciente con dicho genotipo, quien cursó en la etapa neonatal con hepatopatía y

actualmente presenta retraso psicomotor y ataxia leves a pesar de la restricción

dietética de galactosa, ya que en él se realizó el diagnóstico después de los 6

meses de edad.

DISCUSIÓN.

En el tamiz neonatal realizado en México no se hacen pruebas para la

detección de galactosemia. Desafortunadamente, son pocos los neonatos, todos

ellos nacidos en el medio hospitalario privado, los que tienen acceso a dicha

prueba que se realiza en laboratorios norteamericanos. Esto crea un problema

para la mayoría de los enfermos de galactosemia de nuestro país, ya que sólo

serán diagnosticados cuando presenten sintomatología hepática, neurológica u

oftalmológica, cuyo curso es potencialmente letal y con alta tasa de morbilidad. En

el tamiz neonatal que contempla la galactosemia se realiza la determinación

cualitativa de GALT y reporta niveles totales de galactosa en sangre cuando estos

sobrepasan el limite normal; si el resultado es sugestivo de galactosemia en otros

países se realiza la genotipificación de las mutaciones más frecuentes.

Varias de las mutaciones descritas en el gen GALT se presentan con mayor

frecuencia en algunos grupos étnicos. Las mutaciones más comunes, 0188R,

K285N y N314D corresponden al 70% de las mutaciones en población caucásica,

mientras que la mutación S1351- corresponde hasta al 62% de los alelos

causantes de galactosemia clásica en población Afro-Americana.

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El cambio Q188R es altamente prevalente en varias poblaciones y no se

encuentra en individuos con actividad de GALT conservada. Dicha mutación

produce un efecto dramático e inequívoco en la enzima que causa deterioro

severo de su función. Estos hallazgos se corroboraron en nuestro estudio al ser el

alelo más frecuente en la población de estudio; su prevalencia fue 42% vs 58%

reportado en población latina por Wong y cols. La cifra menor que nosotros

observamos con relación a la literatura pudiera estar en relación al tamaño

reducido de nuestra muestra de estudio. Así mismo, todos los pacientes

homocigotos para esta mutación debutaron con elevados niveles de galactosa

total en sangre, prueba de Beutler con ausencia de actividad enzimática y

glucosuria severa que clínicamente se tradujo en hepatopatia, hipotonia y, en un

caso, catarata congénita.

La presentación clínica de los 3 casos heterocigotos Q188RJX fue variable y

esto probablemente se encuentra relacionado al fenotipo enzimático que produce

la segunda mutación aún no identificada, para la cual en el Laboratorio de Biología

Molecular se harán otras estrategias metodológicas para su caracterización.

La frecuencia del alelo N314D fue similar a la observada a nivel mundial (22% de

los aletos analizados). Para los 2 casos heterocigotos compuestos 0188R1N314D,

la funcionalidad enzimática que proporciona el alelo Duarte evitó la elevación

severa de galactosa total en sangre y la aparición de sintomatología hepática y

neurológica temprana y grave.

Los portadores de un alelo N314D y otro no identificado mostraron curso clínico

variable, también probablemente relacionado a la funcionalidad enzimática

condicionada por la segunda mutación aún no caracterizada.

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La homocigocidad para el alelo N314D brinda un pronóstico favorable ya que la

actividad enzimática residual evita la acumulación de galactosa-1-fosfato,

galactosa y galactitol. La catarata congénita observada en un paciente de este

grupo representa la excepción a la regla, ya que este genotipo no se asocia con

patología ocular y en muchos casos con ausencia total de sintomatología a lo

largo de la vida, sin embargo, el encontrar sólo portador de la mutación al padre,

sugiere dos posibles escenarios que podrían explicar el fenómeno: disomia

uniparental paterna del cromosoma 9 o bien, una mutación tipo deleción en el

alelo materno. La primera opción resulta poco viable ya que a la fecha no hay

reportes que apoyen la disomía uniparental de la región de GALT del cromosoma

9, pero en un futuro se realizarán estudios de marcadores microsatélites en la

familia para confirmar o descartar este fenómeno. La segunda teoría se basa en el

hecho de que la amplificación de DNA por PCR no ocurriría ante una deleción ya

que si uno de los alelos mutados tiene una deleción del gen completo o de sitios

críticos para la hibridación de los oligonucleótidos, el alelo no deletado amplificará

y dará un resultado falso de homocigocidad para el alelo con la mutación puntual.

En este caso también se requiere realizar otras estrategias moleculares para

confirmar la deleción materna.

La ausencia del alelo K285N en nuestra población de estudio pudiera ser reflejo

del efecto fundador que dicho cambio tiene en población de Europa Oriental y a

que la migración de su población originaria está limitada en nuestro país.

La identificación de la mutación S1351- en una familia con dos hermanos

afectados, confirma que en población mexicana existe contribución genética de

origen de raza negra. A pesar de que esta mutación no se describe en población

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caucásica, ningún miembro de esta familia presenta fenotipo negroide y ambos

padres provienen de una región endogámica del Estado de México, lo que sugiere

que dicho cambio ha estado presente en esta comunidad hace varias

generaciones.

La frecuencia total de alelos identificados por las metodologías empleadas en este

estudio fue de 70%. Dada la gran heterogeneidad alélica que presenta la

galactosemia, los alelas no identificados deberán genotipificarse por otras

metodologías como SSCP, lo que también permitirá conocer si existen mutaciones

propias de población mexicana.

CONCLUSIONES.

Los mejores predictores del pronóstico de los pacientes afectados por la

galactosemia clásica son los parámetros bioquímicos, enzimáticos y el genotipo de

GALT. Aunado al seguimiento clínico estrecho de los pacientes, gracias a estos

resultados se pueden ofrecer intervenciones para evitar o disminuir las secuelas

ocasionadas por la acumulación de galactosa y galactitol a distintos niveles.

Este estudio enfatiza la necesidad del tamizaje bioquímico y genético para

galactosemia clásica en población mexicana con el fin de captar los casos

sospechosos, confirmar los casos positivos y así prevenir complicaciones, retraso

mental o la muerte en los pacientes afectados por la enfermedad al instaurar un

tratamiento oportuno.

La historia familiar, el fenotipo bioquímico y el genotipo molecular de los pacientes

afectados por galactosemia clásica permiten un diagnóstico sensible y especifico

de la patología. Además, del asesoramiento genético de certeza se pueden

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identificar a otros familiares en riesgo de ser portadores de mutaciones de GALT,

e incluso ofrecerles diagnóstico prenatal.

En el futuro, nos permitirá realizar la búsqueda de cambios en GALT responsables

de galactosemia clásica en otro grupo de padecimientos, como aquellos con

defectos de canalización genital, infertilidad femenina o catarata presenil aislada,

en los cuales la literatura ha demostrado que un porcentaje de ellos son causados

por mutaciones heterocigotas de GALT.

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ANEXO 1

CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO (menores de edad)

México, D. F., a de de 200_

Por medio de la presente hago constar que estoy de acuerdo en que yo y mi

hijo(a) participemos en el proyecto

"DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS MUTACIONES Q188R, K285N Y N314D

EN PACIENTES CON GALACTOSEMIA CLÁSICA", que se lleva a cabo en el

Instituto Nacional de Pediatría. Se me ha explicado que para la realización del

estudio, se requiere una muestra de sangre periférica, la cual será tomada con

todos los requisitos de seguridad por lo que no representa ningún riesgo para

ninguno de nosotros. Además, me han informado que de la muestra de sangre se

obtendrá el material genético, cuyo análisis permitirá identificar las mutaciones que

se asocian con la galactosemia y es probable que en un futuro los resultados

puedan servir para un mejor diagnóstico, pronóstico y tratamiento de esta

patología.

Así mismo, se me ha indicado que toda información derivada del estudio es

absolutamente confidencial y que nuestra participación es completamente

voluntaria, por lo que si no deseamos participar, ello no repercutirá en la atención

de mi hijo (a).

Atentamente,

Padre, Madre o tutor Testigo

Médico responsable: Dra. Ariadna González del Ángel.

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ANEXO 1.1

CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO (mayores de edad)

México, D. F., a de de 200_

Por medio de la presente hago constar que yo,

estoy de acuerdo en participar en el

estudio "DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS MUTACIONES Q188R, K285N

Y N314D EN PACIENTES CON GALACTOSEMIA CLÁSICA", que se lleva a

cabo en el Instituto Nacional de Pediatría. Se me ha explicado que para la

realización de¡ estudio, se requiere una muestra de sangre periférica, la cual será

tomada con todos los requisitos de seguridad por lo que no representa ningún

riesgo para ninguno de nosotros. Además, me han informado que de la muestra

de sangre se obtendrá el material genético, cuyo análisis permitirá identificar las

mutaciones que se asocian con la galactosemia y es probable que en un futuro los

resultados puedan servir para un mejor diagnóstico, pronóstico y tratamiento de

esta patología.

Así mismo, se me ha indicado que toda información derivada de¡ estudio es

absolutamente confidencial y que mi participación es completamente voluntaria,

por lo que si no deseo participar, ello no repercutirá en mi atención médica.

Atentamente,

Padre o Madre Testigo

Médico responsable: Dra. Ariadna González de¡ Ángel.

52

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ANEXO 2

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE LAS MUTACIONES Q188R,

K285N Y N314D EN PACIENTES CON GALACTOSEMIA CLÁSICA

Caso índice:

Sexo: MF Edad: _________ (años)

Institución tratante:

Expediente No. Fecha de nacimiento: II

No. Registro interno (muestra DNA):

Consanguinidad:

Lugar de Origen:

Árbol Genealógico

53

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Las manifestaciones por aparatos y sistemas enunciadas a continuación se

definieron en el marco teórico.

1 Si = Presente

2 No = Ausente

1. OFTALMOLÓGICO II. GASTROINTESTINAL

Catarata congénita Rechazo al alimento

Vómito

III. HEPÁTICO Diarrea

Hepatomegalia LII V. PIEL Y MUCOSAS

IV. RENAL Ictericia

Tubulopatía LIII VII. INMUNOLÓGICO

VI. HEMATOLÓGICO Infección E. coli, gram (-)

Coagulopatia LI

VIII. NEUROLÓGICO

Letargia

Hipotonía LI Retraso psicomotor/mental LI Ataxia LIII

IX. LABORATORIO

Prueba de Beutler (+) LI Galactosuria LI Determinación GALT LI Galactosa total en sangre LII

Valor:

54

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REFERENCIAS

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chronischem Leberleiden. KIin. W.schr 1917; 54:473-477. 2 Walter JH, Collins JE, Leonard JV, et al. Recommendations for the management

of galactosaemia. Arch Dis Child 1999; 80: 93-96.

Kalckar HM, Anderson EP, lsselbacher KJ. Galactosemia, a congenital defect in

a nucleotide transferase: a preliminary report. Proc Nat Acad Sci USA 1956; 42:

49-51.

Waggoner DD, Biest NRM, Donriell G. Long term prognosis in galactosemia:

results of a survey of 350 cases. J Inhent Metab Dis 1990; 13: 802-818.

Flach J, Reichardt L, Elsas L. Sequence of a cDNA encoding human galactose-1-

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